Получение и стандартизация нового пробиотика хилафор
На правах рукописи
ШЕВЕЛЕВА
Мария Александровна
ПОЛУЧЕНИЕ И СТАНДАРТИЗАЦИЯ НОВОГО ПРОБИОТИКА
«ХИЛАФОР»
14.04.02 - фармацевтическая химия, фармакогнозия
АВТОРЕФЕРАТ
диссертации на соискание ученой степени
кандидата фармацевтических наук
МОСКВА - 2010
Работа выполнена в ГОУ ВПО Московская медицинская академия имени
И.М. Сеченова
Научный руководитель: доктор фармацевтических наук, профессор
Галина Владиславовна Раменская
Официальные оппоненты:
Доктор фармацевтических наук,
профессор Татьяна Александровна Сокольская
Кандидат фармацевтических наук Андрей Семенович Михалев
Ведущая организация: Институт по изысканию новых антибиотиков им. Г.Ф. Гаузе РАМН.
Защита диссертации состоится «___»______________2010 г. в____часов на заседании Диссертационного Совета Д.208.040.09 при Московской Медицинской Академии имени И.М.Сеченова по адресу: 119019, Москва, Никитский бульвар, 13.
С диссертацией можно ознакомиться в Центральной Научной Медицинской Библиотеке ММА имени И.М.Сеченова по адресу: 117998, г. Москва, Нахимовский проспект, 49.
Автореферат разослан «____» ___________ 2010 г.
Ученый секретарь
Диссертационного Совета,
доктор фармацевтических наук,
профессор Наталья Петровна Садчикова
ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ
Актуальность темы. Известно, что микрофлора организма человека принимает участие в поддержании его гомеостаза и осуществлении многих важных физиологических функций, обеспечивающих нормальную жизнедеятельность. При чрезмерном воздействии повреждающих факторов компенсаторные возможности системы "организм человека - нормальная микрофлора" истощаются, формируются нарушения микробно-тканевых взаимоотношений, изменяется кишечный состав нормофлоры, развиваются различные заболевания [Ардатская М.Д. и соавт., 2004].
Проблема коррекции изменённого микробиоценоза желудочно-кишечного тракта и его гомеостаза является одной из самых важных в современной клинической и профилактической медицине. Для поддержания нормофлоры применяются различные группы пробиотических, пребиотических и синбиотических препаратов [Белоусова Е.А., 2009]. Несмотря на довольно широкое использование, бактериальные препараты на основе живых микроорганизмов не всегда оказываются высокоэффективными. Это связано, с одной стороны, с быстрой элиминацией вводимых в агрессивную среду штаммов из-за высокой толерантности иммунной системы к собственной микрофлоре. С другой – при попадании в желудочно-кишечный тракт активизируется лишь 5% лиофилизированных бактерий, представляющих основу пробиотика.
Решение проблем коррекции дисбактериозов может заключаться в разработке и внедрении в клиническую практику принципиально новых препаратов, созданных на основе микробных метаболитов, названных по новой классификации пробиотиками метаболитного типа. Такие препараты реализуют свое положительное влияние на физиологические функции и биохимические реакции организма либо непосредственно вмешиваясь в метаболическую активность клеток соответствующих органов и тканей, либо опосредованно через регуляцию функционирования биопленок на слизистых оболочках организма.
Контроль и стандартизация данной группы препаратов осуществляется на основании качественного и количественного анализа состава с помощью физико-химических методов. Основными метаболитами бактерий, содержащимися в пробиотических препаратах, являются короткоцепочечные жирные кислоты (КЦЖК): уксусная, пропионовая, масляная, изомасляная, валериановая, изовалериановая [Bouhnik Y., 2004].
Уксусная кислота обеспечивает антимикробный эффект, участвует в липогенезе, регулирует рН в полости кишечника и моторику желудочно-кишечного тракта, поступает в ткани в качестве энергетического субстрата [Осипов Г.А., 2008]. Пропионовая кислота включается в гликонеогенез. В дистальных отделах толстой кишки масляная кислота, подвергаясь внутриклеточному окислению, является основным энергетическим субстратом для клеток слизистой оболочки [Chalhoub E., 2007].
В литературе широко представлены методы определения короткоцепочечных жирных кислот, однако их использование в оценке качества конкретных препаратов не всегда дает удовлетворительные результаты [Костюкевич О.И., 2007].
В связи с неблагоприятной экологической обстановкой, частыми нарушениями метаболизма в организме человека и распространенностью дисбактериотических заболеваний создание отечественного метаболитного пробиотика для коррекции и поддержания гомеостаза организма человека является актуальной задачей.
Все вышесказанное определило цель и задачи настоящего исследования.
Целью исследования являлось получение метаболитного пробиотика «Хилафор» и разработка методов его стандартизации.
Задачи исследования:
- предложить состав метаболитного пробиотика, содержащего продукты жизнедеятельности бактерий, оказывающих положительное влияние на физиологические и биохимические функции организма человека;
- разработать методику совместного количественного определения КЦЖК различными физико-химическими методами;
- оценить возможность применения методов высокоэффективной жидкостной и газовой хроматографии в контроле качества препаратов, содержащих КЦКЖ, провести метрологическую оценку разработанных методик;
- с помощью предложенного метода количественного анализа провести определение КЦЖК в образцах препарата с целью выявления оптимального состава с наибольшим их содержанием;
- определить подходы к стандартизации препарата «Хилафор»;
- разработать нормативную документацию на метаболитный пробиотик «Хилафор».
Научная новизна результатов исследования.
Впервые предложен новый отечественный пробиотик «Хилафор», направленный на поддержание гомеостаза организма человека, не имеющий аналогов на отечественном фармацевтическом рынке.
Разработаны методики анализа и подходы к стандартизации по содержанию действующих веществ. Обоснован выбор состава и нормативные показатели его качества.
Внедрение результатов в практику.
На основании проведенных исследований был выбран оптимальный состав пробиотика «Хилафор». Результаты по разработке методики анализа короткоцепочечных жирных кислот вошли в нормативную документацию на пробиотик «Хилафор» (производства ЗАО «Партнер», г.Москва).
Апробация работы.
Апробация работы проведена на научно-практической конференции фармацевтического факультета ММА им. И.М. Сеченова (май 2010). Основные результаты работы доложены на межвузовской научной конференции студентов и молодых ученых «Фармация в XXI веке: эстафета поколений» (Санкт-Петербург, апрель 2009 г.); VII международной научно-практической конференции и выставке «Технологии и продукты здорового питания. Функциональные пищевые продукты» (Москва, октябрь 2009 г.); XI Всероссийском Конгрессе диетологов и нутрициологов «Питание и здоровье» (Москва, декабрь 2009 г.); XVII Российском Национальном Конгрессе "Человек и Лекарство" (Москва, апрель 2010).
Публикации. По материалам исследования опубликовано 6 печатных работ (2 из них в изданиях, рекомендованных ВАК РФ).
Связь исследования с проблемным планом фармацевтических наук.
Диссертационная работа выполнена в рамках комплексной темы кафедры фармацевтической химии с курсом токсикологической химии фармацевтического факультета ММА им. И.М. Сеченова «Совершенствование контроля качества лекарственных средств (фармацевтические и экологические аспекты)» (№ государственной регистрации 01.2.006 06352).
Основные положения, выносимые на защиту:
- методика определения КЦЖК, позволяющая с необходимой чувствительностью и селективностью проводить качественный и количественный анализ при их совместном присутствии в пробиотическом препарате;
- результаты по выбору оптимального состава отечественного пробиотика «Хилафор»;
- подходы к стандартизации препарата «Хилафор» и оценке его качества.
Объем и структура диссертации. Диссертация изложена на 122 страницах машинописного текста и состоит из введения, обзора литературы, экспериментальной части, выводов, списка цитируемой литературы из 143 названий (94 из которых зарубежные). Работа иллюстрирована 19 таблицами и 44 рисунками.
ОСНОВНОЕ СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ
Состав пробиотика.
| дрожжевой экстракт гидролизат казеина натрий фосфорнокислый однозамещенный ГОСТ 245-76 калий фосфорнокислый однозамещенный ГОСТ 4198-75 ортофосфорная кислота ГОСТ 6552-80 лимонная кислота ГОСТ 908-2004 калия сорбат молочная кислота ГОСТ 490-79 краситель сахарный колер IV (Е 150d) натуральный или идентичный натуральному ароматизатор «Яблоко» | ||
| Состав № 1 фильтрат бифидобактерий Bifidobacterium bifidum | Состав № 2 фильтрат бифидобактерий Bifidobacterium bifidum фильтрат лактобактерий Lactobacillus acidophilus и Lactobacillus plantarum | Состав № 3 фильтрат бифидобактерий Bifidobacterium bifidum фильтрат лактобактерий Lactobacillus acidophilus и Lactobacillus plantarum фильтрат энтерококка Enterococcus faecium |
Оборудование и реактивы
Анализ состава пробиотика проводили с помощью капиллярного электрофореза на автоматизированной системе 3D CE Agilent Technologies (США) с широкодиапазонным спектральным детектором на основе диодной матрицы. Для проведения исследований методом высокоэффективной жидкостной хроматографии (ВЭЖХ) была использована система: жидкостной хроматограф Agilent 1100 Series с дегазатором, насосом, обеспечивающим одновременную подачу 2-х растворителей, устройством для автоматического ввода проб (автосемплером) с термостатом (температура образцов в лотке 15°С), термостатом хроматографических колонок, фотодиодноматричным детектором. Разделение проводилось на колонке Atlantis C18, 4,6*250 мм, с диаметром частиц 5 мкм. Для газохроматографического анализа применяли газовый хроматограф Agilent 7890A с устройством для автоматического ввода проб (автосемплером), термостатом хроматографических колонок, пламенно-ионизационным детектором (ПИД) и газовый хроматограф Perichrom 2100 (Франция) с устройством для автоматического ввода проб (автосемплером), термостатом хроматографических колонок, пламенно-ионизационным детектором (ПИД). В качестве неподвижной фазы использовалась колонка Agilent 19095N 240C, 30 м*530 мкм*1 мкм HP-INNOWax Polyethylenglycol.
Применялось следующее вспомогательное оборудование: весы Sartorius BP 121S; рН-метр Metter Toledo MP220; ультразвуковой генератор, дистиллятор ДЭ-10; орбитальный шейкер BIOSAN OS-10.
При приготовлении подвижных фаз и пробоподготовки использовались: ортофосфорная кислота «ХЧ»; калия дигидрофосфат «ХЧ»; серная кислота «ХЧ»; диэтиловый эфир «ХЧ»; аммония сульфат «ХЧ»; вода дистиллированная.
Стандартные образцы
При разработке методик и проведении аналитических исследований по содержанию короткоцепочечных жирных кислот нами были использованы коммерчески доступные стандартные образцы уксусной кислоты, пропионовой кислоты, масляной кислоты, изомасляной кислоты, валериановой кислоты, изовалериановой кислоты, производства компаний Fluka и Supelko.
Приготовление модельной смеси стандартов кислот
Последовательно, в мерную колбу вместимостью 10,0 мл отвешивали и переносили 50,0 мг изовалериановой кислоты, 50,0 мг валериановой кислоты, 50,0 мг масляной кислоты, 50,0 мг изомасляной кислоты, 50,0 мг пропионовой кислоты, 50,0 мг уксусной кислоты. Доводили дистиллированной водой до метки (раствор А). Концентрация каждой КЦКЖ в растворе 5 мг/мл. Стандартные растворы хранили при - 25°C не более 6 месяцев.
Приготовление рабочих растворов стандартных растворов
Для приготовления рабочих стандартных растворов с концентрацией 200 и 400 мкг/мл 200 мкл, 400 мкл раствора A соответственно, помещали в мерную колбу вместимостью 10,0 мл. Доводили дистиллированной водой до метки (раствор Б). Рабочий стандартный раствор хранили в холодильнике при температуре 1-2°C не более месяца.
Обработка полученных результатов
Для оценки пригодности хроматографической системы рассчитывали следующие параметры: коэффициент емкости (k’), число теоретических тарелок (N), коэффициент асимметрии (As), селективность () и степень разделения (R). Для вычисления этих показателей использовали алгоритмы программы обработки хроматографических данных ChemStations, Agilent и общие фармакопейные статьи USP30 и ВР2009. Статистическая обработка результатов количественного определения проводилась в соответствии с требованиями ГФ XI. При статистической обработке оценивались следующие параметры: среднее выборки (Хср), дисперсия (s2), стандартное отклонение (s), доверительный интервал (х ср), относительная погрешность (), для решения вопроса о наличии или отсутствии систематической ошибки вычисляли критерий Стьюдента (t), если рассчитанный коэффициент Стьюдента был больше табличного значения, то рассчитывали систематическую ошибку ().
Качественный и количественный анализ короткоцепочечных жирных кислот.
При выборе методов анализа была использована методика определения органических кислот методом капиллярного электрофореза, так как полученные результаты не удовлетворяли поставленной задаче, не удалось добиться четкого разделения пиков и получить количественную характеристику действующих веществ (Рис. 1).
Рис.1. Электрофореграмма определения КЦЖК в пробиотике «Хилафор».
Метод ВЭЖХ.
Приготовление буфера.
0,10 г калия дигидрофосфата растворяли в 80 мл дистиллированной воды, прибавляли ортофосфорную кислоту до рН 2,5 и доводили объем дистиллированной водой до 100 мл, фильтровали через фильтр с размером пор 45 мкм.
Пробоподготовка.
В мерную колбу вместимостью 10 мл помещали 200 мкл раствора Б и доводили дистиллированной водой до метки. Для лучшей экстракции пробы помещали сначала на шейкер, а затем в УЗ-баню. Затем пробы центрифугировали и отбирали 1 мл в виалки для дальнейшего анализа на ВЭЖХ (Рис. 2).
Рис. 2. Хроматограмма модельной смеси короткоцепочечных жирных кислот методом ВЭЖХ (1 – уксусная кислота; 2 – пропионовая кислота; 3 – изомасляная кислота; 4 – масляная кислота; 5 – изовалериановая кислота; 6 - валериановая кислота).
Таблица 1
Параметры разделения КЦКЖ при определении методом высокоэффективной жидкостной хроматографии
| Компоненты смеси | tR, мин | K | N | R | |
| Уксусная кислота | 5,83 | 1,3320 | 17373 | 2,8288 1,3747 1,2278 1,0377 1,1151 | 4,35 2,94 2,46 0,50 1,36 |
| Пропионовая кислота | 11,92 | 3,7680 | 18637 | ||
| Изомасляная кислота | 15,45 | 5,1800 | 46890 | ||
| Масляная кислота | 18,40 | 6,3600 | 11722 | ||
| Изовалериановая кислота | 19,00 | 6,6000 | 7180 | ||
| Валериановая кислота | 20,90 | 7,3600 | 4986 |
Параметры разделения КЦКЖ при определении методом высокоэффективной жидкостной хроматографии представлены в таблице 1.
Предел обнаружения короткоцепочечных жирных кислот составил 10 мкг/мл, предел количественного определения 15-30 мкг/мл, линейность наблюдалась в диапазоне концентраций от 10 до 1000 мкг/мл, коэффициент корреляции был близок к единице.
Метод анализа короткоцепочечных жирных кислот.
ВЭЖХ анализ проводили в сравнении со стандартом. Приготовленную пробу помещали в термостат вместе со стандартом. Объём ввода 20 мкл. Длина волны 210 нм. Подвижная фаза: фосфатный буфер. Колонка: Atlantis C18, 4,6*250 мм, 5 мкм; скорость потока – 0,9 мл/мин. Общее время анализа составляло 25 минут. Ошибка метода ± 10%.
Рис. 3. Хроматограмма определения короткоцепочечных жирных кислот методом ВЭЖХ в разрабатываемом препарате (1 – уксусная кислота; 2 – пропионовая кислота; 3 – изомасляная кислота; 4 – масляная кислота; 5 – изовалериановая кислота; 6 - валериановая кислота).
На рис. 3 представлена хроматограмма определения короткоцепочечных жирных кислот методом ВЭЖХ в разрабатываемом препарате. Представленная хроматограмма показывает возможность использования данного метода количественного и качественного определения короткоцепочечных жирных кислот. Однако для исследуемого пробиотического средства многокомпонентного состава не удалось добиться хорошего разделения веществ, так как при данных условиях определяются и другие компоненты продукта. Крайне тяжело обнаружить органические соединения в следовых концентрациях. Хроматографическое определение короткоцепочечных кислот в препарате ограничено эффективностью и селективностью отделения соответствующего пика от пиков других органических кислот, а также некоторых слабоионизированных и нейтральных соединений, например углеводов и спиртов.
Газохроматографическая методика количественного определения КЦЖК с использованием анализа паровой фазы над жидкостью.
Пробоподготовка.
Органический экстракт готовили следующим образом: к 100 мкл стандартного раствора каждой кислоты добавляли 150 мкл метанола и 5 мл дистиллированной воды, доводили концентрированной серной кислотой до рН 1,0. Кипятили на водяной бане для проведения полной дериватизации в течение 30 мин. Полученные пробы ставили в автосамплер, а отобранная паровая фаза вводилась в газовый хроматограф.
Все пробы инкубировали в течение 1 минуты в парофазном автосамплере при температуре 200°C. Анализ проводили при различных температурных режимах. Первый температурный режим: в инжекторе температура устанавливалась на отметке 200°C, эта же температура оставалась постоянной на протяжении всего анализа. Второй температурный режим: начиная с 80°C, 1мин задержки, далее температура поднималась до 150°C со скоростью 10°C/мин, 1 мин задержки, далее - со скоростью 5°C/мин до 220°С. Третий температурный режим: начиная с 60°C, 5 мин задержки, далее температура поднималась до 90°C со скоростью 10°C/мин, 1 мин задержки, далее - со скоростью 5°C/мин до 220°C. При подборе температурных условий в данном режиме начальная температура устанавливалась и на отметке 50°C и 40°C. Оптимальная начальная температура оказалась 60°C.
Наилучшее разделение пиков наблюдалось при использовании третьего температурного режима. На рис. 4 представлена хроматограмма модельной смеси метанольного извлечения.
Рис. 4. Хроматограмма модельной смеси метанольного извлечения.
Таблица 2
Параметры разделения КЦКЖ в условиях газохроматографического
определения метанольного извлечения
| Компоненты смеси | tR, мин | K | N | R | |
| Уксусная кислота | 8,92 | 0,6043 | 141824 | 1,6906 1,1021 1,4233 1,1650 1,3333 | 2,50 21,50 6,08 6,40 4,29 |
| Пропионовая кислота | 11,24 | 1,0216 | 13850 | ||
| Изомасляная кислота | 11,82 | 1,1259 | 11219 | ||
| Масляная кислота | 14,47 | 1,6025 | 13850 | ||
| Изовалериановая кислота | 15,94 | 1,8669 | 40027 | ||
| Валериановая кислота | 19,40 | 2,4892 | 23406 |
Параметры разделения КЦКЖ в условиях газохроматографического определения метанольного извлечения представлены в таблице 2. Предел обнаружения короткоцепочечных жирных кислот составил 0,1 мкг/мл, предел количественного определения 0,2 мкг/мл, линейность наблюдалась при концентрациях от 0,2 до 1000 мкг/мл, коэффициент корреляции был близок к единице. Метрологические характеристики методики определения короткоцепочечных жирных кислот газохроматографическим методом с использованием паровой фазы представлены в таблице 3.
Таблица 3
Метрологические характеристики методики определения короткоцепочечных жирных кислот методом газовой хроматографии с использованием паровой фазы t(0,95; 9) = 2,26
| Вещество | Х, мкг/мл | s2 | s | x | |
| Уксусная кислота | 99,78 | 1,92 | 1,39 | 0,35 | 0,35 |
| Пропионовая кислота | 124,59 | 1,20 | 1,10 | 0,26 | 0,21 |
| Изомасляная кислота | 94,19 | 3,69 | 1,92 | 0,48 | 0,51 |
| Масляная кислота | 90,89 | 9,52 | 3,08 | 0,77 | 0,85 |
| Изовалериановая кислота | 111,20 | 13,63 | 3,69 | 0,93 | 0,84 |
| Валериановая кислота | 115,08 | 5,62 | 2,37 | 0,60 | 0,52 |
Как видно из представленных результатов полученное разделение КЦКЖ с помощью газовой хроматографии с использованием анализа паровой фазы может применяться при количественном определении данных кислот.
Газохроматографическая методика количественного определения КЦЖК с использованием эфирной экстракции.
Пробоподготовка.
Для приготовления растворов КЦЖК помещали 100 мкл стандартного раствора каждой кислоты в мерную колбу вместимостью 10 мл и доводили до метки дистиллированной водой. Отбирали 200 мкл каждого раствора кислоты, прибавляли 6 г аммония сульфата, перемешивали до полного растворения вещества, доводили концентрированной серной кислотой до рН 1,0-2,0. К полученной смеси прибавляли 1 мл эфира, перемешивали в течение 10 мин, используя BIOSAN OS-10 Orbital Shaker, охлаждали, отбирали эфирный слой и вводили в хроматограф.
При разработке данной методики оптимального разделения КЦЖК анализ проводили при различных температурных режимах. Первый температурный режим: устанавливали температуру в инжекторе 200°C, которая оставалась постоянной на протяжении всего анализа. Второй температурный режим: в течение 1 мин температура оставалась на отметке 120°C, в течение 10 мин температура поднималась до 250°C и держалась в течение 5 мин. Третий температурный режим: начиная с 80°C, 1мин задержки, далее температура поднималась до 150°C со скоростью 10°C/мин, 1 мин задержки, далее - со скоростью 5C/мин до 220°C. Наилучшее разделение пиков было получено при использовании последнего температурного режима.
Рис. 5. Хроматограмма модельной короткоцепочечных жирных кислот.
Таблица 4
Параметры разделения КЦКЖ в условиях газохроматографического
определения при эфирном извлечении
| Компоненты смеси | tR, мин | K | N | R | |
| Уксусная кислота | 10,73 | 2,3168 | 13850 | 1,1966 1,0555 1,1209 1,0722 1,1137 | 7,5 16 14,9 30,40 1,17 |
| Пропионовая кислота | 12,22 | 2,7723 | 35456 | ||
| Изомасляная кислота | 12,71 | 2,9262 | 319104 | ||
| Масляная кислота | 13,88 | 3,2800 | 293066 | ||
| Изовалериановая кислота | 14,64 | 3,5169 | 977256 | ||
| Валериановая кислота | 15,98 | 3,9169 | 10772544 |
Параметры разделения КЦКЖ в условиях газохроматографического определения при эфирном извлечении представлены в таблице 4.
Предел обнаружения короткоцепочечных жирных кислот составил 0,05 мкг/мл, предел количественного определения 0,05 мкг/мл, линейность наблюдалась при концентрациях от 0,05 до 1000 мкг/мл, коэффициент корреляции был близок к единице. Метрологические характеристики методики определения короткоцепочечных жирных кислот в условиях газохроматографического определения при эфирном извлечении представлены в таблице 5.
Таблица 5
Метрологические характеристики методики определения короткоцепочечных жирных кислот методом газовой хроматографии при использовании эфирной экстракции t(0,95; 9) = 2,26
| Вещество | Х, мкг/мл | s2 | s | x | |
| Уксусная кислота | 105,52 | 0,46 | 0,68 | 0,17 | 0,16 |
| Пропионовая кислота | 96,45 | 1,00 | 1,00 | 0,25 | 0,26 |
| Изомасляная кислота | 91,19 | 1,33 | 1,15 | 0,29 | 0,27 |
| Масляная кислота | 93,76 | 0,22 | 0,46 | 0,30 | 0,12 |
| Изовалериановая кислота | 90,25 | 4,75 | 2,18 | 0,55 | 0,61 |
| Валериановая кислота | 105,48 | 20,32 | 4,51 | 1,13 | 1,07 |
Данные статистической обработки полученных результатов, показывают, что методика характеризуется необходимой точностью и воспроизводимостью.
Анализ полученных в ходе эксперимента данных позволил сделать вывод о возможности применения данного метода для определения короткоцепочечных жирных кислот в пробиотических препаратах.
Выбор метода качественного и количественного определения КЦЖК.
В результате проделанных экспериментов для качественного и количественного анализа КЦЖК был выбрана методика газовохроматографического определения с использованием эфирной экстракции. Выбор основан на лучшей степени разделения веществ и эффективности метода. Время анализа занимает меньше времени, чем в газохроматографическом определении с использованием парофазного ввода пробы. Длительность и простота пробоподготовки превосходит данные параметры другого метода.
С помощью выбранной методики для качественного и количественного определения КЦЖК сначала были проанализированы отдельные фильтраты.
Пробоподготовка.
10,0 мл фильтрата помещали во флакон, объемом 20 мл с завинчивающейся крышкой, добавляли 6,0 г аммония сульфата, доводили концентрированной серной кислотой до рН 1,0, интенсивно встряхивали до полного растворения соли. Прибавляли 1 мл диэтилового эфира, перемешивали в течение 10 мин, используя BIOSAN OS-10 Orbital Shaker, охлаждали, отбирали эфирный слой, непосредственно который вводили в хроматограф.
На рис. 6 представлена хроматограмма КЦЖК в фильтрате бифидобактерий. Основным метаболитом бифидобактерий, в частности Bifidobacterium bifidum, является уксусная кислота. Концентрация уксусной кислоты в фильтрате бифидобактерий составила 1474,37 мкг/мл. Кроме уксусной кислоты в фильтрате бифидобактерий были обнаружены и другие КЦЖК (таб. 6).
Рис. 6. Хроматограмма КЦЖК в фильтрате бифидобактерий.
Таблица 6
Содержание КЦЖК в фильтрате бифидобактерий
| Фильтрат бифидобактерий | Концентрация в фильтрате, мкг/мл |
| Уксусная кислота | 1474,37±389,48 |
| Пропионовая кислота | 3,98±0,86 |
| Изомасляная кислота | 4,27±1,06 |
| Масляная кислота | 4,85±1,28 |
| Изовалериановая кислота | 1,52±0,24 |
| Валериановая кислота | 0,57±0,19 |
На рис. 7 представлена хроматограмма КЦЖК в фильтрате лактобактерий. Основными метаболитами Lactobacillus acidophilus и Lactobacillus plantarum, являются уксусная кислота, изомасляная кислота масляная кислота, изовалериановая кислота (таб. 7).
Рис. 7. Хроматограмма КЦЖК в фильтрате лактобактерий.
Таблица 7
Содержание КЦЖК в фильтрате лактобактерий
| Фильтрат лактобактерий | Концентрация в фильтрате, мкг/мл |
| Уксусная кислота | 256,92±27,45 |
| Пропионовая кислота | 4,97±1,39 |
| Изомасляная кислота | 7,75±2,84 |
| Масляная кислота | 18,26±4,61 |
| Изовалериановая кислота | 9,054±3,270 |
| Валериановая кислота | - |
На рис. 8 представлена хроматограмма КЦЖК в фильтрате энтеробактерий. Основными метаболитами Enterococcus faecium, являются уксусная кислота, изомасляная кислота, масляная кислота, изовалериановая кислота (таб. 8).
Рис. 8. Хроматограмма КЦЖК в фильтрате энтеробактерий.
Таблица 8
Содержание КЦЖК в фильтрате энтеробактерий
| Фильтрат энтеробактерий | Концентрация в фильтрате, мкг/мл |
| Уксусная кислота | 107,38±10,38 |
| Пропионовая кислота | - |
| Изомасляная кислота | 1,26±0,07 |
| Масляная кислота | 57,38±6,29 |
| Изовалериановая кислота | 1,06±0,18 |
| Валериановая кислота | - |
Качественное и количественное определение КЦЖК в разработанных рецептурах методом газовой хроматографии.
Далее предложенная методика количественного определения была использована для анализа КЦЖК в разработанных препаратах разного состава.
Пробоподготовка.
10,0 мл испытуемого образца помещали во флакон, объемом 20 мл с завинчивающейся крышкой, добавляли 6,0 г аммония сульфата, доводили концентрированной серной кислотой до рН 1,0, интенсивно встряхивали до полного растворения соли. Затем добавляли 1 мл диэтилового эфира, перемешивали в течение 10 мин, используя шейкер BIOSAN OS-10 Orbital Shaker. Флакон охлаждали и давали отстояться до разделения фаз, после чего из верхнего эфирного слоя отбирали 1 мкл, который непосредственно вводили в хроматограф.
На рис. 9 представлена хроматограмма определения КЦЖК в образце состава №1, а в таблице 9 представлено содержание обнаруженных КЦЖК.
Рис. 9. Хроматограмма определения КЦЖК в испытуемом образце, состав №1.
Таблица 9
Определение содержания КЦЖК в образце, состав №1
| КЦЖК | Концентрация в образце, мкг/мл |
| Уксусная кислота | 10994,38±2647,04 |
| Пропионовая кислота | 1,9±0,28 |
| Изомасляная кислота | - |
| Масляная кислота | 3,25±0,72 |
| Изовалериановая кислота | - |
| Валериановая кислота | - |
На рис. 10 представлена хроматограмма определения КЦЖК в образце состава №2, а в таблице 10 представлено содержание обнаруженных КЦЖК.
Рис. 10. Хроматограмма определения КЦЖК в испытуемом образце, состав №2.
Таблица 10
Определение содержания КЦЖК в образце, состав №2
| КЦЖК | Концентрация в образце, мкг/мл |
| Уксусная кислота | 10874,29±1368,05 |
| Пропионовая кислота | - |
| Изомасляная кислота | 10,12±1,97 |
| Масляная кислота | 15,14±2,89 |
| Изовалериановая кислота | 10,56±1,24 |
| Валериановая кислота | 5,15±1,73 |
На рис. 11 представлена хроматограмма определения КЦЖК в образце состава №3, а в таблице 11 представлено содержание, обнаруженных КЦЖК.
Рис. 11. Хроматограмма определения КЦЖК в испытуемом образце, состав №3.
Таблица 11
Определение содержания КЦЖК в образце, состав №3
| КЦЖК | Концентрация в образце, мкг/мл |
| Уксусная кислота | 15629,77±5894,10 |
| Пропионовая кислота | 1,59±0,14 |
| Изомасляная кислота | 3,767±1,05 |
| Масляная кислота | 90,88±10,73 |
| Изовалериановая кислота | 9,38±3,59 |
| Валериановая кислота | 3,21±1,11 |
Наиболее важными кислотами для метаболизма в организме человека являются уксусная и масляная кислоты. Максимальное их содержание получено при приготовлении образца состава №3. В результате проведенных исследований для последующего внедрения был выбран состав, в котором получается наибольший объем действующих веществ – короткоцепочечных жирных кислот.
ОБЩИЕ ВЫВОДЫ
- Предложен состав метаболитного пробиотика «Хилафор», обеспечивающий наибольший объем действующих веществ – короткоцепочечных жирных кислот, необходимых для поддержания гомеостаза организма человека.
- С целью оценки возможного использования различных физико-химических методов для совместного определения КЦЖК в метаболитных пробиотиках были выбраны капиллярный электрофорез и хроматографические методы. Методом капиллярного электрофореза не удалось достичь полного разделения анализируемых соединений. Для дальнейшего использования были выбраны хроматографические методы (ВЭЖХ, ГХ).
- Проведенное исследование показало возможность использования метода ВЭЖХ в анализе короткоцепочечных жирных кислот. Однако его применение для определения короткоцепочечных жирных кислот в пробиотиках метаболитного типа не представляется возможным в следствие недостаточной эффективности (N=7180 для изовалериановой кислоты и N=4986 для валериановой кислоты), а также плохого разделения пиков масляной и изовалериановой кислот (1,0).
- Разработаны методики газохроматографического определения КЦЖК с использованием анализа паровой фазы над жидкостью и с использованием эфирной экстракции. Обе разработанные методики показали хорошую эффективность (от 10000 теоретических тарелок), высокую степень разделения и селективность (R= 1,0-30,0; >1,0). Методика с использованием эфирной экстракции предложена для определения короткоцепочечных жирных кислот в пробиотике «Хилафор» как наиболее простая, требующая меньше времени для анализа, обладающая наилучшими хроматографическими и метрологическими характеристиками.
- Проведенный количественный анализ содержания короткоцепочечных жирных кислот в разрабатываемом пробиотике показал максимальное их содержание в составе №3, что позволило рекомендовать данный состав для дальнейшего внедрения.
- Полученные результаты по разработке методов анализа короткоцепочечных жирных кислот в пробиотике были использованы при составлении нормативной документации на новый отечественный пробиотик «Хилафор».
Публикации по теме исследования:
- Шевелева М.А. Разработка метода определения короткоцепочечных жирных кислот на основе бактериальных субстратов / М.А. Шевелева, Г.В. Раменская // Межвузовская научная конференция студентов и молодых ученых «Фармация в XXI веке: эстафета поколений». - Санкт-Петербург, 2009 г. - С. 41-42.
- Шевелева М.А. Современные представления о применении различных групп пробиотических средств при антибиотикотерапии / М.А. Шевелева, Г.В. Раменская // Антибиотики и химиотерапия. – 2009. – Т.54, №3-4. – С.61-68.
- Шевелева М.А. Определение короткоцепочечных жирных кислот в биологически активных добавках к пище на основе бактериальных субстратов / М.А. Шевелева, О.И. Передеряев, В.В. Бессонов // VII международная научно-практическая конференция и выставка «Технологии и продукты здорового питания. Функциональные пищевые продукты». - Москва, 2009. – С.374-375.
- Шевелева М.А. Определение карбоновых кислот С1-С5 в продуктах на основе бактериальных субстратов методом газо-жидкостной хроматографии / М.А. Шевелева, О.И. Передеряев, В.В. Бессонов // XI Всероссийский Конгресс диетологов и нутрициологов «Питание и здоровье» - Москва, 2009. – С.182-183.
- Шевелева М.А. Определение летучих жирных кислот в составе пробиотических средств и БАД на основе бактериальных субстратов / М.А. Шевелева // Сборник материалов XVII Российского Национального Конгресса "Человек и лекарство" – М., 2010.– С. 746.
- Шевелева М.А. Летучие жирные кислоты в пробиотических средствах и биологически активных добавках / М.А. Шевелева // Фармация. – 2010.– №3. - С. 13-14.
