Создание и биофармацевтическое изучение новой липосомальной лекарственной формы тиосенса для фотодинамической терапии

На правах рукописи

Санарова Екатерина Викторовна

СОЗДАНИЕ И БИОФАРМАЦЕВТИЧЕСКОЕ ИЗУЧЕНИЕ НОВОЙ ЛИПОСОМАЛЬНОЙ ЛЕКАРСТВЕННОЙ ФОРМЫ ТИОСЕНСА ДЛЯ ФОТОДИНАМИЧЕСКОЙ ТЕРАПИИ

14.04.01 – Технология получения лекарств

АВТОРЕФЕРАТ

диссертации на соискание ученой степени

кандидата фармацевтических наук

Москва – 2012

Работа выполнена в Научно-исследовательском институте экспериментальной диагностики и терапии опухолей Федерального Государственного бюджетного учреждения «Российский онкологический научный центр имени Н.Н.Блохина» РАМН (ФГБУ «РОНЦ им. Н.Н.Блохина» РАМН)

Научные руководители:

доктор фармацевтических наук,

профессор Оборотова Наталия Александровна

доктор медицинских наук,

профессор Смирнова Зоя Сергеевна

Официальные оппоненты:

доктор фармацевтических наук, Титова Анна Васильевна

начальник отдела организации

контроля качества лекарственных

средств ФГБУ «Информационно-

методический центр по экспертизе,

учету и анализу обращения средств

медицинского применения»

Росздравнадзора

доктор химических наук, Кеменова Вера Александровна

главный научный сотрудник

лаборатории технологии лекарственных форм

отдела фармацевтической технологии

государственного научного

учреждения «Всероссийский

научно-исследовательский институт

лекарственных и ароматических

растений» Россельхозакадемии

Ведущая организация: Федеральное Государственное бюджетное учреждение «Научно-исследовательский институт фармакологии имени В.В.Закусова» РАМН.

Защита диссертации состоится «____» ________________ 2013 г. в _____ часов на заседании диссертационного совета Д.208.040.09 при ГБОУ ВПО Первый Московский государственный медицинский университет имени И.М.Сеченова по адресу: 119019, г. Москва, Никитский бульвар, д. 13.

С диссертацией можно ознакомиться в Центральной научной медицинской библиотеке ГБОУ ВПО Первый Московский государственный медицинский университет имени И.М.Сеченова по адресу: 117998, г. Москва, Нахимовский проспект, д. 49.

Автореферат разослан «____» ____________ 2012 г.

Ученый секретарь

диссертационного совета Д.208.040.09

доктор фармацевтических наук,

профессор Садчикова Наталья Петровна

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность темы

Перед современной наукой стоит задача создания новых противоопухолевых препаратов и методов, избирательно разрушающих опухолевую ткань. Одним из таких методов, увеличивающим селективность действия препаратов на опухоль и снижающим токсические эффекты, является фотодинамическая терапия (ФДТ). ФДТ – это способ лечения, основанный на способности фотосенсибилизаторов (ФС) селективно накапливаться в ткани опухолей и при локальном воздействии лазерного облучения определенной длины волны генерировать образование синглетного кислорода и активных радикалов, оказывающих повреждающее действие на опухолевые клетки. Эффективность фотодинамического повреждения клетки определяется внутриклеточной концентрацией ФС, его локализацией в клетке, фотохимической активностью и дозой лазерного облучения.

В настоящее время продолжается поиск новых ФС с улучшенными терапевтическими свойствами, поглощающих свет в ближней инфракрасной области (720-850 нм) и характеризующихся более высоким квантовым выходом генерации синглетного кислорода и свободных радикалов. К таким ФС относится – тетра-3-фенилтиофталоцианин-гидроксиалюминия (тиосенс), синтезированный в ФГУП ГНЦ «НИОПИК» и имеющий максимум поглощения при 717±4 нм. Этот ФС является гидрофобным соединением, поэтому инкапсуляция его в липосомы не только позволяет вводить препарат внутривенно in vivo, но также улучшает фармакокинетический профиль препарата. В исследованиях, проведенных в ФГБУ «Российский онкологический научный центр им. Н.Н. Блохина» РАМН, выявлено, что тиосенс в составе липосомальной лекарственной формы (ЛЛФ) обладает достаточно высокой селективностью накопления в опухоли по отношению к нормальной ткани (индекс селективности достигает значений 3 в интервале 1-3 суток после введения) и ФДТ с его использованием вызывает высокий противоопухолевый эффект на опухоли Эрлиха, лимфолейкозе Р-388 и саркоме 37.

Целью данного исследования являлось создание стерически стабилизированной лиофилизированной липосомальной лекарственной формы (ЛЛЛФ) тиосенса, обеспечивающей высокую избирательность его противоопухолевого действия при проведении ФДТ.

Для достижения поставленной цели решались следующие задачи:

1. В результате технологических исследований установить оптимальный состав лиофилизированной липосомальной лекарственной формы тиосенса.
2. Разработать способ получения стабильной при хранении эффективной лиофилизированной липосомальной лекарственной формы тиосенса для внутривенного введения.
3. Разработать методики химико-фармацевтического анализа лиофилизированной липосомальной лекарственной формы тиосенса.
4. Оценить фотодинамическую активность лиофилизированной липосомальной лекарственной формы тиосенса на перевиваемых опухолях мышей (опухоль Эрлиха, лимфоцитарная лейкемия P-388, карцинома легкого Льюис, аденокарцинома молочной железы Са-755 и саркома 37).
5. Выбрать показатели качества для стандартизации разработанного лекарственного препарата и изучить его стабильность в процессе хранения.

Научная новизна результатов исследования

В результате проведенных исследований впервые разработана стабильная лиофилизированная ЛЛФ (ЛЛЛФ) тиосенса, сохраняющая заявленные физико-химические свойства и фотодинамическую эффективность на протяжении всего срока хранения. Разработан оптимальный состав и технология получения ЛЛЛФ, имеющие ряд особенностей, связанных с наличием у тиосенса гидрофобных свойств. На основе выбранных показателей качества создан проект ФСП на «Тиосенс липосомальный, лиофилизат для приготовления раствора для инъекций 1,5 мг» и получены данные о высокой противоопухолевой эффективности новой лекарственной формы (ЛФ) тиосенса при проведении ФДТ на перевиваемых опухолях мышей.

Научно-практическая значимость результатов исследования

Выполнение настоящего исследования позволило создать стабильную и эффективную ЛЛЛФ тиосенса для доклинического изучения. Разработаны и внедрены в практику лаборатории разработки лекарственных форм НИИ экспериментальной диагностики и терапии опухолей ФГБУ «РОНЦ им. Н.Н. Блохина» РАМН лабораторный регламент и проект ФСП на «Тиосенс липосомальный, лиофилизат для приготовления раствора для инъекций 1,5 мг», проведена стандартизация полученных серий ЛФ по выбранным параметрам.

Положения, выносимые на защиту:

1. Методики химико-фармацевтического анализа лиофилизированной липосомальной лекарственной формы тиосенса: качественный хроматографический анализ компонентов лекарственной формы и количественное спектрофотометрическое определение тиосенса в липосомальной лекарственной форме.
2. Состав и технология получения лиофилизированной липосомальной лекарственной формы тиосенса.
3. Результаты контроля качества трех серий лиофилизированной липосомальной лекарственной формы тиосенса по выбранным параметрам и изучения их стабильности в процессе хранения.
4. Результаты оценки эффективности фотодинамического действия лиофилизированной липосомальной лекарственной формы тиосенса на перевиваемых опухолях мышей.

Апробация работы

Материалы научных исследований по теме диссертации представлены на XVII Международной научной конференции студентов, аспирантов и молодых ученых «Ломоносов – 2010» (12-15 апреля 2010, Москва); II Всероссийской научной конференции с международным участием «Наноонкология» (26-28 сентября 2010, Тюмень); II международной студенческой научно-практической конференции «Интеллектуальный потенциал ХХI века: ступени познания» (8 июля 2010, Новосибирск); III Международной научно-практической конференции «Современные проблемы гуманитарных и естественных наук» (20-25 июля 2010, Москва); Международном форуме по нанотехнологиям Rusnanotech 2010 (1-3 November 2010, Moscow) и Rusnanotech 2011 (26-28 October 2011, Moscow); X и ХI Всероссийской научной конференции с международным участием «Отечественные противоопухолевые препараты» (22-23 марта 2011, Москва; 31 мая-01 июня 2012 Нижний Новгород); IV Архангельской международной медицинской научной конференции молодых ученых и студентов (26-27 апреля 2011, Архангельск); IV Всероссийской научно-практической конференции с международным участием: «Биомедицинская инженерия и биотехнология» (июнь 2011, Курск); III Всероссийской научной конференции с международным участием «Наноонкология», (6-7 сентября 2011, Саратов).

Апробация диссертационной работы прошла 28 июня 2012 г. на межлабораторной научной конференции НИИ экспериментальной диагностики и терапии опухолей ФГБУ «Российский онкологический научный центр  им. Н.Н.Блохина» Российской академии медицинских наук.

Личный вклад автора

Автор принимал непосредственное участие в постановке целей и задач настоящего исследования, их реализации, анализе и обобщении данных, изложении полученных результатов в виде научных публикаций. В работах, выполненных в соавторстве, автором проведена аналитическая и статистическая обработка, научное обоснование и обобщение полученных результатов. Автором лично произведен обзор литературы по данной теме, сделан научно обоснованный выбор вспомогательных веществ для разработки состава лекарственной формы тиосенса. Также разработаны методики качественного анализа и оптимальная технологическая схема получения разработанного препарата. Разработана нормативно-техническая документация: проект ФСП и лабораторный регламент на «Тиосенс липосомальный, лиофилизат для приготовления раствора для инъекций 1,5 мг».

Соответствие диссертации паспорту научной специальности

Научные положения диссертации соответствуют формуле специальности 14.04.01 – Технология получения лекарств. Результаты проведенного исследования соответствуют области исследования специальности, конкретно пунктам 1, 3 и 4 паспорта специальности технология получения лекарств.

Связь задач исследования с проблемным планом фармацевтической науки

Диссертационная работа выполнена в соответствии с планом научно-исследовательских работ НИИ экспериментальной диагностики и терапии опухолей ФГБУ «РОНЦ им. Н.Н. Блохина» РАМН по теме «Поиск наноструктурированных лекарственных форм для внутривенного введения производных фталоцианинов как потенциальных фотосенсибилизаторов для ФДТ и контрастирующих препаратов для МРТ» (№ гос. регистрации 01.200.809453), а также в рамках научно-технической программы «Разработка и практическое освоение в здравоохранении новых методов и средств профилактики, диагностики лечения онкологических, инфекционных и других опасных заболеваний» на 2010-2012гг.

Публикации

По материалам диссертации опубликовано 24 научных работы, в том числе 5 статей в журналах, рекомендованных ВАК РФ.

Структура и объем диссертации

Структура диссертационной работы включает введение, обзор литературы, описание материалов и методов исследований, четыре главы собственных исследований, общее заключение, общие выводы, список литературы и приложения. Объем работы составляет 174 листа машинописного текста и содержит 46 рисунков, 29 таблиц. Список литературы состоит из 157 источников, в том числе 131 – на иностранном языке.

СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ

Материалы и методы исследований

В исследованиях использовалась субстанция тиосенса, структурная формула которого отражена на рис. 1, серии 020310, синтезированная в ФГУП ГНЦ «НИОПИК» и соответствующая всем показателям качества, указанным в ФСП на субстанцию.

Рис. 1 Структурная формула тиосенса

1. Технология получения многослойных (мультиламеллярных) липосом тиосенса

Ингредиенты липосомального бислоя (лецитин, холестерин, полиэтиленгликоль-2000-дистеароилфосфатидилэтаноламин – PEG-2000-DSPE) растворяли в хлороформе. Субстанцию тиосенса растворяли в 10 мл хлороформа, помещали в ультразвуковую ванну «Transsonic» на 5-10 мин и добавляли к раствору липидов. Полученный раствор фильтровали через нейлоновые мембранные фильтры «Pall» с размером пор 0,22 мкм и переносили в круглодонную колбу. Растворитель отгоняли при температуре выше температуры фазового перехода лецитина (+37 °С) на роторном испарителе «BCHI Rotavapor R-200» с получением однородной полупрозрачной липидной пленки. Пленку гидратировали водой для инъекций. Фильтровали полученную дисперсию мультиламеллярных везикул на экструдере «LIPEXТМ» через нейлоновые мембранные фильтры «Pall» с размером пор 1,2 мкм.

2. Получение однослойных (моноламеллярных) липосом тиосенса

Для измельчения мультиламеллярных липосом использовали ультразвук, методы экструзии и гомогенизации. При получении небольших объемов препарата дисперсию мультиламеллярных везикул измельчали на ручном мини-экструдере «Avanti Mini-Extruder», последовательно пропуская через поликарбонатные мембранные фильтры «Nuclepore» с размерами пор 0,4 и 0,2 мкм. В процессе масштабирования технологии получения ЛЛЛФ тиосенса измельчение мультиламеллярных везикул после фильтрации проводили на гомогенизаторе высокого давления «Microfluidizer M-110S», в котором установлена интерактивная керамическая камера, имеющая Y-конфигурацию, предпочтительную для измельчения липосом. Ультразвуковое измельчение липосомальной дисперсии проводили в ультразвуковой ванне «Transsonic».

3. Стерилизующая фильтрация липосомальной дисперсии тиосенса

К дисперсии моноламеллярных липосом тиосенса добавляли необходимый объем стерильного раствора криопротектора определенной концентрации, аккуратно перемешивали и проводили фильтрацию последовательно через нейлоновые мембранные фильтры «Pall» с размером пор 0,45 и 0,22 мкм. Полученную стерильную липосомальную дисперсию тиосенса разливали во флаконы по 6 мл и лиофилизировали в камере сублимационной сушки «Minifast DO.2».

4. Стандартизация липосомальной дисперсии тиосенса

4.1 Определение размеров липосом тиосенса

На всех стадиях получения липосом производили измерение размера фосфолипидных везикул на наносайзере «Nicomp 380 Submicron Particle Sizer». При этом 1 мл липосомальной дисперсии тиосенса растворяли в 50 мл воды очищенной и перемешивали до получения гомогенной дисперсии. 1 мл полученной дисперсии переносили в мерную колбу вместимостью 50 мл, доводили объём водой очищенной до метки, перемешивали и проводили определение размера частиц на наносайзере. При измерении размера лиофилизированных липосом во флакон с лиофилизатом добавляли 5,8 мл воды очищенной, а затем разводили как описано выше.

4.2 Определение значения рН липосомальной дисперсии и лиофилизата тиосенса

В липосомальной дисперсии значение рН измеряли не разбавляя. Для определения значения рН лиофилизата к нему добавляли 10 мл воды для инъекций и измеряли значение рН на рН-метре «HANNA pH 211».

4.3 Анализ компонентов ЛЛЛФ тиосенса с помощью тонкослойной хроматографии

На линию старта хроматографической пластинки размером 150100 мм наносили по 10 мкл раствора содержимого флакона ЛЛЛФ тиосенса в 50 мл хлороформа (0,3 мкг) и хлороформных растворов стандартных образцов веществ-свидетелей (СОВС): тиосенса с концентрацией 0,25 мг/мл (СОВС-1 – 2,5 мкг), лецитина с концентрацией 50 мг/мл (СОВС-2 – 500 мкг), холестерина – 5 мг/мл (СОВС-3 – 50 мкг). Пластинку с нанесенными пробами подсушивали на воздухе, помещали в хроматографическую камеру со смесью растворителей и хроматографировали восходящим способом. Когда расстояние старт-финиш достигало 12,0 см, пластинку вынимали и подсушивали на воздухе. Обнаружение пятен проводили: визуально – наблюдали зеленые пятна тиосенса, при помещении в йодную камеру проявлялись желтые пятна лецитина и холестарина. Холестерин также идентифицировали путем опрыскивания пластинки разбавленной серной кислотой с последующим нагреванием в сушильном шкафу до 200 °С (появление красных пятен). С целью обнаружения сахарозы готовили реактив на основе 1-нафтола в смеси 95 % этилового спирта и концентрированной серной кислоты, который при нагревании формирует с молекулами сахарозы соединения хиноидной структуры (окрашены в темно-фиолетовый цвет).

4.4 Спектрофотометрическое определение содержания тиосенса:

а) в липосомальной дисперсии;

Помещали 5 мл липосомальной дисперсии тиосенса в мерную колбу вместимостью 25 мл и доводили объем хлороформом до метки. Помещали 5 мл хлороформной дисперсии в мерную колбу вместимостью 100 мл и доводили спиртом этиловым 95 % до метки, оставляли на 40 мин в темном месте. Определяли максимум поглощения раствора образца в диапазоне длин волн от 713 до 721 нм в кюветах с толщиной оптического слоя 10 мм относительно раствора сравнения. Измеряли величину оптической плотности в максимуме поглощения. Параллельно проводили измерение оптической плотности раствора рабочего стандартного образца (РСО) тиосенса относительно раствора сравнения. Количество тиосенса в мг/мл (Х) рассчитывали по формуле (разведения РСО и исследуемого образца одинаковы):

Х = А1a0 / А05,

где А1 и А0 – оптические плотности растворов образца ЛЛФ тиосенса и РСО, соответственно; а0 – навеска РСО тиосенса, мг; 5 – 5 мл образца.

б) в лиофилизате;

К содержимому флакона ЛЛЛФ тиосенса добавляли 10 мл хлороформа, количественно переносили в мерную колбу вместимостью 25 мл и доводили хлороформом до метки. Помещали 5 мл полученного раствора в мерную колбу вместимостью 100 мл и доводили спиртом этиловым 95 % до метки, оставляли на 40 мин в темном месте. Определяли максимум поглощения раствора образца в диапазоне длин волн от 713 до 721 нм в кюветах с толщиной оптического слоя 10 мм относительно раствора сравнения. Измеряли величину оптической плотности в максимуме поглощения. Параллельно проводили определение оптической плотности раствора РСО тиосенса относительно раствора сравнения. Количество тиосенса в мг/флакон (Х) рассчитывали по формуле (разведения РСО и исследуемого образца одинаковы):

Х = А1a0 / А0,

где А1 и А0 – оптические плотности растворов образца ЛЛФ тиосенса и РСО, соответственно; а0 – навеска РСО тиосенса, мг.

4.5 Определение количества тиосенса, включенного в липосомальный бислой

В связи с тем, что тиосенс является гидрофобным веществом количество включенного препарата (КВП) определяли путем фильтрации стерильной липосомальной дисперсии через нейлоновые мембранные фильтры «Pall» с размером пор 0,22 мкм (5 раз). После этого проводили спектрофотометрическое определение содержания тиосенса в липосомальной дисперсии по методике для количественного определения. Рассчитывали КВП как отношение содержания препарата в липосомальной дисперсии после гидратации липидной пленки к его содержанию в полученном стерильном фильтрате. Выражали этот показатель в процентах.

4.6 Определение концентрации малонового диальдегида

Содержание конечного продукта перекисного окисления липосомальных фосфолипидов – малонового диальдегида (МДА) определяли по реакции с 2-тиобарбитуровой кислотой (ТБК). В чистую пробирку помещали 0,5 мл анализируемого образца (липосомальная дисперсия или лиофилизат, растворенный в 5,8 мл воды для инъекций) и 3,0 мл свежеприготовленной смеси ТХУК и ТБК, перемешивали и нагревали на кипящей водяной бане в течение 30 мин. Измеряли оптическую плотность полученного раствора относительно смеси ТХУК и ТБК при 580 и 532 нм и рассчитывали содержание МДА (нмоль/мл) в пробе по формуле:

С= (А532 – А580) 6 1000 / 155,

где А532 и А580 – оптическая плотность образца, при длине волны 532 нм и 580 нм; 6 – коэффициент разведения образца; 155 – коэффициент молярной экстинкции МДА-ТБК2, мл·мкмоль–1·см–1.

4.7 Оценка эффективности фотодинамической терапии

Исследование проводили на перевиваемых опухолях мышей. На 4-6 день после перевивки, когда объем опухолевого узла составлял 700-900 мм3, флакон ЛЛЛФ тиосенса разводили 5,8 мл воды для инъекций и вводили мышам однократно внутривенно в дозе 6 мг/кг. Через 5 ч после введения, когда наблюдались максимальный уровень и селективность накопления препарата в опухолевой ткани, проводили облучение опухоли лазером «ЛФД-730-01-БИОСПЕК» с длиной волны 720 нм и режимом облучения 400 мВт/см2 в течение 20 мин.

Опыт повторялся трижды, результаты эффективности представлены средние. После проведения ФДТ наблюдали за животными, замеряя размеры опухолей, определяли день гибели животных. Критериями оценки противоопухолевой активности ФДТ служили: торможение роста опухоли (ТРО, %) и излечение. ТРО рассчитывали по формуле:

ТРО = (Vк – Vо) / Vк100 %,

где Vк – средний объем опухолей в контрольной группе (мм3); Vо – средний объем опухолей в опытной группе (мм3). Минимальный критерий активности – ТРО50 %.

Результаты собственных исследований

1. Подбор подвижной фазы для хроматографического определения компонентов ЛЛЛФ тиосенса

Первоначально подбор подвижной фазы (ПФ) осуществляли с использованием хроматографических пластинок «Silufol». При этом наилучшее разделение тиосенса и холестерина обеспечивала смесь растворителей хлороформ/метанол/25 % раствор аммиака (87:12:1), но в этой системе пятно лецитина оставалось на старте.

Дальнейшее исследование с целью подбора ПФ для идентификации лецитина проводили на хроматографических пластинках «Sorbfil», которые обеспечивали высокую селективность и хорошую чувствительность методики анализа, хотя и увеличивали продолжительность эксперимента. Кроме того экспериментально установлено, что данные пластики обеспечивали разделение тиосенса и холестерина в системе подобранной для пластинок «Silufol». Поиск системы растворителей, которая обеспечила бы эффективное разделение лецитина в ЛФ, проводили на 15 подвижных фазах представленных в табл. 1.

Как видно из табл. 1 наилучшие показатели коэффициента разделения – Rf для лецитина как в СОВС (Rf=0,22), так и в составе ЛЛЛФ (Rf=0,20) обнаружены в ПФ хлороформ/н-бутанол/ацетон/ЛУК/вода (25:25:15:5:4). Именно эта система выбрана для качественного ТСХ-анализа лецитина в составе ЛЛЛФ тиосенса.

Таблица 1

Выбор подвижной фазы для ТСХ-анализа ЛЛЛФ тиосенса на хроматографических пластинках «Sorbfil»

Состав подвижной фазы	Значение Rf
	СОВС			ЛЛЛФ Тиосенса
	Тио*	Лец*	Хол*	Тио*	Лец*	Хол*
хлороформ/метанол/аммиак (87:12:1)	0,89	старт	0,76	0,87	старт	0,78
ацетон/этилацетат/ЛУК (60:40:20)	0,82	старт	0,80	0,83	старт	0,83
хлороформ/этанол/вода (65:25:4)	0,60	старт	0,58	0,58	старт	0,55
н-бутанол/ЛУК/вода (12:3:5)	0,83	0,14	0,80	0,79	0,15	0,77
хлороформ/ацетон/ЛУК/вода (25:15:5:4)	0,96	старт	0,78	0,96	старт	0,79
хлороформ/н-бутанол/ацетон/ЛУК/вода (25:25:15:5:4)	0,91	0,22	0,89	0,89	0,20	0,88
хлороформ/аммиак (95:5)	0,75	старт	0,59	0,75	старт	0,60
пропанол-2/аммиак/ ЛУК/вода (15:15:3:5)	0,95	0,11	0,93	0,94	0,08	0,91
ацетон/этилацетат/ЛУК/вода (15:10:3:5)	старт	0,20	0,68	старт	0,17	0,66
хлороформ/ацетон/метанол/ЛУК/вода (25:15:4:2:5)	старт	0,12	0,56	старт	0,13	0,53
метанол/хлороформ/аммиак/вода (6:5:1:2)**	-	старт	-	-	старт	-
пропанол-2/хлороформ/ЛУК/вода (27:23:3:1)**	-	0,08	-	-	0,07	-
хлороформ/метанол/вода (35:15:2)**	-	0,17	-	-	0,18	-
н-бутанол/ЛУК/вода (12:3:5)**	-	старт	-	-	старт	-
пропанол-2/ЛУК/вода (12:3:1)**	-	старт	-	-	старт	-

*Тио - тиосенс, Лец – лецитин, Хол – холестерин, аммиак – 25% раствор аммиака

**системы, в которых определяли только положение пятен лецитина

Анализ сахарозы в составе ЛЛЛФ тиосенса проводили с применением хроматографических пластинок «Sorbfil» и двух систем растворителей – хлороформ/н-бутанол/ацетон/ЛУК/вода (25:25:15:5:4) и хлороформ/метанол/ 25 % раствор аммиака (87:12:1), которые выбраны для анализа липидов и субстанции тиосенса. В системе 1 значения Rf для сахарозы в составе СОВС и ЛФ составили 0,31, в то время как в системе 2 фиолетовое пятно для обоих образцов осталось на линии старта. В связи с этим для анализа сахарозы в составе ЛЛЛФ тиосенса выбрана ПФ состава хлороформ/н-бутанол/ацетон/ЛУК/вода (25:25:15:5:4).

2. Разработка методики спектрофотометрического определения тиосенса в составе ЛЛФ

Целью проведения этого исследования являлось создание точной и чувствительной методики определения содержания тиосенса в ЛЛФ. Первоначально снимали электронный спектр поглощения спирто-хлороформного раствора субстанции тиосенса, на котором, как видно на рис. 2, в области от 200 до 800 нм обнаружены максимумы при 717±4 нм, 646±4 нм, 342±3 нм. Причем наиболее интенсивным пиком является 717±4 нм. Именно эта длина волны выбрана для проведения спектрофотометрического анализа с целью определения количественного содержания тиосенса в изучаемой ЛФ. Для оценки влияния вспомогательных веществ (лецитина, холестерина, PEG-2000-DSPE, сахарозы) на поглощение действующего вещества при характеристической длине волны сравнивали спектры спирто-хлороформных растворов «пустых» липосом и ЛЛЛФ тиосенса, представленные на рис. 2.

Рис. 2 Электронные спектры поглощения спирто-хлороформных растворов: 1 – «пустых» липосом; 2 – субстанции тиосенса (РСО); 3 –ЛЛЛФ тиосенса

При сравнении спектров «пустых» липосом и ЛЛЛФ тиосенса, отраженных на рис. 2, обнаружено, что компоненты липосомального бислоя и криопротектор незначительно поглощают (А=0,006) на характеристической длине волны субстанции и их поглощение можно не учитывать при расчетах количественного содержания тиосенса в ЛЛЛФ. Это говорит о специфичности методики обнаружения тиосенса в ЛФ методом спектрофотометрии. На электронном спектре поглощения раствора сравнения (спирто-хлороформный раствор в соотношении по объему 95/5) в области от 200 до 800 нм поглощение света отсутствовало. Линейная зависимость оптической плотности для спирто-хороформного раствора субстанции тиосенса и лиофилизата при 717 нм соблюдалась в диапазоне концентраций от 0,1 мг/мл до 0,6 мг/мл. Следовательно, можно утверждать, что количественное спектрофотометрическое определение тиосенса как в виде субстанции, так и в составе ЛЛЛФ позволяет получить достоверные результаты. Ошибка определения тиосенса в липосомальной дисперсии и ЛЛЛФ по данной методике не превышала 2,0 %, что указывает на высокую точность анализа. Методика спектрофотометрического количественного определения тиосенса в ЛЛЛФ валидирована по критериям: аналитическая область, линейность, правильность, сходимость, межлабораторная прецизионность и селективность.

3. Разработка состава и технологии получения лиофилизированной липосомальной лекарственной формы тиосенса

3.1 Исследование влияния соотношения препарат/лецитин на размер липосом и количество включенного препарата

Одним из важных этапов разработки ЛЛЛФ тиосенса являлся выбор оптимального соотношения препарат/лецитин. В ходе эксперимента получали 9 составов с различными молярными соотношениями тиосенс/лецитин. Оценка качества этих составов проводилась по двум критериям – средний размер липосом и количество включенного препарата (КВП, %) в липосомы. Результаты анализа представлены в табл. 2.

Таблица 2

Влияние соотношения препарат/лецитин на размер липосом тиосенса и КВП

Молярное соотношение препарат/лецитин	Размеры липосом после получения, нм	Размеры липосом после экструзии/фильтрации, нм	КВП, %
1/90	478±13	123±8	59,0
1/120	609±10	146±6	67,0
1/150	598±14	159±8	75,0
1/180	714±11	188±7	80,0
1/210	658±14	234±8	74,0
1/240	696±20	187±9	89,0
1/270	889±26	161±8	98,0
1/300	914±24	195±10	88,0
1/330	820±21	186±4	90,0

Анализируя данные табл. 2 можно сделать вывод о целесообразности разработки ЛЛФ тиосенса с молярным соотношением препарат/лецитин 1/270, имеющей приемлемый средний размер везикул (161 нм) и высокий процент включения (98,0 %).

3.2 Оценка модельных смесей для выбора состава липосом тиосенса

Выбор компонентов для получения липосом основывался на их функциональности: лецитин применяли в качестве основного компонента, в связи с его биосовместимостью и приемлемыми физико-химическими свойствами; холестерин добавляли для придания бислою необходимого уровня жесткости; а фосфолипид конъюгированный с полиэтиленгликолем (PEG-2000-DSPE) для преодоления захвата фосфолипидных везикул клетками ретикулоэндотелиальной системы. На основе этих компонентов получали 9 различных составов, причем для определения влияния УЗ на качество липосом состав №1 измельчали с помощью УЗ. Основными параметрами определяющими пригодность того или иного состава выбраны размер липосом и КВП, результаты анализа которых отражены в табл. 3.

Таблица 3

Размер везикул и количество включенного тиосенса в липосомы различных составов

Состав №	Молярное соотношение компонентов (Л/Х/Р)*	Средний размер везикул после фильтрации и экструзии, нм	КВП, %
1	1/0,22/0,002	344±9	90,0
2	1/0,22/0,001	231±26	55,0
3	1/0,22/0,004	196±7	84,0
4	1/0,31/0,002	221±6	78,0
5	1/0,13/0,002	164±8	54,0
6	1/0,18/0,002	186±4	90,0
7	1/0,29/0,003	234±8	74,0
8	1/0,22/0,002	151±5	96,0
9	1/0,20/0,002	195±10	88,0

* Л – лецитин, Х – холестерин, Р – PEG-2000-DSPE

Из табл. 3 видно, что наиболее приемлемым, по указанным выше параметрам, является измельченный методом экструзии состав с молярным соотношением лецитин/холестерин/PEG-2000-DSPE равным 1/0,22/0,002, который использовался для дальнейших испытаний.

3.3 Влияние параметров гомогенизации на качество липосомальной дисперсии тиосенса:

а) Исследование влияния давления гомогенизации;

Для определения влияния давления на качество липосомальной дисперсии тиосенса использовали диапазон давлений от 1,38 бар/20 psi до 5,52 бар/80 psi, объем загрузки липосомальной дисперсии составлял 150 мл, средний диаметр липосом после получения – 906 нм, значение рН липосомальной дисперсии после получения 6,9. После гомогенизации оценивали размеры липосом, значение рН липосомальной дисперсии и количество включенного тиосенса. Результаты определения этих параметров представлены в табл. 4.

Таблица 4

Влияние величины давления гомогенизации на размер липосом и значение рН липосомальной дисперсии

Давление на манометре, бар/psi	Оптимальное число циклов	рН	Средний размер липосом, нм (распределение по фракциям, %)	КВП, %
1,38 / 20	6	6,5	18±5 (20%); 108±9 (80%)	98,0
2,07 / 30	4	6,7	25±9 (17%); 115±7 (83%)	98,0
2,76 / 40	2	6,7	28±3 (14%); 107±5 (86%)	95,0
3,45 / 50	2	6,7	29±8 (18%); 113±8 (82%)	92,0
4,14 / 60	2	6,4	25±3 (25%); 102±5 (75%)	90,0
4,83 / 70	1	6,6	25±6 (26%); 116±8 (74%)	84,0
5,52 / 80	2	6,1	24±4 (24%); 112±8 (29%); 145±5 (47%)	81,0

Из табл. 4 видно, что при увеличении давления гомогенизации уровень включенного в липосомальный бислой препарата снижается. При давлении гомогенизации свыше 4,0 бар КВП становится менее 90,0 %. Согласно полученным результатам наилучшими показателями – средний диаметр липосом 107 нм, значение рН=6,7 на втором цикле гомогенизации и КВП на уровне 95,0 % обладает дисперсия, измельченная под давлением 2,76 бар (40 psi). Выбранная величина давления гомогенизации использовалась в дальнейшем при наработке серий ЛЛЛФ тиосенса.

б) Исследование влияния времени гомогенизации;

В связи с тем, что увеличение времени гомогенизации приводит к ускорению перекисного окисления липосомальных фосфолипидов, увеличению размеров везикул и уменьшению КВП для оптимизации процесса измельчения определяли минимальное время (количество циклов), за которое можно получить липосомы необходимого диаметра (100-140 нм). Контролировали процесс гомогенизации путем оценки среднего размера липосом и при прекращении уменьшения размеров образующихся частиц процесс останавливали. Липосомальную дисперсию получали объемами 150, 300 и 450 мл, а затем измельчали, отбирая пробы после каждого цикла гомогенизации. Цикл гомогенизации соответствовал 1 мин для объема загрузки 150 мл, 2 мин для загрузки 300 мл и 3,5 мин для загрузки 450 мл. При этом оценивали изменения значений рН, среднего размера везикул и окисленности липосомальных ФЛ (по концентрации МДА) в зависимости от времени измельчения при неизменном давлении – 2,76 бар/40 psi.

При загрузке в приемное устройство гомогенизатора 150 мл липосомальной дисперсии Тиосенса потребовалось 2 цикла измельчения для получения везикул оптимального размера. На третьем цикле гомогенизации размер везикул увеличивался, значения рН снижались, а концентрация МДА возрастала до 1,63 нмоль/мл, поэтому проводить процесс измельчения более 2-х мин для данного объема загрузки не рационально. Результаты показали, что при объеме загрузки 300 мл после 8 мин (4 циклов) происходит резкий рост диаметра везикул, что приводит к выпадению в осадок фрагментов бислоя. В этот период также возрастают значение рН и содержание МДА. Поэтому при таком объеме загрузки время измельчения не должно превышать 6 минут (3 цикла), что позволяет получить липосомальную дисперсию отвечающую заявленным показателям качества (значение рН – 7,0; средний размер липосом – 143 нм; концентрация МДА – 1,31 нмоль/мл). При увеличении объема загрузки до 450 мл возрастает и продолжительность гомогенизации (1 цикл длится 3,5 мин). Оптимальным временем измельчения для данного объема липосомальной дисперсии является 17,5 мин – 5 циклов. На шестом цикле качество липосомальных везикул Тиосенса по рассматриваемым параметрам значительно ухудшалось – значение рН снижалось до 5,7; средний размер везикул преобладающей фракции возрастал до 366 нм, а концентрация МДА до 2,87 нмоль/мл.

3.4 Оценка влияния фильтрации на качество липосомальной дисперсии тиосенса

Растворы ФС предназначены для парентерального введения, что требует получения стерильной ЛФ. В связи с особенностями строения липосом режим и способ стерилизации должны минимально влиять на их стабильность и не приводить к снижению фармакологического действия получаемого препарата. Наиболее часто применяемый для этой цели метод – стерилизующая фильтрация через каскад фильтров с величиной пор от 1,2 до 0,22 мкм. Преимуществом стерилизующей фильтрации также является отделение гидрофобного тиосенса, не включенного в липосомы. Для оценки изменения содержания тиосенса в ЛЛФ на различных технологических стадиях проводили количественное определение действующего вещества сразу после получения липосомальной дисперсии, после ее гомогенизации и фильтрации через нейлоновый мембранный фильтр «Pall» с размером пор 0,45 и 0,22 мкм. Результаты эксперимента представлены в табл. 5.

Таблица 5

Количество тиосенса в липосомальной дисперсии на этапах технологического процесса

Технологическая стадия	КВП (%) для дисперсии №:
	1	2	3	4
Гидратация липидной пленки	100,0 99,0 98,0	98,0 96,0 95,0	98,0 98,0 94,0	99,0 97,0 97,0
Гомогенизация+Фильтрация 0,45 мкм
Гомогенизация+Фильтрация 0,45 мкм+0,22 мкм

Анализируя данные табл. 5, можно сделать вывод о высоком уровне КВП в липосомальном бислое, что связано с его гидрофобной природой. В среднем за счет адсорбции субстанции на фильтре содержание препарата в липосомальной дисперсии снижается на 2,0 – 4,0 %.

3.5 Влияние типа криопротектора на размеры липосом тиосенса в ЛЛФ

Дальнейшее исследование состояло в изучении влияния на размеры липосом тиосенса типа криопротектора и уровня его содержания (массовое соотношение лецитин/криопротектор) в липосомальной дисперсии. В качестве объектов для исследования применяли растворы сахарозы, лактозы, глюкозы, коллидона, и маннита в массовых соотношениях лецитин/криопротектор 1/1 и 1/2,5. Измеряли размеры фосфолипидных везикул после получения (914 нм), экструзии и фильтрации (175 нм), разбавления экструдированной липосомальной дисперсии растворами криопротекторов в нужной концентрации, после ее постепенного замораживания до –18 °С и после лиофилизации. Результаты влияния криопротекторов на размер липосом тиосенса представлены в табл. 6.

Таблица 6

Влияние криопротекторов на размеры липосом тиосенса

Массовое соотношение лецитин/криопротектор		Средний размер липосом тиосенса, нм (распределение по фракциям, %)
		До замораживания	После замораживания	После лиофилизации
Лецитин/сахароза	1/1	174*	189*	257*
	1/2,5	166*	169*	157*
Лецитин/глюкоза	1/1	188*	161*	284*
	1/2,5	176*	186*	167*
Лецитин/коллидон	1/1	210*	77/534 (57%/43%)	89/632 (71%/29%)
	1/2,5	52/238 (63%/37%)	42/320 (77%/23%)	78/388 (84%/16%)
Лецитин/лактоза	1/1	189*	90/236 (78%/22%)	123/289 (90%/10%)
	1/2,5	189*	174*	186*
Лецитин/маннит	1/1	92/269 (15%/85%)	71/700 (69%/31%)	97/840 (77%/23%)
	1/2,5	128/393 (52%/48%)	101/814 (65%/45%)	144/852 (72%/28%)

*одна фракция – 100 %

Как видно из табл. 6 сахароза из всех испытанных с этой целью криопротекторов показала наилучшие результаты как по критерию гомогенности (отсутствует вторая фракция), так и по обеспечению необходимого диаметра везикул в ЛФ, что показано на рис. 3, отражающем распределение фосфолипидных везикул липосомальной дисперсии с сахарозой по размерам.

А Б

Рис. 3 Размер липосом тиосенса с сахарозой при массовом соотношении лецитин/криопротектор 1/1 (А) и 1/2,5 (Б) до замораживания дисперсии

При использовании сахарозы в качестве криопротектора для липосомальной дисперсии тиосенса в расширенном диапазоне концентраций (массовые соотношения лецитин/криопротектор 1/1, 1/1,5, 1/2, 1/2,5, 1/3) установлено, что она обеспечивает сохранение размеров и гомогенности липосом при лиофилизации в массовых соотношениях лецитин/криопротектор от 1/1,5 до 1/2,5. На следующем этапе исследования изучали стабильность липосомальных дисперсий с сахарозой в указанных выше соотношениях при температуре + 4 °С. Результаты изменения размеров липосом в процессе хранения представлены в табл. 7.

Таблица 7

Размеры липосом тиосенса с сахарозой в процессе хранения

Время хранения, дни	Размер липосом дисперсии с массовым соотношением лецитин/сахароза
	1/1	1/1,5	1/2	1/2,5	1/3
1	174	173	167	166	154
4	176	178	171	169	157
7	176	178	172	173	171
10	187	178	175	167	170
14	258осадок	191	176	177	175

Как видно из табл.7 наименьший процент роста диаметра везикул (5,1%) наблюдали в дисперсии с соотношением лецитин/сахароза 1/2, в связи с этим именно это соотношение использовано для получения ЛЛЛФ тиосенса.

С целью увеличения срока годности липосомальной дисперсии тиосенса проводили лиофильную сушку. Оценивали изменение размера и формы фосфолипидных везикул в результате лиофилизации при просматривании снимков полученных на электронном микроскопе (рис. 4).

А Б

Рис. 4 Электронная фотография липосом тиосенса до (А) и после (Б) лиофилизации

Сравнение фотографий липосом до (рис. 4А) и после лиофилизации (рис. 4Б) указывает на незначительное увеличение размеров лиофилизированных везикул и формирование липосом более правильной шарообразной формы.

4. Стандартизация лиофилизированной липосомальной лекарственной формы тиосенса

В качестве критериев для оценки качества ЛЛЛФ тиосенса выбраны: описание, растворимость (регидратация), подлинность, средняя масса содержимого флакона, значение рН и размер частиц (после регидратации), потеря в массе при высушивании, количественное определение, однородность дозирования. На основании выбранных параметров разработали проект ФСП на «Тиосенс липосомальный, лиофилизат для приготовления раствора для инъекций 1,5 мг», на основе которого оценивали качество трех серий ЛЛЛФ тиосенса (010310, 020410 и 030510) сразу после получения и при хранении в течение 1,5 лет для определения срока годности препарата. Результаты оценки параметров качества представлены в табл. 8.

Таблица 8

Анализ качества серий ЛЛЛФ тиосенса после получения и в процессе хранения для установления срока годности

Параметры качества	Значения по ФСП	Срок хранения, мес	Серия
			010310	020410	030510
Средняя масса содержимого флакона, г	0,89-0,99	0 3 6 9 12 18	0,894 0,896 0,903 0,918 0,918 0,924	0,956 0,958 0,964 0,968 0,972 0,973	0,922 0,925 0,931 0,934 0,939 0,941
Значение рН	6,0 – 7,2	0 3 6 9 12 18	7,1 6,8 6,8 6,5 6,5 6,5	6,7 6,7 6,5 6,5 6,5 6,4	6,4 6,4 6,4 6,2 6,1 6,2
Средний размер липосом, нм	менее 250	0 3 6 9 12 18	143 157 177 173 151 159	156 162 154 155 150 168	154 155 159 154 154 156
Потеря в массе при высушивании, %	менее 3,0	0 3 6 9 12 18	0,5 0,6 0,6 0,7 0,9 1,0	0,7 0,7 0,9 0,9 1,1 1,1	0,6 0,8 0,8 0,8 1,0 1,0
Количественное содержание тиосенса, мг/флакон	1,30 – 1,70	0 3 6 9 12 18	1,454 1,452 1,452 1,447 1,449 1,449	1,473 1,467 1,465 1,466 1,464 1,460	1,348 1,346 1,346 1,345 1,345 1,342

Из табл. 8 видно, что мониторинг качества ЛЛЛФ тиосенса в течение 1,5 лет показал отсутствие значимых изменений параметров качества указанных в проекте ФСП. Проведенные исследования позволили установить срок годности для препарата «Тиосенс липосомальный, лиофилизат для приготовления раствора для инъекций 1,5 мг» равный 1 году.

5. Оценка фотодинамической активности и стабильности ЛЛЛФ тиосенса в процессе хранения

5.1 Изучение фотодинамической активности ЛЛЛФ тиосенса на перевиваемых опухолях мышей

Исследование эффективности ФДТ с ЛЛЛФ тиосенса проводилось на перевиваемых опухолях мышей: опухоль Эрлиха, лимфоцитарная лейкемия P-388, карцинома легкого Льюис, аденокарцинома молочной железы Са-755 и саркома 37.

На рис. 5А показано, что ФДТ с ЛЛЛФ тиосенса проявляет высокий противоопухолевый эффект на опухоли Эрлиха – максимальное ТРО 76 %. Эффективность ФДТ с применением ЛЛЛФ тиосенса на саркоме 37 постепенно росла и к 31 дню после лазерного облучения составляла 94 % ТРО (рис. 5Б). Кроме того выявлено излечение мышей с саркомой 37 в 33,3 % случаев.

А Б

Рис. 5 Динамика торможения роста опухоли Эрлиха (А) и саркомы 37 (Б) после ФДТ с ЛЛЛФ тиосенса (*p < 0,05 по отношению к контролю)

На лимфоцитарной лейкемии Р-388 терапевтический эффект ФДТ с ЛЛЛФ тиосенса проявлялся уже на 3 день после лазерного облучения и составлял 70 % ТРО, а к 7 дню возрастал до 76 % ТРО. При проведении ФДТ на эпидермоидной карциноме легкого Льюис с применением ЛЛЛФ тиосенса выявлен умеренный, но длительный противоопухолевый эффект. Так на 7 день после лазерного облучения ТРО составляло 59 %, а на 23 день – 53 %. Максимальный терапевтический эффект наблюдался на 14 день после лазерного облучения и составлял 70 % ТРО. Терапевтическая эффективность ФДТ с ЛЛЛФ тиосенса на аденокарциноме молочной железы Са-755 составила через 3 дня после лазерного облечения 74 % ТРО, а затем она постепенно снижалась и на 7 день после лазерного облучения не превышала 52 % ТРО.

5.2 Исследование эффективности ФДТ со свежеприготовленной и хранившейся в течение 1 года ЛЛЛФ тиосенса

Фотодинамическая активность серий ЛЛЛФ тиосенса (010310, 020410, 030510) изучалась на мышах-гибридах первого поколения F1 с опухолью Эрлиха. Результаты эксперимента с использованием свежеприготовленных серий отражены на рис. 6.

Рис. 6 Динамика торможения роста опухоли Эрлиха после ФДТ со свежеприготовленной ЛЛЛФ тиосенса (серии 010310, 020410, 030510)

На рис. 6 показано, что ФДТ со свежеприготовленными сериями ЛЛЛФ тиосенса вызывает стабильный, высокий и длительный (14 дней) терапевтический эффект на опухоли Эрлиха. Для серии 010310 максимальное значение ТРО составило 76 %, а для серии 020410 на тот же срок наблюдения – 67 %, а противоопухолевый эффект серии 030510 достигал значения – 70 % ТРО. Результаты эксперимента позволили заложить вышеуказанные серии на хранение. В дальнейшем проводили исследование по изучению стабильности фотодинамической активности ЛЛЛФ тиосенса в процессе хранения. Результаты отражены в табл. 9.

Таблица 9

Динамика торможения роста опухоли Эрлиха после ФДТ с ЛЛЛФ тиосенса (серии 010310, 020410, 030510) при хранении в течение 1 года

Дни после лазерного облучения	ТРО, %
	Серия 010310	Серия 020410	Серия 030510
3	25	21	44
7	33	54	53
10	68	62	69
14	70	68	72
17	61	67	69
20	57	59	59
23	59	55	56
27	48	49	50
30	46	45	43

Из табл. 9 видно, что при сроке хранения 1 год все серии ЛЛЛФ тиосенса проявляют максимальный терапевтический эффект на 14 день после лазерного облучения (серия 010310 – 70 % ТРО, серия 020410 – 68 % ТРО, серия 030510 – 72 % ТРО). При проведении ФДТ на опухоли Эрлиха терапевтическая эффективность свежеприготовленных серий и серий находящихся на хранении равноценна.

Проведенные эксперименты позволяют сделать заключение о сохранении высокой фотодинамической эффективности ЛЛЛФ тиосенса в процессе хранения в течение 1 года. Выбранный состав обеспечивает получение качественной и стабильной ЛЛЛФ тиосенса как по физико-химическим показателям, так и по эффективности воздействия на опухоль.

ОБЩИЕ ВЫВОДЫ:

1. В результате технологических исследований установлен оптимальный состав лиофилизированной липосомальной лекарственной формы тиосенса, содержащий лецитин/холестерин/PEG-2000-DSPE в молярном соотношении 1/0,22/0,002 и с соотношением препарат/лецитин 1/270. Для обеспечения сохранения качества липосомальной дисперсии в процессе лиофилизации подобран эффективный криопротектор – сахароза, в массовом соотношении лецитин/сахароза 1/2.
2. Разработан и масштабирован способ получения стабильной при хранении эффективной лиофилизированной липосомальной лекарственной формы тиосенса для внутривенного введения. Проведено определение оптимальных условий гомогенизации липосомальной дисперсии тиосенса (давление, продолжительность измельчения) и оценено влияние фильтрации на количество включенного в липосомы препарата.
3. Разработана методика качественного хроматографического анализа компонентов лекарственной формы, для обнаружения которых выбраны две системы растворителей – хлороформ/метанол/25 % раствор аммиака (87:12:1) для определения тиосенса и холестерина и хлороформ/н-бутанол/ацетон/ледяная уксусная кислота/вода (25:25:15:5:4) для определения лецитина и сахарозы. Разработана и валидирована методика количественного спектрофотометрического определения тиосенса в составе лиофилизированной липосомальной лекарственной формы с использованием рабочего стандартного образца при длине волны 717±4 нм.
4. Оценена фотодинамическая активность лиофилизированной липосомальной лекарственной формы тиосенса и определено, что наиболее чувствительными опухолями к фотодинамической терапии с ее использованием по критерию торможения роста опухоли являются: опухоль Эрлиха (торможение роста опухоли 76 %), солидный вариант лимфоцитарной лейкемии Р-388 (торможение роста опухоли 76 %) и саркома 37, на которой высокое торможение роста опухоли (94 %) сочетается с излечением 33,3 % животных.
5. Выбраны критерии качества для стандартизации препарата «Тиосенс липосомальный, лиофилизат для приготовления раствора для инъекций 1,5 мг». На трех сериях лиофилизированной липосомальной лекарственной формы тиосенса установлено сохранение противоопухолевой активности и заявленных в проекте ФСП показателей качества в течение 1 года.

СПИСОК РАБОТ, ОПУБЛИКОВАННЫХ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ

1. Санарова Е.В. Определение степени гидролиза липосомальных фосфолипидов // Ломоносов – 2010. Тезисы докладов XVII Международной научной конференции студентов, аспирантов и молодых ученых. Секция Биология. (12-15 апреля 2010, Москва). Москва. – 2010. – С. 36.
2. Санарова Е.В., Игнатьева Е.В., Полозкова А.П., Оборотова Н.А. Влияние фильтрации на включение гидрофобного фотосенсибилизатора Тиосенса в липосомы // Наноонкология: Материалы II Всероссийской научной конференции с международным участием (26-28 сентября 2010, Тюмень). Российский биотерапевтический журнал. – 2010. – Т.9, № 3. – С. 20.
3. Санарова Е.В. Разработка состава липосомальной лекарственной формы тиосенса для фотодинамической терапии опухолей // Интеллектуальный потенциал ХХI века: ступени познания. Сборник материалов II международной студенческой научно-практической конференции (8 июля 2010, Новосибирск). Новосибирск. – 2010. – С. 203–207.
4. Санарова Е.В. Технологические особенности получения липосомальной лекарственной формы тиосенса // Современные проблемы гуманитарных и естественных наук: Материалы III Международной научно-практической конференции (20-25 июля 2010, Москва). Москва. – 2010. – С. 375–376.
5. Смирнова З.С., Борисова Л.М., Киселева М.П., Санарова Е.В., Лукьянец Е.А., Меерович Г.А. Противоопухолевое действие фотодинамической терапии с тиосенсом-лио на перевиваемых опухолях мышей // Наноонкология: Материалы II Всероссийской научной конференции с международным участием (26-28 сентября 2010, Тюмень). Российский биотерапевтический журнал. – 2010. – Т.9, № 3. – С. 20–21.
6. Санарова Е.В., Полозкова А.П., Орлова О.Л., Партолина С.А., Родионова Ю.В., Оборотова Н.А. Отработка методики измельчения липосом Тиосенса при масштабировании технологического процесса // Отечественные противоопухолевые препараты: Материалы X Всероссийской научной конференции с международным участием (22-23 марта 2011, Москва). Российский биотерапевтический журнал. – 2011. – Т. 10, № 1. – С. 54–55.
7. Санарова Е.В., Игнатьева Е.В., Полозкова А.П., Оборотова Н.А. Оценка влияния криопротекторов на размер липосом Тиосенса // Отечественные противоопухолевые препараты: Материалы X Всероссийской научной конференции с международным участием (22-23 марта 2011, Москва). Российский биотерапевтический журнал. – 2011. – Т. 10, № 1. – С. 54.
8. Санарова Е.В., Котова Е.А. Сравнение технологии изготовления липосомальных лекарственных форм гидрофильных и гидрофобных веществ // Тезисы докладов IV Архангельской международной медицинской научной конференции молодых ученых и студентов к 300-летию со дня рождения М.В. Ломоносова (26-27 апреля 2011, Архангельск). Бюллетень Северного Государственного медицинского университета. – 2011. – № 1; выпуск XXVI. – С. 274–275.
9. Kotova E.A., Sanarova E.V. Comparison of hydrophilic and hydrophobic liposomal drugs preparation technology // Тезисы докладов IV Архангельской международной медицинской научной конференции молодых ученых и студентов к 300-летию со дня рождения М.В. Ломоносова (26-27 апреля 2011, Архангельск). Бюллетень Северного Государственного медицинского университета. - 2011. – выпуск XXVI; № 1. – С. 345.
10. Котова Е.А., Санарова Е.В., Ланцова А.В., Денисова Т.В., Краснюк И.И., Оборотова Н.А. Сравнение уровня перекисного окисления фосфолипидов в однослойных липосомах полученных различными способами // Биомедицинская инженерия и биотехнология: Сборник материалов IV Всероссийской научно-практической конференции с международным участием (июнь 2011, Курск). – Курск. – 2011. – С. 53–55.
11. Санарова Е.В., Игнатьева Е.В., Меерович И.Г., Полозкова А.П., Орлова О.Л., Смирнова З.С., Оборотова Н.А. Параметры технологического процесса получения липосомальной лекарственной формы Тиосенса // Наноонкология: Материалы III Всероссийской научной конференции с международным участием (6-7 сентября 2011, Саратов). Российский биотерапевтический журнал. – 2011. – Т.10, №4. – С. 110–111.
12. Санарова Е.В., Котова Е.А., Полозкова А.П., Игнатьева Е.В., Ланцова А.В., Денисова Т.В., Краснюк И.И., Оборотова Н.А. Индекс окисленности липосомальных фосфолипидов на стадиях технологического процесса // Наноонкология: Материалы III Всероссийской научной конференции с международным участием (6-7 сентября 2011, Саратов). Российский биотерапевтический журнал. – 2011. – Т.10, №4. – С. 111.
13. Котова Е.А., Санарова Е.В., Козеев С.Г., Ланцова А.В., Орлова О.Л., Партолина С.А., Игнатьева Е.В., Краснюк И.И., Оборотова Н.А. Окисление фосфолипидов липосом в процессе лиофилизации // Наноонкология: Материалы III Всероссийской научной конференции с международным участием (6-7 сентября 2011, Саратов). Российский биотерапевтический журнал. – 2011. – Т.10, №4. – С. 101–102.
14. Ермакова К.В., Смирнова З.С., Кубасова И.Ю., Борисова Л.М., Киселева М.П., Оборотова Н.А., Орлова О.Л., Полозкова А.П., Санарова Е.В., Меерович Г.А. Эффективность лиофилизированной липосомальной лекарственной формы отечественного фотосенсибилизатора Тиосенс при фотодинамической терапии олигодендроглиомы 14-4-9 Наноонкология: Материалы III Всероссийской научной конференции с международным участием (6-7 сентября 2011, Саратов). Российский биотерапевтический журнал. – 2011. – Т.10, №4. – С. 97.
15. Игнатьева Е.В., Машалова Н.А., Санарова Е.В., Ярцева И.В. Модификация методики определения лецитина в лекарственной форме Тиосенса // Наноонкология: Материалы III Всероссийской научной конференции с международным участием (6-7 сентября 2011, Саратов). Российский биотерапевтический журнал. – 2011. – Т.10, №4. – С. 98–99.
16. Санарова Е.В., Полозкова А.П., Меерович И.Г., Ланцова А.В., Игнатьева Е.В., Орлова О.Л., Оборотова Н.А. Влияние технологических факторов на качество липосомальной лекарственной формы нового фотосенсибилизатора – тиосенса // Химико-фармацевтический журнал. – 2011. – Т.45, № 12. – С. 32–36.
17. Санарова Е.В., Полозкова А.П., Оборотова Н.А. Лиофилизированная наноструктурированная лекарственная форма тиосенса // Всероссийский журнал научных публикаций. – 2011. – август. – С.74–76.
18. Санарова Е.В., Смирнова З.С., Полозкова А.П., Игнатьева Е.В., Борисова Л.М., Киселева М.П., Меерович Г.А., Меерович И.Г., Оборотова Н.А. Биофармацевтические исследования новой липосомальной лекарственной формы Тиосенса // Биофармацевтический журнал. – 2011. – Т. 3,. № 6. – С. 33–36.
19. Смирнова З.С., Санарова Е.В., Борисова Л.М., Киселева М.П., Оборотова Н.А., Орлова О.Л., Полозкова А.П., Меерович Г.А., Лукьянец Е.А. Противоопухолевая активность фотодинамической терапии с липосомальной лекарственной формой тиосенса на перевиваемых опухолях мышей // Российский биотерапевтический журнал. – 2011. – Т.10, №4. – С. 55–59.
20. Санарова Е.В., Полозкова А.П., Ланцова А.В., Орлова О.Л., Оборотова Н.А. Солюбилизация гидрофобного фотосенсибилизатора «Тиосенс» с помощью липосом // Сандеровские чтения: материалы международной научно-методической конференции (3-4 февраля 2012, Санкт-Петербург). – Санкт-Петербург. – 2012. – С. 131-134.
21. Санарова Е.В., Котова Е.А., Козеев С.Г., Ланцова А.В., Игнатьева Е.В., Краснюк И.И., Оборотова Н.А. Качество липосомальных фосфолипидов на этапах технологического процесса // Химико-фармацевтический журнал. – 2012. – Т.46, № 3. – С. 50-53.
22. Аршинова О.Ю., Санарова Е.В., Ланцова А.В., Оборотова Н.А. Особенности лиофилизации липосомальных лекарственных препаратов // Химико-фармацевтический журнал. – 2012. – Т.46, № 4. – С. 29-34.
23. Санарова Е.В., Полозкова А.П., Орлова О.Л., Ланцова А.В., Оборотова Н.А. Разработка плана валидации технологического процесса получения лиофилизированной липосомальной лекарственной формы тиосенса // Отечественные противоопухолевые препараты: Материалы XI Всероссийской научной конференции с международным участием (30 мая – 1 июня 2012, Нижний Новгород). Российский биотерапевтический журнал. – 2012. – Т. 11, № 2. – С. 46.
24. Смирнова З.С., Ермакова К.В., Кубасова И.Ю., Борисова Л.М., Киселева М.П., Санарова Е.В., Ланцова А.В., Полозкова А.П., Оборотова Н.А., Меерович Г.А. Эффективность фотодинамической терапии с отечественным фотосенсибилизатором Тиосенс на глиоме С6 крыс // Отечественные противоопухолевые препараты: Материалы XI Всероссийской научной конференции с международным участием (30 мая – 1 июня 2012, Нижний Новгород). Российский биотерапевтический журнал. – 2012. – Т. 11, № 2. – С. 49.