Исследование комплекса биологически активных веществ растения polemonium coeruleum l.
На правах рукописи
МАЛЬЦЕВА
Алевтина Алексеевна
Исследование комплекса биологически активных веществ
растения Polemonium coeruleum L.
14.04.02 – фармацевтическая химия, фармакогнозия
АВТОРЕФЕРАТ
диссертации на соискание ученой степени
кандидата фармацевтических наук
Москва 2011
Работа выполнена в ГОУ ВПО Воронежский государственный университет
Научный руководитель:
доктор фармацевтических наук,
профессор Алла Анатольевна Сорокина
Официальные оппоненты:
доктор фармацевтических наук,
профессор Вера Ивановна Прокофьева
кандидат фармацевтических наук,
доцент Нина Васильевна Иващенко
Ведущая организация: ГОУ ВПО Курский государственный медицинский университет
Защита состоится «__»_______2011г. в __.__ часов на заседании диссертационного совета Д.208.040.09 в ГОУ ВПО Первый Московский государственный медицинский университет имени И.М. Сеченова по адресу: 119992, Москва, ул. Трубецкая, д. 8.
С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке ГОУ ВПО Первый Московский государственный медицинский университет имени И.М. Сеченова по адресу: 117998, Москва, Нахимовский проспект, д.49.
Автореферат разослан «__»_______ 2011г.
Ученый секретарь Диссертационного Совета Д.208.040.09
доктор фармацевтических наук,
профессор Садчикова Наталья Петровна
ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ
Актуальность темы. Синюха голубая – Polemonium coeruleum L., семейства синюховые – Polemoniaceae, растение достаточно широко распространенное в средней полосе России. Корневища с корнями синюхи – Rhizomata cum radicibus Polemonii, включены в ГФ XI в качестве отхаркивающего средства, применяемого в форме отвара. Данный вид сырья не входит в фармакопеи ведущих стран мира.
Синюха голубая была предложена для медицинского применения профессором М.Н. Варлаковым в 1932г. как заменитель импортной сенеги и активно изучалась в 50-х – 60-х годах ХХ века. В СССР растение культивировалось в Белоруссии, западной части Украины, Прибалтике, Западной Сибири, центральной части нечерноземья России. В настоящее время корневища с корнями синюхи имеют ограниченное применение и практически перестали реализовываться через аптечную сеть.
В народной медицине корневища с корнями синюхи имеют более широкое применение – не только как отхаркивающее средство, но и как седативное, противовоспалительное, ранозаживляющее, кровоостанавливающее, антибактериальное и др. Помимо подземных органов в народной медицине используется надземная часть растения, которая в настоящее время является отходом при заготовке официнального сырья. Сырье синюхи не входит в фармакопеи ведущих стран мира.
Учитывая недостаточную изученность комплекса действующих веществ, разнообразную фармакологическую активность, отсутствие на фармацевтическом рынке лекарственных форм синюхи, а так же перспективу безотходного использования растения, углубленное изучение синюхи голубой следует считать актуальным.
Целью настоящего исследования является проведение углубленного комплексного изучения биологически активных веществ (БАВ) растения, совершенствование имеющейся нормативной документации на сырье и изучение возможности получения лекарственных форм синюхи голубой.
Задачи исследования:
- Провести информационно–аналитические исследования по вопросам химического состава синюхи голубой, фармакологической активности и возможности получения новых лекарственных форм.
- С использованием современных физико-химических методов анализа провести углубленное изучение БАВ подземных и надземных органов синюхи голубой и разработать методики определения содержания БАВ в сырье.
- Провести микроскопическое исследование корневищ с корнями синюхи голубой с целью изучения вариабильности диагностически значимых признаков при измельчении сырья.
- Провести фармакогностическое изучение травы синюхи голубой как возможного дополнительного вида лекарственного растительного сырья.
- Провести исследования по вопросу получения и стандартизации экстракционных лекарственных форм из сырья синюхи.
- Провести фармакологическое изучение сырья и лекарственных форм синюхи голубой.
Работа выполнена в соответствии с планом НИР кафедры фармацевтической химии и фармацевтической технологии ГОУ ВПО Воронежский государственный университет по теме «Разработка новых и совершенствование существующих методов получения, оценки качества и стандартизации лекарственного растительного сырья, лекарственных средств природного, биотехнологического и синтетического происхождения», № Государственной регистрации темы – 01.200302927.
Научная новизна результатов исследования заключается в получении научно–обоснованных данных при экспериментальном изучении состава БАВ сырья синюхи голубой: тритерпеновых сапонинов и флавоноидов. С использованием современных физико–химических методов (УФ-спектроскопия, ИК-спектроскопия и др.) дана их качественная и количественная характеристика. Разработана спектрофотометрическая методика количественного определения флавоноидов в сырье синюхи голубой. Проведено сравнительное химическое изучение корневищ с корнями и травы синюхи голубой, показана перспективность использования последней как дополнительного источника тритерпеновых сапонинов. Экспериментально подтверждены гипогликемическое действие и антиоксидантная активность сырья и жидких экстрактов синюхи голубой.
Практическая значимость полученных результатов состоит в изучении вариабельности диагностических признаков анатомического строения сырья синюхи голубой различных форм переработки (цельное и измельченное сырье) и их визуализации. Выявлены диагностически значимые признаки при идентификации измельченных корневищ с корнями синюхи. На основании результатов проведенных исследований внесены усовершенствования в фармакопейную методику количественного определения тритерпеновых сапонинов в корневищах с корнями синюхи. Проведенные исследования по стандартизации лекарственного растительного сырья были использованы при разработке проекта ФС на корневища с корнями синюхи голубой для Государственной фармакопеи XII издания. Обоснована возможность рационального безотходного использования растения синюха голубая – Polemonium coeruleum L., и расширения сырьевой базы за счет применения в качестве растительного сырья не только подземных органов, но и травы растения. Проведенные фармакологические исследования сырья синюхи позволяют расширить область применения растения. Показана возможность получения жидких экстрактов (1:1) из корневищ с корнями и травы синюхи голубой. Разработаны методики их стандартизации.
Внедрение результатов работы в практику. Результаты проведенных исследований используются в учебном процессе на кафедре фармакогнозии ГОУ ВПО Воронежский государственный университет и ГОУ ВПО Воронежская государственная медицинская академия им. Н.Н. Бурденко, что подтверждается соответствующими актами внедрения.
Апробация диссертации. Основные положения диссертации доложены на пленарном заседании IV Всероссийской с международным участием научно–методической конференции «Фармобразование–2010» (Воронеж, 2010г.), III Всероссийской научно–методической конференции «Фармобразование–2007» (Воронеж, 2007г.), научных конференциях кафедры управления и экономики фармации и фармакогнозии фармацевтического факультета ГОУ ВПО Воронежского государственного университета (Воронеж, 2006-2010гг.).
Публикации. Материалы диссертационной работы опубликованы в 21 печатной работе, из них 5 работ в рецензируемых журналах.
Основные положения, выносимые на защиту:
- Результаты углубленного изучения качественного состава БАВ корневищ с корнями и травы синюхи голубой.
- Данные по разработке методик количественного определения тритерпеновых сапонинов и флавоноидов в сырье синюхи голубой.
- Результаты изучения вариабильности диагностически значимых признаков при измельчении корневищ с корнями синюхи голубой.
- Результаты макроскопическиго и микроскопического изучения травы синюхи голубой.
- Результаты изучения водных извлечений и жидких экстрактов 1:1 синюхи.
- Результаты исследования фармакологической активности сырья и жидких экстрактов (1:1) синюхи.
Объем и структура диссертации. Работа изложена на 184 страницах и состоит из введения, обзора литературы, экспериментальной части, включающей 7 глав, выводов, списка литературы, состоящего из 171 источника, 24 - на иностранных языках, и приложения. Диссертация содержит 27 таблиц, 54 рисунка, в том числе 17 фотографий.
Во введении раскрыта актуальность темы, определены цель и задачи исследования, сформулирована научная новизна и практическая значимость работы. В первой главе на основании литературных данных обобщены сведения о ботанико–фармакогностической характеристике синюхи голубой, химическом составе, методах анализа основных биологически активных веществ в растительном сырье; нормативной документации на сырье синюхи; фармакологической активности и использовании сырья синюхи в медицине. Вторая глава посвящена описанию объектов и методов исследований, используемых при комплексном изучении основных групп биологически активных веществ синюхи голубой (тритерпеновых сапонинов и флавоноидов) и разработке методик стандартизации сырья. В третьей главе представлены результаты изучения тритерпеновых сапонинов и флавоноидов методом ТСХ. Четвертая глава посвящена изучению тритерпеновых сапонинов и флавоноидов синюхи спектральными методами. В пятой главе приведены результаты исследований по разработке методик количественного определения тритерпеновых сапонинов и флавоноидов в сырье синюхи. В шестой главе приведены материалы изучения вариабильности диагностически значимых признаков при измельчении корневищ с корнями синюхи голубой и фармакогностического изучения травы синюхи. В седьмой главе обобщены результаты получения и изучения водных и водно–спиртовых лекарственных форм сырья синюхи. Восьмая глава посвящена фармакологическому исследованию сырья и лекарственных форм синюхи. Приведены результаты изучения антиоксидантной, мембранстабилизирующей и гипогликемической активности. Приложение включает проект ФС «Корневища с корнями синюхи».
Объекты и методы исследования
Объектами исследования служили высушенные корневища с корнями и трава синюхи, заготовленные в Воронежской области и стандартизованные (корневища с корнями) согласно требованиям ГФ XI, а также водные извлечения из сырья и жидкие экстракты (1:1).
Микроскопические исследования сырья проводили в соответствии с требованиями общих статей ГФ XI, визуализацию диагностических признаков осуществляли с помощью цифрового фотоаппарата «Canon А 630».
ИК–спектры регистрировали в диапазоне средних частот 400 – 4000 см-1 на ИК–спектрометре с Фурье-преобразованием «Nicolet 6700/8700» с приставкой Smart Accessories и последующей обработкой программой OMNIC. УФ–спектры получали с помощью прибора СФ 2000-01. Спектральный диапазон прибора – от 200 до 750. Для получения КР–спектров образцов использовали прибор РАМАН–модуль к ИК–Фурье спектрометру марки «Nicolet NRX-FT Raman».
Флуориметрический анализ растительного сырья и препаратов синюхи проводили с помощью прибора «Анализатор жидкости «Флюорат–02– Панорама».
Отвар корневищ с корнями синюхи и настой травы синюхи готовили согласно методике общей статьи ГФ XI, вып. 2, с.147 «Настои и отвары» и «Инструкции по изготовлению в аптеке жидких лекарственных форм» (Приложение к приказу МЗ РФ от 21.10.97. №308). Жидкие экстракты (1:1) корневищ с корнями и травы синюхи готовили методом перколяции.
Изучение гипогликемизирующей активности сырья и препаратов синюхи голубой проводили с использованием глюкозо-толерантного теста (ГТТ) на здоровых животных. Антиоксидантную активность сырья и препаратов определяли титриметрически по методике Т.В.Максимовой с соавторами.
В работе использовали реактивы, стандарты, растворители, отвечающие требованиям соответствующей нормативной документации. Статистическую обработку экспериментальных данных проводили фармакопейным методом и с помощью программы «Statistica - 6.0».
ОСНОВНОЕ СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ
Анализ биологически активных веществ синюхи голубой методом ТСХ
С помощью известных фармакопейных реакций и методик в сырье синюхи определены тритерпеновые сапонины, флавоноиды, полисахариды, кумарины, дубильные вещества, жирное масло. Для дальнейшего более подробного изучения были взяты две основные группы БАВ синюхи – тритерпеновые сапонины и флавоноиды.
В соответствии с поставленными задачами были подобраны оптимальные условия хроматографирования тритерпеновых сапонинов и флавоноидов сырья синюхи голубой на пластинках «Sorbfil» и рассчитаны основные критерии эффективности хроматографического процесса.
Для анализа сапонинов сырья синюхи оптимальными являются: элюирующая система бутанол – спирт этиловый – аммиак (7:2:5), детектирующий реагент – 25% спиртовой раствор фосфорновольфрамовой кислоты с последующим прогреванием в течение 5 минут при температуре 105оС. На хроматограммах обнаруживаются 6 зон сапонинов с Rf от 0,13 до 0,55. Изучена возможность использования для детектирования хроматограмм реакции гемолиза эритроцитов. Установлено, что способностью к гемолизу обладает только часть сапонинов, что позволяет предположить наличие в растительном сырье синюхи двух групп сапонинов, различающихся по способности к гемолизу эритроцитов крови.
При определении флавоноидов в сырье синюхи методом ТСХ лучшие результаты наблюдаются при использовании элюирующей системы этилацетат– кислота муравьиная–вода (10:2:3), а в качестве проявляющего регента – 2% спиртового раствор алюминия хлорида с последующим детектированием в УФ-свете. При просматривании хроматограмм в УФ свете при длине волны 365 нм обнаруживается 5 (корневища с корнями) и 6 (трава) флуоресцирующих зон с Rf от 0,32 до 0,95.
Изучение сырья синюхи голубой спектральными методами
Для изучения сапонинов с использованием спектральных методов анализа из сырья синюхи предварительно получили очищенную сумму сапонинов.
Были получены ИК–спектры сырья синюхи и ИК– спектры очищенной суммы сапонинов. Проведено отнесение характеристических частот поглощения в ИК–спектрах исследуемых объектов. Попытка детальной расшифровки ИК–спектров растительного сырья синюхи и полученных из него очищенных индивидуальных сапонинов показала, что выбрать характерный участок спектра, позволяющий идентифицировать исследуемые вещества с должной специфичностью, не представляется возможным. Поэтому нами рекомендовано использование метода ИК–спектроскопии как возможного метода подтверждения подлинности растительного сырья синюхи только как «отпечатков пальцев».
Была изучена возможность применения Рамановской спектроскопии для идентификации тритерпеновых пентациклических сапонинов и флавоноидов в сырье синюхи и лекарственных формах на его основе. Показано, что данный метод не пригоден для анализа сапонинов синюхи, т.к. они не дают характерных, пригодных для идентификации полос в спектральной области прибора.
Для изучения возможности идентификации флавоноидов был получен спектр комбинационного рассеяния (КР–спектр) стандартного образца рутина (рис.1), имеющий максимум в области 8650 см-1 и максимум малой интенсивности в области 7350 см-1. Сравнение КР–спектров РСО рутина, сырья синюхи и жидких экстрактов (рис. 1-3) показало, что все КР–спектры имеют пик в области 8650 см-1, что может свидетельствовать о наличии рутина в анализируемых объектах. КР–спектры водных извлечений сырья синюхи характерных максимумов в данной области не имели.
Рисунок 1. КР–спектр РСО рутина
Рисунок 2. КР – спектры сырья синюхи: 1 – трава, 2 – корневища с корнями
Рисунок 3. КР – спектры жидких экстрактов 1:1 сырья синюхи: 1 – травы, 2 – корневищ с корнями
Разработка методики количественного определения сапонинов
в сырье синюхи голубой
При количественном определении суммы сапонинов в сырье синюхи с использованием фармакопейной спектрофотометрической методики, было установлено, что при рекомендуемой длине волны (=381 нм) максимум поглощения незначителен, в то же время имеется выраженный максимум поглощения при 282±2нм (рис.4). Установлено, что наибольший выход сапонинов из сырья синюхи обеспечивается при использовании в качестве экстрагента спирта этилового 70%, а не при использовании рекомендованного 90% спирта этилового.
Учитывая установленные факты и необходимость усовершенствования нормативной документации (НД) на сырье синюхи, были проведены исследования по модификации существующей методики определения содержания суммы тритерпеновых сапонинов в корневищах с корнями синюхи. Проведена оптимизация пробоподготовки и подобраны оптимальные условия проведения анализа: соотношение объемов исследуемой пробы и кислоты серной концентрированной 1:1, время нагревания реакционной смеси 1 час, в качестве аналитической предложена длина волны 282 нм. В выбранных условиях получена градуировочная зависимость для определения суммы сапонинов методом УФ–спектрофотометрии по реакции с концентрированной кислотой серной.
Достоверность результатов аналитического определения доказывалась установлением критериев правильности, точности, диапазона линейности, прецизионности количественного определения аналита в соответствии с ОФС «Валидация фармакопейных методов». Статистическую обработку данных проводили в соответствии с ОФС ГФ XI. Оценка правильности подтверждена результатами анализа модельных смесей, точность метода описывается метрологическими характеристиками в соответствии с ГФ XI. Результаты прецизионности оценивались при проведении анализа исследуемого образца в рекомендованном ОФС числе повторностей. Метрологические характеристики представленные в табл.1
Рисунок 4. Спектры поглощения продуктов реакции исследуемых образцов с концентрированной кислотой серной: раствора –эсцина (1), спиртовых извлечений из корневищ с корнями синюхи (2), травы синюхи(3)
Таблица 1. Метрологические характеристики УФ – спектрофотометрической методики определения суммы тритерпеновых сапонинов сырья синюхи голубой в пересчете на -эсцин (Р=95, n=5)
| Лекарственное растительное сырье | Параметры | |||||||
| f | x | S2 | S | S | t(p,f) | ±X | , % | |
| Корневища с корнями | 4 | 20,9 | 1,04 | 1,02 | 0,45 | 2,78 | 1,26 | 6 |
| Трава | 4 | 19,2 | 0,66 | 0,81 | 0,36 | 2,78 | 1,01 | 5,2 |
Разработка методики количественного определения флавоноидов
в сырье синюхи голубой
Изучена возможность применения для количественного определения суммы флавоноидов в сырье синюхи спектрофотометрической методики, основанной на образовании окрашенных продуктов взаимодействия флавоноидов со спиртовым раствором алюминия хлорида, имеющих характерный максимум поглощения при длине волны 415±2нм. Количественное содержание суммы флавоноидов в пересчете на рутин определяли, используя вариант дифференциальной спектрофотометрии.
Проведены исследования по адаптации методики к растительному сырью синюхи. Подобраны оптимальные условия проведения анализа: время, необходимое для созревания окраски продуктов реакции и их стабильность во времени. В выбранных условиях получена градуировочная зависимость для определения суммы флавоноидов методом УФ–спектрофотометрии по реакции с хлоридом алюминия (рис.5, 6.).
Достоверность результатов аналитического определения доказывалась установлением критериев правильности, точности, диапазона линейности, прецизионности количественного определения аналита с использованием той же НД, что и при определении сапонинов.
Метрологические характеристики разработанной методики представленные в табл.2.
Рисунок 5. Фрагменты спектров поглощения продуктов реакции флавоноидов с алюминия хлоридом: спиртовой раствор рутина (1), спиртовое извлечение травы синюхи (2), спиртовое извлечение корневищ с корнями синюхи (3)
Рисунок 6. Градуировочная зависимость оптической плотности раствора от концентрации рутина
Таблица 2. Метрологические характеристики УФ– спектрофотометрической методики определения суммы флавоноидов сырья синюхи голубой в пересчете на рутин (Р=95, n=5)
| параметры | f | x | S2 | S | S | P | t(p,f) | ±X | , % |
| Корневища с корнями | 4 | 0,59 | 0,002 | 0,047 | 0,021 | 95% | 2,78 | 0,06 | 9,9 |
| Трава | 4 | 0,97 | 0,0025 | 0,05 | 0,022 | 95% | 2,78 | 0,06 | 6,4 |
Разработка флуориметрической методики количественного определения сапонинов в растительном сырье синюхи голубой
Была изучение возможность количественного определения суммы флавоноидов сырья синюхи методом флуориметрии.
Получены спектры возбуждения и спектры регистрации раствора рутина с добавлением спиртового раствора алюминия хлорида, значительно усиливающего флуоресценцию (рис.7). Установлены рабочие максимумы методики ( max возб=426 нм, max рег=522 нм). В выбранных условиях получена градуировочная зависимость для определения суммы флавоноидов методом флуориметрии по реакции с хлоридом алюминия (рис.8). Рассчитаны метрологические характеристики методики (табл.3).
Рисунок 7. Фрагменты спектров возбуждения (1) и регистрации (2) комплекса рутина с алюминия хлоридом при определении его методом флуориметрии
Рисунок 8. Градуировочная зависимость показателя флуоресценции от
концентрации стандартного раствора рутина для диапазона высоких концентраций (0,1 – 1%)
Флуориметрический метод может быть использован для определения флавоноидов в сырье синюхи, однако сравнительный анализ двух разработанных методик показал, что флуориметрическая методика дает заниженные значения по сравнению со спектрофотометрической методикой, имеющей меньшее значение стандартного отклонения и большее значение коэффициента корреляции (0,991).
Таблица 3. Метрологические характеристики флуориметрической методики определения суммы флавоноидов сырья синюхи голубой в пересчете на рутин (Р=95, n=5)
| Лекарственное растительное сырье | Параметры | |||||||
| f | x | S2 | S | S | t(p,f) | ±X | , % | |
| Корневища с корнями | 4 | 0,091 | 0,00015 | 0,007 | 0,003 | 2,78 | 0,009 | 12,1 |
| Трава | 4 | 0,243 | 0,00017 | 0,0132 | 0,006 | 2,78 | 0,007 | 6,8 |
Изучение характеристик подлинности сырья синюхи голубой
В настоящее время на корневища с корнями синюхи голубой в РФ существуют два нормативных документа – статья 74 ГФ XI и изменение №1 к ГФ XI от 08.07.1998г. Проведенные информационно–аналитические исследования показали, что в разделе «Внешние признаки» дается достаточно подробная характеристика внешнего вида цельного и измельченного сырья. В разделе «Микроскопия» отсутствуют характеристики анатомического строения цельных корневищ синюхи, а также измельченных корневищ с корнями синюхи. Нормативная документация на траву синюхи отсутствует, т.к. данное сырье в официнальной медицине не используется.
В соответствии с современными требованиями к НД на ЛРС было проведено углубленное микроскопическое изучение строения подземных органов синюхи, дана характеристика анатомического строения цельных корневищ. При изучении вариабильности диагностически значимых признаков сырья при измельчении установлено, что диагностическое значение имеют: крупные, тангентально вытянутые клетки первичной коры с неравномерно утолщенными оболочками с каплями жирного масла; изредка встречающиеся мелкие крахмальные зерна, обрывки спиральных, реже сетчатых или лестничных сосудов; крупные клетки эндодермы, клеточные оболочки которой окрашиваются Суданом III; клетки эпидермиса, имеющие тонкие опробковевшие оболочки (рис.9–13).
Рисунок 9. Рисунок 10.
Поперечный срез корня синюхи Синюха голубая. Давленый препарат
Увеличение х 125 корня. Клетки паренхимы. Сосуды
ксилемы. Увеличение х125.
Рисунок 11. Рисунок 12.
Синюха голубая. Синюха голубая.
Давленый препарат корня. Клетки Давленый препарат корня. Клетки
первичной коры. Зерна крахмала. паренхимы. Капли жирного масла.
Увеличение х125. Увеличение х125.
В ходе изучения характеристик подлинности травы синюхи дано описание внешних признаков и анатомического строения цельного и измельченного сырья, определены некоторые числовые показатели.
Исследование жидких лекарственных форм синюхи голубой
Дана характеристика водных извлечений синюхи: отвара корневищ с корнями и настоя травы (прозрачность, цветность, запах, вкус, pH). Хроматографически показано, что водные извлечения синюхи отличаются от исходного сырья по качественному составу сапонинов и флавоноидов. С помощью разработанных методик в водных извлечениях определено содержание суммы тритерпеновых сапонинов в пересчете на – эсцин и суммы флавоноидов в пересчете на рутин (табл.4).
Таблица 4. Содержание биологически активных веществ в сырье и лекарственных формах синюхи голубой
| ЛРС | лекарственная форма | Содержание, % | |
| Сумма сапонинов | Сумма флавоноидов | ||
| Корневища с корнями синюхи | отвар | 1,28±0,11 | 0,100 ± 0,004 |
| жидкий экстракт | 9,44±0,64 | 0,410 ± 0,037 | |
| Трава синюхи | настой | 1,00±0,071 | 0,370 ± 0,035 |
| жидкий экстракт | 7,60±0,57 | 0,960 ± 0,123 | |
Недостатком водных извлечений растительного сырья является ограниченный срок годности (не более 3-х суток), поэтому из изучаемого сырья были получены жидкие экстракты (1:1) и дана их характеристика (описание внешних признаков, прозрачность, цветность, pH, вкус). Жидкие экстракты были стандартизованы в соответствии с требованиями ГФ XI по сухому остатку, содержанию спирта и тяжелых металлов. При хроматографическом изучении качественного состава жидких экстрактов сырья синюхи показано, что в них переходит практически вся сумма тритерпеновых сапонинов и флавоноидов. С помощью достоверных образцов доказано присутствие ликвиритина, рутина и кверцетина. Дана количественная оценка содержания БАВ в изучаемых лекарственных формах синюхи (табл.4).
Изучение фармакологической активности сырья и препаратов
синюхи голубой
С использованием титриметрической методики Т.В.Максимовой с соавт. проведена оценка антиоксидантной активности сырья и лекарственных форм корневищ с корнями и травы синюхи. Показано, что сапонины синюхи не обладают антиоксидантными свойствами. В то же время флавоноиды растения проявляют высокую антиоксидантную активность. Из лекарственных форм наибольшую активность проявляет жидкий экстракт травы синюхи голубой.
На культуре инфузорий Paramecium caudatum было определено мембраностабилизирующее действие полученных препаратов. Установлено, что жидкий экстракт корневищ с корнями синюхи проявляет максимальную мембраностабилизирующую активность в концентрации 110-8. Отвар корневищ с корнями синюхи такой активностью не обладает и в большинстве случаев снижает жизнеспособность клеток. Лекарственные формы травы синюхи проявляли активность в двух разведениях – жидкий экстракт в концентрациях 110-4 и 110-10, настой – 110-3 и 110-9.
Первичная оценка гипогликемического действия проводилась в опытах на здоровых мышах на модели глюкозотолерантного теста. Установлено, что жидкие экстракты корневищ с корнями и травы синюхи, а также очищенная сумма сапонинов корневищ с корнями синюхи проявляли гипогликемические свойства (рис.13). Выраженной гипогликемической активностью обладал жидкий экстракт корневищ с корнями, его эффект развивался через 1 час после попадания в организм, однако являлся коротким по длительности (около 30 минут). Очищенная сумма сапонинов корневищ с корнями синюхи проявляла наименее выраженный, запаздывающий по отношению к глюкозной нагрузке гипогликемический эффект: начало эффекта – через 1,5 часа после попадания в организм, длительность – около 30 мин.
Наиболее благоприятным фармакокинетическим профилем гипогликемической активности обладал жидкий экстракт травы. Гипогликемический эффект жидкого экстракта травы синюхи был достаточно длительным и наиболее физиологичным, начинал проявляться через 60 минут после попадания в организм, обеспечивая снижение уровня гликемии в течение последующих 1,5 часов.
Рисунок 13. Динамика гликемии у животных по данным ГТТ
Сравнение гипогликемической активности жидкого экстракта травы синюхи с действием глибенкламида показало, что экстракт не снижал гликемию натощак и концентрацию глюкозы крови ниже нормальных значений (рис.13), что позволяло избежать риска гипогликемии. Полученные данные дают возможность рассматривать жидкий экстракт травы синюхи в качестве регулятора прандиальной гликемии растительного происхождения.
ВЫВОДЫ
- С использованием современных физико-химических методов анализа проведено углубленное изучение биологически активных веществ синюхи голубой. Показано, что корневища с корнями и трава синюхи имеют различный состав тритерпеновых сапонинов и флавоноидов. Установлено, что в растительном сырье синюхи присутствуют две группы сапонинов, различающиеся по способности к гемолизу эритроцитов крови. В корневищах с корнями синюхи идентифицированы рутин и ликвиритин, в траве – рутин и кверцетин.
- Разработаны методики качественного хроматографического обнаружения тритерпеновых сапонинов и флавоноидов в сырье синюхи голубой.
- Проведено изучение биологически активных веществ синюхи (тритерпеновых сапонинов и флавоноидов) спектральными методами. Показано, что ИК–спектроскопию рациональнее использовать в анализе очищенных индивидуальных тритерпеновых сапонинов. Получен КР–спектр стандартного образца рутина, имеющий максимум в области 8650 см-1 и максимум малой интенсивности в области 7350 см-1, а также КР – спектры сырья и лекарственных форм синюхи. Показана возможность использования метода РСС для идентификации флавоноидов в сырье и лекарственных формах синюхи голубой.
- Оптимизирована спектрофотометрическая методика количественного определения суммы тритерпеновых сапонинов в пересчете на –эсцин в сырье синюхи.
- Разработаны спектрофотометрическая и флуориметрическая методики количественного определения суммы флавоноидов в пересчете на рутин в сырье синюхи.
- С использованием микроскопического метода изучена вариабильность диагностически значимых признаков при измельчении корневищ с корнями синюхи голубой. Установлено, что диагностическое значение имеют обрывки спиральных, реже сетчатых или лестничных сосудов, клетки эпидермиса с тонкими опробковевшими оболочками, крупные клетки эндодермы, оболочка которых окрашивается Суданом III, паренхимные клетки с каплями жирного масла и мелкими крахмальными зернами. Выявленные признаки визуализированы.
- Изучены характеристики подлинности травы синюхи. Выявлены и визуализированы диагностические признаки анатомического строения стебля, листа и цветка синюхи.
- Из корневищ с корнями и травы синюхи получены жидкие экстракты (1:1) и проведена их стандартизация. Сравнительным анализом показано, что жидкие экстракты являются более рациональной лекарственной формой по сравнению с водными извлечениями, т.к. в них переходит максимальное количество сапонинов и флавоноидов, содержащихся в растительном сырье.
- Установлено наличие антиоксидантного, мембраностабилизируещего и гипогликемического действия лекарственных форм корневищ с корнями и травы синюхи голубой.
- Материалы исследований были использованы при разработке проекта ФС «Корневища с корнями синюхи» для Государственной Фармакопеи XII издания.
Основное содержание диссертационной работ отражено в публикациях:
- Мальцева А.А., Брежнева Т.А., Боева С.А., Сливкин А.И., Бузлама А.В., Мироненко Н.В. Получение сапонинсодержащего препарата синюхи голубой, его стандартизация и первичная оценка гипогликемического действия // Труды молодых ученых ВГУ.-2006.-№1-2.-с.99-102.
- Мальцева А.А., Брежнева Т.А., Сливкин А.И., Мироненко Н.В. Исследование возможности количественного определения сапонинов синюхи голубой методом УФ-спектрофотометрии // Науч. Труды VII Международн. Науч.-практич. Конф. «Здоровье и образование в ХХIвеке». - М. 2006.- 23-26 ноября 2006г. -Т.1.-–с.320-321.
- Мальцева А.А., Брежнева Т.А., Боева С.А., Сливкин А.И., Селеменев В.Ф., Мироненко Н.В. Получение и стандартизация сапонинсодержащего препарата синюхи голубой //Сорбционные и хроматографические процессы. - Воронеж.-2006.-т.6, вып.6.- ч.4.- с.1450-1454.
- Мальцева А.А., Боева С.А., Брежнева Т.А., Бузлама А.В., Сливкин А.И. Сапонины растений Beta vulgaris L. и Polemonium coeruleum L. особенности получения, сравнительная оценка гипогликемической активности // Вестник Воронеж. Гос. Ун-та. Сер. Химия, биология, фармация. - Воронеж. – 2007, №1.- с.99-102.
- Мальцева А.А., Брежнева Т.А., Боева С.А., Сливкин А.И., Мироненко Н.В. Исследование возможности количественного определения тритерпеновых сапонинов методом УФ-спектрофотометрии // Вестник Воронеж. Гос. Ун-та. Сер. Химия, биология, фармация. - Воронеж, 2007, - №2. с.142-144.
- Мальцева А.А., Брежнева Т.А., Сливкин А.И., Селеменев В.Ф., Мироненко Н.В. Хроматографическое исследование сапонинного состава растительного сырья и фитопреператов синюхи голубой // Сорбционные и хроматографические процессы. - Воронеж. - 2007.- т.7, вып.4.- с.695-698.
- Мальцева А.А., Брежнева Т.А., Мироненко Н.В., Боева С.А. Количественное определение тритерпеновых сапонинов в некоторых видах лекарственного растительного сырья //Материалы 3-й Всерос.науч.-метод. конф. «Фармобразование-2007». - Воронеж. 2007 - 22-24 марта 2007г.,- ч.1.- с.80-81.
- Мальцева А.А., Брежнева Т.А., Сливкин А.И. Получение и исследование экстракционных фитопрепаратов синюхи голубой //. Материалы 3-й Всерос.науч.-метод. конф. «Фармобразование-2007». - Воронеж. 2007- 22-24 марта 2007г.,- ч.1- с.222-224.
- Мальцева А.А., Брежнева Т.А.,Сливкин А.И. Сравнительное исследование сапонинного состава высушенных подземных и надземных частей растения Polemonium coeruleum L. // Материалы 3-й Всерос.науч.-метод. конф. «Фармобразование-2007». - Воронеж. 2007- 22-24 марта 2007г.,- ч.1.- с.225-227
- Мальцева А.А., Брежнева Т.А., Сливкин А.И. Исследование сапонинного состава экстракционных препаратов синюхи голубой //Всероссийский национальный конгресс «Человек и лекарство». Тез. докл. – М. 2007.- 16-20 апреля 2007г. - с.844.
- Мальцева А.А., Бакалова Н.В., Брежнева Т.А., Сливкин А.И. Определение флавоноидов в лекарственном растительном сырье синюхи голубой // Проблемы здоровьесбережения школьников и студентов. Новые научные тенденции в медицине и фармации: материалы межрегион. Науч.-практ. Юбилейной конф. - Воронеж. – 2008.- 6-7 февраля 2008 г. – с.290-292.
- Мальцева А.А., Андриенкова А.В., Брежнева Т.А., Сливкин А.И. Исследование возможности количественного определения сапонинов синюхи голубой методом хроматоспектрофотометрии //Проблемы здоровьесбережения школьников и студентов. Новые научные тенденции в медицине и фармации: материалы межрегион. Науч.-практ. Юбилейной конф. - Воронеж.- 2008. - 6-7 февраля 2008 г. – с.287-289.
- Мальцева А.А., Брежнева Т.А., Бузлама А.В., Сливкин А.И. Изучение гипогликемизирующей активности сапонинов растения Polemonium coeruleum L. //«Здоровье и образование в ХХI веке». Науч. тр. IX междунар. Конгресса. – М. 2008. 27-30 ноября 2008 г.- с.385.
- Мальцева А.А., Брежнева Т.А., Бузлама А.В., Сливкин А.И. Получение, стандартизация и исследование фармакологической активности сапонинсодержащего препарата синюхи голубой // «Науки о человеке». Материалы Х конгресса молодых ученых и специалистов. – Томск: СибГМУ. – 2009.- с.118-119.
- Мальцева А.А., Гвоздевский П.А. Определение некоторых групп БАВ в растительном сырье Polemonium coeruleum L. // Разработка, исследование и маркетинг новой фармацевтической продукции: сб.науч.тр.- Пятигорск: Пятигорская ГФА.- 2009. - Вып.64.-с.81-82.
- Мальцева А.А., Брежнева Т.А., Камаева Г.М., Сливкин А.И. Микроскопическое исследование листьев Polemonium coeruleum L // Всероссийский национальный конгресс «Человек и лекарство». Тез. Докл. – М., 2009.-с.695.
- Мальцева А.А., Гвоздевский П.А., Брежнева Т.А., Сливкин А.И. Флавоноиды растения Polemonium coeruleum L. и предварительная оценка их антиоксидантной активности // Разработка, исследование и маркетинг новой фармацевтической продукции: сб.науч.тр.- Пятигорск: Пятигорская ГФА. - 2010.- Вып.65.-с.89-90.
- Мальцева А.А., Сорокина А.А., Брежнева Т.А., Сливкин А.И. Оценка гипогликемического действия препарата синюхи голубой //Фармация.-2010.-№2.-с.18-20.
- Мальцева А.А., Сорокина А.А., Брежнева Т.А., Сливкин А.И. Выбор оптимальных условий хроматографирования флавоноидов растения Polemonium coeruleum L.//Материалы 4-й Всерос.науч.-метод. конф. «Фармобразование-2010». – Воронеж. – 2010.- 20-22 апреля 2010г. - ч.2.-с.371-373.
- Мальцева А.А., Сорокина А.А., Брежнева Т.А., Сливкин А.И. Получение жидких экстрактов (1:1) корневищ с корнями синюхи голубой // Материалы 4-й Всерос.науч.-метод. конф. «Фармобразование-2010». – Воронеж.- 2010. - 20-22 апреля 2010г. - ч.2.- с.369-370.
- Мальцева А.А., Сорокина А.А. Синюха голубая: химический состав, фармакологические свойства // Фармация.-2010.-№5 - с. 54-56.
