Экспериментальное изучение связи строения с противовоспалительным действием в ряду ариламидов nн-замещённых антраниловых кислот и их ацильных производных на основе констант ионизации и липофильности

На правах рукописи

Ендальцева Ольга Сергеевна

ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНОЕ ИЗУЧЕНИЕ СВЯЗИ СТРОЕНИЯ С ПРОТИВОВОСПАЛИТЕЛЬНЫМ ДЕЙСТВИЕМ В РЯДУ АРИЛАМИДОВ NН-ЗАМЕЩЁННЫХ АНТРАНИЛОВЫХ КИСЛОТ И ИХ АЦИЛЬНЫХ ПРОИЗВОДНЫХ НА ОСНОВЕ КОНСТАНТ ИОНИЗАЦИИ И ЛИПОФИЛЬНОСТИ

14.04.02 - фармацевтическая химия, фармакогнозия

Автореферат

диссертации на соискание учёной степени

кандидата фармацевтических наук

Пермь - 2011

Работа выполнена в ГОУ ВПО «Пермская государственная фармацевтическая академия Федерального агентства по здравоохранению и социальному развитию».

Научный руководитель:

- доктор фармацевтических наук, профессор Коркодинова Л. М.

Официальные оппоненты:

- доктор химических наук, профессор Гейн В. Л.,

ГОУ ВПО « Пермская государственная

фармацевтическая академия Федерального

агентства по здравоохранению

и социальному развитию» ;

- доктор фармацевтических наук, профессор Оганесян Э.Т.,

ГОУ ВПО« Пятигорская государственная

фармацевтическая академия Федерального

агентства по здравоохранению и социальному развитию».

Ведущая организация:

- ГОУ ВПО « Башкирский государственный медицинский университет Федерального агентства по здравоохранению и социальному развитию».

Защита диссертационной работы состоится «31» мая 2011 г. В 13 часов на заседании диссертационного совета Д 208.068.01 при ГОУ ВПО « Пермская государственная фармацевтическая академия Федерального агентства по здравоохранению и социальному развитию» по адресу 614990, г. Пермь, ГСП-277, ул. Полевая, 2.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Пермской государствен-ной фармацевтической академии по адресу: г. Пермь, ул. Крупской, 46.

Дата размещения объявления о защите диссертации на сайте ПГФА

http:// www.pfa.ru «26» апреля 2011 г.

Автореферат разослан «27» апреля 2011г.

Учёный секретарь

диссертационного совета Д 208.068.01,

кандидат фармацевтических наук, доцент Липатникова И.А.

ВВЕДЕНИЕ

Актуальность проблемы:

Поиск новых биологически активных соединений, обладающих низкой токсичностью, является одной из основных проблем фармацевтической химии. Вещества из ряда производных антраниловой кислоты представляют интерес не только как исходные продукты для синтеза гетероциклических соединений, но и как биологически активные объекты исследования, близкие по структуре к природным соединениям. Для целенаправленного синтеза высокоэффективных веществ с противовоспалительной активностью необходимо разработать определенные пути количественных соотношений структура-активность (КССА).

Существуют вычислительные методы изучения КССА, а также с помощью экспериментально найденных констант, отражающих физико-химические свойства молекул. Поиск перспективных методов КССА позволяет значительно уменьшить материальные затраты на создание нового лекарственного вещества.

Диссертационная работа выполнена в соответствии с планом научных исследований Пермской государственной фармацевтической академии Федерального агентства по здравоохранению и социальному развитию (номер государственной регистрации 01. 9. 50 007422). Тема утверждена на заседании Учёного совета Пермской государственной фармацевтической академии, протокол № 4 от 29 января 2004г.

Цель и задачи исследования:

Целью исследования является изыскание связи степени выраженности противовоспалительного действия с константами ионизации и липофильности и составление соответствующих корреляционных уравнений для направленного синтеза биологически активных веществ в рядах ариламидов NН-замещённых антраниловой кислоты и их ацильных производных.

Для реализации намеченной цели были поставлены следующие задачи:

1. Наработка 20-ти соединений из 2 рядов ариламидов NН-замещённых антраниловых кислот и их ацильных производных, обладающих различной степенью противовоспалительного действия.

2. Экспериментально определить константы ионизации и липофильности выбранных соединений и провести качественный анализ зависимости этих констант от структуры.

3.Провести подбор значимых корреляционных уравнений, связывающих противовоспалительное действие с константами ионизации или липофильности.

4. Найти статистически значимые одно и двухпараметровые корреляционные уравнения, связывающие противовоспалительное действие с константами ионизации и липофильности.

5. Осуществить прогнозирование уровня ПВД на 6 вновь синтезированных соединениях из данных рядов и экспериментально подтвердить уровень противовоспалительного действия.

Научная новизна исследования:

Впервые установлена количественная связь между экспериментально определённым уровнем противовоспалительного действия 20 соединений с экспериментально найденными константами ионизации и липофильности в 2 рядах производных антраниловой кислоты: ариламиды NН-аллил(бензил, 3-хлорбутен-2-ил) антраниловой кислоты, ариламиды N-ацетил-N-аллил(бензил, 3-хлорбутен-2-ил) антраниловой кислоты.

Найдены корреляционные уравнения, связывающие противовоспалите-льное действие с константами ионизации.

Осуществлён подбор корреляционных уравнений, связывающих противовоспалительное действие с константами липофильности.

Составлены статистически значимые корреляционные уравнения, связывающие противовоспалительное действие с константами ионизации и липофильности.

Рассчитаны прогнозируемые значения противовоспалительного действие с использованием полученных корреляционных уравнений на примере 6 вновь синтезированных соединений из данных рядов, которые подтверждены экспериментально на животных.

По результатам исследований найдено вещество 4-метоксифениламид N-аллил-N-ацетилантраниловой кислоты, процент торможения ПВД которого составляет 54,70%.

Практическая значимость работы:

Проведён качественный и количественный анализ противовоспалительного действия 20 вновь наработанных соединений на основе экспериментально найденных констант ионизации и липофильности. Найдены корреляционные уравнения, которые позволяют проводить прогноз уровня противовоспалительного действия с использованием этих констант. Показана пригодность полученных корреляционных уравнений для расчёта этого вида активности новых соединений в данных рядах веществ. Это даёт возможность для целенаправленного синтеза новых биологически активных соединений. Полученные результаты используются на кафедрах физической и коллоидной химии при выполнении дипломных работ, а также на кафедре фармацевтической химии очного факультета Пермской государственной фармацевтической академии в лекционном курсе и на практических занятиях по теме "Общая фармацевтическая химия. Пути решения проблемы создания новых лекарственных средств.", а также на кафедре зоологии позвоночных и экологии Пермского государственного университета в научно-исследовательской работе при поиске новых биологически активных соединений с противовоспалительным действием.

Связь задач исследования с проблемным планом фармацевтических наук:

Диссертационная работа выполнена в соответствии с планом научных исследований Пермской государственной фармацевтической академии Федерального агентства по здравоохранению и социальному развитию (номер государственной регистрации 01. 9. 10018875)

Апробация работы:

Материалы работы докладывались и обсуждались на научных конференциях профессорско-преподавательского состава ПГФА 2003, 2004 и 2008 гг.; на областных конференциях «Молодёжная наука Прикамья» и «Рациональное использование лекарств» в 2004, 2005 гг.; на юбилейных межвузовских научных конференциях студентов и молодых учёных в Воронеже и Кемерове 2007года.

Публикации:

Материалы диссертации отражены в 9 работах, их них: 2 статьи в изданиях, рекомендованных ВАК РФ, 2 статьи в сборниках и материалах научных конференций различного уровня, 5 тезисов докладов научных конференций.

Объём и структура диссертации:

Работа состоит из введения, семи глав, выводов, списка литературы (103). Объём диссертации составляет (130) страниц машинописного текста, содержит 30 таблицы и 15 рисунков.

В первой главе приводится обзор литературы по лекарственным средствам из ряда производных антраниловой кислоты и исследованию связи структура-активность на основе вычислительных и экспериментальных методов.

Во второй главе отражены исследования связи противовоспалительного действия с константами ионизации в рядах ариламидов NН-замещённых антраниловых кислот и их ацильных производных и вывод соответствующих корреляционных уравнений, описывающих зависимость противовоспалительного действия от констант ионизации.

Третья глава посвящена исследованиям связи противовоспалительного действия с константами липофильности в этих же рядах и вывод соответствующих корреляционных уравнений, описывающих зависимость противовоспалительного действия от констант липофильности.

В четвёртой главе найдена количественная зависимость противовоспалительного действия от констант ионизации и липофильности для данных рядов соединений.

В пятой главе осуществлён синтез и проверена пригодность полученных корреляционных уравнений для расчёта уровня противовоспалительного действия шести вновь синтезированных соединений по 3 вещества из аналогичных рядов.

Шестая глава посвящена соотношению результатов прогнозирования ПВД и экспериментально найденных констант ионизации и липофильности

для шести вновь синтезированных соединений из данных рядов с ПВД, найденным экспериментально.

Седьмая глава посвящена методикам определения констант ионизации, липофильности и синтеза вновь полученных 6 соединений.

На защиту выносятся:

1. Экспериментальное исследование противовоспалительного действия с константами ионизации в рядах ариламидов NН-замещённых антраниловых кислот и их ацильных производных.

2. Экспериментальное исследование противовоспалительного действия с константами липофильности в рядах ариламидов NН-замещённых антраниловых кислот и их ацильных производных.

3. Количественная зависимость противовоспалительного действия от констант ионизации и липофильности в этих же рядах.

4. Сравнительный анализ прогнозируемых значений противовоспалительного действия с экспериментально определенными величинами ПВД на примере шести вновь синтезированных соединений из данных рядов.

Основное содержание диссертации

1.Исследование связи структуры с противовоспалительным действием на основе констант ионизации.

Синтез ариламидов NН-аллил(бензил, 3-хлорбутен-2-ил) замещённых антраниловых кислот и их ацильных производных был разработан и осуществлён проф. Коркодиновой Л.М. Противовоспалительное действие синтезированных соединений изучалось на кафедре физиологии и патологии Пермской государственной фармацевтической академии под руководством профессора Мардановой Л.Г.

1.1. Качественная связь структуры с противовоспалительным действием.

Качественный анализ ариламидов NH-замещённых антраниловых кислот показал, что выраженным противовоспалительным действием обладают N-фениламид и 2-метилфениламид N-(3-хлорбутен-2-ил) антраниловой кислоты(соед.1 и 2), процент торможения каррагенинового отёка которых составил 62% и 59% соответственно.

При ацетилировании N-фениламида N-(3-хлорбутен-2-ил) антраниловой кислоты (соед.11) происходит незначительное снижение ПВД с 62% до 57,30%, а при ацетилировании 4-хлорфениламида N-аллил антраниловой кислоты (соед. 20) происходит существенное изменение ПВД с 22,9% до 56,8%.

1.2. Определение констант ионизации.

Константы ионизации играют существенную роль при интерпритации механизма действия лекарственных веществ. Так, ионизация может способствовать избирательности действия, влиять на абсорбцию на поверхности рецепторов.

В ариламидах NН-замещённых и N,N-дизамещённых антраниловых кислот есть 2 ионогенные группы: амино(-NН-) и амидная (-СОNН-) группы антраниловой кислоты. Поэтому в зависимости от условий среды они проявляют как кислотные, так и основные свойства (т.е. амфотерные). Это позволяет определять константы кислотности рКа и константы основности рКв.

Для изучения предполагаемого механизма взаимодействия ариламидов NН-замещённых антраниловых кислот и их ацильных производных с гидроксидом калия или хлорной кислотой были проведены их квантово-механические исследования. Заряды на атомах кислорода, азота и водорода (в электронных единицах) в данных рядах соединений, рассчитанные полуэмперическим методом PM 3 (Parmetrison -3), приведены в табл. 1 и 2. Расчёт зарядов выполнен на кафедре физики и математики ПГФА доцентами Вахриным М.И. и Даниловым Ю.Л.

Заряды на атомах кислорода, азота и водорода в ариламидах NН-замещённых антраниловых кислот

Таблица 1

№ п/п	R	R1	1N CONH	2N NH-R1	3H CONH	4H NH-R1	5о CONH
1.	Н	CH2-CH=CCl-CH3	-0,0185	-0,0134	0,133	0,127	-0,379
2.	2-СН3	CH2-CH=CCl-CH3	-0,0135	-0,0135	0,129	0,124	-0,366
3.	3-СН3	CH2-CH=CCl-CH3	-0,0190	-0,0134	0,133	0,127	-0,380
4.	4-СН3	CH2-CH=CCl-CH3	-0,0134	-0,0133	0,127	0,126	-0,376
5.	4-Вr	CH2-CH=CCl-CH3	-0,0175	-0,0132	0,131	0,125	-0,384
6.	4-OCH3	CH2-CH=CCl-CH3	-0,0185	-0,0134	0,129	0,127	-0,381
7.	4-CH3	CH2C6H5	-0,0178	-0,0131	0,139	0,125	-0,372
8.	4-Вr	CH2C6H5	-0,0182	-0,0133	0,134	0,128	-0,369
9.	4-Вr	CH2-CH=CH2	-0,0168	-0,0136	0,132	0,130	-0,377
10.	4-Cl	CH2-CH=CH2	-0,0172	-0,0138	0,130	0,128	-0,374

Заряды на атомах кислорода, азота и водорода в ариламидах N-ацетил-N-замещённых антраниловых кислот

Таблица 2

№ п/п	R	R1	1N CONH	2N NHCO	3H CONH	4O CONH	5O NHCO
11.	Н	CH2-CH=CCl-CH3	-0,0549	-0,0604	0,151	-0,374	-0,388
12.	2-СН3	CH2-CH=CCl-CH3	-0,0425	-0,0521	0,144	-0,362	-0,376
13.	3-СН3	CH2-CH=CCl-CH3	-0,0515	-0,0564	0,138	-0,365	-0,372
14.	4-СН3	CH2-CH=CCl-CH3	-0,0598	-0,0611	0,127	-0,359	-0,367
15.	4-Вr	CH2-CH=CCl-CH3	-0,0409	-0,0771	0,131	-0,329	-0,334
16.	4-OCH3	CH2-CH=CCl-CH3	-0,0113	-0,0536	0,123	-0,359	-0,382
17.	4-CH3	CH2C6H5	-0,0456	-0,0575	0,146	-0,364	-0,392
18.	4-Вr	CH2C6H5	-0,0510	-0,0580	0,133	-0,352	-0,364
19.	4-Вr	CH2-CH=CH2	-0,0492	-0,0608	0,140	-0,366	-0,374
20.	4-Cl	CH2-CH=CH2	-0,0515	-0,0588	0,135	-0,354	-0,382

Возможные схемы механизма ионизации можно предположить исходя из квантово-механических расчетов.

Значение величин зарядов на атомах азота (1,2) и на связанных с ними атомах водорода (3,4) позволяет предположить, что реакция протекает по ниже приведённой схеме 1. Так положительный заряд на атоме водорода 3 больше заряда 4, а отрицательный заряд на атоме азота 2 меньше заряда 1, вследствие чего атом водорода аминогруппы будет проявлять большую подвижность. При взаимодействии с калия гидроксидом ариламидов NН-замещённых антраниловых кислот происходит образование сопряжённого основания в результате потери протона аминогруппы.

Схема 1

В кислой среде протонирование ариламидов NН-замещённых антраниловых кислот происходит по атому кислорода амидной группы, так как отрицательный заряд на атоме кислорода 5 больше‚ чем на атомах азота 1 и 2. При этом возможно образование карбониевого катиона‚ переходящего затем в аммониевый(схема 2).

Схема 2

При взаимодействии с калия гидроксидом ариламидов N-ацетил-N-замещённых антраниловых кислот происходит образование сопряжённого основания в результате потери протона амидной группы (схема 3). В данном случае протекает амидная таутомерия и происходит переход протона от атома азота на атом кислорода, что приводит к существованию этих молекул в растворе в разных таутомерных формах, быстро переходящих одна в другую.

Схема 3

В кислой среде протонирование ариламидов N-ацетил-N-замещённых антраниловых кислот может происходить как по атому кислорода амидной группы (4), так и по атому кислорода ацильного фрагмента (5). Однако, сравнение частичных отрицательных зарядов 4 и 5 на этих атомах кислорода (5>4) позволило сделать вывод о преимущественном протонировании по атому кислорода ацильного фрагмента в среде хлорной кислоты. При этом возможно образование карбониевого катиона, переходящего затем в аммониевый (схема 4).

Схема 4

Определение констант ионизации исследуемых соединений было проведено методом неводного потенциометрического титрования с помощью универсального иономера ЭВ-74. В качестве индикаторного использовался стеклянный электрод, в качестве электрода сравнения – хлорсеребряный. Концентрация титруемых соединений в этаноле составила 5·10-3М. Титрование проводили 5·10-2М раствором хлорной кислоты и 5·10-2М раствором гидроксида калия в этаноле. Точную навеску исследуемого вещества растворяли в мерной колбе на 25 мл. 10 мл 0,005М спиртового раствора исследуемого соединения титровали из микробюретки 0,05М спиртовым раствором KOH или HClO4, каждый раз измеряя значение pH исследуемого раствора. В области точки эквивалентности наблюдался достаточный скачок значения pH. Для каждого соединения рассчитывали отношение pH/V- f(Vср.) и при максимальном значении по построенным дифферинциальным кривым титрования для каждого вещества определяли величину pH, равную значению константы кислотности pKa и основности pKв в точке полунейтрализации. Титрование спиртовым раствором KOH или HClO4 проводили для каждого вещества три раза и для расчётов брали среднее значение константы ионизации pKa ср. и pKв ср.

При обсуждении полученных результатов константы основности pKв преобразованы через константы кислотности по уравнению;

pKв = pKs- pKа,

где pKs-константа автопротолиза растворителя, равная для этанола 18,54.

Таблица 3

Константы ионизации ариламидов NН-аллил(бензил,3-хлорбутен-2-ил) антраниловой кислоты.

№ п/п	1	2	3	4	5	6	7	8	9	10
pKa ср. KOH	3,80	4,03	4,66	4,80	7,60	6,25	7,30	7,90	5,40	6,80
pKв ср. HClO4	15,34	15,54	14,00	14,90	11,36	11,32	11,09	11,34	14,44	12,40

Константы ионизации 10 производных ариламидов NН-аллил(бензил, 3-хлорбутен-2-ил) замещённых антраниловой кислоты приведены в таблице 3. Исходя из значений констант кислотности (рКа) у ариламидов NН-аллил(бензил, 3-хлорбутен-2-ил) замещённых антраниловых кислот довольно сильно выражены кислотные свойства. Значения рКа лежат в интервале от 3,80 для соединения 1 до 7,90 для соединения 8, константы основности (рКв) от 11,09 до 15,54 соответствующие значениям соединений 7 и 2.

Таблица 4

Константы ионизации ариламидов N-аллил(бензил, 3хлорбутен-2-ил)-N- ацетилантраниловой кислоты

№ п/п	11	12	13	14	15	16	17	18	19	20
pKa ср. KOH	7,10	7,80	7,43	7,33	8,60	7,65	8,80	8,20	8,45	7,15
pKв ср. HClO4	12,62	12,11	12,26	12,33	14,32	12,00	14,50	14,04	14,29	11,39

Исходя из значений констант кислотности (рКа) ариламиды N-аллил(бензил, 3хлорбутен-2-ил)-N-ацетилзамещённых антраниловых кислот слабо проявляют кислотные свойства (таб.4). Значения рКа для них лежат в интервале от 7,10 для соединения 11 до 8,80 для соединения 17, а константы основности (рКв) от 11,39 до 14,50 соответствующие соединениям 20 и 17.

1.3. Количественная зависимость противовоспалительного действия от констант ионизации.

Для установления количественной связи между биологическим действием и строением соединений были составлены корреляционные уравнения, связывающие константы ионизации (pKа и pKв) с противовоспалительным действием. С этой целью была использована программа Microsoft Exсel. Мерой биоответа служил lg ПВД. Противовоспалительное действие соединений определяли по методике каррагенинового отёка. Величину воспалительной реакции оценивали онкометрически, по изменению объёма воспалённой конечности через 1 и 4 часа. За основу было выбрано значение противовоспалительного действия через 4 часа.

С использованием программы Microsoft Exсel было получено более 30 одно- и двухпараметровых линейных и квадратичных уравнений зависимости ПВД от найденных экспериментально значений констант ионизации. Для всех полученных уравнений были рассчитаны коэффициенты корреляции.

Чтобы определить пригодность полученных уравнений для расчёта ПВД соединений была вычислена средняя квадратичная ошибка (S), найден доверительный интервал при вероятности 90% () и критерий Фишера(F), свидетельствующий о значимости регрессии и выбраны уравнения:

• Ариламиды NН-аллил(бензил,-3-хлорбутен-2-ил) антраниловой кислоты.

lg ПВД= - 0,0141·pKа 2- 0,0029·pKв2 + 2,5742 (1)

r=0,80;n=10;S=1,5%;= 4,4%;F=5,71%

При статистической обработке уравнение 1 имеет минимальную среднюю квадратичную ошибку (S=1,5%) и минимальный доверительный интервал (=4,4%).

• Ариламидов N-аллил(бензил, 3-хлорбутен-2-ил)-N- ацетилантраниловой кислоты.

lg ПВД= -0,0089·pKа 2- 0,0016·pKв2 + 2,4203 (2)

r=0,88;n=10;S=0,5%;= 1,5%;F=8,95%

При статистической обработке уравнение 2 имеет минимальную среднюю квадратичную ошибку (S=0,5%) и минимальный доверительный интервал (=1,5%).

2. Исследование связи структуры с противовоспалительным действием на основе констант липофильности.

В изучении закономерности связи структура - активность важную роль играет изучение липофильных свойств биологически активных веществ. Липофильность химических соединений рассматривается как важнейший физико-химический параметр практически во всех исследованиях, связанных с токсическими свойствами и их фармакологическим поведением, а логарифм коэффициента распределения в системе октанол-вода (lgP) является наиболее часто используемым дескриптором при установлении связи «структура-активность». Константы липофильности также характеризуют транспортные способности биологически активных веществ и гидрофобное связывание их с отдельными участками рецепторов.

Определение констант липофильности исследуемых соединений было проведено спектофотометрическим методом в УФ-области с помощью спектофотометра СФ-26. Для получения исходного раствора с концентрацией 5·10-3М точную навеску вещества растворяли в этаноле в мерной колбе на 25 мл. Для каждого вещества снимали УФ-спектр и находили максимальные длины волн ( мах). В УФ-спектрах ариламидов NН-аллил(бензил,3-хлорбутен-2-ил) антраниловой кислоты наблюдается три максимума поглощения‚ а на спектрах ариламидов N-аллил(бензил, 3хлорбутен-2-ил)-N-ацетилантраниловой кислоты два. В мерную колбу на 250 мл помещали 3 мл исходного раствора и 0,5 мл октанола и доводили октанольной водой до метки. У полученного раствора измеряли оптическую плотность до и после распределения между водой и октанолом. Для каждого соединения определение проводили три раза и в корреляционных уравнених использовали среднее значение константы липофильности.

Этим методом были экспериментально определены константы липофильности(lg Pэксп.) и по уравнению произведён расчёт:

lg Pэксп.= lg [Vвод/Vокт(D0/D1-1)],

D0- оптическая плотность водно-спиртового раствора до распределения;

D1- оптическая плотность водного раствора после распределения;

Vвод- объём водной фазы;

Vокт- объём октанольной фазы.

Таблица 5

Результаты спектрофотометрического определения констант липофильности для соединений 1-10

№ п/п	1	2	3	4	5	6	7	8	9	10
lgP эксп.	3,05	2,92	2,82	2,71	2,40	2,61	2,33	2,28	2,66	2,25

Исходя из значений коэффициента распределения (lg Pэксп) видно, что самыми слабыми липофильными свойствами обладают соединения 5 и 10, а самыми сильными - соединение 1(таб. 5).

Таблица 6

Результаты спектрофотометрического определения констант липофильности для соединений 11-20

№ п/п	11	12	13	14	15	16	17	18	19	20
lgP эксп.	2,92	2,70	2,80	2,62	2,44	2,56	2,40	2,52	2,36	2,84

Исходя из значений коэффициента распределения (lg Pэксп) видно, что самыми слабыми липофильными свойствами обладают соединения 19 и 17, а самыми сильными- соединение 11(таб.6).

2.2. Количественная зависимость противовоспалительного действия от констант липофильности.

Для установления количественной связи между биологическим действием и строением соединений были составлены корреляционные уравнения, связывающие константы липофильности (lg Pэксп.) с противовоспалительным действием. Мерой биоответа служил lg ПВД эксп.

С использованием программы Microsoft Exсel было получено более 20 одно- и двухпараметровых линейных и квадратичных уравнений зависимости ПВД от констант липофильности. Для всех полученных уравнений были рассчитаны коэффициенты корреляции. Для последующего изучения связи структура-активность были составлены уравнения, имеющие максимальные коэффициенты корреляции с противовоспалительным действием и выбраны уравнения:

• Ариламидов NН-аллил(бензил, 3-хлорбутен-2-ил) антраниловой кислоты.

lg ПВД= - 0,7091·lgP2 + 4,4328·lgP- 5,1422 (3)

r=0,90;n=10;S=0,10%;= 6,3%;F=4,92%

При статистической обработке уравнение 3 имеет минимальную среднюю квадратичную ошибку (S=0,10%) и минимальный доверительный интервал (=6,3%).

• Ариламидов N- ацетил- N-аллил(бензил, 3-хлорбутен-2-ил) антра-ниловой кислоты.

lg ПВД=-1,3150·lg P2 + 7,6408·lg P - 9,3452 (4)

r=0,85;n=10;S=0,50%;= 3,2%;F=12,95%

При статистической обработке уравнение 4 имеет минимальную среднюю квадратичную ошибку (S=0,5%) и минимальный доверительный интервал (=3,2%).

3. Исследование количественной зависимости противовоспалительного действия от констант ионизации и липофильности.

Представляло интерес также составить и провести анализ корреляционных уравнений, одновременно связывающих противовоспалительное действие с константами ионизации и фактором липофильности. Мерой биологического отклика служил логарифм противовоспалительного действия. Из 10 полученных уравнений наилучшие статистические характеристики имеет общее уравнение, в котором противовоспалительное действие линейно зависит от кислотно-основных свойств и параболически – от липофильных свойств молекул:

• АриламидыNН-аллил(бензил, 3-хлорбутен-2-ил) антраниловой кислоты.

lg ПВД= 3,4550 + 0,0023·lg P2эксп. – 0,0544·рКв – 0,2123·рКа (5)

r=0,92; n=10;S=1,7%;=3,9%;F=6,56

• АриламидыN-аллил(бензил, 3-хлорбутен-2-ил)-N- ацетилантраниловой кислоты.

lg ПВД= 2,3713 + 0,0584·lg P2эксп. – 0,0336·рКв – 0,0943·рКа (6)

r=0,91; n=10;S=1,5%;=3,5%;F=6,56

Таким образом, наиболее целесообразно использовать уравнения 5 и 6 для прогнозирования ПВД соединений с новой структурой в ряду ариламидов NН-аллил(бензил, 3-хлорбутен) антраниловой кислоты и их ацильных производных.

4. Прогноз уровня противовоспалительного действия вновь синтезированных соединений из рядов ариламидов NH-замещённых и N,N-дизамещённых антраниловых кислот.

Исследование количественных соотношений связи структура-активность (КССА), позволяющее проводить целенаправленный синтез новых соединений с определённым видом биологической активности, на данный момент является одним из перспективных направлений в фармации. Использование вычислительных и экспериментальных методов позволит снизить материальные издержки на целенаправленный синтез биологически активных веществ. Для прогнозирования уровня противовоспалительного действия в рядах ариламидов NН-замещённых и N,N-дизамещённых антраниловых кислот были синтезированы новые соединения из этих рядов, доказана их структура, определены константы кислотности(рКа), основности(рКв) и липофильности(lgP) и по полученным наиболее значимым корреляционным уравнениям рассчитан количественный уровень предполагаемого противовоспалительного действия (ПВДрасч.) и экспериментально дана количественная оценка ПВД (ПВДэксп.) на животных.

4.1. Синтез и свойства ариламидов NН-замещённых антраниловой кислоты и их ацильных производных.

Для этой цели из ряда NН-замещённых антраниловых кислот были синтезированы новые сходные по структуре соединения с общей формулой:

Этерификацией N-аллилантраниловой кислоты или антраниловой кислоты метанолом в присутствии концентрированной серной кислоты синтезированы метиловые эфиры N-аллилантраниловой кислоты или антраниловой кислоты. Эти эфиры использовали в димагнезиламинном способе. Синтезированные продукты ацилировали хлорангидридами соответствующих кислот в среде бензола при нагревании до 800С в течение 30 минут.

Схема 5

R= -CH2-CH=CH2 ; R1=2-СH3(21); R= -CH2-CH=CH2 ; R1=4-СH3(22);

R=H ; R1=4-Сl; R2 =фурил(23)

Путём ацетилирования уксусным ангидридом ариламидов N-аллил(бензил) антраниловых кислот были получены новые соединения 24-26

(схема 6).

Схема 6

R=2-CH3;R1=-CH2-C6H5(24);R=4-OCH3;R1=-CH2-CH=CH2 (25)

R= 4-CH3; R1= -CH2-CH=CH2 (26)

Синтезированные соединения являются кристаллическими веществами белого цвета, нерастворимыми в воде, растворимыми в органических растворителях, таких как ДМСО, ДМФА, этанол. Для подтверждения структуры были сняты УФ-,ИК- и ПМР-спектры.

В ЯМР 1Н-спектрах соединений 21-22 сигналы метиленовых групп

(-CH2-) аллильного фрагмента наблюдаются в интервале 3,76 - 3,79 м.д., метиновые группы в области 5,15 - 5,75 м.д.(= CH2), а протон метиновой группы (-CH =) в области 5,75 - 5,77 м.д. Протоны ароматического кольца проявляются в области 6,47-8,43 м.д. Сигнал протона амидной группы

(-CONH-) присутствует в более слабом поле в области 9,25-12,28 м.д. Протоны вторичной аминогруппы(NH-R1) проявляются в области 6,53- 6,65м.д.

В ИК-спектрах полученных соединений наличие амидной группы подтверждается присутствием характерных полос поглощения в области 3350-3220 см-1 (CONH) и в области 1640-1600 см-1 (CONH). Вторичная аминогруппа амидного фрагмента наблюдается в области 3360-3520 см-1 (NH-R).

В УФ-спектрах соединений 21-23 наблюдается три максимума поглощения. Первая (=224-226нм) и вторая (=256-292нм) полосы поглощения соответствуют -* переходу электронов бензольного кольца. Третий максимум поглощения(=350-352нм) относится к n-* переходу неподелённых электронов атомов азота, которые участвуют в сопряжении с -электронами бензольного кольца.

В ЯМР 1Н-спектрах соединений 24-26 протоны метильных групп ацетильного фрагмента наблюдаются в интервале 2,33-2,94 м.д.(-СН3-), метиленовые группы аллильного фрагмента наблюдаются в интервале 3,58-3,62 м.д. (-CH2-) и в области 5,05-5,12 м.д.(= CH2), а протон метиновой группы (-CH =) в области 5,70 -5,72 м.д. Протоны ароматического кольца проявляются в области 7,16-9,16 м.д. Протон амидной группы (-CONH-) наблюдается при 8,61 м.д.

В ИК-спектрах полученных соединений полоса поглощения вторичной аминогруппы амидного фрагмента соответствует интервалу 3270-3240 см-1 (CONH), а полоса карбонила амидной группы интервалу 1650-1620 см-1 (CONH). В интервале 1680-1640 см-1 проявляется полоса карбонила ацетильной группы (COCH3).

В УФ-спектрах соединений 24-26 наблюдается два максимума поглощения. Первая полоса поглощения находится в области 262-270нм, а вторая в области 334-360нм. Уменьшение количества максимумов поглощения объясняется наложением 1 и 2 полосы поглощения, которые соответствуют -* переходу электронов ароматических колец, а полоса, соответствующая n-* переходу неподелённой электронной пары атомов азота сохранилася.

4.2. Прогноз уровня противовоспалительного действия с помощью экспериментально найденных констант ионизации для новых соединений.

Для прогноза уровня ПВД вновь синтезированных соединений 21-26 были определены их константы ионизации аналогично методике, что и для соединений 1-10, проведена их статистическая обработка, определены метрологические характеристики и проведена количественная оценка уровня противовоспалительного действия с использованием уравнений 1 и 2.

(21-23) (24-26)

Таблица 7

Прогноз уровня противовоспалительного действия для соединений 21-26 с использованием констант ионизации

№ п/п	21	22	23	24	25	26
рKa KOH	5,19	5,26	5,08	7,16	6,81	6,93
рKв HСlO4	13,59	12,56	13,44	14,48	14,04	14,24
Прогноз ПВД %	47,30±4,4	53,30±4,4	46,80±4,4	42,30±1,5	49,20±1,5	46,60±1,5

Рассчитанные величины противовоспалительного действия (ПВДрасч.) по корреляционным уравнениям 1 и 2 имеют отклонения от экспериментальных (ПВД эксп.) в интервале от 0,5% до 5,9%, определенных на лабораторных животных.

4.3. Прогноз уровня противовоспалительного действия с помощью экспериментально найденных констант липофильности для новых соединений.

Для прогноза уровня противовоспалительного действия вновь синтезированных соединений 21-26 были определены их константы липофильности аналогично методике, что и для соединений 1-10, проведена статистическая обработка полученных результатов, определены метрологические характеристики и рассчитан предполагаемый уровень противовоспалительного действия с использованием уравнений 3 и 4.

Таблица 8

Прогноз уровня противовоспалительного действия для соединений 21-26 с использованием констант липофильности

№ п/п	21	22	23	24	25	26
lg P эксп.	2,63	2,89	2,72	2,47	2,88	2,68
Прогноз ПВД расч%	40,65±6,3	57,20±6,3	46,50±6,3	32,10±3,2	57,40±3,2	49,00±3,2

Рассчитанные величины противовоспалительного действия (ПВДрасч.) по корреляционным уравнениям 3 и 4 имеют отклонения от экспериментальных (ПВД эксп.) в интервале от 1,1% до 6,9%, определенных на лабораторных животных.

4.4. Количественная зависимость противовоспалительного действия от констант ионизации и липофильности для новых соединений.

Наилучшие статистические характеристики имеет общее уравнение, в котором противовоспалительное действие линейно зависит от кислотно-основных свойств и параболически - от липофильных свойств. Для прогноза уровня ПВД с использованием уравнений 5 и 6 соединений 21-26 были использованы ранее найденные константы ионизации и липофильности данных соединений.

Таблица 9

Прогноз уровня противовоспалительного действия для соединений 21-26 с использованием констант ионизации и липофильности

№ п/п	21	22	23	24	25	26
pKa KOH	5,19	5,26	5,08	7,16	6,81	6,93
pKв HСlO4	13,59	12,56	13,44	14,48	14,04	14,24
lg P2 эксп.	6,92	8,95	7,40	6,10	8,29	7,18
Прогноз ПВД %	43,30- 46,70	45,55- 48,95	41,85- 45,25	33,30-40,30	51,65-58,65	42,10-49,10
ПВД экс. %	48,10-59,50	32,40-44,00	46,90-54,90	36,50-54,50	40,50-55,70	34,90-45,90

Для подтверждения прогнозируемых значений ПВД шести вновь синтезированных соединений из данных рядов было экспериментально определено их ПВД на модели каррагенинового отека на кафедре физиологии и патологии под руководством проф. Сыропятова Б.Я.

Опыты проводились на белых нелинейных крысах массой 180- 220 г на модели каррагенинового отёка. Изучаемые вещества вводили внутрибрюшинно в дозе 50 мг/кг в виде 1% крахмальной слизи за час до инъекции флогогена. Крысам контрольной серии вводили эквиобъёмное количество 1% крахмальной слизи. В качестве стандартного препарата использовали натриевую соль мефенамовой кислоты, которую вводили из расчёта в дозе 50 мг/кг в условиях, аналогичных описанным для тестируемых соединений. Эффект оценивали по уменьшению прироста отёка лап в сравнении с контрольной группой крыс.

Наиболее близкое прогнозируемое значение противовоспалительного действия к экспериментальному имеет соединение 21, у которого ПВД расч. находится в интервале 43,3%-46,7%, а ПВД экс. – 48,1%-59,5%.

Таким образом, рассчитанные величины противовоспалительного действия (ПВДрасч.) по корреляционным уравнениям 5 и 6 имеют минимальные отклонения (не более 4,95%) от экспериментальных (ПВД эксп.), определенных на лабораторных животных. Уравнения 5 и 6 можно использовать для целенаправленного синтеза биологически активных веществ с противовоспалительным действием в рядах ариламидов NН-замещённых антраниловой кислоты и их ацильных производных.

ВЫВОДЫ

1. Установлены количественные соотношения между противовоспалительным действием и константами ионизации, найденные экспериментально потенциометрическим методом неводного титрования для 20 ариламидов NH-замещённых антраниловых кислот и их ацильных производных.
2. Найдены количественные соотношения между противовоспалительным действием и константами липофильности, определённые экспериментально спектрофотометрическим методом для 20 ариламидов NH-замещённых антраниловых кислот и их ацильных производных.
3. Из 50 полученных уравнений по программе Microsoft Exсel выбрано для каждого ряда однопараметровые корреляционные уравнения с наибольшим коэффициентом корреляции и наименьшим доверительным интервалом.
4. Из 10 составленных двухпараметровых корреляционных уравнений, связывающих противовоспалительное действие с константы ионизации и липофильности выбрано по одному статистически значимому уравнению для каждого ряда, использование которых позволяет количественно прогнозировать уровень противовоспалительного действия вновь полученных соединений.
5. Рассчитанный уровень противовоспалительного действия для шести вновь синтезированных соединений с помощью одно и двухпараметровых уравнений соответствует экспериментально найденным значениям противовоспалительного действия на лабораторных животных.
6. Обнаружено, что среди вновь синтезированных и изученных 6 соединений наиболее перспективным для дальнейшего исследования является соединения 25. Значение противовоспалительного действия через 3 часа для этого соединения составляет 54,70%.

Основное содержание диссертации опубликовано в следующих работах:

1. Определение констант ионизации и липофильности в ряду ариламидов N-(3-хлорбутен-2-ил) антраниловой кислоты и их ацетильных производных в изучении связи структура-активность / О.С.Ендальцева, Ю.В. Аносова, О.П. Матвеева, Г.А. Вейхман, Л.М. Коркодинова // Сборник КМГУ.- Курск: КМГУ, 2000.- С. 229-230.
2. Константы ионизации в ряду N-ацилзамещённых антраниловых кислот в изучении связи структура-активность / О.С. Ендальцева, О.Б. Кремлёва, Л.М. Коркодинова, Ю.Л. Данилов // Рациональное использование лекарств: Мат. Росс. науч-прак. конф. – Пермь: 2004.- С. 55-57.
3. Константы липофильности в ряду N-ацилзамещённых антраниловых кислот в изучении связи структура-активность/ О.С. Ендальцева, Г.А. Вейхман, Л.М. Коркодинова // Разработка, исследование и маркетинг новой фармацевтической продукции: Сб. науч. трудов.- Пятигорск: 2005.- С. 211-213.
4. Константы ионизации в ряду амидов N-замещённых антраниловых кислот / О.С. Ендальцева, О.Б. Кремлёва, Л.М. Коркодинова, К.В. Андрюков // Второй Всероссийский съезд фармацевтических работников.- Сочи.- 2005.- С.87-88.
5. Константы ионизации амидов N-замещённых антраниловых кислот в изучении связи структура-активность / О.С. Ендальцева, О.Б. Кремлёва, Л.М. Коркодинова, Ю.Л. Данилов, А.Б. Шакирова, Г.А. Вейхман, Л.Г. Марданова // Хим.- фарм. журн. – 2005.- №1.- С.45-47.
6. Константы ионизации в ряду ариламидов NН-замещённых антраниловых кислот / О.С. Ендальцева, О.Б. Кремлёва, Л.М. Коркодинова // Медицина в Кузбасе: Мат. Межрегиональной научно-практ. конференции. – Кемерово.- 2007.- С.60.
7. Константы ионизации в ряду ариламидов N,N-дизамещённых антраниловых кислот в изучении связи структура-активность / О.С. Ендальцева, О.Б. Кремлёва, Л.М. Коркодинова, Г.А. Вейхман, О.Е. Саттарова, О.Л. Визгунова // Интеграция науки и образовательного процесса. Создание новых физиологически активных веществ: мат. третьей всероссийской научно-методической конференции. – Воронеж.-2007.- С.131-133.
8. Количественные соотношения констант липофильности с противовоспалительным действием в ряду ариламидов N,N-дизамещённых антраниловых кислот в изучении связи структура-активность / О.С. Ендальцева, О.Б. Кремлёва, Г.А. Вейхман, Л.М. Коркодинова // Мат. межвуз. научно-практ. конференции профессорско- преподавательского состава.- Пермь.- 2007.- С. 143-147.

9. Константы липофильности в ряду ариламидов NH-замещённых и N-ацетил-N-замещённых антраниловых кислот в изучении связи структура-активность / О.С. Ендальцева, Л.М. Коркодинова,О.Б. Кремлёва, Г.А. Вейхман, Л.Г. Марданова // Достижения и перспективы

в области создания новых лекарственных средств: мат. Росс. науч.-

практ. конф, посвящ. 70-летию Пермской госуд. фармац. акад. (Пермь,

27-28 нояб., 2007г.). – Пермь, 2007. – С.44-48.