Создание и биофармацевтическое обоснование термочувствительной липосомальной лекарственной формы доксорубицина
На правах рукописи
Тазина Елизавета Владимировна
СОЗДАНИЕ И БИОФАРМАЦЕВТИЧЕСКОЕ ОБОСНОВАНИЕ ТЕРМОЧУВСТВИТЕЛЬНОЙ ЛИПОСОМАЛЬНОЙ
ЛЕКАРСТВЕННОЙ ФОРМЫ ДОКСОРУБИЦИНА
14.04.01 – технология получения лекарств
Автореферат диссертации на соискание ученой степени кандидата фармацевтических наук
Москва – 2010
Работа выполнена в НИИ экспериментальной диагностики и терапии опухолей Учреждения Российской академии медицинских наук Российский онкологический научный центр имени Н.Н.Блохина РАМН (РОНЦ им. Н.Н.Блохина РАМН).
Научные руководители:
доктор фармацевтических наук,
профессор Оборотова Наталия Александровна
доктор медицинских наук,
профессор Барышников Анатолий Юрьевич
Официальные оппоненты:
доктор фармацевтических наук,
профессор Демина Наталья Борисовна
доктор фармацевтических наук,
профессор Саканян Елена Ивановна
Ведущая организация: Учреждение Российской академии медицинских наук Научно-исследовательский институт фармакологии имени В.В.Закусова РАМН
Защита диссертации состоится «____» ________________ 2010 г. в _____ часов на заседании диссертационного совета Д.208.040.09 при ГОУ ВПО Московская медицинская академия имени И.М.Сеченова Росздрава по адресу: 121019, г. Москва, Никитский бульвар, д. 13.
С диссертацией можно ознакомиться в Центральной научной медицинской библиотеке ГОУ ВПО ММА им. И.М.Сеченова Росздрава по адресу: 117418, г. Москва, Нахимовский проспект, д. 49.
Автореферат разослан «____» _______________ 2010 г.
Ученый секретарь
диссертационного совета Д.208.040.09
доктор фармацевтических наук,
профессор Садчикова Наталья Петровна
ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ
Актуальность темы. Антрациклиновый антибиотик доксорубицин обладает высокой противоопухолевой и противолейкозной активностью при низкой избирательности действия. Одной из характерных токсикологических особенностей препарата является кардиотоксичность. Включение цитостатика в липосомы позволяет оптимизировать его противоопухолевый эффект. В настоящее время на мировом фармацевтическом рынке присутствует несколько липосомальных форм доксорубицина: Доксил®, Келикс®, в состав которых входит полиэтиленгликоль (ПЭГ), защищающий липосомы от обнаружения и захвата фагоцитарной системой, поэтому ПЭГ-липосомы позволяют поддерживать более высокую концентрацию доксорубицина в крови в течение длительного времени.
С целью увеличения избирательности противоопухолевого действия доксорубицина актуальны исследования по созданию термочувствительных липосом, используемых в комбинации с локальной гипертермией. Термолипосомы высвобождают цитостатик в процессе нагревания опухоли до температуры 40-43 °C. При этой температуре в липосомальной мембране образуются поры, через которые инкапсулированный доксорубицин проникает в окружающее пространство. Новый препарат ThermoDox®, созданный компанией Celsion Corporation совместно с Duke University (США), в сочетании с высокочастотной аблацией проходит III фазу клинических испытаний при гепатоцеллюлярном раке, а с нагревом токами сверхвысокой частоты (СВЧ-нагревом) – I-II фазы клинических испытаний при рецидивирующем раке молочной железы.
В РОНЦ им. Н.Н.Блохина РАМН совместно с МИТХТ им. М.В.Ломоносова разработана модель термолипосомального доксорубицина, однако ее существенным недостатком изначально являлась невысокая эффективность инкапсулирования цитостатика в везикулы, для увеличения которой потребовалась модификация технологии получения лекарственной формы. Данная работа посвящена оптимизации состава, технологии производства и разработке методов анализа термочувствительной липосомальной лекарственной формы доксорубицина.
Цель и задачи исследования. Получение термочувствительной липосомальной лекарственной формы доксорубицина для увеличения селективности доставки препарата в опухоль.
В соответствии с целью были поставлены следующие задачи:
- Оптимизировать технологию получения термолипосомального доксорубицина с высокой степенью загрузки цитостатика в везикулы: выбрать подходящий состав термолипосомальной мембраны и соотношение препарат : суммарные липиды.
- Разработать методику очистки термолипосомальной дисперсии от невключившегося цитостатика.
- Подобрать криопротектор, разработать режим лиофилизации термолипосомального доксорубицина и наработать лиофилизированный препарат в количестве, достаточном для проведения химико-фармацевтических и биологических исследований.
- Разработать методики химико-фармацевтического анализа термолипосом с доксорубицином.
- Выбрать критерии качества готового препарата, провести его стандартизацию и изучить стабильность в процессе хранения.
- Провести оценку биологической активности лиофилизированного термолипосомального доксорубицина в сочетании с локальной гипертермией in vitro и in vivo.
Научная новизна исследования. Разработан состав и технология производства лиофилизированного термолипосомального доксорубицина. Изучено влияние различных криопротекторов на стабильность термолипосом с доксорубицином до и после лиофилизации, а также в процессе замораживания до температуры –18 °C. Разработан режим лиофилизации термолипосомального доксорубицина. Разработаны методики химико-фармацевтического анализа термолипосом с доксорубицином. Выбраны критерии и параметры качества лиофилизированного термолипосомального доксорубицина, разработан проект ФСП на препарат «Доксорубицин термолипосомальный, лиофилизат для приготовления раствора для инъекций 0,7 мг». Показана стабильность лекарственной формы в процессе хранения в течение одного года при температуре 18 °C. В биологических экспериментах показано, что термолипосомальный препарат в комбинации с локальной гипертермией обладает большей избирательностью действия по сравнению со свободным доксорубицином.
Практическая значимость и внедрение результатов исследования. Создана новая термочувствительная липосомальная лекарственная форма высокоактивного противоопухолевого антибиотика доксорубицина для использования в комбинации с локальной гипертермией. В экспериментальных исследованиях in vitro и in vivo выявлено преимущество новой лекарственной формы перед субстанцией доксорубицина. Разработан проект ФСП, в соответствии с которым проведена стандартизация препарата «Доксорубицин термолипосомальный, лиофилизат для приготовления раствора для инъекций 0,7 мг».
В РФ в настоящее время липосомальные лекарственные формы не производятся. Разработка и производство собственного высокоэффективного препарата для лечения онкологических больных позволит расширить его доступность для широкого круга отечественных пациентов, повысив тем самым лекарственную безопасность страны.
Внедрено в учебный процесс методическое пособие «Липосомальные формы лекарственных препаратов» для системы послевузовского профессионального образования провизоров.
Апробация работы. Материалы проведенных исследований представлены на конференциях: VI, VII и VIII Всероссийской научно-практической конференции с международным участием «Отечественные противоопухолевые препараты» (24-26 марта 2007 г., 17-19 марта 2008 г. и 21-22 апреля 2009 г., Москва); VIII конференции молодых онкологов с международным участием «Современные проблемы экспериментальной и клинической онкологии» (26-27 апреля 2007 г., Киев); The 2008 Nanotechnology Conference and Trade Show, NSTI Nanotech 2008, 11th Annual Conference (June 1-5, 2008, Boston, Massachusetts, USA); The Second Saint-Petersburg International Conference on NanoBioTechnologies, NanoBio 2008 (16-18 June 2008, Saint-Petersburg, Russia); XII и XIII Российском онкологическом конгрессе (18-20 ноября 2008 г. и 17-19 ноября 2009 г., Москва); The 2008 Materials Research Society (MRS) Fall Meeting (December 1-5, 2008, Boston, Massachusetts, USA); III съезде токсикологов России (2-5 декабря 2008 г., Москва); Международном форуме по нанотехнологиям Rusnanotech 2008 и Rusnanotech 2009 (3-5 декабря 2008 г. и 6-8 октября 2009 г., Москва); Всероссийской научной конференции с международным участием «Наноонкология» (18-19 февраля 2009 г., Москва); IV региональной конференции молодых ученых-онкологов имени академика РАМН Н.В. Васильева «Актуальные вопросы экспериментальной и клинической онкологии» (24 апреля 2009 г., Томск); Российской научно-практической конференции с международным участием, посвященной 30-летию НИИ онкологии СО РАМН «Современная онкология: достижения и перспективы развития» (10-11 сентября 2009 г., Томск).
Апробация диссертационной работы прошла 28 сентября 2009 г. в НИИ экспериментальной диагностики и терапии опухолей РОНЦ им. Н.Н.Блохина РАМН.
Публикации. По материалам диссертации опубликовано 30 печатных работ, из них 5 статей, 5 тезисов докладов на английском языке и 20 тезисов на русском языке.
Связь темы диссертационной работы с планом научных работ учреждения. Диссертационная работа выполнена в соответствии с планом научно-исследовательских работ НИИ ЭДиТО РОНЦ им. Н.Н.Блохина РАМН по теме: «Разработка и создание новых лекарственных форм для медицинской промышленности» (№ гос. регистрации 01.200.316267), а также в рамках научно-технической программы «Разработка и практическое освоение в здравоохранении новых методов и средств профилактики, диагностики и лечения онкологических, инфекционных и других опасных заболеваний» на 2007-2009 гг.
Положения, выносимые на защиту:
- Состав и технология производства лиофилизированного термолипосомального доксорубицина.
- Методики химико-фармацевтического анализа: спектрофотометрическое определение содержания доксорубицина в лекарственной форме и хроматографическое определение компонентов лекарственной формы.
- Результаты контроля качества шести наработанных серий препарата и изучения их стабильности в процессе хранения при температуре 18 °C.
- Результаты оценки эффективности действия термолипосомального доксорубицина в сочетании с локальной гипертермией in vitro и in vivo.
Структура и объем диссертации. Диссертационная работа состоит из введения, обзора литературы, описания материалов и методов, четырех глав результатов собственных исследований, общего заключения, общих выводов, списка литературы и приложений. Работа изложена на 244 страницах машинописного текста, содержит 92 рисунка и 54 таблицы. Библиографический список включает 318 наименований, в том числе 278 – на иностранном языке.
СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ
Материалы и методы исследований
1. Получение термолипосом с инкапсулированным доксорубицином (Докс-ТЛ)
В результате проведенных экспериментов разработаны следующие прописи Докс-ТЛ:
| Пропись 1 на 40 мл: | Пропись 2 на 40 мл: | ||
| Дипальмитоилфосфатидилхолин (DPPC) | 105,28 мг | Дипальмитоилфосфатидилхолин (DPPC) | 103,98 мг |
| Дистеароилфосфатидилхолин (DSPC) | 12,60 мг | Дистеароилфосфатидилхолин (DSPC) | 12,44 мг |
| Дистеароилфосфатидилэтаноламин-ПЭГ-2000 (DSPE-PEG-2000) | 0,90 мг | Дистеароилфосфатидилэтаноламин-ПЭГ-2000 (DSPE-PEG-2000) | 0,88 мг |
| Холестерин (Chol) | 1,24 мг | Холестерин (Chol) | 1,22 мг |
| -токоферола ацетат (-TA) | 1,48 мг | ||
 | 120 мг |  | 120 мг |
| Доксорубицин | 16 мг | Доксорубицин | 16 мг |
Молярные соотношения компонентов термолипосомальной мембраны:
Пропись 1 – DPPC : DSPC : Chol : DSPE-PEG-2000 = 9 : 1 : 0,2 : 0,02;
Пропись 2 – DPPC : DSPC : Chol : DSPE-PEG-2000 : -TA = 9 : 1 : 0,2 : 0,02 : 0,2.
Весовое соотношение препарат : суммарные липиды составляло 0,13 : 1.
Для получения пустых термолипосом (ТЛ) использовали метод обращения фаз. Липиды (1,2-дипальмитоил-sn-глицеро-3-фосфохолин (DPPC), 1,2-дистеароил-sn-глицеро-3-фосфохолин (DSPC), Lipoid GmbH, Германия), 1,2-дистеароил-sn-глицеро-3-фосфоэтаноламин-N-[метокси(полиэтиленгликоль)-2000] аммониевая соль (DSPE-PEG-2000) и холестерин (Avanti Polar Lipids, Inc., США) растворяли в хлороформе. В случае прописи 2 с целью предотвращения окисления липидов добавляли -токоферола ацетат. Органический растворитель упаривали под вакуумом до образования липидной пленки. Высушенную липидную пленку гидратировали раствором сульфата аммония при постоянном перемешивании и нагревании до 50 °C. Образовавшуюся дисперсию мультиламеллярных везикул (МЛВ) экструдировали через поликарбонатные мембраны Nuclepore (Whatman, Великобритания) с размером пор 200 нм при температуре 50 °C с помощью мини-экструдера Avanti Mini-Extruder (Avanti Polar Lipids, Inc., США). Доксорубицин (Докс), ОАО ОНОПБ (Россия) загружали в ТЛ против градиента сульфата аммония. Градиент концентрации сульфата аммония формировался при двадцатикратном разбавлении термолипосомальной дисперсии 10 мМ буфером HEPES (N-2-гидроксиэтилпиперазин-N'-2-этансульфоновая кислота), AppliChem GmbH (Германия) с криопротектором – 4 % сахарозой (pH 8,4).
Свежеприготовленную дисперсию Докс-ТЛ подвергали стерилизующей фильтрации под давлением через нейлоновые мембранные фильтры с размером пор 0,45 мкм и 0,22 мкм (Pall Corporation, США). Для стабилизации Докс-ТЛ проводили их сублимационную сушку. Анализ среднего диаметра везикул и оценку их распределения по размерам проводили с использованием метода корреляционной спектроскопии светорассеяния (динамического лазерного светорассеяния) на наносайзере Nicomp 380 Submicron Particle Sizer (Particle Sizing Systems, США).
Рис. 1. Гель-фильтрация образцов пустых ТЛ, 10 мМ буфера HEPES с 4 % сахарозой и Докс-ТЛ.
Термолипосомальную дисперсию Докс очищали от не включившегося в везикулы препарата методом колоночной хроматографии (гель-фильтрации) с целью количественного определения содержания цитостатика в дисперсии и оценки эффективности его инкапсулирования в ТЛ. На хроматографическую колонку C 10/20, заполненную сефадексом G-50 Superfine (Amersham Biosciences, Швеция), наносили 1 мл дисперсии Докс-ТЛ. В качестве элюента использовали 0,15 М раствор хлорида натрия, скорость элюции составляла 0,3-0,4 мл/мин. Процесс очистки контролировали с помощью детектора UVis-920 и рекордера REC 111 (Amersham Biosciences, Швеция), фиксировавшего разделение в виде пиков. На выходе из колонки получали три фракции (рис. 1): I фракция – очищенный термолипосомальный Докс (первый пик на рис. 1), II фракция – буфер HEPES с 4 % сахарозой (второй пик на рис. 1); III фракция – не включившийся в везикулы Докс (третий пик на рис. 1). Видно, что термолипосомальный Докс начинал сходить через 16-20 мин после нанесения на колонку, 10 мМ буфер HEPES с 4 % сахарозой выходил спустя 39-42 мин, а не включившийся в везикулы Докс – через 59-60 мин. Процесс гель-фильтрации термолипосомального Докс в целом занимал около 1 ч 30 мин-1 ч 40 мин.
2. Количественный анализ Докс-ТЛ
Содержание Докс в ТЛ определяли методом спектрофотометрии с использованием рабочего стандартного образца (РСО) Докс при длине волны 252 ± 2 нм. Измерение оптической плотности спиртовых растворов Докс-ТЛ и РСО Докс проводили относительно 95 % этилового спирта в кюветах с толщиной оптического слоя 10 мм.
Содержание Докс (Х, мг) рассчитывали по формуле:
X = 
(1),
где D – оптическая плотность раствора образца; Do – оптическая плотность РСО Докс; C – величина разбавления образца; Co – величина разбавления РСО Докс; а – навеска РСО Докс, мг.
Эффективность включения Докс в ТЛ (B, %) вычисляли по формуле:
B = 
100 % (2),
где D1 – оптическая плотность раствора фракции с очищенным термолипосомальным Докс; D – оптическая плотность раствора исходной термолипосомальной дисперсии; C1 – величина разбавления фракции с очищенным термолипосомальным Докс; C – величина разбавления исходной термолипосомальной дисперсии; V1 – объем фракции с очищенным термолипосомальным Докс, мл; V – объем исходной термолипосомальной дисперсии, нанесенной на колонку, мл.
3. Изучение противоопухолевой активности Докс-ТЛ in vitro и in vivo
Изучение биологической активности свободного Докс и Докс-ТЛ проводили на культурах клеток меланомы В-16 мышей и V-79 китайского хомячка. Критериями активности служили снижение скорости роста клеток (оценка – по степени конверсии красителя АламарБлю, который при метаболизме в клетках меняет цвет с синего на красный) и степень сохранения ими способности к неограниченному делению (образованию макроколоний, рассматриваемому как критерий выживаемости клеток). Препараты вводили в суспензию клеток меланомы В-16 в дозах, соответствующих 1-15 мкг/мл Докс, а в суспензию клеток V-79 китайского хомячка – в дозе 10 мкг/мл Докс. Клетки с препаратами инкубировали в течение 1 ч при 37 °C или 42,5 °C.
Исследования in vivo проводили на меланоме В-16 и солидной карциноме Эрлиха линии ELD, привитых мышам в мышцу голени за 8 дней до начала эксперимента. В день опыта диаметр растущей опухоли голени составлял 7-9 мм. Каждая экспериментальная группа состояла из 6 животных, контрольная – из 8-10 животных. Свободный Докс и Докс-ТЛ вводили мышам в ретроорбитальный синус из расчета 9 мг/кг Докс и 4,5 мг/кг Докс. Локальную гипертермию (ГТ) голени с опухолью проводили в водяном ультратермостате и начинали через 20 мин после введения животным препаратов в случае меланомы В-16, а в случае карциномы Эрлиха – через 10-12 мин, 15-20 мин и 35-40 мин после введения препаратов. Продолжительность ГТ составляла 30 мин при 43 °C. Наблюдение за животными состояло в измерении габаритных размеров опухолей, которое проводили трижды в неделю в течение нескольких недель после лечения, и фиксации момента гибели животных. Динамику роста опухоли в разных группах животных рассчитывали как отношение средних габаритных объемов опухоли в день измерения (Vt) к объемам в день начала эксперимента (Vo).
Критерием оценки противоопухолевой активности препаратов служило торможение роста опухоли (ТРО, %), которое рассчитывали по формуле:
ТРО % = 
% (3),
где V – средний объем опухоли (мм3) в подопытной и контрольной группах соответственно, на конкретный срок.
Выживаемость животных (SA, %) в каждой группе вычисляли по формуле:
SA = 
% (4),
где Nd – количество выживших животных в группе на конкретный срок; No – общее количество животных в группе.
Результаты исследований
1. Разработка методики спектрофотометрического определения содержания Докс в термолипосомальной лекарственной форме
Процедура разработки спектрофотометрической методики количественного определения действующего вещества в лекарственной форме включала следующие основные этапы:
- Изучение спектра поглощения электромагнитного излучения действующим веществом в спиртовом растворе, определение максимумов поглощения и их интенсивности, выбор рабочей длины волны.
- Проверка соблюдения основного закона светопоглощения Бугера-Ламберта-Бера.
- Выбор рабочих концентраций исследуемых растворов, при которых оптическая плотность составляет 0,2-0,7 единиц.
- Изучение влияния вспомогательных веществ, входящих в состав лекарственной формы, на спектральные характеристики действующего вещества.
Оптическую плотность спиртовых растворов субстанции Докс и Докс-ТЛ измеряли в диапазоне длин волн от 200 нм до 600 нм. Полученные спектры поглощения показаны на рис. 2.
Рис. 2. Спектры поглощения спиртовых растворов субстанции Докс и Докс-ТЛ.
Как видно из рис. 2, спиртовые растворы субстанции Докс и Докс-ТЛ имели шесть максимумов поглощения в области от 200 нм до 600 нм при следующих длинах волн: 234 нм, 252 нм, 288 нм, 480 нм, 496 нм и 532 нм.
В качестве аналитической выбирали длину волны, на которой пик Докс был наиболее выраженным и узким. Такой пик отмечали при длине волны 252 нм.
Линейная зависимость оптической плотности для спиртового раствора субстанции Докс при 252 нм соблюдалась в интервале концентраций от 1,21 мкг/мл до 30,88 мкг/мл, а для спиртового раствора Докс-ТЛ – в диапазоне концентраций от 1,45 мкг/мл до 30,96 мкг/мл. Оптическая плотность спиртовых растворов находилась в пределах 0,2-0,7 единиц при концентрации Докс 5-16 мкг/мл.
При изучении влияния вспомогательных веществ на оптические характеристики раствора Докс установили, что вспомогательные вещества в соотношениях, соответствовавших составу лекарственной формы, практически не влияли на поглощение Докс и не мешали его спектрофотометрическому определению.
Содержание Докс в свежеприготовленной термолипосомальной дисперсии, которое рассчитывали по значениям оптической плотности, измеренной при длине волны 252 ± 2 нм, составляло 0,388 ± 0,002 мг/мл, относительная ошибка среднего результата (
) не превышала 0,52 %.
В процессе исследования была проведена валидация методики количественного определения содержания Докс в ТЛ по следующим характеристикам: правильность, повторяемость (сходимость), воспроизводимость, специфичность (селективность) и линейность. Для проведения градуировки методики измеряли оптическую плотность модельных смесей с разными концентрациями Докс при длине волны 252 ± 2 нм.
Результаты количественного определения Докс в модельных смесях, а также в лекарственной форме описывались линейной зависимостью y = 0,00139 + 0,04324x с коэффициентом корреляции R = 0,99927.
2. Разработка методик хроматографического определения Докс, липидов и сахарозы в составе термолипосомальной лекарственной формы
2.1. Хроматографическое определение Докс и липидов в Докс-ТЛ
Качественный анализ термолипосомального Докс методом тонкослойной хроматографии (ТСХ) проводили в следующих системах растворителей:
- хлороформ – метанол – вода (60:30:5), (65:25:4), (75:25:4) и (80:20:3);
- хлороформ – метанол – концентрированный аммиак (60:35:5), (60:40:1) и (65:25:4);
- хлороформ – метанол – вода – концентрированный аммиак (90:54:5,5:5,5);
- хлороформ – метанол – ледяная уксусная кислота – вода (50:25:8:4), (25:15:4:2), (60:50:1:4), (80:20:14:6) и (90:40:12:2);
- хлороформ – ацетон – метанол – ледяная уксусная кислота – вода (6:8:2:2:1).
На линию старта хроматографической пластинки «Sorbfil» 10 x 10 см (Россия) и «Silica gel 60 F 254» 10 x 20 см (Merck KGaA, Германия) наносили по 20 мкл образцов Докс-ТЛ и стандартных образцов веществ-свидетелей (СОВС). Пластину с нанесенными пробами проявляли парами йода. Пятна липидов идентифицировали по желтой или желто-коричневой окраске, а пятно Докс – по характерной красно-розовой окраске.
Методом ТСХ установили, что лиофилизированные Докс-ТЛ по составу не отличались от свежеприготовленных Докс-ТЛ и не содержали примесей или каких-либо продуктов деградации, кроме действующего и вспомогательных веществ, что служило качественной характеристикой для оценки стабильности лекарственной формы.
Во всех исследованных системах растворителей липиды (DPPC и DSPC) имели близкие значения Rf и при хроматографировании Докс-ТЛ определялись одним пятном.
Наиболее четкое разделение липидов и Докс в составе лекарственной формы наблюдали в системах растворителей хлороформ – метанол – концентрированный аммиак (65:25:4) и хлороформ – метанол – ледяная уксусная кислота – вода (25:15:4:2). Предел обнаружения липидов в указанных системах составил 1,0 мкг. Предел обнаружения Докс в системе хлороформ – метанол – концентрированный аммиак (65:25:4) составил 1,0 мкг, а в системе хлороформ – метанол – ледяная уксусная кислота – вода (25:15:4:2) – 0,5 мкг. Холестерин и DSPE-PEG-2000 содержались в термолипосомальной лекарственной форме в очень маленьких количествах, и поэтому в данных хроматографических системах не обнаруживались. Сахароза при проявлении парами йода также не давала никаких пятен на пластинках.
Наименее удачной оказалась хроматографическая система хлороформ – метанол – вода, в которой липиды и Докс в составе лекарственной формы не разделялись.
Хроматографическое определение Докс-ТЛ в системах хлороформ – метанол – концентрированный аммиак (65:25:4) и хлороформ – метанол – ледяная уксусная кислота – вода (25:15:4:2) показано на рис. 3-4.
 |  |
| Рис. 3. ТСХ Докс-ТЛ на пластинке «Silica gel 60 F 254» в системе хлороформ – метанол – аммиак (65:25:4): 1 – Докс-ТЛ; 2 – DPPC (52 мкг); 3 – DSPC (6 мкг); 4 – Докс (7 мкг); 5 – Докс (7 мкг) + DSPC (6 мкг). | Рис. 4. ТСХ Докс-ТЛ на пластинке «Sorbfil» в системе хлороформ – метанол – ледяная уксусная кислота – вода (25:15:4:2): 1 – Докс-ТЛ; 2 – DPPC (52 мкг); 3 – DSPC (6 мкг); 4 – Докс (7 мкг); 5 – DPPC (52 мкг) + DSPC (6 мкг). |
2.2. Хроматографическое определение сахарозы в Докс-ТЛ
Анализ Докс-ТЛ на наличие сахарозы проводили в системах растворителей 1,2-дихлорэтан – безводная уксусная кислота – метанол – вода (10:5:3:2) и изопропиловый спирт – ацетон – эфир – вода (7:7:2:4). На линию старта хроматографической пластинки «Sorbfil» или «Silica gel 60 F 254» наносили по 5 мкл образцов Докс-ТЛ, пустых ТЛ и СОВС. Хроматограммы проявляли раствором 1-нафтола в смеси 95 % этилового спирта и серной кислоты. Пятна сахарозы идентифицировали по сиреневой или черно-фиолетовой окраске.
Хроматографическое определение сахарозы, Докс-ТЛ и пустых ТЛ на пластинках «Sorbfil» и «Silica gel 60 F 254» в системах растворителей 1,2-дихлорэтан – безводная уксусная кислота – метанол – вода (10:5:3:2) и изопропиловый спирт – ацетон – эфир – вода (7:7:2:4) показано на рис. 5-6.
 |  |
| Рис. 5. ТСХ Докс-ТЛ и ТЛ на пластинке «Silica gel 60 F 254» в системе 1,2-дихлорэтан – безводная уксусная кислота – метанол – вода (10:5:3:2): 1 – Сахароза (9,5 мкг); 2 – ТЛ (47,5 мкг); 3 – ТЛ (9,5 мкг); 4 – Докс-ТЛ (47,5 мкг); 5 – Докс-ТЛ (9,5 мкг). | Рис. 6. ТСХ Докс-ТЛ на пластинке «Silica gel 60 F 254» в системе изопропиловый спирт – ацетон – эфир – вода (7:7:2:4): 1 – Сахароза (19 мкг); 2 – Сахароза (9,5 мкг); 3 – Докс-ТЛ (19 мкг); 4 – Докс-ТЛ (9,5 мкг). |
Как видно из рис. 5-6, в данных системах растворителей пятна Докс-ТЛ по форме и окраске соответствовали пятнам СОВС. Докс не мешал хроматографическому определению сахарозы в лекарственной форме. Предел обнаружения сахарозы в системе 1,2-дихлорэтан – безводная уксусная кислота – метанол – вода (10:5:3:2) составил около 0,5 мкг, а в системе изопропиловый спирт – ацетон – эфир – вода (7:7:2:4) – около 0,9 мкг.
3. Оптимизация технологии получения и состава Докс-ТЛ
3.1. Выбор оптимального липидного состава Докс-ТЛ
Для выбора оптимального липидного состава термолипосомальной мембраны изучали шесть составов ТЛ. Критериями выбора являлись: эффективности инкапсулирования Докс в ТЛ и размеры везикул. Полученные результаты представлены в табл. 1.
Таблица 1
Эффективность включения Докс в ТЛ разных составов и размеры везикул
| № | Состав ТЛ | Молярное соотношение | Включение Докс в ТЛ, % | Диаметр везикул, нм |
| 1. | DPPC : DSPC : Chol : DSPE-PEG-2000 : -TA | 9:1:0,2:0,02:0,2 | 94,0 | 170 ± 15 |
| 2. | DPPC : DSPC : Chol : DSPE-PEG-2000 | 9:1:0,5:0,1 | 87,7 | 160 ± 9 |
| 3. | DPPC : DSPC : Chol : DSPE-PEG-2000 | 9:1:0,75:0,2 | 85,7 | 149 ± 7 |
| 4. | DPPC : DSPC : Chol : DSPE-PEG-2000 | 9:1:1:0,3 | 57,8 | 170 ± 6 |
| 5. | DPPC : DSPC : Chol : DSPE-PEG-2000 | 9:1:1,2:0,4 | 60,8 | 184 ± 10 |
| 6. | DPPC : DSPC : Chol | 7:2:1 | 66,9 | 183 ± 8 |
Как видно из табл. 1, при увеличении количества холестерина и ПЭГ в составе термолипосомальной мембраны степень инкапсулирования Докс в везикулы снижалась, размеры частиц при этом менялись незначительно. В свежеприготовленные ТЛ, содержавшие DPPC : DSPC : Chol в молярном соотношении 7:2:1, включилось около 67 % Докс, а спустя 15 ч включение препарата увеличилось до 72,5 %. Включение Докс в везикулы, содержавшие DPPC : DSPC : Chol : DSPE-PEG-2000 : -TA в молярном соотношении 9:1:0,2:0,02:0,2, составило 94 %. Следовательно, данный состав является наиболее оптимальным для получения термочувствительной липосомальной лекарственной формы Докс.
3.2. Выбор оптимального соотношения препарат : суммарные липиды для загрузки Докс в везикулы
Проводилась сравнительная оценка эффективности загрузки Докс в ТЛ с молярным соотношением компонентов мембраны DPPC : DSPC : Chol : DSPE-PEG-2000 = 9 : 1 : 0,2 : 0,02 и разными весовыми соотношениями препарат : суммарные липиды, а также оценка агрегационной устойчивости полученных Докс-ТЛ при комнатной температуре. Полученные результаты представлены в табл. 2.
Таблица 2
Включение Докс в ТЛ при разных весовых соотношениях препарат : суммарные липиды, размеры везикул и их агрегационная устойчивость
| Весовое соотношение препарат : суммарные липиды | Концентрация Докс в дисперсии ТЛ, мг/мл | Включение Докс в ТЛ, % | Диаметр Докс-ТЛ, нм | Агрегационная устойчивость Докс-ТЛ, дни |
| 0,13:1 | 0,4 | 94,3 | 163 ± 9 | 7-8 |
| 0,20:1 | 0,6 | 91,9 | 158 ± 9 | 7 |
| 0,30:1 | 0,9 | 93,6 | 165 ± 10 | 3-4 |
| 0,40:1 | 1,2 | 93,5 | 170 ± 5 | 3 |
| 0,50:1 | 1,5 | 88,6 | 210 ± 5 | 2 |
| 0,60:1 | 1,8 | 86,0 | 180 ± 9 | 2 |
| 0,70:1 | 2,1 | 82,8 | 181 ± 10 | образование осадка в процессе загрузки Докс в ТЛ |
Как видно из табл. 2, включение Докс в ТЛ оставалось высоким при весовых соотношениях препарат : суммарные липиды от 0,13:1 до 0,70:1. Однако агрегационная устойчивость Докс-ТЛ заметно снизилась при увеличении весового соотношения препарат : суммарные липиды от 0,30:1 до 0,70:1. Поэтому для получения агрегационно устойчивого препарата с наибольшей степенью инкапсулирования Докс в везикулы рациональнее использовать весовые соотношения препарат : суммарные липиды 0,13:1 и 0,20:1.
3.3. Изучение влияния размеров ТЛ на включение Докс
Размер везикул определяет их поведение в живых системах, а также влияет на стабильность липосомальных препаратов во время хранения. В данном исследовании изучали влияние размеров ТЛ на включение в них Докс. Наблюдения проводили в течение трех суток после получения термолипосомальной дисперсии с препаратом.
Результаты оценки эффективности инкапсулирования Докс в ТЛ-200, полученные после экструзии через поликарбонатные мембраны с размером пор 200 нм, и ТЛ-100, полученные после последовательной экструзии через мембраны с размером пор 200 нм и 100 нм, представлены в табл. 3.
Как видно из табл. 3, включение Докс в свежеприготовленные ТЛ-200 и ТЛ-100 было довольно высоким (от 86 % до 89 %). На вторые и третьи сутки после приготовления включение препарата в ТЛ-200 увеличилось на 3,0 % и 4,0 % соответственно. В то же время, включение Докс в ТЛ-100 на вторые и третьи сутки уменьшилось на 1,2 % и 2,6 % соответственно. Исходя из этих данных, предположили, что Докс вытекает из более мелких везикул с течением времени. Таким образом, для получения стабильного препарата с наибольшей степенью инкапсулирования Докс в ТЛ экструзию ТЛ рациональнее проводить через поликарбонатные мембраны с диаметром пор 200 нм.
Таблица 3
Размеры везикул и включение Докс в ТЛ-200 и ТЛ-100
| ТЛ | Первые сутки | Вторые сутки | Третьи сутки | |||
| Размер Докс-ТЛ, нм | Включение Докс в ТЛ, % | Размер Докс-ТЛ, нм | Включение Докс в ТЛ, % | Размер Докс-ТЛ, нм | Включение Докс в ТЛ, % | |
| ТЛ-200 | 159 ± 8 | 89,3 | 160 ± 7 | 92,3 | 162 ± 7 | 93,3 |
| ТЛ-100 | 124 ± 5 | 88,7 | 125 ± 4 | 87,5 | 129 ± 7 | 86,1 |
3.4. Выбор оптимального криопротектора для замораживания и лиофилизации термолипосомального Докс
Изучалось влияние различных криопротекторов на включение Докс в свежеприготовленные, замороженные и лиофилизированные ТЛ, а также на размеры везикул. Полученные результаты представлены в табл. 4.
Таблица 4
Размеры везикул и эффективность включения Докс в свежеприготовленные, замороженные, лиофилизированные ТЛ
| Криопротектор | Свежеприготовленные Докс-ТЛ | Докс-ТЛ после замораживания | Докс-ТЛ после лиофилизации | |||
| Диаметр везикул, нм | Включение Докс в ТЛ, % | Диаметр везикул, нм | Включение Докс в ТЛ, % | Диаметр везикул, нм | Включение Докс в ТЛ, % | |
| 2 % сахароза | 150-160 | 90 | 150-165 | 70 | 165-173 | 49 |
| 4 % сахароза | 164-173 | 87 | 165-185 | 86 | 165-175 | 74 |
| 10 % сахароза | 175-189 | 94-95 | – | – | 184-192 | 52-53 |
| 3,7 % сахароза + + 0,4 % коллидон | 160-176 | 95 | – | – | 160-170 | 77 |
| 1,9 % сахароза + + 1,3 % мочевина | 156-170 | 86 | 153-170 | 59 | 154-400 | 52 |
| 3 % декстран 10 000 | 150-156 | 67-70 | 165-400 | агрегация Докс-ТЛ | 192-600 | агрегация Докс-ТЛ |
| 4 % глюкоза | 164-177 | 75 | 155-170 | 68 | 164-174 | 47 |
| 2 % ПЭГ 2000 | 147-157 | 77 | 148-155 | 57 | 185-900, до 1900 | агрегация Докс-ТЛ |
| 2 % сахароза + + 1 % декстран 40 000 | 150-170 | 80 | 140-153 | 62 | 154-167 | 27 |
| 2 % сахароза + + 1 % ПЭГ 2000 | 152-168 | 74 | – | – | 185-194 | 45 |
Из табл. 4 видно, что разные криопротекторы и формообразователи (коллидон) влияли на эффективность инкапсулирования Докс в ТЛ до лиофилизации и особенно после лиофилизации, а также на размеры везикул. После замораживания и лиофилизации наименьшее количество Докс вытекало из ТЛ с 4 % раствором сахарозы, поэтому данный криопротектор был выбран как оптимальный для замораживания и лиофилизации термолипосомального препарата.
4. Разработка режима лиофилизации Докс-ТЛ
Для стабилизации Докс-ТЛ в процессе хранения разрабатывали методику их лиофилизации, при этом исследовали разные режимы замораживания и сублимационной сушки препарата. Оценку влияния способа замораживания и сублимационной сушки термолипосомальной дисперсии на качество готового продукта проводили по таким критериям, как внешний вид лекарственной формы, остаточная влажность, размеры везикул и включение Докс в ТЛ.
На основании проведенных исследований выбрали постепенное замораживание полок сублимационной камеры Minifast DO.2 (Edwards, Великобритания) от +20 °C до 50 °C и постепенное замораживание препарата на полках до 40…45 °C с выдержкой при данной температуре в течение 3 ч. Продолжительность замораживания составляла 6-8 ч. Изучение стабильности дисперсии при низкой температуре показало возможность краткосрочного замораживания и хранения препарата при температуре 18 °C.
В процессе масштабирования технологии получения термолипосомальной лекарственной формы Докс провели 15 сушек, при этом исследовали режимы сублимационной сушки с разным временем выдержки препарата при низкой температуре, с разной скоростью и продолжительностью сушки, а также различной температурой и продолжительностью досушивания продукта. Установили, что уменьшение температуры досушивания препарата с +20 °C до +15 °C не влияет на основные показатели качества лекарственной формы, поэтому в дальнейшем досушивание проводили при температуре +20 °C в течение 3 ч. После всех сублимационных сушек отмечали снижение эффективности инкапсулирования Докс в ТЛ на ~ 8-19 %. В наименьшей степени препарат вытекал из везикул при использовании следующего режима: постепенный нагрев полок от 50…55 °C до 0 °C со скоростью 4-5 °C/ч, а затем нагрев от 0 °C до +20 °C со скоростью 5-6 °C/ч. Данный режим сублимационной сушки выбрали как оптимальный для получения лиофилизированного термолипосомального Докс.
Изучение влияния различных физико-химических факторов на включение Докс в лиофилизированные ТЛ показало, что после сублимационной сушки из ТЛ вытекало до 19 % Докс независимо от растворителей, использовавшихся для регидратации лиофилизата, pH растворителя, времени регидратации, а также буферов для получения исходной термолипосомальной дисперсии. Размеры частиц в процессе сушки и последующей регидратации лиофилизата соответствующим растворителем практически не менялись. В дальнейшем для регидратации лиофилизата выбрали 5 % изотонический раствор глюкозы как наиболее подходящий растворитель.
5. Стандартизация лиофилизированной термочувствительной липосомальной лекарственной формы Докс
Согласно требованиям ГФ XI к препаратам для инъекций выбрали следующие критерии качества лиофилизированной термолипосомальной лекарственной формы Докс: описание, растворимость (регидратация) и время растворения в растворителе для инъекций, подлинность, средняя масса содержимого флакона, размер везикул, pH, потеря в массе при высушивании, количественное определение и однородность дозирования. На основе данных критериев разработали проект ФСП на препарат «Доксорубицин термолипосомальный, лиофилизат для приготовления раствора для инъекций 0,7 мг» и провели контроль качества шести наработанных серий препарата (071007, 081007, 091007, 130108, 140208, 150408) по выбранным критериям. Эти серии заложили на хранение при температуре 18 °C для установления срока годности. Результаты анализа лекарственной формы через полгода и один год хранения представлены в табл. 5.
Из табл. 5 видно, что после одного года хранения в морозильной камере при температуре 18 °C серии 130108, 140208 и 150408 препарата полностью соответствовали критериям и параметрам качества, указанным в ФСП. Серия 091007 не соответствовала требованиям ФСП по критерию потеря в массе при высушивании, которая через год увеличилась на 1,59 %. Серия 071007 препарата не соответствовала требованиям ФСП по критериям потеря в массе при высушивании, которая увеличилась на 1,64 %, и средняя масса содержимого флакона (0,100 г вместо 0,088-0,098 г по ФСП). Серия 081007 после одного года хранения при температуре 18 °C соответствовала требованиям ФСП по всем критериям качества, хотя потеря в массе при высушивании в данном случае увеличилась на 1,36 %.
Таким образом, срок годности серий 071007, 081007 и 091007 препарата «Доксорубицин термолипосомальный, лиофилизат для приготовления раствора для инъекций 0,7 мг» составил полгода, а серий 130108, 140208 и 150408 – один год. Химико-фармацевтические исследования срока годности серий 130108, 140208 и 150408 препарата продолжаются.
Таблица 5
Результаты оценки качества препарата «Доксорубицин термолипосомальный, лиофилизат для приготовления раствора для инъекций 0,7 мг»
| Критерии качества | Пределы по ФСП | Срок хранения | Серия препарата | |||||
| 071007 | 081007 | 091007 | 130108 | 140208 | 150408 | |||
| Описание | Сухая пористая масса красновато-розового цвета. | |||||||
| Растворимость (регидратация) | Образование термолипосомальной дисперсии красновато-розового цвета после добавления к содержимому флакона 2 мл 5 % глюкозы и интенсивного встряхивания в течение 2 мин. | |||||||
| Подлинность | Наличие в электронном спектре поглощения спиртового раствора Докс-ТЛ характеристических максимумов при длинах волн: 232 ± 2 нм, 252 ± 2 нм, 288 ± 2 нм, 480 ± 2 нм, 498 ± 2 нм, 530 ± 2 нм. Докс, липиды и сахарозу в составе лекарственной формы определяли с помощью ТСХ, при этом на хроматограммах отсутствовали дополнительные пятна, указывавшие на присутствие продуктов деградации. | |||||||
| Средняя масса содержимого флакона, г | 0,088-0,098 | 0 | 0,096 | 0,093 | 0,095 | 0,095 | 0,096 | 0,094 |
| 0,5 года | 0,098 | 0,094 | 0,096 | 0,095 | 0,096 | 0,094 | ||
| 1 год | 0,100 | 0,094 | 0,098 | 0,095 | 0,096 | 0,095 | ||
| Диаметр Докс-ТЛ, нм | Не более 250 | 0 | 171 ± 6 | 178 ± 9 | 176 ± 10 | 172 ± 5 | 172 ± 5 | 160 ± 9 |
| 0,5 года | 170 ± 5 | 178 ± 9 | 176 ± 10 | 172 ± 5 | 172 ± 5 | 160 ± 9 | ||
| 1 год | 181 ± 8 | 189 ± 8 | 189 ± 7 | 169 ± 6 | 178 ± 9 | 165 ± 9 | ||
| pH | 7,30-7,80 | 0 | 7,55 | 7,62 | 7,60 | 7,65 | 7,69 | 7,58 |
| 0,5 года | 7,74 | 7,74 | 7,66 | 7,65 | 7,69 | 7,60 | ||
| 1 год | 7,56 | 7,77 | 7,68 | 7,72 | 7,62 | 7,66 | ||
| Потеря в массе при высушивании, % | Не более 3,0 | 0 | 1,47 | 1,44 | 1,44 | 1,67 | 1,31 | 1,15 |
| 0,5 года | 2,14 | 2,03 | 1,55 | 1,67 | 1,31 | 1,17 | ||
| 1 год | 3,11 | 2,80 | 3,03 | 1,65 | 1,35 | 1,74 | ||
| Содержание Докс, мг | 0,60-0,80 | 0 | 0,76 | 0,76 | 0,77 | 0,78 | 0,78 | 0,77 |
| 0,5 года | 0,77 | 0,76 | 0,77 | 0,78 | 0,78 | 0,77 | ||
| 1 год | 0,76 | 0,76 | 0,76 | 0,77 | 0,78 | 0,78 | ||
| Однородность дозирования, % | 85-115 | 0 | 108 | 108 | 110 | 112 | 111 | 111 |
| 0,5 года | 110 | 108 | 110 | 111 | 112 | 111 | ||
| 1 год | 109 | 108 | 109 | 110 | 112 | 111 | ||
6. Изучение биологической активности Докс-ТЛ в сочетании с ГТ
6.1. Изучение биологической активности Докс-ТЛ на клетках in vitro
Результаты оценки действия свободного Докс, пустых ТЛ и лиофилизированных Докс-ТЛ на клетки меланомы B-16 in vitro представлены на рис. 7. Видно, что при 42,5 °C Докс высвобождался из ТЛ в среду и вызывал значительное повреждение и гибель клеток.
 | |
| Рис. 7. Выживаемость клеток меланомы B-16. Инкубация (t = 1 ч при 37 °C и 42,5 °C) в присутствии свободного Докс и Докс-ТЛ трех стандартных серий. Данные оценены по отношению к контролю при 37 °C. | |
| 1 – ТЛ серии 071007 (37 °C) 2 – Докс (37 °C) 3 – Докс-ТЛ серии 071007 (37 °C) 4 – Докс-ТЛ серии 081007 (37 °C) 5 – Докс-ТЛ серии 091007 (37 °C) | 6 – ТЛ серии 071007 (42,5 °C) 7 – Докс (42,5 °C) 8 – Докс-ТЛ серии 071007 (42,5 °C) 9 – Докс-ТЛ серии 081007 (42,5 °C) 10 – Докс-ТЛ серии 091007 (42,5 °C) |
При воздействии свободного Докс, ТЛ и лиофилизированных Докс-ТЛ в дозе 10 мкг/мл на клетки V-79 китайского хомячка также наблюдали усиление степени повреждения клеток термолипосомальным Докс в сочетании с ГТ. После прогревания клеток с Докс-ТЛ их выживаемость снизилась в 3 раза.
Из результатов биологических экспериментов in vitro следует, что пустые ТЛ не обладают цитотоксическим действием. Инкапсулирование Докс в везикулы снижает его цитотоксичность при физиологической температуре. Под влиянием ГТ Докс высвобождается из ТЛ и оказывает заметный угнетающий эффект на рост клеток.
6.2. Изучение биологической активности Докс-ТЛ in vivo
В исследовании на меланоме B-16 наименьшую скорость роста опухоли наблюдали в группе животных, которым провели сеанс ГТ на фоне введения Докс-ТЛ в дозе 9 мг/кг. Терапевтическая эффективность ГТ на фоне в/в введения свободного Докс и Докс-ТЛ на меланоме B-16 представлена в табл. 6. Из табл. 6 видно, что противоопухолевая активность Докс-ТЛ (9 мг/кг) в сочетании с ГТ оказалась выше, чем противоопухолевая активность Докс-ТЛ (9 мг/кг) и ГТ, используемых в монотерапии. Наибольшая выживаемость наблюдалась у животных, которым ввели Докс-ТЛ в дозе 9 мг/кг + ГТ.
Таблица 6
Терапевтическая эффективность ГТ на фоне в/в введения свободного Докс и Докс-ТЛ на меланоме B-16
| Группы животных | ТРО, % | |||||
| Дни после окончания лечения | ||||||
| 1 | 3 | 7 | 12 | 14 | ||
| 1 | Докс (9 мг/кг) | 15 | 39 | 44 | 46 | 53 |
| 2 | Докс-ТЛ (4,5 мг/кг) | 11 | 29 | 3 | 23 | 23 |
| 3 | Докс-ТЛ (9 мг/кг) | 15 | 39 | 13 | 25 | 27 |
| 4 | ГТ | 25 | 58 | 64 * | 67 * | 73 * |
| 5 | Докс (9 мг/кг) + ГТ | 30 | 66 | 78 * | 79 * | 75 * |
| 6 | Докс-ТЛ (4,5 мг/кг) + ГТ | 30 | 65 | 90 * | 89 * | 88 * |
| 7 | Докс-ТЛ (9 мг/кг) + ГТ | 35 | 72 | 91 *, ** | 96 *, ** | 96 *, ** |
Примечания: * p < 0,05 по отношению к контролю;
** p < 0,05 по отношению к ГТ и Докс (9 мг/кг) + ГТ.
В исследовании на карциноме Эрлиха линии ELD наименьшую скорость роста опухоли наблюдали в группе мышей, которым провели ГТ спустя 15-20 мин после введения Докс-ТЛ в дозе 9 мг/кг. Терапевтическая эффективность ГТ на фоне в/в введения свободного Докс и Докс-ТЛ в дозе 9 мг/кг на карциноме Эрлиха линии ELD представлена в табл. 7. Как видно из табл. 7, торможение роста карциномы Эрлиха при воздействии ГТ спустя 15-20 мин после введения Докс-ТЛ было статистически достоверно выше, чем при воздействии ГТ спустя 15-20 мин после введения свободного Докс, за счет большей избирательности действия Докс-ТЛ. Кроме того, выявлена более низкая терапевтическая эффективность при воздействии ГТ через 10-12 мин и 35-40 мин после введения Докс-ТЛ. Наибольшую выживаемость наблюдали в группе животных, которым провели сеанс ГТ через 15-20 мин после введения Докс-ТЛ в дозе 9 мг/кг.
Таким образом, оптимальный интервал между введением Докс-ТЛ и началом сеанса ГТ в проведенном исследовании составил 15-20 мин.
Таблица 7
Терапевтическая эффективность ГТ на фоне в/в введения свободного Докс и Докс-ТЛ в дозе 9 мг/кг на карциноме Эрлиха линии ELD
| Группы животных | ТРО, % | ||||||
| Дни после окончания лечения | |||||||
| 1 | 4 | 7 | 9 | 14 | 15 | ||
| 1 | Докс-ТЛ | +2 | +9 | +1 | +15 | +9 | +32 |
| 2 | ГТ | 14 | 46 | 54 * | 60 * | 66 * | 62 |
| 3 | Докс + ГТ через 15-20 мин | 17 | 54 | 64 * | 68 * | 63 * | 56 |
| 4 | Докс-ТЛ + ГТ через 10-12 мин | 19 | 58 | 69 * | 71 * | 58 * | 49 |
| 5 | Докс-ТЛ + ГТ через 15-20 мин | 27 | 72 | 85 *, ** | 86 *, ** | 84 *, ** | 80 |
| 6 | Докс-ТЛ + ГТ через 35-40 мин | 23 | 67 | 77 * | 80 * | 77 * | 74 |
Примечания: знак «+» означает стимуляцию роста опухоли;
* p < 0,05 по отношению к контролю;
** p < 0,05 по отношению к ГТ и Докс + ГТ через 15-20 мин.
По результатам биологических экспериментов in vivo можно заключить, что пустые ТЛ не обладают токсическим действием, а инкапсулирование Докс в ТЛ не повышает его токсичность. Лиофилизированный термолипосомальный Докс в дозе 9 мг/кг в комбинации с ГТ вызывает более высокий терапевтический эффект, чем свободный Докс в тех же условиях.
ВЫВОДЫ
- Установлен оптимальный состав термолипосомальной мембраны – дипальмитоилфосфатидилхолин (DPPC) : дистеароилфосфатидилхолин (DSPC) : холе-стерин (Chol) : дистеароилфосфатидилэтаноламин-ПЭГ-2000 (DSPE-PEG-2000) : -токоферола ацетат (-TA) = 9:1:0,2:0,02:0,2 с весовым соотношением препарат : суммарные липиды – 0,13-0,20 : 1. Масштабирована технология получения водной дисперсии термолипосомального доксорубицина с размером частиц 170 ± 20 нм и эффективностью инкапсулирования препарата в свежеприготовленные везикулы – 87-94 %.
- Разработана методика очистки термолипосомальной дисперсии от невключившегося доксорубицина на хроматографической колонке для оценки эффективности инкапсулирования цитостатика в везикулы.
- Для стабилизации дисперсии термолипосомального доксорубицина в процессе хранения разработан режим ее лиофилизации с криопротектором – 4 % раствором сахарозы.
- Разработаны методики химико-фармацевтического анализа термолипосом с доксорубицином, определена их чувствительность и воспроизводимость, в том числе:
- спектрофотометрическое определение содержания действующего вещества в лекарственной форме с использованием РСО доксорубицина при длине волны 252 ± 2 нм;
- хроматографическое определение доксорубицина, липидов и сахарозы в составе лекарственной формы.
Для качественного анализа термолипосомального препарата методом ТСХ предложены следующие системы растворителей: хлороформ – метанол – концентрированный аммиак (65:25:4) и хлороформ – метанол – ледяная уксусная кислота – вода (25:15:4:2) для определения липидов и доксорубицина; 1,2-дихлорэтан – безводная уксусная кислота – метанол – вода (10:5:3:2) или изопропиловый спирт – ацетон – эфир – вода (7:7:2:4) для определения сахарозы.
- Выбраны критерии качества лиофилизированной термочувствительной липосомальной лекарственной формы доксорубицина, разработан проект ФСП на препарат «Доксорубицин термолипосомальный, лиофилизат для приготовления раствора для инъекций 0,7 мг» и проведен контроль качества шести наработанных серий препарата в хранении при температуре 18 °C в течение одного года, исследования продолжаются.
- В доклинических испытаниях показано, что «Доксорубицин термолипосомальный, лиофилизат для приготовления раствора для инъекций 0,7 мг» в комбинации с локальной гипертермией обладает большей избирательностью действия по сравнению со свободным доксорубицином.
Список работ, опубликованных по теме диссертации
- Игнатьева Е.В., Орлова О.Л., Ярцева И.В., Гатинская Л.Г., Кортава М.А., Тазина Е.В., Оборотова Н.А. Оценка включения доксорубицина в термочувствительные стерически стабилизированные липосомы // Отечественные противоопухолевые препараты: Материалы Всероссийской научно-практической конференции (24-26 марта 2007 г., Москва). М.: Российский биотерапевтический журнал. – 2007. – № 1 (6). – С. 74.
- Полозкова А.П., Тазина Е.В., Орлова О.Л., Игнатьева Е.В., Бунятян Н.Д., Оборотова Н.А. Получение термозависимой липосомальной лекарственной формы доксорубицина // Отечественные противоопухолевые препараты: Материалы Всероссийской научно-практической конференции (24-26 марта 2007 г., Москва). М.: Российский биотерапевтический журнал. – 2007. – № 1 (6). – С. 78.
- Полозкова А.П., Тазина Е.В., Орлова О.Л., Игнатьева Е.В., Бунятян Н.Д., Оборотова Н.А., Тарасова О.И. Разработка оптимального состава термочувствительных стерически стабилизированных липосом // Отечественные противоопухолевые препараты: Материалы Всероссийской научно-практической конференции (24-26 марта 2007 г., Москва). М.: Российский биотерапевтический журнал. – 2007. – № 1 (6). – С. 78.
- Тазина Е.В., Оборотова Н.А. Получение и стандартизация термочувствительной стерически стабилизированной липосомальной лекарственной формы доксорубицина // Материалы VI международной научной конференции студентов и молодых ученых «Актуальные вопросы спортивной медицины, лечебной физической культуры, физиотерапии и курортологии» (20 апреля 2007 г., Москва). М.: Журнал РАСМИРБИ. – 2007. – № 2 (22). – С. 58.
- Тазина Е.В., Полозкова А.П., Орлова О.Л., Игнатьева Е.В., Оборотова Н.А. Получение и стандартизация лиофилизированной термочувствительной липосомальной лекарственной формы доксорубицина // Тезисы VIII конференции молодых онкологов с международным участием «Современные проблемы экспериментальной и клинической онкологии» (26-27 апреля 2007 г., Киев). Киев. – 2007. – С. 76.
- Тазина Е.В., Полозкова А.П., Рогова О.Г., Игнатьева Е.В., Бабкина М.М., Орлова О.Л., Оборотова Н.А., Гордина Г.А., Тарасова О.И. Влияние растворителей на регидратацию лиофилизированных термолипосом с доксорубицином // Отечественные противоопухолевые препараты: Материалы Всероссийской научно-практической конференции с международным участием (17-19 марта 2008 г., Москва). М.: Российский биотерапевтический журнал. – 2008. – № 1 (7). – С. 32.
- Тазина Е.В., Полозкова А.П., Рогова О.Г., Игнатьева Е.В., Орлова О.Л., Оборотова Н.А., Гордина Г.А., Тарасова О.И. Режим замораживания термочувствительных липосом с доксорубицином // Отечественные противоопухолевые препараты: Материалы Всероссийской научно-практической конференции с международным участием (17-19 марта 2008 г., Москва). М.: Российский биотерапевтический журнал. – 2008. – № 1 (7). – С. 32.
- Тазина Е.В., Игнатьева Е.В., Орлова О.Л., Мещерикова В.В., Вайнсон А.А., Оборотова Н.А. Термозависимая липосомальная форма доксорубицина // Материалы VII международной научной конференции студентов и молодых ученых «Актуальные вопросы спортивной медицины, лечебной физической культуры, физиотерапии и курортологии» (25 апреля 2008 г., Москва). М.: Журнал РАСМИРБИ. – 2008. – № 2 (25). – С. 37-38.
- Мещерикова В.В., Тазина Е.В., Полозкова А.П., Орлова О.Л., Оборотова Н.А., Вайнсон А.А., Ярмоненко С.П., Барышников А.Ю. Противоопухолевый эффект включенного в термолипосомы доксорубицина в условиях гипертермии. – М.: Медицинская радиология и радиационная безопасность. – 2008. – № 4 (53). – С. 7-12.
- Тазина Е.В., Оборотова Н.А. Селективная доставка препаратов в опухоль с помощью термочувствительных липосом и локальной гипертермии. – М.: Российский биотерапевтический журнал. – 2008. – № 3 (7). – С. 4-12.
- Тазина Е.В., Мещерикова В.В., Игнатьева Е.В., Полозкова А.П., Орлова О.Л., Вайнсон А.А., Оборотова Н.А., Барышников А.Ю. Получение и изучение противоопухолевой активности термолипосомального доксорубицина // Материалы XII Российского онкологического конгресса (18-20 ноября 2008 г., Москва). М.: Издательская группа ГУ РОНЦ им. Н.Н. Блохина РАМН. – 2008. – С. 142.
- Тазина Е.В., Оборотова Н.А. Новые подходы к использованию термочувствительных липосом и локальной гипертермии. – М.: Российский биотерапевтический журнал. – 2008. – № 4 (7). – С. 71-79.
- Тазина Е.В., Мещерикова В.В., Орлова О.Л., Вайнсон А.А., Оборотова Н.А., Барышников А.Ю. Изучение биологической активности термозависимой липосомальной лекарственной формы доксорубицина in vitro и in vivo // Тезисы докладов 3-го съезда токсикологов России (2-5 декабря 2008 г., Москва). М.: М-во здравоохранения и соц. развития Российской Федерации [и др.]. – 2008. – С. 530-531.
- Тазина Е.В., Игнатьева Е.В., Полозкова А.П., Орлова О.Л., Мещерикова В.В., Вайнсон А.А., Оборотова Н.А., Барышников А.Ю. Контролируемая доставка доксорубицина в опухоль с помощью термочувствительных липосом и локальной гипертермии // Rusnanotech Международный форум по нанотехнологиям: Сборник тезисов докладов научно-технологических секций (3-5 декабря 2008 г., Москва). – 2008. – Т. 2. – С. 420-422.
- Тазина Е.В., Игнатьева Е.В., Полозкова А.П., Орлова О.Л., Оборотова Н.А. Технология получения и анализ термозависимой липосомальной лекарственной формы доксорубицина. – М.: Химико-фармацевтический журнал. – 2008. – Том 42, № 12. – С. 30-35.
- Тазина Е.В., Мещерикова В.В., Игнатьева Е.В., Вайнсон А.А., Оборотова Н.А., Барышников А.Ю. Повышение противоопухолевой активности доксорубицина с помощью термочувствительных липосом // Наноонкология: Материалы научной конференции с международным участием (18-19 февраля 2009 г., Москва). М.: Российский биотерапевтический журнал. – 2009. – № 1 (8). – С. 11-12.
- Тазина Е.В., Полозкова А.П., Игнатьева Е.В., Орлова О.Л., Оборотова Н.А. Выбор оптимального соотношения препарат/липиды для загрузки доксорубицина в термолипосомы // Наноонкология: Материалы научной конференции с международным участием (18-19 февраля 2009 г., Москва). М.: Российский биотерапевтический журнал. – 2009. – № 1 (8). – С. 11.
- Тазина Е.В., Полозкова А.П., Игнатьева Е.В., Орлова О.Л., Оборотова Н.А. Изучение влияния криопротекторов на включение доксорубицина в термочувствительные липосомы // Наноонкология: Материалы научной конференции с международным участием (18-19 февраля 2009 г., Москва). М.: Российский биотерапевтический журнал. – 2009. – № 1 (8). – С. 11.
- Тазина Е.В., Мещерикова В.В., Игнатьева Е.В., Полозкова А.П., Орлова О.Л., Вайнсон А.А., Оборотова Н.А., Барышников А.Ю. Биофармацевтические исследования термочувствительной липосомальной лекарственной формы доксорубицина. – М.: Российский биотерапевтический журнал. – 2009. – № 1 (8). – С. 40-47.
- Игнатьева Е.В., Тазина Е.В., Гатинская Л.Г., Ярцева И.В., Оборотова Н.А. Оценка качества термозависимой лиофилизированной липосомальной лекарственной формы доксорубицина // Материалы VIII Всероссийской научно-практической конференции «Отечественные противоопухолевые препараты» (21-22 апреля 2009 г., Москва). М.: Российский биотерапевтический журнал. – 2009. – № 2 (8). – С. 48.
- Тазина Е.В., Игнатьева Е.В., Ярцева И.В., Орлова О.Л., Оборотова Н.А. Применение метода тонкослойной хроматографии для определения фосфолипидов и доксорубицина в термозависимой липосомальной лекарственной форме // Материалы VIII Всероссийской научно-практической конференции «Отечественные противоопухолевые препараты» (21-22 апреля 2009 г., Москва). М.: Российский биотерапевтический журнал. – 2009. – № 2 (8). – С. 50.
- Тазина Е.В., Полозкова А.П., Игнатьева Е.В., Орлова О.Л., Оборотова Н.А. Влияние размеров термолипосом на включение доксорубицина // Материалы VIII Всероссийской научно-практической конференции «Отечественные противоопухолевые препараты» (21-22 апреля 2009 г., Москва). М.: Российский биотерапевтический журнал. – 2009. – № 2 (8). – С. 49.
- Тазина Е.В., Мещерикова В.В., Полозкова А.П., Орлова О.Л., Вайнсон А.А., Оборотова Н.А., Барышников А.Ю. Использование термочувствительных липосом и локальной гипертермии для доставки доксорубицина в опухоль // Материалы IV региональной конференции молодых ученых-онкологов имени академика РАМН Н.В. Васильева «Актуальные вопросы экспериментальной и клинической онкологии» (24 апреля 2009 г., Томск). Томск: Сибирский онкологический журнал. – 2009. – Приложение № 1. – С. 190-191.
- Тазина Е.В., Полозкова А.П., Мещерикова В.В., Вайнсон А.А., Оборотова Н.А., Барышников А.Ю. Сравнительная оценка действия доксорубицина, инкапсулированного в термолипосомы, и свободного доксорубицина на солидные опухоли в условиях локального прогревания // Материалы Российской научно-практической конференции с международным участием, посвященной 30-летию НИИ онкологии СО РАМН «Современная онкология: достижения и перспективы развития» (10-11 сентября 2009 г., Томск). Томск: Сибирский онкологический журнал. – 2009. – Приложение № 2. – С. 189-190.
- Тазина Е.В., Мещерикова В.В., Полозкова А.П., Игнатьева Е.В., Орлова О.Л., Вайнсон А.А., Оборотова Н.А., Барышников А.Ю. Оценка противоопухолевой активности термолипосомального доксорубицина и свободного доксорубицина in vivo // Материалы XIII Российского онкологического конгресса (17-19 ноября 2009 г., Москва). М.: Издательская группа ГУ РОНЦ им. Н.Н. Блохина РАМН. – 2009. – С. 258-259.
- Tazina E.V., Polozkova A.P., Orlova O.L., Ignatieva E.V., Mescherikova V.V., Wainson A., Yarmonenko S.P., Oborotova N.A. Preparation and investigation of biological activity of thermosensitive liposomes loaded with doxorubicin // Technical Proceedings of the 2008 Nanotechnology Conference and Trade Show (June 1-5, 2008, Boston, Massachusetts, USA). – 2008. – Vol. 2. – P. 53-56.
- Tazina E.V., Ignatieva E.V., Orlova O.L., Mescherikova V.V., Wainson A., Oborotova N.A., Baryshnikov A.Yu. Doxorubicin-encapsulated thermosensitive liposomes // The Second Saint-Petersburg International Conference on NanoBioTechnologies (16-18 June 2008, Saint-Petersburg, Russia). SPb.: Publishing House of Politechnical University. – 2008. – P. 177-178.
- Tazina E.V., Ignatieva E.V., Polozkova A.P., Orlova O.L., Mescherikova V.V., Wainson A.A., Oborotova N.A., Baryshnikov А.Yu. Controlled delivery of doxorubicin to tumor by thermosensitive liposomes and local hyperthermia // Rusnanotech 2008. Nanotechnology International Forum: Abstracts of Scientific and Technological Sections (December 3-5, 2008, Moscow, Russia). – 2008. – Vol. 2. – P. 311-313.
- Tazina E.V., Polozkova A.P., Ignatieva E.V., Orlova O.L., Mescherikova V.V., Wainson A.A., Oborotova N.A., Baryshnikov A.Yu.: Delivery of Doxorubicin to Solid Tumors using Thermosensitive Liposomes, in Advances in Material Design for Regenerative Medicine, Drug Delivery, and Targeting/Imaging, edited by V. Prasad Shastri, A. Lendlein, L-S. Liu, S. Mitragotri, A. Mikos (Mater. Res. Soc. Symp. Proc. Volume 1140E, Warrendale, PA, 2009). Paper number 1140-HH13-14, P.1-6.
- Tazina E.V., Polozkova A.P., Ignatieva E.V., Orlova O.L., Mescherikova V.V., Wainson A.A., Oborotova N.A., Baryshnikov А.Yu. Nanostructural thermosensitive liposomal form of doxorubicin // Rusnanotech 2009. Nanotechnology International Forum: Abstracts of The Second International Competition of Scientific Papers in Nanotechnology for Young Researchers (October 6-8, 2009, Moscow, Russia). – 2009. – P. 816-818.
