Фармакогностическое изучение растений рода фиалка и спектр их фармакологической активности
На правах рукописи
БУБЕНЧИКОВ РОМАН АЛЕКСАНДРОВИЧ
ФАРМАКОГНОСТИЧЕСКОЕ
ИЗУЧЕНИЕ РАСТЕНИЙ РОДА ФИАЛКА И СПЕКТР ИХ ФАРМАКОЛОГИЧЕСКОЙ АКТИВНОСТИ
14.04.02 – фармацевтическая химия, фармакогнозия
АВТОРЕФЕРАТ
диссертации на соискание ученой степени
доктора фармацевтических наук
Пятигорск - 2011
Работа выполнена в Государственном образовательном учреждении высшего профессионального образования «Курский государственный медицинский университет» Министерство здравоохранения и социального развития Российской Федерации.
Научный консультант: доктор фармацевтических наук, профессор
Маркарян Артем Александрович
Официальные оппоненты: доктор фармацевтических наук, профессор
Ермакова Валентина Алексеевна
доктор фармацевтических наук, профессор
Куркин Владимир Александрович
доктор медицинских наук, профессор Тюренков Иван Николаевич
Ведущая организация: Всероссийский научно-исследовательский институт лекарственных и ароматических растений (ВИЛАР) РАСХН.
Защита состоится «____» ______ 2011 г. в _____ часов на заседании диссертационного совета Д 208.069.01 при ГОУ ВПО «Пятигорская ГФА Росздрава» (357532, Ставропольский край, г. Пятигорск, пр. Калинина, 11).
С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке ГОУ ВПО «Пятигорская ГФА Росздрава» (357532, Ставропольский край, г. Пятигорск, пр. Калинина, 11).
Автореферат разослан « ____»___________2011 г.
Ученый секретарь
диссертационного совета
Д 208.069.01 Е.В. Компанцева
ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ
Актуальность темы. Болезни органов дыхания широко распространены среди населения, они занимают одно из ведущих мест по заболеваемости, часто являясь причиной трудопотерь, инвалидизации и смертности населения. Рост заболеваемости дыхательных путей обусловлен ухудшением социально-экономических условий жизни, неблагоприятной экологической обстановкой, снижением иммунитета, ростом резистентности возбудителей патологии к применяемым антибиотикам, возрастающий этиологической ролью условно-патогенной микрофлоры (Чучалин А.Г., 2007; Стрельцова Е.Н., 2007).
В настоящее время для лечения заболеваний органов дыхания используется широкий арсенал синтетических препаратов. Однако, их применение в клинической практике часто сопровождается развитием побочных явлений и осложнений (Клиппел Д.Х., 2001).
Наряду с синтетическими препаратами в терапии этих заболеваний значительное место занимают лекарственные средства растительного происхождения, которые имеют широкий спектр фармакологического действия, обладают низкой токсичностью, мягкостью действия, способны быстро устранять симптомы обострения, не имеют отрицательных побочных эффектов при длительном применении. Наиболее часто в комплексной терапии заболеваний дыхательной системы фитопрепараты используют в качестве отхаркивающих, противовоспалительных, иммуностимулирующих, антимикробных средств.
Одним из путей увеличения фитопрепаратов является расширение спектра действия фармакопейных лекарственных растений и изучение возможности использования в научной медицине близкородственных видов. С этой точки зрения большой интерес представляют растения рода Фиалка.
В медицинской практике используются лишь два вида: фиалка трехцветная и фиалка полевая, которые применяются в виде настоев из травы в качестве отхаркивающего средства (Машковский М.Д., 2008). Растения рода Фиалка имеют достаточную сырьевую базу, широко применяются в народной медицине в качестве отхаркивающих и противовоспалительных средств. Из растений рода Фиалка наиболее изучен химический состав фиалки трехцветной, фиалки полевой и фиалки душистой (Растительные…, 2009, Бубенчиков Р.А., 2002). Химический состав других видов данного рода практически не изучен. Используемая лекарственная форма фармакопейных видов – настой имеет ряд недостатков, связанных с невозможностью точного дозирования и коротким сроком хранения. Все это делает актуальным вопрос разработки оптимальных лекарственных форм в виде сухих и густых экстрактов и представляет интерес в плане рационального использования лекарственного растительного сырья.
Существующая нормативная документация на траву фиалки трехцветной и фиалки полевой не позволяет объективно оценивать качество лекарственного сырья, т.к. не предусматривает стандартизацию сырья по содержанию действующих веществ и не учитывает пути его дальнейшего использования, в связи с чем возникает необходимость в разработке новых подходов к стандартизации сырья фиалки трехцветной и фиалки полевой и созданию для них современной нормативной документации.
Таким образом, исследования направленные на изучение растений рода Фиалка флоры Центрального Черноземья, их химического состава, фармакологического действия, стандартизации сырья, расширение сырьевой базы фармакопейных видов фиалок с целью создания на их основе фитопрепаратов для лечения заболеваний органов дыхания является актуальной проблемой.
Цель и задачи исследования. Целью работы является теоретическое и экспериментальное обоснование возможности расширения сырьевой базы фиалок на основе их фармакогностического и фармакологического исследования с целью создания фитопрепаратов для лечения заболеваний органов дыхания.
Для достижения указанной цели необходимо было решить следующие задачи:
- на основе данных литературы по распространенности, сырьевым ресурсам, химическому составу, применению растений в народной медицине для лечения заболеваний органов дыхания выделить перспективные виды для дальнейшего изучения;
- определить качественный состав биологически активных веществ растений рода фиалка и их количественное содержание;
- выделить сумму фенольных соединений и разделить их на индивидуальные компоненты;
- установить структуру индивидуальных соединений фенольной природы;
- выделить и изучить полисахариды изучаемых видов;
- разработать нормативную документацию на лекарственное растительное сырье;
- провести фармакологические исследования настоев и комплексов биологически активных веществ, полученных из изучаемых видов;
- предложить комплексную переработку сырья фиалок с последовательным получением густого экстракта, суммы водорастворимых полисахаридов и пектиновых веществ на примере сырья фиалки трехцветной;
- разработать состав и технологию жидкой лекарственной формы-сиропа на основе сухого водорастворимого экстракта травы фиалки полевой;
- выявить дополнительные источники сырья фармакопейных видов фиалок во флоре Центрального Черноземья за счет внедрения новых видов (фиалки душистой, фиалки сомнительной, фиалки удивительной, фиалки собачьей, фиалки скальной, фиалки опушенной, фиалки донской).
Научная новизна. Впервые на основании данных по систематическому положению, распространенности и сырьевым ресурсам флоры Центрального Черноземья установлено, что наиболее перспективными для фармакогностического изучения являются фиалка трехцветная, фиалка полевая, фиалка душистая, фиалка сомнительная, фиалка удивительная, фиалка собачья, фиалка скальная, фиалка опушенная, фиалка донская.
Исследования химического состава видов рода Фиалка позволили получить новые данные о содержание в них биологически активных веществ.
Различными методами хроматографии (бумажной, тонкослойной, ВЭЖХ) в исследуемых растениях идентифицировано 30 фенольных соединений, из них 21 впервые. Выделено 23 вещества фенольной природы и подтверждена их структура. Фенольные соединения фиалок представлены простыми фенологликозидами: арбутином; кумаринами: кумарином, умбеллифероном, скополетином, герниарином, дикумарином; оксикоричными и оксибензойными кислотами: феруловой, изоферуловой, неохлорогеновой, хлорогеновой, кофейной, салициловой, коричной, галловой, эллаговой; флавоноидными соединениями, в том числе: халконами – изосалипурпозидом; флаванонами - гесперидином; флавонами: апигенином, лютеолином и их гликозидами; флаванонолами: дигидрокверцетином; флавонолами: кверцетином, кемпферолом и их гликозидами.
Установлено, что общим и доминирующим флавоноидным соединением среди исследованных видов фиалок, имеющим значение для целей стандартизации является рутин.
Для растений рода фиалка характерно наличие гликофлавоноидов, среди которых идентифицированы моногликозиды апигенина и лютеолина и дигликозид апигенина. При изучении структуры гликофлавоноидов подтверждается ротационный характер изомерии с получением 2-х изомеров у С-моногликозидов и 4-х изомеров у С-дигликозида.
Впервые в растениях рода фиалка найдены халконы, флаваноны, флаванонолы; впервые охарактеризованы производные кумаринов, оксибензойных кислот.
Среди углеводов растений рода фиалки выделены и изучены водорастворимые полисахаридные комплексы (ВРПС), пектиновые вещества (ПВ), гемицеллюлозы А (ГЦ А) и Б (ГЦ Б). Изучен качественный и количественный состав выделенных комплексов. Проведен анализ структурных особенностей пектинов.
Научная новизна защищена 2 патентами: «Способ получения водорастворимых полисахаридов» из травы фиалки душистой (патент №2232774 от 20.04.04 г.), «Способ получения пектинов» из травы филаки собачьей (патент №2285536 от 20.10.2006 г.).
Впервые изучен аминокислотный и элементный состав исследуемых видов.
Установлено, что фитопрепараты, полученные из растений рода фиалка (настои, полисахаридные комплексы, выделенные из них, а также густой экстракт из травы фиалки трехцветной, сухой водорастворимый экстракт из травы фиалки полевой) являются практически нетоксичными веществами. Испытуемые фитопрепараты обладают широким спектром фармакологической активности: отхаркивающей, противовоспалительной, капилляроукрепляющей, анальгезирующей, диуретической, антибактериальной, антиоксидантной и мембраностабилизирующей.
Впервые разработана технология комплексной переработки сырья фиалки трехцветной, обеспечивающая последовательное получение густого экстракта с использованием метода вакуум-фильтрационной экстракции, суммы водорастворимых полисахаридов и пектиновых веществ.
Впервые показана возможность, обоснована целесообразность и предложена малоотходная технология переработки травы фиалки полевой, предусматривающая последовательное получение густого и сухого экстракта, а также сиропа на основе сухого водорастворимого экстракта.
Таким образом, теоретически обоснована и экспериментально подтверждена возможность расширения сырьевой базы фиалок и создания фитопрепаратов на их основе для лечения заболеваний органов дыхания.
Практическая значимость. Доказана идентичность состава полисахаридных комплексов изученных видов фиалок и фармакопейных видов: фиалки трехцветной и фиалки полевой. Полученные данные, а также фармакологические исследования обосновывают возможность использования травы фиалки душистой, фиалки сомнительной, фиалки собачьей, фиалки удивительной, фиалки опушенной, фиалки скальной и фиалки донской наряду с официнальными видами – фиалкой трехцветной и фиалкой полевой, что существенно расширит сырьевую базу этого ценного вида лекарственного сырья.
Разработаны методические приемы получения природных комплексов фенольных соединений и разделение их на индивидуальные компоненты.
Разработаны и апробированы методики анализа: содержание суммы флавоноидов в пересчете на рутин для травы фиалок, густых экстрактов, полученных из травы фиалки трехцветной и фиалки полевой; содержание полисахаридов для травы фиалок, сухого водорастворимого экстракта и сиропа на его основе.
Предложена стандартизация цельного, измельченного и порошкованного сырья в зависимости от путей его использования.
На основании морфолого-анатомического исследования впервые установлены макро- и микродиагностические признаки для определения подлинности измельченного и порошкованного сырья, которые включены в проект фармакопейной статьи.
Проведенные экспериментальные исследования фармакологической активности фитопрепаратов из растений рода фиалка аргументируют целесообразность их использования в качестве средств, предназначенных для лечения заболеваний органов дыхания, протекающих на фоне воспаления.
Внедрение в практику. В результате проведенных исследований разработаны и утверждены:
- Фармакопейная статья "Фиалки трава" №42-0142-05;
- «Инструкция по сбору и сушке травы фиалки трехцветной и фиалки полевой», утверждена Комиссией по стандартизации ВИЛАР;
- Разработан проект ФСП «Фиалки душистой трава».
Методика качественного обнаружения флавоноидов методом ТСХ, методики количественного определения суммы флавоноидов в траве фиалки и суммы полисахаридов в траве фиалки трехцветной, фиалки полевой и фиалки душистой апробированы на базе ЗАО Фирма «Здоровье» (г. Москва); способы получения пектинов и способ получения водорастворимых полисахаридов используются в научно-исследовательском процессе кафедры фармакогнозии и ботаники Курского государственного медицинского университета и кафедры фармации Кубанского государственного медицинского университета; методика количественного определения суммы флавоноидов в траве фиалки трехцветной используется в научно-исследовательском процессе кафедры фармацевтической химии и клинической фармации ВГМА им. Н.Н. Бурденко.
Результаты исследований включены в монографию А.А. Маркаряна, Р.А. Бубенчикова [и др.] «Растения рода Фиалка – перспективные источники эффективных лекарственных и оздоровительных средств», а также в справочник «Большая Курская энциклопедия «Растительный мир» Т.3 кн. 1.
Положения, выносимые на защиту:
- теоретическое и экспериментальное обоснование возможности расширения сырьевой базы фиалок;
- результаты изучения химического состава растений рода фиалка;
- разработка методов выделения и разделения фенольных соединений, установление их структуры;
- исследования по стандартизации травы фиалки трехцветной, фиалки полевой и фиалки душистой;
- результаты морфолого-анатомического исследования фиалки трехцветной и фиалки полевой;
- обоснование показателей качества сырья фиалок;
- доказательство отхаркивающей, противовоспалительной, капилляроукрепляющей, анальгезирующей, диуретической, антибактериальной, мембраностабилизирующей и антиоксидантной активности растений рода фиалка;
- технология комплексной переработки сырья фиалки трехцветной, обеспечивающая последовательное получение густого экстракта, суммы водорастворимых полисахаридов и пектиновых веществ, а также технология получения сиропа на основе сухого водорастворимого экстракта фиалки полевой.
Апробация материалов диссертации. Основные положения диссертации были представлены и доложены, на региональной конференции, посвященной 100-летию со дня рождения заслуженного деятеля науки РСФСР, член.-корр. АМН СССР, проф. Островерхова (Курск, 2004), на Международной научно-практической конференции «Экология, окружающая среда и здоровье населения Центрального Черноземья» (Курск, 2005), на VI национальном съезде фармацевтов Украины «Досягнення та перспективи розвитку фармацевтично галуз Украни» (Харьков, 2005), на 1-ой, 2-ой, 3-ей международных конференциях «Краеведение в Курском крае: прошлое и современность (Курск, 2006, 2007, 2008), на международной научно-практической конференции «Современные проблемы фитодизайна» (Белгород, 2007), на международной конференции «Кластерные подходы в современной фармации и фармацевтическом образовании (Белгород, 2008), International medizinscher congress. Program Abstracts. Euromedica Hannover – 2009 (Ганновер, 2009), на II Российском фитотерапевтическом съезде (Москва, 2010).
Связь задач исследования с проблемами медицинских и фармацевтических наук. Диссертационная работа выполнена в соответствии с планом научно-исследовательских работ Курского государственного медицинского университета (номер государственной регистрации 01.2010.65016).
Публикации. По материалам диссертации опубликовано 88 научных работ, в том числе 15 в изданиях, из перечня, рекомендуемого ВАК; 1 монография, 1 справочник; получены 2 патента на изобретения.
Работа представляет итог исследований, выполненных автором в творческом сотрудничестве с сотрудниками кафедр фармакогнозии и ботаники; микробиологии, вирусологии и иммунологии; общей химии; НИИ экологической медицины ГОУ ВПО «Курский государственный медицинский университет», Государственного научного центра лекарственных средств Украины сектора химии и технологии фенольных препаратов, кафедры фармации Кубанского государственного медицинского университета, кафедры фармации с курсом социальной фармации Московского медицинского университета им. И.М. Сеченова.
Структура и объем диссертации. Диссертационная работа состоит из введения, обзора литературы, описания материалов и методов исследования, четырех глав собственных исследований, заключения, выводов, списка использованной литературы и приложения. Диссертация изложена на 319 страницах компьютерного текста, иллюстрирована 76 таблицами, 44 рисунками. Библиографический указатель содержит 325 источника, из которых 74 – на иностранных языках.
ОСНОВНОЕ СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ
Объекты исследований
Объектами исследований были выбраны растения рода фиалка флоры Центрального Черноземья: фиалка трехцветная (Viola tricolor L.), фиалка полевая (Viola arvensis Murr.), фиалка душистая (Viola odorata L.), фиалка сомнительная (Viola ambigua Waldst et Kit.), фиалка собачья (Viola canina L.), фиалка опушенная (Viola hirta L.), фиалка удивительная (Viola mirabilis L.), фиалка скальная (Viola rupestris F.W.Schmidt) и фиалка донская (Viola tannaitica Grosset). Наряду с этим изучению подвергались настои из исследуемых видов фиалок, которые готовили в соответствии с ГФ XI изд. в соотношении 1:10, густой экстракт из травы фиалки трехцветной, сухой водорастворимый экстракт из травы фиалки полевой, а также сироп на основе сухого водорастворимого экстракта. Были исследованы и отдельные фракции, содержащие полисахаридные комплексы, пектиновые вещества.
Сырье заготавливалось в областях Центральной России в 2002-2009 годах в период цветения растений.
Все образцы хранились в соответствии с требованиями ГОСТ 17768-90 в сухом, прохладном, хорошо проветриваемом помещении, без прямого попадания солнечных лучей в бумажных мешках в условиях лаборатории.
Изучение качественного состава и выделение основных групп биологически активных веществ
Нами изучен в сравнительном плане состав 9 видов из рода фиалка и установлено наличие флавоноидов, кумаринов, фенолкарбоновых кислот, углеводных производных, аминокислот, макро- и микроэлементов.
Методами хроматографии на бумаге, в тонких слоях сорбента, ВЭЖХ идентифицировано 30 соединений: 1 фенологликозид, 5 кумаринов, 9 производных фенолкарбоновых кислот, 15 флавоноидных соединений.
Впервые в исследуемых видах идентифицировано 21 соединение: в фиалке трехцветной идентифицировано 14 фенольных веществ (4-впервые); фиалке полевой – 18 (13 впервые); фиалке душистой – 20 (11 впервые); фиалке сомнительной – 21 (21 впервые); фиалке собачьей – 14 (13 впервые); фиалке опушенной – 19 (19 впервые); фиалке удивительной – 14 (12 впервые); фиалке скальной – 16 (15 впервые); фиалке донской – 4 (4 впервые).
Изучены углеводы исследуемых растений, которые представлены свободными и связанными сахарами. Из свободных сахаров обнаружены арабиноза, галактоза и глюкоза; связанные сахара содержатся в виде гликозидов и полисахаридов.
Аминокислотный анализ изученных растений показал присутствие 14 аминокислот: аланина, аргинина, аспарагиновой кислоты, валина, гистидина, глицина, глутаминовой кислоты, лейцина, лизина, метионина, тирозина, треонина, серина, фенилаланина; среди которых 7 являются незаменимыми.
Суммарное содержание свободных аминокислот в изученных растениях колебалось в пределах 1,98 мг%-25,35 мг%. Наибольшее содержание суммы свободных кислот обнаружено в траве фиалки удивительной (25,35мг%) и траве фиалки опушенной (17,10 мг%).
Результаты анализа макро- и микроэлементного состава изученных растений показывают наличие в них от 15 до 29 биоэлементов, из которых 11 являются эссенциальными.
Изученные комплексы фенольных соединений, полисахаридов, макро- и микроэлементов, аминокислот являются перспективной группой веществ для создания новых фитопрепаратов для лечения воспалительных заболеваний органов дыхания с широким спектром действия.
Для препаративного выделения фенольных соединений использовали сухое растительное сырье (надземную часть исследуемых фиалок), измельченное вальцеванием в порошок с частицами менее 1 мм. Для экстракции и выделения веществ использовали от 200,0 г до 3,0 кг изучаемого растительного сырья. При подборе экстрагента веществ фенольной природы проводили определение экстрактивных веществ по ГФ ХI издания параллельно различными растворителями: ацетоном, спиртом этиловым различной концентрации и водой.
В результате установлено, что наибольшая по качественному и количественному содержанию сумма фенольных соединений извлекается 70% ацетоном, 70% спиртом этиловым в зависимости от вида исследуемых фиалок и состава фенольных соединений. Поэтому для извлечения фенольных соединений сырье экстрагировали 70% ацетоном или 70% спиртом этиловым методом фильтрационной экстракции. Полученные извлечения упаривали под вакуумом до водного остатка, который оставляли на ночь в холодильнике.
Выпавший осадок хлорофилла и липофильных веществ отфильтровывали на складчатом фильтре и промывали водой. Концентрированные извлечения разделяли фракционированием по растворимости, для чего их обрабатывали равными количествами органических растворителей (диэтилового эфира, хлороформа, этилацетата, бутанола). Данные операции повторяли 6-8 раз для каждого растворителя. Полученные таким образом извлечения обезвоживали натрия сульфатом безводным и упаривали под вакуумом до полного удаления растворителя.
Все полученные фракции анализировали методом хроматографии на бумаге в системе растворителей: 15% кислота уксусная, 2% кислота уксусная, хлороформ-формамид, бензол – этилацетат – кислота уксусная (50:50:1), и далее вещества во фракциях разделяли методами дробной кристаллизации, колоночной и тонкослойной хроматографии на полиамиде и силикагеле, бумажной хроматографии. В итоге разработаны групповые методики выделения фенольных соединений из исследуемых видов фиалок (рис.1).
В результате проведенных исследований в индивидуальном состоянии выделено 23 фенольных соединения, из них 1 фенологликозид, 6 производных фенолкарбоновых кислот, 4 кумарина, 12 флавоноидных соединений (табл. 1).
Наряду с фенольными соединениями выделены полисахаридные комплексы из травы исследуемых видов фиалок. Для выделения водорастворимых полисахаридных комплексов использовали воздушно-сухой шрот сырья после экстракции полифенольных соединений (рис. 1). Полисахаридные комплексы получали последовательно фракционно: водорастворимые полисахаридные комплексы (ВРПС), пектиновые вещества (ПВ), гемицеллюлоза (ГЦ А и ГЦ Б). Выход полисахаридных комплексов колеблется: ВРПС от 4,0% до 12,5%, ПВ от 8,0% до 23,0%, ГЦ А от 3,9% до 9,0%, ГЦ Б от 2,5% до 4,7% (табл. 2).
Изучение фенольных соединений и углеводов
растений рода фиалка
Структуру выделенных фенольных соединений устанавливали, применяя инструментальные физико-химические (УФ, ИК, ПМР-спектроскопию) и химические (качественные реакции, кислотный, ферментативный гидролиз, щелочное расщепление, ацетилирование, метилирование и др.) методы исследований, а также в сравнении с достоверными образцами.
С помощью качественных реакций обнаруживали те или иные группы флавоноидных соединений, а также устанавливали различия между ними.
Таблица 1 - Фенольные соединения, выделенные из сырья исследуемых фиалок
| Номер вещества | Название вещества, химическая структура | Растение, из которого выделено вещество |
| 1 | 2 | 3 |
| ГЛИКОЗИДЫ ПРОСТЫХ ФЕНОЛОВ | ||
| 3.01 | Арбутин (гидрохинон-О--D-глюкопиранозид) | Фиалка скальная* |
| ФЕНОЛКАРБОНОВЫЕ КИСЛОТЫ | ||
| 3.02 | Эллаговая (дилактон гексаоксидифеновой кислоты) | Фиалка сомнительная* |
| 3.03 | Галловая (3,4,5-триоксибензойная) | Фиалка душистая* |
| 3.04 | Кофейная (3,4-диоксикоричная) | Фиалка душистая, фиалка опушенная*, фиалка скальная* |
| 3.06 | Феруловая (4-окси-3-метокси-коричная) | Фиалка полевая*, фиалка удивительная*, фиалка собачья* |
| 3.07 | Хлорогеновая (5-О-кофеил-D-хинная) | Фиалка душистая, фиалка сомнительная*, фиалка удивительная* |
| 3.08 | Неохлорогеновая (3-О-кофеил-D-хинная) | Фиалка душистая*, фиалка скальная* |
| КУМАРИНЫ | ||
| 3.12 | Кумарин (бензо--пирон) | Фиалка опушенная*, фиалка сомнительная*, фиалка полевая |
| 3.13 | Герниарин (7-метоксикумарин) | Фиалка удивительная* |
| 3.14 | Скополетин (6-метокси,7-оксикумарин) | Фиалка полевая, фиалка удивительная* |
| 3.16 | Умбеллиферон (7-оксикумарин) | Фиалка полевая*, фиалка душистая* |
| Таблица 1(продолжение) | ||
| 1 | 2 | 3 |
| ФЛАВОНОИДЫ | ||
| 3.18 | Кверцетин (3,5,7, 3-4-пентаоксифлавон) | Фиалка трехцветная*, фиалка сомнительная*, фиалка удивительная* |
| 3.20 | Лютеолин (5,7, 34-тетраоксифлавон) | Фиалка сомнительная* |
| 3.21 | Апигенин (5,7,4-триоксифлавон) | Фиалка трехцветная*, фиалка собачья*, фиалка сомнительная* |
| 3.22 | Хризоэриол (5,7,4-триокси-3метоксифлавон) | Фиалка сомнительная* |
| 3.24 | Витексин (8-С-син--D-глюкопиранозид апигенина) | Фиалка трехцветная, фиалка собачья*, фиалка сомнительная*, фиалка опушенная* |
| 3.25 | Ориентин (8-С-син--D-глюкопиранозид лютеолина) | Фиалка опушенная* |
| 3.26 | Цинарозид (лютеолин-7-О--D-глюкопиранозид) | Фиалка скальная* |
| 3.27 | Гиперозид (кверцетин-3-О--D-галактопиранозид) | Фиалка душистая*, фиалка опушенная*, фиалка скальная*, фиалка трехцветная*, фиалка собачья* |
| 3.28 | Виценин (8-С--D-глюкопиранозил-6-С--D-глюкопиранозид апигенина) | Фиалка скальная*, фиалка полевая |
| 3.29 | Гесперидин (5,3-диокси-4-метокси-7-О--D-глюкопиранозидо (16)-О--L-рамнопиранозид флаванона) | Фиалка полевая*, фиалка собачья* |
| 3.30 | Рутин (кверцетин-3-О--D-глюкопиранозидо-(16)-О--L-рамнопиранозид) | Фиалка трехцветная, фиалка собачья*, фиалка сомнительная*, фиалка полевая |
| 3.31 | Робинин (3-0- -D-галактопиранозил-6-0- -рамнопиранозил-7-0- - L - рамнопиранозид) кемпферола. | Фиалка опушенная* |
Примечание – «*» означает, что соединение из данного растения выделено впервые.
Таблица 2 - Выход фракций полисахаридов из травы изученных
видов рода Фиалка
| Растение рода Фиалка | Фракции полисахаридов, % | |||
| водорастворимые полисахариды | пектиновый комплекс | гемицеллю-лоза А | гемицеллю-лоза Б | |
| Фиалка трехцветная | 10,0 | 12,8 | 4,3 | 2,8 |
| Фиалка полевая | 5,8 | 9,0 | 5,1 | 3,7 |
| Фиалка душистая | 10,5 | 23,0 | 3,9 | 3,2 |
| Фиалка сомнительная | 7,5 | 12,0 | 6,6 | 3,9 |
| Фиалка собачья | 10,7 | 16,8 | 4,2 | 4,7 |
| Фиалка опушенная | 10,0 | 8,0 | 4,3 | 3,5 |
| Фиалка удивительная | 4,0 | 13,0 | 9,0 | 3,0 |
| Фиалка скальная | 6,5 | 13,5 | 5,0 | 4,0 |
| Фиалка донская | 12,5 | 11,0 | 7,5 | 2,5 |
Характер окраски продуктов цианидиновой реакции позволял предварительно отнести исследуемое соединение к флавонам или флавонолам. По продуктам деструкции в щелочной среде определяли основные элементы флавоноидных структур: кольцо А по наличию флороглюцина, кольцо В по присутствию n-оксибензойной или протокатеховой кислот. Метилирование и дезметилирование
использовали для установления замещения оксигруппами в агликонах и гликозидах. С помощью ацетилирования обнаруживали число оксигрупп в агликонах и гликозидах. Флавоноидные гликозиды гидролизовали в обычных условиях кислотами, щелочами и отдельными ферментными системами (рамнодиастазой). Проводили также ступенчатый гидролиз с выделением промежуточных продуктов деструкции гликозидов и кислотный гидролиз по Киллиани. В УФ-спектральном анализе флавоноидов применяли ионизирующие и комплексообразующие реактивы.
Фенологликозиды. Вещество 3.01 по качественным реакциям, хроматографической подвижности, физико-химическим характеристикам было охарактеризовано как О--D-глюкопиранозид гидрохинона или арбутин (табл.3).
Производные галловой кислоты. Вещества 3.02-3.03 на основании качественных реакций, результатов химических превращений, хроматографического анализа, физико-химических характеристик были отнесены к производным галловой кислоты. В результате проведенных
Таблица 3 - Физико-химические свойства веществ, выделенных из сырья исследуемых фиалок
| Номер вещества | Название вещества | Общая формула | T пл., С | Молеку-лярная масса | Окраска веществ в УФ-свете | Величина Rf | |||
| До проявления | После проявления | ||||||||
| Парами аммиака | Спиртовым раствором NaOH | Раствором циркония хлорокиси | |||||||
| 1 | 2 | 3 | 4 | 5 | 6 | 7 | 8 | 9 | 10 |
| ПРОСТЫЕ ФЕНОЛЫ | |||||||||
| 3.01 | Арбутин (гидрохинон-О--D-глюкопиранозид) | С12Н16О7 | 195-197 | 272,26 | бледно-фиолетовая | - | - | ярко-фиолето-вая | 0,85Б; 0,90З; 0,89И. |
| ФЕНОЛКАРБОНОВЫЕ КИСЛОТЫ | |||||||||
| 3.02 | Эллаговая (дилактон гексаоксидифеновой кислоты) | С14Н6О8 | 360 разл. | 302,00 | сиреневая | желтая | желтая | 0,25А; 0,10Б. | |
| 3.03 | Галловая (3,4,5-триоксибензойная) | С7Н6О5 | 254-256 | 170,00 | темная | - | - | синяя | 0,62А; 0,55Е. |
| 3.04 | Кофейная (3,4-диоксикоричная) | С9 Н8 О4 | 193-195 | 184,30 | светло-голубая | ярко- голубая | ярко- голубая | голубая | 0,82А; 0,41Б; 0,26В. |
| 3.06 | Феруловая (4-окси-3-метокси-коричная) | С10 Н10 О4 | 167-169 | 194,19 | голубовато-фиолетовая | ярко-голубовато-фиолетовая | ярко-голубоватофиолетовая | голубая | 0,83А; 0,55Б; 0,33В. |
| 3.07 | Хлорогеновая (5-О-кофеил-D-хинная) | С16 Н18 О9 | 203-205 | 353,08 | голубая | зеленовато-голубая | зеленовато-голубая | голубая | 0,65А; 0,72Б; 0,70В. |
| 3.08 | Неохлорогеновая (3-0-кофеил- D-хинная) | С16 Н18 О9 | аморфн. | 354,00 | голубая | голубая | зеленовато-голубая | голубая | 0,72В. |
| КУМАРИНЫ | |||||||||
| 3.12 | Кумарин (бензо--пирон) | С9 Н6 О2 | 67-68 | 146,89 | - | - | зелено- ватая | - | 0,80Г; 0,93Ж. |
| 3.13 | Герниарин (7-метоксикумарин) | С10 Н8 О3 | 117-118 | 173,40 | сиреневая | ярко-сиреневая | ярко-сиреневая | - | 0,88Ж. |
| 3.14 | Скополетин (6-метокси,7-оксикумарин) | С10 Н8 О4 | 204-205 | 196,60 | голубая | ярко- голубая | ярко- голубая | - | 0,50Б; 0,20Г; 0,60Ж. |
| 3.16 | Умбеллиферон (7-оксикумарин) | С9 Н6 О3 | 233-234 | 162,88 | голубая | ярко- голубая | ярко- голубая | голубая | 0,65Б; 0,32Г; 0,25Ж. |
| ФЛАВОНОИДЫ | |||||||||
| 3.18 | Кверцетин (3,5,7, 3-4-пентаоксифлавон) | С15 Н10 О7 | 310-312 | 302,00 | желтая | ярко-желтая | желтая | - | 0,68А; 0,10Б; 0,12Е. |
| Таблица 3 (продолжение) | |||||||||
| 1 | 2 | 3 | 4 | 5 | 6 | 7 | 8 | 9 | 10 |
| 3.20 | Лютеолин (5,7, 3-4-тетраоксифлавон) | С15 Н10 О6 | 328-330 | 286,24 | темная | оранжевая | - | желтая | 0,22Е. |
| 3.21 | Апигенин (5,7,4-триоксифлавон) | С15 Н10 О5 | 340-345 | 270,24 | темная | зеленая | - | желтая | 0,82А; 0,18Е. |
| 3.22 | Хризоэриол (5,7,4-триокси-3-метоксифлавон) | С16Н12 О6 | 330-331 | 300,00 | темная | - | - | желтая | 0,83 Л. |
| 3.24 | Витексин (8-С-син--D-глюкопиранозид апигенина) | С21 Н20О10 | 263-265 | 432,20 | темная | зеленая | - | желтая | 0,20Б; 0,35Е. |
| 3.25 | Ориентин (8-С-син--D-глюкопиранозид лютеолина) | С21 Н20О11 | 260-262 | 448,00 | темная | оранжевая | - | желтая | 0,24Б; 0,33Е. |
| 3.26 | Цинарозид (лютеолин-7- О--D-глюкопиранозид) | С12 Н20О11 | 256-258 | 448,00 | темно-коричневая | оранжевая | - | желтая | 0,24 Е. |
| 3.27 | Гиперозид (кверцетин-3-О- -D-галактопиранозид) | С21Н20О12 | 235-237 | 464,00 | темно-желтая | - | - | желтая | 0,50Б. |
| 3.28 | Виценин (8-С--D-глюкопиранозил-6-С--D-глюкопиранозид апигенина) | С27 Н30О15 | 232-234 | 594,00 | темная | желто- зеленая | желтая | желтая | 0,60Б. |
| 3.29 | Гесперидин (5,3-диокси-4-метокси-7-О--D-глюкопи-ранозидо (16)-О--L-рамнопиранозид флаванона) | С28Н34О15 | 260-261 | 610,58 | - | зеленовато-желтая | салатная | зеленовато-желтая | 0,50А; 0,75Б. |
| 3.30 | Рутин (кверцетин-3-О--D-глюкопиранозидо-(16)-О--L-рамнопиранозид) | С27 Н30О16 | 188-190 | 610,52 | темно-бурая | оранжевая | желто-оранжевая | желтая | 0,70А; 0,55Б. |
| 3.31 | Робинин (3-0-В-D-галактопиранозил-6-0-L-рамнопиранозил-7-0--L-рамнопиранозид) кемпферола | С33Н40О19 | 192-194 | 740,15 | темная | желто- зеленая | - | желтая | 0,31 А; 0,79 Б; 0,88 В. |
Примечание: Системы растворителей для хроматографирования:
А – н. бутанол- кислота уксусная - вода (4:1:2) - БХ;
Б – 15% раствор кислоты уксусной - БХ;
В – 2% раствор кислоты уксусной - БХ;
Г – бензол-этилацетат (2:1) – ТСХ («Silufоl»);
Д – бензол-этилацетат - кислота уксусная (50:50:1) - БХ;
Е – 30% раствор кислоты уксусной - БХ;
Ж – хлороформ-формамид - БХ;
З – этилацетат- кислота муравьиная - вода (3:1:1) - БХ;
И – 60% раствор кислоты уксусной – ТСХ («Silufоl»);
К – хлороформ-спирт этиловый - вода (100:50:2) - ТСХ («Silufоl»);
Л – н.бутанол- кислота уксусная - вода (4:1:5) – БХ.
физико-химических исследований и в сравнении с достоверными образцами вещество 3.02 идентифицировано как дилактон гексаоксидифеновой кислоты или эллаговая кислота, а вещество 3.03 как 3,4,5-триоксибензойная или галловая кислота.
Оксикоричные кислоты. Вещества 3.04, 3.06, 3.07, 3.08 по флюоресценции пятен на хроматограммах в УФ-свете, хроматографической подвижности, качественным цветным реакциям с хлоридом железа, диазотированной сульфаниловой кислотой и бромкрезоловым зеленым были отнесены к производным коричной кислоты. Данные УФ-спектров подтверждают предположение, что исследуемые соединения являются производными коричной кислоты, имеющими максимумы поглощения в области 235-245 и 296-325 нм. Продукты щелочного гидролиза вещества 3.04 идентифицировали с протокатеховой кислотой, вещества 3.06 с ванилиновой кислотой, веществ 3.07 и 3.08 с кофейной и D-хинной кислотой. Для установления места присоединения кофейной и D-хинной кислот в веществах
3.07 и 3.08 проводили лактонизацию этих веществ в ледяной кислоте уксусной. При этом образование лактона происходило только в присутствии вещества 3.08, вещество 3.07 оставалось без изменений. Следовательно в молекуле вещества 3.07 оксигруппа D-хинной кислоты замещена остатком кофейной кислоты в С-5 положении, а вещества 3.08 – в положении С-3. Таким образом, исследуемые соединения охарактеризованы как: 3.04 - 3,4-диоксикоричная или кофейная кислота, 3.06 - 4-окси-3-метокси-коричная или феруловая кислота, 3.07 - 5-О-кофеил-D- хинная или хлорогеновая кислота, 3.08 - 3-0-кофеил-D-хинная или неохлорогеновая кислота.
Кумарины. Вещества 3.12, 3.13, 3.14, 3.16 по флуоресценции пятен на хроматограммах в УФ-свете, хроматографической подвижности, качественным реакциям отнесены к кумаринам. Кумариновая природа исследуемых соединений подтверждена также их деструкцией кислотой йодистоводородной в среде жидкого фенола. Данные УФ-, ИК-спектров, продуктов химических превращений, отсутствие депрессии температуры плавления в смешанных пробах с достоверными образцами дали основание охарактеризовать вещество
3.12 как бензо--пирон или кумарин, вещество 3.13 - 7-метоксикумарин или герниарин, вещество 3.14 – 6-метокси-7-оксикумарин или скополетин, вещество 3.16 – 7-оксикумарин или умбеллиферон.
Флавоноидные агликоны. Вещества 3.18, 3.20, 3.21, 3.22 дают положительную цианидиновую реакцию по Брианту, это позволяет отнести их к флавоноидным агликонам. При проведении цианидиновой реакции у вещества 3.18 октанольный слой окрашивается в красный цвет, что характерно для флавонолов, а у веществ 3.20, 3.21, 3.22 в розовый цвет, характеризующий флавоны. Флавоноидная природа подтверждается также ИК-спектрами, в которых отмечаются полосы поглощения в области 3385-3200 см-1 (фенольные оксигруппы), 1639-1665 см-1 (карбоксильная группа -пирона), 1615, 1510 см-1 (колебания ароматических колец). Положение свободных оксигрупп доказывали на основании данных прямой и дифференциальной УФ-спектроскопии, применяя ионизирующие и комплексообразующие реактивы. Продуктами щелочной деструкции веществ 3.18 и 3.20 являются флороглюцин и протокатеховая кислота, вещества 3.21 – флороглюцин и n-оксибензойная кислота, вещества 3.22 – флороглюцин и изовалериановая кислота.
Ацетильные и метильные производные исследуемых веществ полностью совпали по физико-химическим свойствам с соответствующими производными кверцетина, апигенина, лютеолина, хризоэриола. При дезметилировании вещества 3.22 образуется вещество 3.20 (лютеолин).
В результате изучения физико-химических свойств исходных веществ и их производных, а также в сравнении с достоверными образцами выделенные соединения идентифицированы как: вещество 3.18 – 3,5,7,3-4-пентаоксифлавон или кверцетин, вещество 3.20 – 5,7,3-4-тетраоксифлавон или лютеолин, вещество 3.21 - 5,7,4-триоксифлавон или апигенин, вещество 3.22 – 5,7,4-триокси-3-метоксифлавон или хризоэриол. Анализируя распространение флавоноидных агликонов в растениях рода фиалка, отмечено, что наиболее часто встречается кверцетин, он содержится во всех исследованных видах, а наиболее редко хризоэриол, он содержится только в фиалке сомнительной.
Флавоноидные гликозиды. Вещества 3.24, 3.25, 3.26, 3.27, 3.28, 3.29, 3.30, 3.31 на основании отрицательной цианидиновой пробы в модификации Брианта, результатов кислотного гидролиза отнесены к гликозидам флавоноидов. В дифференциальном ИК-спектре этих соединений, кроме полос поглощения, характеризующих их флавоноидную природу, обнаружены три полосы в области 1100-1010 см-1, указывающие на наличие в их структуре углеводов в пиранозной форме, полосы поглощения в области 900-880 см-1, характеризующую -конфигурацию гликозидной связи между углеводом и агликоном.
Количественным кислотным гидролизом, сравнением УФ-спектров гликозидов и их агликонов, данными молекулярной массы гликозиды флавоноидов разделились на моно-, би- и дигликозиды. При изучении конечных продуктов и динамики гидролиза устанавливали, что большинство гликозидов сравнительно легко гидролизуются, что позволило отнести их к О-гликозидами, часть же веществ в обычных условиях гидролиза не расщепляются, что было основанием отнести их к С-гликозидам.
О-гликозиды распределились на 3-О- гликозиды и 7-О-гликозиды. 3-О-гликозиды представлены флавонолами и разделились на моногликозиды (вещество 3.27) и биозиды (вещество 3.30). В продуктах кислотного гидролиза вещества 3.27 обнаружили кверцетин и D-галактозу, а вещества 3.30 -кверцетин, D-глюкозу и L-рамнозу. Для выяснения последовательности присоединения моносахаридов в веществе 3.30 провели мягкий ступенчатый гидролиз 0,5% кислотой хлористоводородной в 50% спирте этиловом. В продуктах реакции промежуточного гликозида не обнаружили, а нашли кверцетин (вещество 3.18) и рутинозу. Следовательно, с агликоном связана D-глюкоза, L-рамноза является терминальным сахаром. Ферментативный гидролиз вещества 3.30 рамнодиастазой вызывал отщепление углеводного остатка, что указывает на 1-6 порядок связи между сахарами. На основании проведенных исследований вещество 3.27 можно охарактеризовать как кверцетин-3-О--D-галактопиранозид или гиперозид, а вещество 3.30 - кверцетин-3-О--D-глюкопиранозид-(16)-О--L-рамнопиранозид или рутин). Рутин является общим и доминирующим соединением растений рода фиалка.
К 7-О-гликозидам отнесены вещества 3.26 и 3.29, которые представлены флавонами (вещество 3.26) и флаванонами (вещество 3.29). В продуктах кислотного гидролиза вещества 3.26 обнаружили лютеолин и D-глюкозу, а вещества 3.29 гесперитин, D-глюкозу и L-рамнозу. Ферментативный гидролиз вещества 3.29 проводили рамнодиастазой параллельно с веществом 3.30 (рутином). В результате устанавливали, что углеводный компонент вещества 3.29 представлен рутинозой. Таким образом, вещество 3.26 идентифицировали как лютеолин-7-О-- D-глюкопиранозид или цинарозид, вещество 3.29 - 5,3-диокси-4-метокси-7-О--D-глюкопиранозидо (16)-О--L-рамнопиранозид флаванона или гесперидин.
Вещество 3.31 является 3-(О--D-галактопиранозид-7-О-L-- рамнопиранозидом) кемпферола или робинином.
Вещества 3.24, 3.25, 3.28 по отношению к кислотному гидролизу отнесены к С-гликозидам. Кислотный гидролиз данных соединений в обычных условиях приводил к образованию 2-х изомеров у веществ 3.24 и 3.25 и 4-х у вещества 3.28 и сахар при этом в гидролизате не обнаруживали. В продуктах кислотного гидролиза по Киллиани обнаружили апигенин у веществ 3.24 и 3.28 и лютеолин у вещества 3.25. В качестве сахарного компонента во всех случаях идентифицировали D-глюкозу. На основании проведенных исследований вещества 3.24 и 3.25 отнесены к С-моногликозидам и охарактеризованы как: вещество 3.24 - 8-С-син--D-глюкопиранозид апигенина или витексин, вещество 3.25 - 8-С-син--D-глюкопиранозид лютеолина или ориентин. Вещество 3.28 отнесено к С-дигликозидам и охарактеризовано как 8-С--D-глюкопиранозил-6-С--D-глюкопиранозид апигенина или виценин.
Изучен качественный и количественный моносахаридный состав полисахаридных комплексов растений рода фиалка. Для анализа полисахаридных комплексов их подвергали гидролизу раствором кислоты серной (1 моль/л). Хроматографически в гидролизатах водорастворимых полисахаридов обнаружили от 6 до 8 веществ моносахаридного характера, из которых идентифицировали арабинозу, галактозу, глюкозу, ксилозу, рамнозу, глюкуроновую и галактуроновую кислоту; в гидролизатах пектиновых веществ идентифицировали 5 моносахаридов: арабинозу, галактозу, рамнозу, ксилозу и галактуроновую кислоты; в гидролизатах ГЦА и ГЦБ - 4 моносахарида: рамнозу, ксилозу, арабинозу, галактозу. Содержание моносахаридов определяли денситометрически после хроматографии гидролизатов в тонких слоях сорбента в системе растворителей: н-бутанол - кислота уксусная - вода в соотношении 3:1:1. Установлено, что в водорастворимых полисахаридах преобладающими являются глюкоза от 4,0% (фиалка душистая) до 9,1% (фиалка трехцветная), арабиноза от 9,5% (фиалка полевая) до 29,7% (фиалка собачья), галактоза от 5,2% (фиалка полевая) до 28,4% (фиалка опушенная). Основу пектиновых веществ составляет галактуроновая кислота – от 68,4% (фиалка душистая) до 89,2% (фиалка опушенная). В гемицеллюлозе А и Б преобладающим моносахаридом является ксилоза от 5,8 % (фиалка сомнительная) до 8,6% (фиалка скальная) и от 6,8% (фиалка душистая) до 8,7% (фиалка опушенная), что указывает на наличие полисахаридов типа ксилана.
Проведено определение функциональных групп пектиновых веществ титриметрическим методом. Содержание свободных карбоксильных групп в исследуемых пектиновых веществах колеблется от 0,43% до 8,17%, метоксилированных карбоксильных групп - от 0,60% до 6,54%, метоксильных групп - от 0,47% до 4,51%. Пектиновые вещества фиалки трехцветной, фиалки полевой, фиалки собачьей, фиалки удивительной характеризуются невысокой степенью этерификации (<50%), а пектиновые вещества фиалки донской, фиалки опушенной, фиалки скальной относятся к высоко этерифицированным соединениям.
Высокое содержание свободных карбоксильных групп у пектиновых веществ фиалки трехцветной, фиалки полевой, фиалки душистой, фиалки собачьей, фиалки удивительной говорит об их комплексообразующей способности и возможности рекомендации их в качестве детоксикантов.
Разработка нормативной документации на сырье фиалок
Существующая ФС «Трава фиалки» (Государственная…, 1989) не удовлетворяет современным требованиям, предъявляемым к нормативной документации на растительное сырье, т.к. в ней отсутствуют методики качественного и количественного определения основных групп биологически активных веществ, что не позволяет дать объективную оценку качества сырья.
Основными группами биологически активных веществ травы фиалок являются флавоноиды и полисахариды, поэтому стандартизацию сырья необходимо проводить по их содержанию.
Для качественного обнаружения флавоноидов в исследуемых видах разработана методика хроматографии в тонком слое сорбента на пластинках «Sorbfil» [ПТСХ–АФ-А-УФ]. В качестве подвижной фазы, обеспечивающей наилучшее разделение суммы флавоноидов растений рода фиалка, экспериментально подобрана система растворителей: этилацетат- кислота муравьиная-вода (70:15:15). В результате проведенных исследований установлено, что на хроматограмме должно быть видно не менее 5 основных зон: - одна на уровне ГСО рутина, остальные с Rs около 0,28, Rs около 0,72, Rs около 1,26, Rs около 1,38, имеющие темную флуоресценцию в УФ-свете. Данная методика внесена в раздел «Хроматография» проекта ФС.
Для количественного определения флавоноидов разработана спектрофотометрическая методика определения суммы флавоноидов непосредственно в извлечениях из сырья. В основу данной методики положена реакция комплексообразования с алюминия хлоридом в сочетании со спектрофотометрическим дифференциальным способом определения оптической плотности комплексов. Это позволяет проводить непосредственное спектрофотометрирование комплексов флавоноидов с алюминия хлоридом без дополнительных стадий очистки. При подборе экстрагента и степени измельчения сырья установлено, что оптимальным растворителем, обеспечивающим максимальный выход флавоноидов из сырья фиалок, является 70% спирт этиловый, степень измельчения сырья 1-2 мм. Для извлечения флавоноидов нами использована экстракция до наступления равновесия, максимальный выход флавоноидов достигается через 45 минут с последующим наступлением равновесия. В составе суммы флавоноидов фиалок содержатся гликозиды кверцетина, апигенина, лютеолина, преобладающим среди них является рутин. Спектры поглощения спиртовых извлечений из сырья фиалок с алюминия хлоридом и рутина с алюминия хлоридом совпадают, при этом максимум поглощения находится при длине волны 410 нм. Устойчивое окрашивание извлечений из сырья фиалок наступает через 30 минут и сохраняется в течении 2-х часов, что достаточно для проведения анализа. Описанные выше исследования позволили разработать методику количественного определения суммы флавоноидов в сырье фиалок в пересчете на ГСО рутин. Методика валидирована по показателям: линейность (у=851,746±0,0125, R2=0,9998), повторяемость (Eотн.– 2,72%), воспроизводимость (RSD=3,20%), правильность (среднее значение выхода 99,67%).
Предложенной методикой проанализировано по 5 партий сырья фиалки трехцветной, фиалки полевой и фиалки душистой, а также сырье всех исследуемых фиалок. Содержание суммы флавоноидов в траве фиалок находится в пределах 1,15-3,21% у травы фиалки трехцветной и фиалки полевой и 1,84-2,74 % у травы фиалки душистой. В траве других исследованных фиалок содержание суммы флавоноидов колеблется от 0,61% до 2,73%.
Установлена норма содержания суммы флавоноидов в траве фиалки трехцветной и фиалки полевой не менее 1,0%.
Для количественного определения водорастворимых полисахаридов использован гравиметрический метод, основанный на экстракции суммы полисахаридов из сырья горячей водой с последующим осаждением их 96% спиртом этиловым. Определены оптимальные условия извлечения и осаждения полисахаридов: степень измельчения сырья – 2 мм, нагревание в течение 30 минут, трехкратная экстракция, соотношение сырья и экстрагента 1:10, 4-кратное количество 95% спирта этилового по отношению к извлечению. Ошибка единичного определения с 95% вероятностью не превышает 4,72%. Установлено, что содержание суммы полисахаридов в траве фиалки трехцветной и фиалке полевой колеблется от 8,4% до 14,5%, а в траве фиалки душистой от 10,5% до 14,5%. На основании полученных данных установлена норма содержания суммы полисахаридов в траве фиалки трехцветной и фиалки полевой, не менее 8,0%.
Разработанные методики количественного определения суммы флавоноидов и суммы полисахаридов введены в новый раздел проекта фармакопейной статьи «Количественное определение».
Впервые осуществлен дифференцированный подход к стандартизации лекарственного сырья фиалки трехцветной и фиалки полевой в зависимости от путей его использования. Показатель «Содержание суммы флавоноидов» распространяется на фиалки траву, предназначенную для получения водно-спиртовых экстрактов; показатель «Суммы полисахаридов» распространяется на траву фиалки, предназначенную для получения водорастворимых экстрактов; показатель «Содержание экстрактивных веществ, извлекаемых водой», распространяется на траву фиалок, предназначенную для получения настоев.
Для установления доброкачественности сырья фиалок определены числовые показатели качества сырья: влажность, зола общая, зола не растворимая в 10% растворе кислоты хлористоводородной, содержание суммы экстрактивных веществ, извлекаемых водой, пожелтевших листьев и стеблей, других частей растения, содержание органической и минеральной примесей, внесенные в проект фармакопейной статьи.
В новый проект Фармакопейной статьи внесены существенные изменения и дополнения в разделы «Внешние признаки» и «Микроскопия». Уточнены и дополнены внешние признаки цельного и измельченного сырья, микродиагностические признаки цельного сырья, впервые разработаны внешние признаки порошкованного сырья, микродиагностические признаки измельченного и порошкованного сырья.
Кроме того, по новым требованиям в проект ФС внесен раздел «Микробиологическая чистота».
Изучение сроков годности сырья фиалок, показало что хранение травы в сухом проветриваемом помещении, при температуре 18-20°С в течение 3,5 лет практически не влияет на содержание основных групп биологически активных веществ, что позволило установить срок годности сырья 3 года.
В результате проведенных исследований разработан проект ФС «Фиалки трава» для фиалки трехцветной и фиалки полевой (табл. 4).
Таблица 4 - Требования и нормы на сырье «Фиалки трава», включенные в проект ФС
| Разделы Фармакопейной статьи | ФС 62 ГФ XI | Проект ФС «Фиалки трава» |
| 1 | 2 | 3 |
| Внешние признаки |
| 1. Цельное сырье 2. Измельченное сырье 3. Порошок |
| Микроскопия | 1. Цельное сырье | 1. Цельное сырье 2. Измельченное сырье |
Таблица 4 (продолжение)
| 1 | 2 | 3 |
| 3. Порошок | ||
| Качественные реакции | Отсутствуют | 1.Определение флавоноидов (с раствором алюминия хлорида) 2. Определение полисахари-дов (осаждение спиртом этиловым 96%) |
| Хроматография | Отсутствует | Пластинки «Sorbfil» (ПТСХ-АФ-А-УФ) Идентификация флавоноидов по наличию 5 зон |
| Числовые показатели | Цельное сырье: экстарктивных веществ, извлекаемых водой; содержание золы общей и золы, нерастворимой в 10% растворе кислоты хлористоводородной; измельченность и содержание примесей. Измельченное сырье: экстарктивных веществ, извлекаемых водой; содержание золы общей и золы, нерастворимой в 10% растворе кислоты хлористо-водородной; измельченность и содержание примесей. | Цельное сырье: экстарктивных веществ, извлекаемых водой; содержание золы общей и золы, нерастворимой в 10% растворе кислоты хлористоводородной; измельченность и содержание примесей; содержание суммы флавоноидов; содержание полисахаридов. Измельченное сырье: экстарк-тивных веществ, извлекаемых водой; содержание золы общей и золы, нерастворимой в 10% растворе кислоты хлористово-дородной; измельченность и содержание примесей; содержа-ние суммы флавоноидов, содержание полисахаридов. Порошкованное сырье: экст-рактивных веществ, извлека-емых водой; содержание золы общей и золы, нерастворимой в 10% растворе кислоты хлористоводородной; измель- ченность и содержание приме-сей; содержание флавоноидов, содержание полисахаридов. |
| Микробиологическая чистота | Отсутствует | Введен показатель |
Примечание: жирным шрифтом в таблице выделены показатели, которые для данного вида сырья разработаны впервые.
Нами также разработан проект ФСП «Фиалки душистой трава», для которого установлены показатели определения подлинности и доброкачественности сырья. Стандартизацию этого вида сырья рекомендуем проводить по содержанию флавоноидов, которых должно быть не менее 1,5% и полисахаридов – не менее 10%.
Исследование фармакологических свойств
фитопрепаратов из растений рода фиалка
В соответствии с известными фармакологическими свойствами фитопрепаратов из растений рода фиалка и применением их в народной медицине, а также изученным составом биологически активных веществ исследование специфической фармакологической активности включало определение отхаркивающего, диуретического, противовоспалительного, капилляроукрепляющего, анальгезирующего, антибактериального, мембраностабилизирующего, антиоксидантного действия.
Фармакологические исследования выполнены на 924 беспородных мышах обоего пола массой 18-20 г, 530 белых беспородных крысах обоего пола массой 180-220 г, 32 кроликах массой 2,0-2,5 кг, 190 лягушках, содержащихся в стандартных условиях вивария Курского государственного медицинского университета.
В серии предварительных экспериментов было установлено, что настои из растений рода фиалка в дозах до 5000 мг/кг массы тела (в пересчете на сухое сырье), а также полисахаридные комплексы, густой экстракт из травы фиалки трехцветной и сухой водорастворимый экстракт из травы фиалки полевой в дозах от 100 мг/кг до 300 мг/кг относятся к группе практически нетоксичных веществ согласно классификации Е.А. Лужникова (2000).
О наличии отхаркивающего действия судили по величине коэффициента ускорения движения ресничек мерцательного эпителия пищевода лягушки (табл.5).
Установлено, что все исследуемые настои и полисахаридные комплексы повышают двигательную активность мерцательного эпителия лягушек, что свидетельствует о наличии у них отхаркивающих свойств. При этом установлено, что более выраженным отхаркивающим действием обладают полисахаридные комплексы, полученные из исследуемых растений; наибольшая активность наблюдалась у полисахаридных комплексов травы фиалки
Таблица 5 - Влияние фитопрепаратов из растений рода фиалка на двигательную активность мерцательного эпителия лягушек
| Условия опыта | Коэффициент ускорения | Увеличение двигательной активности, % |
| Опыт (Фиалка трехцветная) настой травы полисахаридный комплекс | 0,80 ± 0,03 0,68 ± 0,02 | 20,38 ± 1,30* 31,55 ± 1,58* |
| Опыт (Фиалка полевая) настой травы полисахаридный комплекс | 0,76 ± 0,09 0,67 ± 0,02 | 24,10 ± 0,27* 32,70 ± 1,60* |
| Опыт (Фиалка душистая) настой травы полисахаридный комплекс | 0,74 ± 0,02 0,68 ± 0,01 | 25,40 ± 0,44* 32,10 ± 0,19* |
| Опыт (Фиалка сомнительная) настой травы полисахаридный комплекс | 0,72 ± 0,01 0,66 ± 0,02 | 28,40 ± 0,53* 34,48 ± 2,02* |
| Опыт (Фиалка собачья) настой травы полисахаридный комплекс | 0,80 ± 0,03 0,74 ± 0,02 | 21,10 ± 3,09* 25,90 ± 1,50* |
| Опыт (Фиалка удивительная) настой травы полисахаридный комплекс | 0,76 ± 0,01 0,65 ± 0,02 | 23,65 ± 0,22* 35,40 ± 2,20* |
| Опыт (Фиалка опушенная) настой травы полисахаридный комплекс | 0,79 ± 0,01 0,69 ± 0,02 | 20,89 ± 0,68* 30,50 ± 0,29* |
| Опыт (Фиалка скальная) настой травы полисахаридный комплекс | 0,76 ± 0,01 0,75 ± 0,02 | 24,17 ± 0,68* 24,50 ± 1,60* |
| Опыт (Фиалка донская) настой травы полисахаридный комплекс | 0,77 ± 0,01 0,72 ± 0,01 | 23,65 ± 0,54* 27,87 ± 0,98* |
| Мукалтин | 0,62 ± 0,01 | 38,33 ± 1,35* |
Примечание:* различия по сравнению с контролем статистически достоверны при p<0,05; n – количество лягушек в группе.
трехцветной, фиалки полевой, фиалки сомнительной, фиалки душистой, фиалки удивительной, (на фоне введения которых увеличение двигательной активности мерцательного эпителия отмечено на 31,55%-35,40%). Настои же изученных фиалок по силе отхаркивающего действия не уступали настоям травы официнальных видов фиалки трехцветной и фиалки полевой. В связи с чем, показана возможность использования в научной медицине в качестве отхаркивающих средств наряду с официнальными видами фиалки душистой, фиалки сомнительной, фиалки удивительной, фиалки опушенной, фиалки собачьей, фиалки скальной, фиалки донской.
Установлено, что водные извлечения и полисахаридные комплексы изучаемых фиалок оказывают противовоспалительное действие, способствуя уменьшению выраженности воспалительной реакции на разных ее фазах. Показано, что испытуемые фитопрепараты угнетали степень развития отека конечности белых мышей при асептическом воспалении, вызванном введением формалина. Так, курсовое введение настоев из растений рода фиалка в объеме 10 мл/кг и полисахаридных комплексов в дозе 50 мг/кг – 100 мг/кг, оказывает антиэкссудативное действие, уменьшая величину отека конечности на 12,8% - 38,5% по сравнению с аналогичными данными у животных контрольной группы. При этом показано, что антиэкссудативная активность настоев травы фиалки душистой, фиалки удивительной, фиалки собачьей, фиалки опушенной, фиалки скальной, а также полисахаридных комплексов фиалки трехцветной, фиалки удивительной, фиалки собачьей, фиалки сомнительной, фиалки донской сопоставима с препаратом сравнения – настоем цветков календулы.
Исследование влияния испытуемых настоев и полисахаридных комплексов на массу ватных гранулем у белых крыс показало, что их введение оказывает умеренное влияние на образование фиброзно-грануляционной ткани. Установлено, что более выраженное антипролиферативное действие оказывают настои из травы исследуемых фиалок: на фоне их введения процент угнетения образования гранулем составил от 3,5% до 51,8% по сравнению с контролем. Установлено также, что превентивно-курсовое введение настоев из растений рода фиалка на фоне воспалительного процесса, индуцированного подкожным введением кислоты уксусной, сопровождалось уменьшением степени альтерации и сокращением сроков регенерации поврежденных тканей. Так, на фоне введения испытуемых фитопрепаратов площадь кожно-мышечного дефекта на 14 и 25 сутки эксперимента была на 25% - 36% меньше, чем в контроле. При этом, показано, что противовоспалительный эффект настоев и полисахаридных комплексов был сопоставим с таковым у препарата сравнения – настоя цветков календулы.
Настои и полисахаридные комплексы из растений рода фиалка оказывают выраженное капилляроукрепляющее действие, о чем свидетельствует увеличение времени проникновения красителя через гисто-гематический барьер на фоне острого асептического воспаления. В частности, у кроликов опытных групп, получавших настои из травы исследуемых видов фиалок, существенно увеличивается латентный период появления пятен окрашивания с 7,50±0,75 минут (настой из травы фиалки трехцветной) до 8,80±0,20 минут (настой из травы фиалки сомнительной) по сравнению с контролем (3,73±0,25 минут). При этом диаметр пятен окрашивания уменьшается с 1,16±0,06 см (настой травы фиалки собачьей) до 1,05±0,04 см (настой травы фиалки трехцветной) по сравнению с контролем (1,83±0,12 см). Капилляроукрепляющее действие фитопрепаратов было сопоставимо с таковым у настоя календулы, а в некоторых случаях превышали его.
Обезболивающее действие изучали на двух моделях: модели «горячей пластинки» и модели «уксусных корчей». Исследование влияния испытуемых настоев на уровень болевой чувствительности мышей, показало, что они оказывают выраженное обезболивающее действие.
Диуретическую активность изучали на беспородных белых крысах, помещенных в обменные клетки. Результаты исследований выявили наличие у изучаемых настоев мочегонного эффекта, обусловленного повышением экскреции ионов натрия. При этом, следует отметить, что на фоне введения настоев из растений рода фиалка концентрация ионов калия в моче статистически не отличалась от таковой у крыс контрольной группы, что свидетельствует о наличии у них калийсберегающего эффекта.
Установлено, что испытуемые фитопрепараты оказывают достаточно выраженное антибактериальное действие по отношению к бактериям, наиболее часто вызывающим распространенные инфекционные заболевания. При этом более выраженным антибактериальным действием (по сравнению с пектиновыми веществами) обладают настои из травы растений рода фиалка по отношению к Mycobacterium smegmatis, Candida, Pseudomonas aeruginosa, Proteus vulgaris, Staphylococcus albus.
Исследование влияния настоев из растений рода фиалка на перекисный гемолиз эритроцитов, вызванный введением реагента Фентона, показало, что испытуемые настои оказывают выраженное мембраностабилизирующее действие, уменьшая степень перекисного гемолиза эритроцитов в среднем на 50% по сравнению с контролем. Поскольку известно, что свободные радикалы, образующиеся при распаде реактива Фентона, индуцируют перекисное окисление липидов клеточных мембран и, как следствие, лизис клеток, можно полагать, что ведущим механизмом мембранопротекторного действия испытуемых настоев является ингибирование процесса свободнорадикального окисления. Указанный механизм был подтвержден в серии экспериментов in vitro. В частности, было показано, что исследуемые фитопрепараты (за исключением настоя травы фиалки опушенной) оказывают ингибирующее влияние на кинетику Fe2+ - индуцированной хемилюминесценции суспензии липосом яичного желтка, о чем свидетельствует достоверное уменьшение уровня спонтанного свечения модельной системы. При этом наиболее выраженное ингибирующее влияние оказывали настои фиалки сомнительной, фиалки удивительной и фиалки душистой, на фоне введения которых уровень спонтанного свечения уменьшался соответственно на 46,9%, 39,0% и 37,8% по сравнению с данными контрольной пробы. Установлено также, что настои из растений рода фиалка, густой экстракт, полисахаридные фракции оказывают ингибирующее влияние на скорость накопления ТБК-активных продуктов в модельной системе в среднем на 45 – 50% по сравнению с контролем. Испытуемые фитопрепараты проявляют четкий дозозависимый эффект: с увеличением концентрации густого экстракта и полисахаридной фракции фиалки трехцветной (от 10 мг/мл до 60 мг/мл) концентрация ТБК-активных продуктов в системе монотонно уменьшается. Густой экстракт фиалки трехцветной проявляет более выраженную антиоксидантную активность по сравнению с фракцией полисахаридов, полученных из этого растения, что объясняется наличием в нем фенольных соединений (кумаринов, фенолкарбоновых кислот, флавоноидов).
Установлено, что один из механизмов антиоксидантной активности испытуемых фитопрепаратов связан с наличием у них выраженного хелатирующего действия, заключающегося в способности взаимодействовать с ионами трехвалентного железа. При этом наиболее выраженным железосвязывающим действием обладают настои из фиалки трехцветной, фиалки полевой, фиалки душистой, фиалки сомнительной, фиалки опушенной, при внесении которых концентрация железа в инкубационной среде уменьшается соответственно на 74,3%; 84,3%; 86,9%; 89,9%; 75,0% по сравнению с контрольной пробой. Такое же действие проявляют густой экстракт и полисахаридная фракция травы фиалки трехцветной.
Экспериментальное обоснование рационального использования растений рода фиалка
В результате проведенных исследований была разработана технология переработки растительного сырья растений рода фиалка, обеспечивающая их рациональное использование.
Для получения густого экстракта из сырья фиалки трехцветной использовали вакуум-фильтрационный способ экстрагирования спиртом этиловым 70% (1:5) при комнатной температуре. Для осаждения хлорофиллов, восков полученное извлечение выдерживали при температуре 8-10°С неделю, которое затем отделяли декантацией извлечения с последующей фильтрацией через нутч фильтр. Извлечение концентрировали с помощью вакуум роторного испарителя и сгущали до остаточного содержания влаги не более 25% (рис. 2). Полученный густой экстракт фиалки представляет собой сильно вязкую массу темно коричневого цвета.
Для контроля качества густого экстракта использовали спектрофотометрическую методику количественного определения флавоноидов, разработанную для сырья, в соответствии с принципом унификации методик в ряду: сырье-лекарственная форма. Методика основана на реакции комплексообразования флавоноидов с алюминия хлоридом. Содержание суммы флавоноидов в густом экстракте должно быть не менее 3,0%.
Густой экстракт обладает мембраностабилизирующей и антиоксидантной активностью.
С целью комплексного использования травы фиалки трехцветной нами из шрота травы после получения густого экстракта получены две фракции полисахаридных комплексов: водорастворимый полисахаридный комплекс и пектиновые вещества.
Технологический процесс получения полисахаридных комплексов состоит из двух стадий: получение концентрированных извлечений и выделение полисахаридных комплексов. Выход водорастворимого полисахаридного комплекса составляет 10,0% по загруженному сухому шроту, пектиновых веществ – 9,0%.
На основании данных исследований была разработана схема комплексной переработки травы фиалки трехцветной с получением густого экстракта, суммы полисахаридов и пектиновых веществ из шрота указанного производства (рис. 3).
Разработаны также способы получения суммы полисахаридов из травы фиалки душистой (патент № 2232774 от 20.04.04 г.) и пектиновых веществ из травы фиалки собачьей (патент № 2285536 от 20.10.2006 г.).
Полисахаридные комплексы из исследуемых фиалок обладают противовоспалительной и отхаркивающей активностью. Пектиновые вещества оказывают антимикробное действие и могут быть использованы в качестве детоксикантов.
Источниками водорастворимых полисахаридных комплексов могут быть трава фиалки трехцветной, фиалки душистой, фиалки собачьей, фиалки опушенной, фиалки донской, а источниками пектиновых веществ – трава фиалки трехцветной, фиалки душистой, фиалки собачьей, фиалки опушенной, фиалки удивительной, фиалки скальной (табл. 2).
Разработана технология получения сухого водорастворимого экстракта из травы фиалки полевой и сиропа на его основе. Установлены оптимальные условия получения сухого экстракта: трехступенчатая ремацерация травы фиалки полевой или шрота травы после получения густого экстракта, горячей водой; соотношение сырьё: экстрагент по ступеням экстракции 1:5; 1:3; 1:2 и продолжительностью 2 часа на каждой стадии. Полученный экстракт представлял собой гигроскопичный аморфный порошок светло-коричневого цвета со специфическим запахом и вкусом.
Подлинность и доброкачественность сухого экстракта устанавливали по содержанию одной из основных групп биологически активных веществ, идентифицированных в сырье, а именно по содержанию полисахаридов. Разработана методика качественного обнаружения (осаждение со спиртом этиловым 96%) и количественного определения полисахаридов
Рисунок 2 - Схема комплексной переработки травы фиалки трехцветной
гравиметрическим методом (предложенная для сырья), содержание которых должно быть не менее 45%.
При фармакологическом изучении доказано, что сухой экстракт из травы фиалки полевой обладает противовоспалительной активностью.
Выявленные фармакологические свойства травы фиалки полевой и сухого экстракта, полученного из нее, дали предпосылки для разработки детской лекарственной формы для внутреннего применения – сиропа. В результате проведенных исследований разработан состав сиропа: подобрана концентрация сухого экстракта (1,5%), в качестве сладкого компонента выбраны сочетание сахарозы и сорбита в отношении 20:40, в качестве консерванта раствор сорбиновой кислоты. Проведена стандартизация полученного сиропа по содержанию полисахаридов, которых должно быть не менее 0,65%. Показано, что сироп обладает отхаркивающим действием, сравнимым с препаратом сравнения «Мукалтин» и настоем травы фиалки полевой.
ЗАКЛЮЧЕНИЕ
На основании изучения химического состава и фармакологической активности разработано научно-методическое обоснование расширения сырьевой базы растений рода фиалка и создания на их основе фитопрепаратов для лечения органов дыхания, протекающих на фоне воспаления (рис. 3).
Проведенные нами на первом этапе теоретические исследования по распространенности растений в областях Центрального Черноземья, оценке ресурсной базы, позволили выбрать в качестве объектов исследования растения рода Фиалка и среди них выделить наиболее перспективные виды. На территории Центрального Черноземья произрастает около 20 видов фиалок, из них 9 имеет достаточный ареал распространения и сырьевую базу: фиалка трехцветная, фиалка полевая, фиалка душистая, фиалка сомнительная, фиалка удивительная, фиалка собачья, фиалка скальная, фиалка опушенная, фиалка донская.
На следующем этапе проведено обоснование перспективности использования растений рода Фиалка для лечения заболеваний органов дыхания. Для этого анализировали литературные данные по химическому составу,
использованию растений рода Фиалка в научной и народной медицине. Как
показали результаты исследования, основными биологически активными веществами растений рода Фиалка являются фенольные соединения и полисахариды. Далее был проведен анализ сведений по изученности фармакологической активности интересующих групп биологически активных веществ (фенольных соединений, полисахаридов).
На последующих этапах проведено экспериментальное обоснование использования растений рода Фиалка для лечения заболеваний органов дыхания, включающее изучение фенольных соединений, полисахаридов, аминокислот, макро- и микроэлементов, разработку нормативной документации на перспективные виды сырья и изучение спектра их фармакологической активности. В рамках экспериментального обоснования важным является установление возможной взаимосвязи между биологической активностью и составом биологически активных веществ.
Выявленные отхаркивающие свойства имеют большое значение, так как острые и хронические заболевания органов дыхания сопровождаются развитием застойных явлений, и своевременная эвакуация продуктов воспалительного процесса является значительной составляющей в комплексной фармакотерапии заболеваний органов дыхания. Отхаркивающее действие растений рода Фиалка обусловлено полисахаридами. Важным является наличие у исследуемых фиалок противовоспалительной активности, что было установлено в серии экспериментов с моделированием разных звеньев воспалительной реакции. Противовоспалительное действие может быть связано с наличием фенокислот, в том числе и салициловой кислотой, полисахаридов, флавоноидов. Капилляроукрепляющая, мембраностабилизирующая и антиоксидантная активность объясняется наличием соединений фенольной природы: кумаринов, фенолкарбоновых кислот, флавоноидов, для которых данный эффект является характерным. Существенное значение имеет и установленная нами антибактериальная активность, при этом наиболее важным явилось наличие у испытуемых настоев бактериостатического действия по отношению к Staphylococcus aureus, который чаще всего является причиной развития воспалительных процессов в органах дыхания.
Диуретическое действие является результатом влияние флавоноидных соединений и их сочетанием с полисахаридами.
На конечном этапе предусматривается разработка фитопрепаратов для лечения заболеваний органов дыхания.
Полученные данные аргументируют целесообразность применения растений рода фиалка (фиалки душистой, фиалки сомнительной, фиалки удивительной, фиалки собачей, фиалки скальной, фиалки опушенной, фиалки донской) в качестве лекарственного сырья наряду с официнальными видами фиалкой трехцветной и фиалкой полевой в качестве отхаркивающего средства и являются перспективными для создания фитопрепаратов для лечения органов дыхания, протекающих на фоне воспаления.
ВЫВОДЫ:
- На основании данных литературы по систематическому положению, распространенности и сырьевым ресурсам растений рода фиалка флоры Центрального Черноземья, установлено, что наиболее перспективными для фармакогностического и фармакологического изучения являются: фиалка трехцветная, фиалка полевая, фиалка душистая, фиалка сомнительная, фиалка удивительная, фиалка собачья, фиалка скальная, фиалка опушенная, фиалка донская.
- Доказана идентичность состава биологически активных веществ травы фиалки душистой, фиалки сомнительной, фиалки удивительной, фиалки собачьей, фиалки скальной, фиалки опушенной, фиалки донской и фармакопейных видов фиалки трехцветной и фиалки полевой, обоснована возможность их использования в качестве отхаркивающих средств наряду с фармакопейными видами.
- С использованием различных методов хроматографии (бумажной, тонкослойной, колоночной, ВЭЖХ) в траве фиалок идентифицировано 30 соединение, из них выделены и установлена структура 23 фенольных соединений. Среди выделенных соединений фенологликозид арбутин; 4 кумарина: кумарин, умбеллиферон, герниарин, скополетин; 6 производных фенолкарбоновых кислот: эллаговая, галловая, кофейная, феруловая, хлорогеновая, неохлорогеновая; 4 флавоноидных агликона: кверцетин, лютеолин, апигенин, хризоэриол; 8 флавоноидных гликозидов: гиперозид, рутин, цинарозид, гесперидин, робинин, витексин, ориентин, виценин. Установлено, что общим и доминирующим соединением у растений рода фиалка является рутин.
- Из исследуемых видов фиалок впервые выделены и изучены различные фракции полисахаридных комплексов (ВРПС, ПВ, ГЦ А, ГЦ Б). Выход их составил: ВРПС от 4,0% до 12,5%, ПВ от 8,0% до 23,0%, ГЦ А от 3,9% до 9,0 %, ГЦ Б от 2,5% до 4,7%.
Изучен аминокислотный и минеральный состав растений рода фиалка. Установлено наличие 14 свободных и 15 связанных аминокислот. Суммарное содержание свободных аминокислот колеблется в пределах 1,98 мг%-25,35 мг%, связанных аминокислот 7,74 мг%-67,73 мг%. Определено количественное содержание от 15 до 29 элементов, из которых 12 являются эссенциальными и 5 условно эссенциальными.
- Для стандартизации сырья «Фиалки трава» разработаны методики качественного обнаружения флавоноидов и количественного определения флавоноидов и полисахаридов. Установлены нормы их содержания в сырье: флавоноидов не менее 1,0% для фиалки трехцветной и фиалки полевой и не менее 1,5% для травы фиалки душистой; полисахаридов – не менее 8,0% - для фиалки трехцветной и фиалки полевой и не менее 10,0% для фиалки душистой.
Осуществлен дифференциальный подход к стандартизации лекарственного сырья «Фиалка трава» в зависимости от путей его использования. Стандартизацию сырья фиалки предложено проводить: по содержанию суммы флавоноидов, суммы полисахаридов и суммы экстрактивных веществ, извлекаемых водой.
- Установлены числовые показатели, регламентирующие доброкачественность сырья фиалок. Впервые проведены морфолого-анатомические исследования с установлением макро- и микродиагностических признаков, позволяющих установить подлинность для измельченного и порошкованного сырья фиалок; уточнены и дополнены макро- и микродиагностические признаки цельного сырья.
- Фитопрепараты, полученные из растений рода фиалка (настои, густой экстракт, сухой водорастворимый экстракт, сироп и отдельные фракции – полисахариды, пектиновые вещества) обладают широким спектром фармакологического действия: отхаркивающим, противовоспалительным, капилляроукрепляющим, анальгезирующим, диуретическим, антибактериальным, мембраностабилизирующим и антиоксидантным. Полученные данные свидетельствуют о перспективности разработки из растений рода фиалка фитопрепаратов для лечения заболеваний органов дыхания, протекающих на фоне воспаления
- Анализ возможной взаимосвязи химического состава растений рода Фиалка с их фармакологическими свойствами показал, что отхаркивающая активность обусловлена содержащимися в них полисахаридами; оптимальное сочетание фенолокислот, в том числе салициловой кислоты, полисахаридов, флавоноидов обеспечивают противовоспалительное действие; капилляроукрепляющая, мембраностабилизирующая и антиоксидантная активность связана с наличием фенольных соединений, в том числе и флавоноидов, в частности рутина, кверцетина; диуретический эффект также обусловлен флавоноидными соединениями и их сочетанием с полисахаридами.
- Разработаны технология комплексной переработки сырья фиалки трехцветной, обеспечивающая последовательное получение густого экстракта, суммы водорастворимых полисахаридов и пектиновых веществ, технология получения сухого водорастворимого экстракта из травы фиалки полевой и сиропа на его основе. Проведено нормирование качества густого экстракта по содержанию флавоноидов (не менее 3%) и сухого водорастворимого экстракта по содержанию полисахаридов (не менее 45%). Показана перспективность получения ВРПС из травы фиалки трехцветной, фиалки душистой, фиалки собачьей, фиалки опушенной, фиалки донской, ПВ – из травы фиалки трехцветной, фиалки душистой, фиалки собачьей, фиалки опушенной, фиалки удивительной, фиалки скальной.
- На основании проведенных исследований разработана и утверждена ФС 42-0142-05 «Фиалка трава» и «Инструкция по сбору и сушке травы фиалки трехцветной и фиалки полевой». Проект ФСП «Фиалки душистой трава» подготовлен к рассмотрению.
Список работ, опубликованных по теме диссертации
1. Монография:
- Растения рода «Фиалка» - перспективные источники эффективных лекарственных и оздоровительных средств / А.А. Маркарян, Р.А. Бубенчиков, Р.Н. Аляутдин, А.В. Бурдейн, Ю.А. Кондратова, И.Ю. Глазкова – Москва, Курск: Серебряные нити 2008.- 86 с.
2. Справочники:
- Растительный мир: большая Курская энциклопедия / В.Н. Бубенчикова, Р.А. Бубенчиков, Н.Ф. Гончаров, И.Л. Дроздова, Ю.А. Кондратова, Н.Н. Коротеева, Л.И. Прокошева, Ю.А. Сухомлинов - Т.3, кн.1– Курск, 2006. – 263 с.
3. Патенты:
- Пат. 2232774 Российская Федерация, МПК7 А 61 К 35/78, С 08, В 37/00. Способ получения водорастворимых полисахаридов / Р.А. Бубенчиков, В.Н. Бубенчикова, И.Л. Дроздова. (РФ). - № 2002132664/04; заявл. 04.12.2002; опубл. 20.07.2004., – 5 с. Бюл. №20.
- Пат. 2285536 Российская Федерация, МПК А 61 К 36/86. Способ получения пектинов / Р.А. Бубенчиков И.Л. Дроздова. (РФ). - № 2005109577/15; заявл. 04.04.2005; опубл. 20.10.2006. – 4 с.
4. Работы, опубликованные в журналах, рекомендуемых ВАК:
- Дроздова, И.Л. Аминокислоты фиалки полевой и донника рослого / И.Л. Дроздова, Р.А. Бубенчиков // Фармация. – 2003. - № 5. - С.14-15.
- Бубенчиков, Р.А. Флавоноиды фиалки трехцветной / Р.А. Бубенчиков, И.Л. Дроздова // Фармация. - 2004. - № 2. - С. 11-12.
- Дроздова, И.Л. Антиоксидантная активность полифенольных комплексов Viola odorata и Fragaria vesca L. / И.Л. Дроздова, Р.А. Бубенчиков // Раст. ресурсы. - 2004. - Вып. 2. - С. 92-96.
- Бубенчиков, Р.А. Противовоспалительные свойства надземной части Viola hirta L. / Р.А. Бубенчиков // Раст. ресурсы. - 2004. Вып. 2. - С. 97-100.
- Бубенчиков, Р.А. Фенольные соединения и полисахариды фиалки собачьей / Р.А. Бубенчиков // Вестн. Воронеж. гос. ун-та. Сер. Химия, Биология, Фармация. - 2004.- №1 - С. 156-159.
- Дроздова, И.Л. Состав и противовоспалительная активность полисахаридных комплексов фиалки душистой и мальвы низкой / И.Л. Дроздова, Р.А. Бубенчиков// Хим.-фармац. журн. - 2005. - Т. 39, № 4. - С. 29-32.
- Бубенчиков, Р.А. Изучение фенольных соединений фиалки полевой методом ВЭЖХ / Р.А. Бубенчиков, Н.Ф. Гончаров // Хим.-фармац. журн. -2005. - № 3. - С. 18-21.
- Бубенчиков, Р.А. Изучение полисахаридов травы фиалки скальной и их противовоспалительная активность / Р.А. Бубенчиков // Кубан. науч. мед. вестн. – 2005. - № 3-4. - С.31-32.
- Бубенчиков, Р.А. Новые растительные источники биологически активных полисахаридов / Р.А. Бубенчиков, И.Л. Дроздова // Фармация. – 2005. - № 4. - С. 16-17.
- Бубенчиков, Р.А. Изучение антиоксидантной активности листьев растений рода лопух и трава фиалки полевой методами ТСХ и хемилюминесцентного анализа / Р.А. Бубенчиков, И.Л. Дроздова // Вестн. Ставрополь. гос. ун-та.- 2005. - Вып. 42. - С.173-176.
- Сергеев, Н.С. Разработка состава и технологии сиропа отхаркивающего действия на основе водного экстракта травы фиалки полевой / Н.С. Сергеев, А.М. Сампиев, Р.А. Бубенчиков // Кубан. науч. мед. вестн. – 2006.- № 12. - С.123-125.
- Бубенчиков, Р.А. Изучение противовоспалительной активности надземной части Viola canina L. / Р.А. Бубенчиков // Кубан. научн. мед. вестн. - 2006, № 1-2.
- Покровский, М.В. Фармакотерапевтическая эффективность растений рода фиалка при лечении стафилококковой пневмонии / М.В. Покровский, Р.А. Бубенчиков // Научн. ведомости Белгород. гос. ун-та. Сер. Медицина. Фармация. - 2010. - № 22. - С. 19-22.
- Бубенчиков, Р.А. Изучение фенольных соединений и полисахаридов травы фиалки скальной / Р.А. Бубенчиков // Башкир. Хим. журн. - 2011, - т. 18, №1. – С. 128-130.
- Бубенчиков, Р.А. Оценка противовоспалительной и отхаркивающей активности фиалки опушенной / Р.А. Бубенчиков, М.В. Покровский, Т.Г. Покровская // Кубан. науч. мед. вестн. – 2010. - №8. - С. 28-31.
5. Прочие работы:
- Бубенчиков, А.А. Общие сведения о лекарственной флоре Курской области // А.А. Бубенчиков, Р.А. Бубенчиков, Н.И. Воротынцева // Охрана и рациональное использование раст. ресурсов Курской области. – Курск, 1999.- С.50-51.
- Бубенчиков, Р.А. Фенольные соединения растений рода фиалка / Р.А.Бубенчиков // Материалы 67-й межвузовской научной конференции студентов и молодых ученых - Ч. 2. Курск, 2002. - С.102-103.
- Бубенчиков, Р.А. Лекарственные растения, применяемые при лечении вирусных заболеваний кожи / Р.А. Бубенчиков, А.С. Власова // Материалы 67-й межвузовской научн. конф.студентов и молодых ученых. - Ч. 2. Курск. - 2002. - С. 103-104.
- Покровский, М.В. Биологически активные вещества фиалки трехцветной, фиалки полевой, фиалки душистой и их фармакологические свойства / М.В. Покровский, Р.А. Бубенчиков, И.Л. Дроздова // Человек и его здоровье: Курский научн.-практич. вестн. -2001 г. - №9. - С. 99-104.
- Покровский, М.В. Противовоспалительные и ранозаживляющие свойства растений рода Viola L. / М.В. Покровский, Л.В. Силина, Р.А. Бубенчиков, И.Л. Дроздова, В.И. Кочкаров // Человек и его здоровье: Курский научн.- практич. вестн. - 2001 г. - №9. - С. 104-109.
- Бубенчиков, Р.А. Флавоноиды растений рода фиалка / Р.А. Бубенчиков // Человек и лекарство: тез. докл. 10 Рос. Нац. конгр. 7-11 апр. 2003 г. –М., 2003. - С. 586-587.
- Бубенчиков, Р.А. Сравнительное исследование антиоксидантных свойств фиалки полевой и фиалки душистой / Р.А. Бубенчиков // Человек и лекарство: тез. докл. 10 Рос. Нац. конгр. 7-11 апр. 2003 г. –М., 2003. - С. 587.
- Бубенчиков, Р.А. Исследование водных и спиртовых извлечений из травы фиалки душистой и фиалки полевой / Р.А. Бубенчиков, Н.Ф. Гончаров // Разработка, исследование и маркетинг новой фармацевтической продукции: материалы 58-й межрегиональной конф. по фармации и фармакологии. – Пятигорск, 2003. - С. 13-14.
- Бубенчиков, Р.А. Исследование фармакологической активности Viola mirabilis L. / Р.А. Бубенчиков, И.Л. Дроздова, Н.Ф. Гончаров // Актуальные проблемы создания новых лекарственных препаратов природного происхождения: материалы 7 Междунар. Съезда Фитофарм 3-5 июля 2003. г. – СПб., 2003. - С. 146-149.
- Бубенчикова, В.Н. Стандартизация сырья Viola odorata L. Malva pusilla Smith. по содержанию полисахаридов / В.Н. Бубенчикова, И.Л. Дроздова, Р.А. Бубенчиков // Актуальные проблемы создания новых лекарственных препаратов природного происхождения: материалы 7 Междунар. Съезда Фитофарм 3-5 июля 2003. г. – СПб., 2003. - С. 327-329.
- Дроздова, И.Л. Элементный состав растений родов земляника, фиалка, хатьма / И.Л. Дроздова, Р.А. Бубенчиков // Человек и вселенная. - № 9 (30). Санкт-Петербург, 2003. - С.33-34.
- Бубенчиков, Р.А. Углеводы фиалки собачьей / Р.А. Бубенчиков // Материалы 68-й межвузовской научн. конф. студентов и молодых ученых. - Ч. 3. - Курск, 2003. - С.30-31.
- Бубенчиков, Р.А. Изучение состава макро- и микроэлементов травы фиалки собачьей / Р.А. Бубенчиков // Сборник работ 69-й итоговой научн. сессии КГМУ и отделения медико-биологических наук Центрально-черноземного научного центра РАМН - Ч.2. - Курск, 2004. - С.243-244.
- Бубенчиков, Р.А. Применение фиалки трехцветной для терапии дерматологических заболеваний / Р.А. Бубенчиков // Сборник работ 69-й итоговой научн. сессии КГМУ и отделения медико-биологических наук Центрально-черноземного научного центра РАМН - Ч.2. - Курск, 2004. - С.244-245.
- Бубенчиков, Р.А. Кумарины фиалки душистой и фиалки опушенной / Р.А. Бубенчиков, В.И. Литвиненко, В.Д. Собакинских // Сборник работ 69-й итоговой научн. сессии КГМУ и отделения медико-биологических наук Центрально-черноземного научного центра РАМН - Ч.2. - Курск, 2004. - С.246-247.
- Бубенчиков, Р.А. Исследование фармакологической активности травы Viola canina L. / Р.А. Бубенчиков //Объединенный мед. журн.. – 2003.- № 3. - С.89-90.
- Бубенчиков, Р.А. Изучение аминокислотного состава травы фиалки удивительной / Р.А. Бубенчиков // Молодежная наука и современность: материалы 69-й межвузовской конф. студентов и молодых ученых. - Ч. 2. Курск, 2004. - С.108-109.
- Бубенчиков, Р.А. Обезболивающее действие фиалки собачьей / Р.А. Бубенчиков // Молодежная наука и современность: материалы 69-й межвузовской конф. студентов и молодых ученых. - Ч. 2. - Курск, 2004. - С.108-109.
- Бубенчиков, Р.А. Применение ВЭЖХ для идентификации фенолкарбоновых кислот фиалки песчаной / Р.А. Бубенчиков // Человек и лекарство: тез. доклад 11 Рос. нац. конгр. 7-11 апр. 2004 г. – М., 2004. - С. 767.
- Бубенчиков, Р.А. Изучение веществ первичного биосинтеза фиалки опушенной / Р.А. Бубенчиков, В.Д. Собакинских, Н.Ф. Гончаров // Человек и лекарство: тез. доклад 11 Рос. нац. конгр. 7-11 апр. 2004 г. – М., 2004. - С. 767.
- Бубенчиков, Р.А. Фенолкарбоновые кислоты травы фиалки душистой / Р.А. Бубенчиков // Разработка, исследование и маркетинг новой фармац. продукции: сб. науч. тр. – Пятигорск, 2004. Вып. 59. - С. 7-8.
- Бубенчиков, Р.А. Изучение полисахаридов травы фиалки донской / Р.А. Бубенчиков, Н.Ф. Гончаров // Разработка, исследование и маркетинг новой фармац. продукции: сб. науч. тр.– Пятигорск, 2004. - Вып. 59. - С. 8.
- Бубенчиков, Р.А. Аминокислотный и минеральный состав Viola hirta L. / Р.А. Бубенчиков // Актуальные проблемы создания новых лекарственных препаратов природного происхождения: материалы 8 Междунар. Съезда Фитофарм 21-23 июня. 2004. Миккели, Финляндия...СПб, 2004. - С. 229-232.
- Бубенчиков, Р.А. Изучение флавоноидных соединений Viola odorata L. / Р.А. Бубенчиков, Н.Ф. Гончаров // Актуальные проблемы создания новых лекарственных препаратов природного происхождения: материалы 8 Междунар. Съезда Фитофарм 21-23 июня. 2004. Миккели, Финляндия...СПб, 2004. - С. 235-238.
- Дроздова, И.Л. Расширение сырьевой базы отхаркивающих средств растительного происхождения / И.Л. Дроздова, Р.А. Бубенчиков // Актуальные проблемы создания новых лекарственных препаратов природного происхождения: материалы 8 Междунар. Съезда Фитофарм 21-23 июня. 2004. Миккели, Финляндия...СПб, 2004. - С. 426-429.
- Бубенчиков, Р.А. Состав и противовоспалительная активность водорастворимых полисахаридов травы фиалки Tanaitica grosset / Р.А. Бубенчиков // Актуальные проблемы создания новых лекарственных препаратов природного происхождения: материалы 8 Междунар. Съезда Фитофарм 21-23 июня. 2004. Миккели, Финляндия. СПб, 2004. - С. 646-648.
- Бубенчиков, Р.А. Фиалка трехцветная и фиалка полевая: химический состав и применение / Р.А. Бубенчиков, В.И. Литвиненко, Н.В. Попова // Фармаком. Харьков, 2004. - Вып.1. ГП «Государственный научный центр лекарственных средств». ГП «научно-экспертный фармакопейный центр». - С. 62-66.
- Бубенчиков, Р.А.Фенольные соединения и полисахариды Viola hirta L. / Р.А. Бубенчиков, В.И. Литвиненко // Фармаком. Харьков, 2004. - Вып.1. ГП «Государственный научный центр лекарственных средств». ГП «научно-экспертный фармакопейный центр». - С. 23-27.
- Бубенчиков, Р.А.Фенолкарбоновые кислоты травы фиалки сомнительной / Р.А. Бубенчиков // Современные вопросы медицинской науки и практики: сб. научн. тр. регион. конф., посвященной 100-летию со дня рождения заслуженного деятеля науки РСФСР, чл.-корр АМН СССР, проф. Георгия Ефимовича Островерхова. - Курск, 2004. - С. 290-291.
- Бубенчиков, Р.А. Полисахариды травы фиалки удивительной / Р.А. Бубенчиков, Н.Ф. Гончаров // Современные вопросы медицинской науки и практики: сб. научн. тр. регион. конф., посвященной 100-летию со дня рождения заслуженного деятеля науки РСФСР, чл.-корр АМН СССР, проф. Георгия Ефимовича Островерхова. – Курск, 2004. - С. 291-292.
- Бубенчиков, Р.А. Изучение кумаринов травы фиалки сомнительной / Р.А. Бубенчиков // Сб. тр. юбил. научн. конф. КГМУ и сессии Центрально-Черноземного научного центра РАМН, посвященной 70-летию КГМУ.- Курск, 2005. - Т.2. - С. 211-212.
- Печенин, О.Д. Изучение антимикробной активности растений рода фиалка / О.Д. Печенин, Р.А. Бубенчиков // Сб. тр. юбил. научн. конф. КГМУ и сессии Центрально-Черноземного научного центра РАМН, посвященной 70-летию КГМУ – Курск, 2005. - Т.2. - С. 259-260.
- Бубенчиков, Р.А. Выделение и исследование полисахаридов травы фиалки скальной / Р.А. Бубенчиков // Человек и лекарство: тез. доклад 12 Рос. нац. конгр. 7-11 апр. 2005 г. - М., 2005. - С. 645.
- Бубенчиков, Р.А.Оценка антиоксидантной активности травы фиалки удивительной методом хемилюминесцентного анализа / Р.А. Бубенчиков, Н.Ф. Гончаров // Человек и лекарство: тез. доклад 12 Рос. нац. конгр. 7-11 апр. 2005 г. - М., 2005. - С. 645-646.
- Бубенчиков, Р.А.Изучение состава флавоноидных соединений фиалки удивительной методом ВЭЖХ / Р.А. Бубенчиков // Разработка, исследование и маркетинг новой фармац. продукции: сб. науч. тр. – Пятигорск, 2005. – Вып. 60. - С. 13-14.
- Дроздова, И.Л. Элементный анализ растений родов фиалка, вероника, лопух / И.Л. Дроздова, Р.А. Бубенчиков, Ю.А. Кондратова // Экология, окружающая среда и здоровье населения Центрального Черноземья: материалы междун. научн.-практич. конф. В 2-х частях. - Курск: КГМУ, 2005. – Ч. 2. - С. 190-192.
- Бубенчиков, Р.А. Изучение веществ первичного биосинтеза фиалки собачей / Р.А. Бубенчиков, Н.Ф. Гончаров // II Всероссийский съезд фармацевтических работников: материалы съезда, 5-7 июня. – Сочи, 2005. - С. 56.
- Бубенчиков, Р.А. Изучение аминокислотного состава травы фиалки собачьей / Р.А. Бубенчиков // Молодежная наука и современность: юбил. межвузовская научн. конф. студентов и молодых ученых, посвященная 70-летию КГМУ: в 2-х частях. - Курск, 2005. – Ч. 2. - С. 84-85.
- Бубенчиков, Р.А. Изучение отхаркивающей активности фиалки донской / Р.А. Бубенчиков // Молодежная наука и современность: юбил. межвузовская научн. конф. студентов и молодых ученых, посвященная 70-летию КГМУ: в 2-х частях. - Курск, 2005. – Ч. 2. - С. 86.
- Бубенчиков, Р.А.Стандартизация сырья фиалки полевой (Viola arvensis L.) по содержанию флавоноидов / Р.А. Бубенчиков, Н.С. Сергеев // Актуальные проблемы создания новых лекарственных препаратов природного происхождения: материалы 9 Междунар. Съезда Фитофарм 22-25 июня. 2005 г., СПб., 2005. - С. 236-238.
- Бубенчиков, Р.А. Изучение фармакологической активности Viola rupestris L. / Р.А. Бубенчиков, Н.Ф. Гончаров // Актуальные проблемы создания новых лекарственных препаратов природного происхождения: материалы 9 Междунар. Съезда Фитофарм 22-25 июня. 2005 г., СПб. - 2005. - С. 572-574.
- Бубенчиков, Р.А. Химико-фармакологическое исследование полисахаридов травы фиалки опушенной / Р.А. Бубенчиков // Актуальные проблемы создания новых лекарственных препаратов природного происхождения: материалы 9 Междунар. Съезда Фитофарм 22-25 июня. 2005 г., СПб. - 2005. - С. 693-695.
- Литвиненко, В.И. Изучение флавоноидных соединений фиалки сомнительной методом ВЭЖХ / В.И. Литвиненко, Р.А. Бубенчиков // Досягнення та перспективи розвитку фармацевтично галузi Украни / Матерiали VI Нацiонального з’зду фармацевтiв Украни- 28-30 вересня 2005 р. м. Харкiв. - С. 747.
- Литвиненко, В.И. Фенолкарбоновые кислоты лопуха паутинистого и фиалки удивительной / В.И. Литвиненко, И.Л. Дроздова, Р.А. Бубенчиков // Досягнення та перспективи розвитку фармацевтично галузi Украни: Матерiали 6 Нац. з’зду фармацевтiв Украни- 28-30 вересня 2005 р. м. Харкiв. - С. 747-748.
- Бубенчиков, Р.А. Исследование флавоноидных соединений фиалки скальной методом ВЭЖХ / Р.А. Бубенчиков // Человек и лекарство: тез. доклад 13 Рос. нац. конгр. 7-11 апр. 2006 г. – М., 2006. - С. 500.
- Сергеев, Н.С. Разработка состава и технологии сиропа отхаркивающего действия с гидрофильным фитокомплексом из травы фиалки полевой/ Н.С. Сергеев, Р.А. Бубенчиков // Человек и лекарство: тез. доклад 13 Рос. нац. конгр. 7-11 апр. 2006 г. – М., 2006. - С. 651-652.
- Смирнова, М.А. Состав и противовоспалительная активность водорастворимых полисахаридов травы фиалки собачьей / М.А. Смирнова, А.Я. Гусейнов, А.Г. Шабанов, Р.А. Бубенчиков // Актуальные проблемы создания новых лекарственных препаратов природного происхождения: материалы 10 Междунар.Съезда. 27-30 июня 2006 г. – СПб., 2006. - С. 294-297.
- Смирнова, М.А. Аминокислотный и минеральный состав Viola rupestris L. / М.А. Смирнова, Р.А. Бубенчиков, А.Я. Гусейнов, А.Г. Шабанов // Актуальные проблемы создания новых лекарственных препаратов природного происхождения: материалы 10 Междунар.Съезда. 27-30 июня 2006 г. – СПб., 2006. - С. 299-302.
- Смирнова, М.А. Стандартизация травы фиалки полевой (Viola arvensis L.) по содержанию полисахаридов / М.А. Смирнова, Н.С. Сергеев, А.Я. Гусейнов, А.Г. Шабанов, Р.А. Бубенчиков // Актуальные проблемы создания новых лекарственных препаратов природного происхождения: материалы 10 Междунар.Съезда. 27-30 июня 2006 г. – СПб., 2006. - С. 307-309.
- Сергеев, Н.С. Возможность производства спиртового экстракта и гидрофильного фитокомплекса травы фиалки полевой по совмещенной технологической схеме / Н.С. Сергеев, Р.А. Бубенчиков, А.М. Сампиев / Разработка, исследование и маркетинг новой фармац. продукции: сб. науч. тр. – Пятигорск, 2006.– Вып. 61. - С. 133-135.
- Бубенчиков, Р.А. Изучение состава и противовоспалительной активности полисахаридных комплексов травы фиалки опушенной / Р.А. Бубенчиков // Вестн. Воронеж. гос. ун-та. Сер. Химия. Биология, Фармация. – 2006. - № 1. - С. 183-185
- Бубенчиков, Р.А. Аминокислотный и минеральный состав травы фиалки удивительной / Р.А. Бубенчиков // Вестн. Воронеж. гос. ун-та. Сер. Химия. Биология, Фармация. – 2006. - № 1. - С. 186-188
- Бубенчиков, Р.А. Фенольные соединения и полисахариды надземной части фиалки сомнительной / Р.А. Бубенчиков // Краеведение в Курском крае: прошлое и современность Межрегиональные связи: тр. 1-ой междун. конф. – Курск, 2006. - Ч.2. - С. 44 – 48.
- Бубенчиков, Р.А. Определение подлинности сырья «Фиалки трава» / Р.А. Бубенчиков // Краеведение в Курском крае: прошлое и современность Межрегиональные связи: тр. 1-ой междун. конф. – Курск, 2006. - Ч.2. - С. 34 – 38.
- Бубенчиков, Р.А. Выделение и исследование полисахаридов травы фиалки сомнительной / Р.А. Бубенчиков // Человек и лекарство: тез. доклад 14 Рос. нац. конгр. 16-20 апр. 2007 г.- М., 2007. - С. 805.
- Бубенчиков, Р.А. Изучение полисахаридного состава фиалки полевой / Бубенчиков Р.А. // 3 Российский гомеопатический съезд: сб. научн. тр. – Москва, 2007. - С. 165 – 166.
- Бубенчиков, Р.А. Изучение противовоспалительной активности жидкого спиртового и сухого водного экстрактов травы фиалки полевой, полученных по малоотходной технологии / Р.А. Бубенчиков, Н.С. Сергеев, А.М. Сампиев // Разработка, исследование и маркетинг новой фармац. продукции: сб. научн. тр.– Пятигорск, 2007. – Вып. 62. - С. 536 – 538.
- Бубенчиков, Р.А. Исследование флавоноидных соединений фиалки собачьей методом ВЭЖХ / Р.А. Бубенчиков // Человек и лекарство: тез. доклад 14 Рос. нац. конгр. 16-20 апр. 2007 г.- М., 2007. - С. 805-806.
- Бубенчиков, Р.А. Изучение полисахаридного состава фиалки полевой / Р.А. Бубенчиков // 3 Российский гомеопатический съезд: сб. научн. тр. - Москва, 2007. – С. 165 -166.
- Бубенчиков, Р.А. Изучение состава фенольных соединений фиалки опушенной методом ВЭЖХ / Р.А. Бубенчиков // Кластерные подходы в современной фармации и фармацевтическом образовании: сб. материалов международной научн. - практич. конф. 20-21 ноября 2008г. - Белгород: БелГУ, 2008. - С.240-242.
- Бубенчиков, Р.А Изучение отхаркивающей активности полисахаридов травы фиалки опушенной / Р.А. Бубенчиков // Актуальные проблемы регионоведения: тр. 3 междунар. научн. конф. 18 декабря 2008 г. - Курск, 2008. – С. 36-38.
- Бубенчиков, Р.А Изучение противовоспалительной активности фиалки скальной и фиалки донской / Р.А. Бубенчиков // Человек и лекарство: тез. доклад 15 Рос. нац. конгр. 14-18 апреля. 2008 г. - М., 2008. – С. 595.
- Бубенчиков, Р.А Исследование фармакологической активности Viola Ambigua Waldst.Et Kit / Р.А. Бубенчиков // 1 Российский фитотерапевтический съезд: сб. научн. тр. - Москва, 2008. – С. 184 -186.
- Бубенчиков, Р.А Применение ВЭЖХ для идентификации фенолкарбоноых кислот фиалки опушенной / Р.А. Бубенчиков // Человек и лекарство: тез. доклад 16 Рос. нац. конгр. 6-10 апреля. 2009 г. - М., 2009. – С. 624.
- Bubenchikova, V.N. Medicinal plants of the central Russia and their rational use / V.N. Bubenchikova, Yu.A. Kondratova, R.A. Bubenchikov, Yu.A. Starchak, A.S.K. Abdulla // International medizinscher congress «Euromedica» (4-5 Juni 2009). Hannover, 2009. – P.22-23.
- Bubenchikova, V.N. Standardization of medicinal raw material / V.N. Bubenchikova, Yu.A. Kondratova, R.A. Bubenchikov // International medizinscher congress «Euromedica» (4-5 Juni 2009). Hannover, 2009. – P. 24-25.
- Бубенчиков, Р.А. Изучение состава фенольных соединений фиалки собачьей методом ВЭЖХ / Р.А. Бубенчиков, А.А. Маркарян // 2 Российский фитотерапевтический съезд: сб. научн тр. съезда. 22-23 октября 2010. Приложение к журналу «Традиционная медицина» №3(22) 2010.-М.: Изд-во Профессиональной ассоциации натуротерапевтов, 2010. - С.112.
- Бубенчиков, Р.А. Исследование фармакотерапевтической эффективности растений рода фиалка на модели острого ларинготрахеита / Р.А. Бубенчиков // 2 Российский фитотерапевтический съезд: сб. научн. тр.съезда. 22-23 октября 2010. Приложение к журналу «Традиционная медицина» №3(22) 2010.-М.: Изд-во Профессиональной ассоциации натуротерапевтов, 2010. - С.11-14
- Бубенчиков, Р.А. Исследование мембраностимулирующей и антиоксидантной активности фиалки трехцветной и фиалки удивительной / Р.А. Бубенчиков // Молодые ученые в решении актуальных проблем науки: сб. работ молодых ученых междун. научн.- практич. конф. – Владикавказ, 2010. - С. 105-106.
