Фитохимическое и фармакологическое изучение травы манжетки
На правах рукописи
МУРИН
Илья Игоревич
ФИТОХИМИЧЕСКОЕ И ФАРМАКОЛОГИЧЕСКОЕ ИЗУЧЕНИЕ ТРАВЫ МАНЖЕТКИ
14.04.02 – фармацевтическая химия, фармакогнозия
14.03.06 – фармакология, клиническая фармакология
АВТОРЕФЕРАТ
диссертации на соискание учёной степени
кандидата фармацевтических наук
Москва – 2011
Работа выполнена в ГОУ ВПО Первый Московский государственный медицинский университет имени И.М. Сеченова
Научные руководители:
доктор фармацевтических наук Баева Вера Михайловна
доктор медицинских наук Козлов Алексей Михайлович
Официальные оппоненты:
доктор фармацевтических наук,
профессор Муравьёва Татьяна Ивановна
доктор фармацевтических наук Баландина Ирина Анатольевна
Ведущее учреждение:
Всероссийский научно-исследовательский институт лекарственных и ароматических растений (ВИЛАР) РАСХН
Защита состоится « » ____________ 2011 г. в ____часов на заседании Диссертационного совета Д.208.040.09 при ГОУ ВПО Первый Московский государственный медицинский университет имени И.М. Сеченова (119019, г. Москва, Никитский бульвар, д. 13).
С диссертацией можно ознакомиться в Центральной научной медицинской библиотеке ГОУ ВПО Первый МГМУ им. И.М. Сеченова (117998, г. Москва, Нахимовский проспект, д. 49).
Автореферат разослан « » ____________ 2010 г.
Учёный секретарь
Диссертационного совета Д.208.040.09,
доктор фармацевтических наук,
профессор Садчикова Наталья Петровна
ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ
Актуальность темы. Поиск новых растительных источников для получения потенциальных лекарственных средств, расширяющих арсенал фармакотерапии наиболее распространенных заболеваний, включая онкологические, является актуальной задачей для современной фармацевтической и фармакологической науки. Внедрение лекарственных препаратов в клиническую практику невозможно при отсутствии детального изучения их химического состава, безопасности и эффективности на уровне доклинических исследований.
По данным ВОЗ, в последние годы смертность от онкологических заболеваний занимает второе место в мире после патологии сердечно-сосудистой системы. Доказательной медициной установлено, что растительные препараты являются эффективными, наименее токсичными, а также способны потенцировать и снижать побочные действия химиотерапевтических средств.
Манжетка обыкновенная традиционно применяется как противовоспалительное, кровоостанавливающее, лимфотропное, гипотензивное и гипогликемическое средство.
В последние десятилетия манжетка активно изучается как сердечно-сосудистое средство. Андреева В.Ю. (1998-2001 г.г.) и Зыков А.А. (2000 г.) изучали траву манжетки как лимфотропное, гиполипидемическое и антиишемическое средство.
Ряд исследователей изучали химический состав эндемичных манжеток Сибирского региона. Для них установлено наличие некоторых фенольных соединений (флавоноидов, дубильных веществ, фенолкарбоновых кислот) в спиртовом извлечении (Андреева В.Ю., 2001 г.). Химический состав водных извлечений из травы манжетки не изучался в полном объеме.
В литературе отсутствуют данные о применении манжетки обыкновенной для профилактики и лечения злокачественных новообразований. Вместе с тем в литературе имеются данные о противоопухолевой активности агримониина, выделенного из других растительных источников (Okuda T., 1990).
Таким образом, трава манжетки является перспективным растительным сырьем для применения в научной медицине и, в частности, в онкологии.
Цель и задачи исследования. Провести фитохимическое и фармакологическое изучение травы манжетки.
Для реализации поставленной цели были решены следующие задачи:
- Провести фитохимическое изучение травы и настоя манжетки по составу фенольных соединений, полисахаридов, аминокислот, соединений нуклеиновой природы, макро- и микроэлементов;
- Разработать характеристики подлинности и показатели качества для травы манжетки;
- Разработать нормы качества для настоя травы манжетки;
- Оценить фармакологическую (противоопухолевую, антиметастатическую и антитоксическую) активность настоя травы манжетки;
- Оценить фармакологическую (цитотоксическую и антитоксическую) активность суммы полифенолов и агримониина из травы манжетки
Научная новизна. Проведено комплексное изучение химического состава нового лекарственного сырья – трава манжетки – в связи с его фармакологической активностью. Качественно и количественно установлено содержание в сырье и настое флавоноидов, фенолкарбоновых кислот, полисахаридов, аминокислот, макро- и микроэлементов, витаминов. Получены новые данные о содержании азотистых основаниях нуклеиновых кислот (НК) в настое травы манжетки. Впервые для настоя травы манжетки установлен спектр фармакологических эффектов, таких как противоопухолевый, антиметастатический и антитоксический. Получен Патент на изобретение (№ 2403055, зарегистрирован в Государственном реестре изобретений Российской Федерации 10 ноября 2010 г., приоритет изобретения от 23 апреля 2009 г.) «Способ получения средства из травы манжетки, снижающего токсичность циклофосфамида». Впервые установлена цитотоксическая и антитоксическая активность суммы полифенолов и агримониина из травы манжетки. Получены 3 заявки на изобретения: от 14.04.2010 г. (входящий № 020921, регистрационный № 2010114834) - «Способ получения полифенольного средства из травы манжетки, снижающего токсичность циклофосфамида и обладающего цитотоксической активностью»; от 14.04.2010 г. (входящий № 020920, регистрационный № 2010114833) - «Способ получения агримониина» и от 14.04.2010 г. (входящий № 020919, регистрационный № 2010114832) - «Средство, снижающее токсичность циклофосфамида».
Практическая значимость.
- В свете современных требований проведена валидация методики дифференциальной спектрофотометрии для количественного определения в траве манжетки суммы флавоноидов в пересчете на рутин. Получен Акт внедрения результатов валидации методики;
- Данные, полученные в результате проведенных исследований вошли в разделы проектов фармакопейной статьи «Herba Alchemillae - трава манжетки» 2009 г. и «Инструкции по сбору и сушке травы манжетки»;
- Установлена фармакологическая активность настоя травы манжетки: противоопухолевая, антиметастатическая, цитотоксическая и антитоксическая. Данные защищены публикациями и Патентом на изобретение. Также определена антитоксическая и цитотоксическая активность суммы полифенолов и агримониина из травы манжетки, защищенные публикациями и заявками на изобретения;
- Результаты проведенных исследований используются в учебном процессе на кафедре фармакогнозии ГОУ ВПО Первый МГМУ имени И.М. Сеченова. Получен Акт внедрения результатов научных достижений.
Положения, выносимые на защиту:
- Результаты фитохимического изучения фенольных соединений, полисахаридов, аминокислот, соединений нуклеиновой природы, макро- и микроэлементов травы и настоя манжетки;
- Данные по разработке характеристик подлинности и показателей качества травы манжетки;
- Данные норм качества настоя травы манжетки;
- Оценка изучения фармакологической активности настоя травы манжетки;
- Данные о фармакологической активности суммы полифенолов и агримониина из травы манжетки.
Публикация материалов исследования и апробация работы. По теме диссертации опубликовано 7 работ, в том числе 2 статьи в изданиях, рекомендованных ВАК РФ. Материалы диссертационной работы представлены на научно-практических конференциях: 63-й региональной конференции по фармации и фармакологии (январь 2008 г., Пятигорск), конференции с международным участием «Татьянин день» (22-23 января 2009 г., Москва), VIII Всероссийской научно-практической конференции «Отечественные противоопухолевые препараты» (21-22 апреля 2009 г., Москва), симпозиуме, посвященном 75-летию академика В.Г. Кукеса, (сентябрь 2009 г., Москва).
Связь задач исследования с проблемным планом фармацевтических наук. Диссертационная работа выполнена в ГОУ ВПО Первый МГМУ имени И.М. Сеченова в соответствии с планом научно-исследовательских работ кафедры фармакогнозии по теме: «Фармакогностическое изучение лекарственного растительного сырья, лекарственных сборов, лекарственных форм из сырья и разработка методов их стандартизации с учетом влияния антропогенных факторов» (код темы 0407093).
Объём и структура диссертации. Работа изложена на ____ страницах машинописного текста и состоит из введения, обзора литературы (1 глава), экспериментальной части (4 главы), общих выводов, списка литературы и приложений; иллюстрирована ___ рисунками и ___ таблицами. Список литературы включает 149 источников, в том числе 35 – на иностранных языках.
Во введении обоснована актуальность выбранной темы, определены цели и задачи исследования, показана научная и практическая значимость работы, основные положения, выносимые на защиту.
В обзоре литературы (глава 1) обобщены данные за последние годы о современном состоянии исследований химического состава, методов анализа, фармакологической активности лекарственного растительного сырья и фитопрепаратов, содержащих полифенолы, проанализированы модели опухолей, рекомендованные для проведения доклинических испытаний по отбору средств, обладающих потенциальной противоопухолевой и антиметастатической активностью.
Глава 2 посвящена описанию объектов и методов исследования.
В главе 3 изложены результаты фитохимического изучения травы и настоя манжетки.
В главе 4 приведены данные по разработке характеристик подлинности и показателей качества травы манжетки, а также данные по разработке норм качества для настоя травы манжетки и валидационные характеристики методики количественного определения суммы флавоноидов в траве манжетки.
Глава 5 посвящена изучению противоопухолевой, антиметастатической, цитотоксической и антитоксической активности настоя, суммы полифенолов и агримониина из травы манжетки.
Приложение включает проекты ФС «Herba Alchemillae – трава манжетки» и «Инструкции по сбору и сушке травы манжетки», Патент на изобретение, уведомления о поступлении и регистрации заявок на изобретения, акт внедрения результатов научных достижений, акт внедрения результатов валидации методики количественного определения, справка о фармакологической активности, а также спектральные и хроматографические характеристики по изучению химического состава травы и настоя манжетки.
ОБЪЕКТЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ
Объектами исследований служили:
- трава манжетки, собранная в период цветения в Истринском и Раменском районах Московской области в 2007 и 2008 годах. Сырье заготавливали на опушке смешанного хвойно-лиственного леса, на суходольных лугах, на расстоянии более 2 км от населенных пунктов и трасс, в сухую погоду;
- настой травы манжетки 1:10 из стандартного сырья, приготовленный по методике Государственной Фармакопеи XI издания;
- настой травы манжетки 1:5 из стандартного сырья, приготовленный сгущением настоя 1:10 в 2 раза;
- настой травы манжетки 1:50 из стандартного сырья, приготовленный разведением настоя 1:10 в 5 раз;
- мыши-самцы линии BDF1;
- мыши-самцы линии С57Bl/6;
- беспородные мыши-самцы SHY/kv
Для фитохимического исследования использовали настой травы манжетки 1:10.
Для определения фенольных соединений в настое травы манжетки использовали метод высокоэффективной жидкостной хроматографии (ВЭЖХ) на жидкостном хроматографе фирмы Perkin Elmer (США).
Полисахариды травы и настоя манжетки количественно определяли методом гравиметрии по методике Государственной Фармакопеи XI издания, вып.2 (частная фармакопейная статья «Herba Bidentis – трава череды»), качественный анализ проводили методом тонкослойной хроматографии (ТСХ) на хроматографических пластинах марки «Сорбифил».
Определение аминокислот в траве и настое манжетки проводили по методике Л.А. Баратовой (1988 г.) на аминокислотном анализаторе, модель 835 фирмы «Хитачи» (Япония).
Для изучения нуклеиновых кислот и нуклеотидов в настое травы манжетки использовали методы ВЭЖХ (жидкостной хроматограф фирмы Perkin Elmer (США)) и ПЦР-РВ (прибор для ПЦР в реальном времени АНК-16/32 (Россия), тест-система «Растение/35S/NOS скрининг»).
Определение макро- и микроэлементов в траве и настое манжетки проводили на оптическом ИСП-спектрометре «Оптима 3000» атомно-эмиссионным методом МУК 4.1.1482-03.
Разработку характеристик подлинности и показателей качества на траву манжетки по разделам «Внешние признаки», «Микроскопия», «Качественный анализ» и «Числовые показатели» проводили с использованием общепринятых методик Государственной Фармакопеи XI издания, вып.1. Анализ сырья по разделу «Количественное определение» проводили по проекту ФС «Herba Alchemillae - трава манжетки» 2009 г.
Разработку норм качества настоя травы манжетки по разделам «Определение окраски жидкостей» и «Определение рН» проводили по общепринятым методикам Государственной Фармакопеи XI издания, вып.1.
Определение сухого остатка настоя травы манжетки проводили по методике общей статьи ГФ XI «Настойки».
Для фармакологических исследований использовали линейных и беспородных животных и настои травы манжетки 1:5, 1:10, 1:50, а также агримониин и сумму полифенолов, выделенные из травы манжетки.
Для определения фармакологической активности использовали общепринятые методики «Руководства по экспериментальному (доклиническому) изучению новых фармакологических веществ» (2005 г.).
СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ
ФИТОХИМИЧЕСКОЕ
ИЗУЧЕНИЕ ТРАВЫ И НАСТОЯ МАНЖЕТКИ
Анализ литературных данных показал, что химический состав БАВ травы манжетки изучен не в полном объеме.
В связи с тем, что в настой травы манжетки переходит весь многокомпонентный комплекс биологически активных веществ вместе с макро- и микроэлементами, нами проведено комплексное фитохимическое изучение данных веществ.
Определение фенольных соединений методом высокоэффективной жидкостной хроматографии (ВЭЖХ). Проведенное хроматографическое разделение при одновременном детектировании при длине волны 255 нм и 280 нм показало, что трава манжетки содержит фенольные соединения (детектирование при 280 нм) и соединения флавоноидной природы (детектирование при 255 нм).
Как показывает анализ полученных экспериментальных данных, при длине волны детектирования 255 нм, настой травы манжетки 1:10 содержит 41 соединение. В то же время при детектировании при 280 нм определен 81 компонент.
Для идентификации и количественной оценки использовали стандартные соединения: рутин, кверцетин, гиперозид, лютеолин, хлорогеновая кислота, кофейная кислота, галловая кислота, арбутин, аскорбиновая кислота и рибофлавин.
Нами определено содержание основных фенольных соединений, обнаруженных в настое травы манжетки: рутин 0,872±0,026 мг/мл, кверцетин 0,009±0,001 мг/мл, гиперозид 0,012±0,0005 мг/мл, лютеолин 0,019±0,001 мг/мл, хлорогеновая кислота 0,272±0,012 мг/мл, кофейная кислота 0,015±0,0006 мг/мл, галловая кислота 0,010±0,0005 мг/мл, арбутин 0,087±0,004 мг/мл, аскорбиновая кислота 0,352±0,016 мг/мл, рибофлавин 0,005±0,0002 мг/мл. Наибольшее содержание установлено для рутина, хлорогеновой и аскорбиновой кислот.
Определение полисахаридов в траве и настое манжетки. В опытных образцах травы манжетки и приготовленных из них настоев методом гравиметрии определили содержание полисахаридов в пересчете на абсолютно сухое сырье, которое колебалось от 7,55% до 12,63% для сырья (в среднем – 10,09±0,12%) и от 4,65% до 7,24% для настоя (в среднем – 5,95±0,09%).
Методом ТСХ в траве и настое манжетки после гидролиза идентифицировали следующие моносахара: ксилоза, глюкоза и галактоза (рис. 1). Для идентификации использовали смесь РСО ксилозы, глюкозы, галактозы, арабинозы и маннозы.
Определение аминокислот в траве и настое манжетки. С помощью аминокислотного анализатора с использованием стандартных образцов соответствующих аминокислот в траве и настое манжетки нами определены 18 аминокислот (АК), из них 7 незаменимых (валин, лейцин, изолейцин, треонин, метионин, лизин и фенилаланин). В настое травы манжетки 1:10 определено наиболее высокое содержание пролина и оксилизина (0,45 мг/мл и 0,13 мг/мл соответственно), а в воздушно-сухом сырье – аспарагиновой кислоты, глютаминовой кислоты, глицина, валина и лизина (1,14 мг/мл, 1,87 мг/мл, 1,03 мг/мл, 1,12 мг/мл и 1,04 мг/мл соответственно).
 | Рис.1. Хроматограмма моносахаридных компонентов травы и настоя манжетки 1:10 после полного гидролиза. кси – ксилоза, глю – глюкоза, гал – галактоза, ара – арабиноза, ман – манноза. |
Определение азотистых оснований нуклеиновых кислот и нуклеотидов в настое травы манжетки. Изучение содержания азотистых оснований в настое травы манжетки проводили методом ВЭЖХ с использованием РСО цитозина, урацила, тимина и ксантина.
На рисунке 2 представлены хроматограммы настоя травы манжетки и стандартов азотистых оснований. Анализ спектральных особенностей исследованных компонентов позволил идентифицировать присутствие в настое травы манжетки азотистых оснований нуклеотидов и нуклеиновых кислот.
 | Рис. 2. Хроматограммы настоя травы манжетки и стандартов азотистых оснований: 1-цитозин; 2-урацил; 3-ксантин; 4-тимин |
Определение эссенциальных и условно-эссенциальных макро- и микроэлементов в настое и траве манжетки. Ввиду большой значимости элементного состава сырья и значительного вклада его в фармакологическую активность, определили элементный состав травы и настоя манжетки. Результаты анализа представлены в таблице 1.
Следует отметить, что содержание калия, переходящее в настой определено до 269,4 мг/л, магния – до 19,44 мг/л, цинка – до 17,46 мг/л, кремния – до 14,91 мг/л, а также марганца - до 12,40 мг/л, что положительно влияет на его фармакологические свойства.
Таблица 1. Содержание эссенциальных и условно-эссенциальных элементов в траве манжетки и в настое из травы манжетки 1:10
| Химический элемент | Воздушно-сухая трава манжетки, мг/кг | Настой травы манжетки 1:10, мг/л |
| Ca | 141 | 39 |
| Co | 0,175 | <0,001 |
| Cr | 0,235 | 0,096 |
| Cu | 3,56 | 2,304 |
| Fe | <0,001 | <0,001 |
| K | 396 | 269,4 |
| Mg | 38,8 | 19,44 |
| Mn | 12,4 | 4,02 |
| Mo | 0,027 | <0,001 |
| Na | 2,44 | 51 |
| P | 24,7 | <0,001 |
| S | 15,4 | <0,001 |
| Se | <0,001 | <0,001 |
| Zn | 27 | 17,46 |
| Si | 17,1 | 14,91 |
| B | 2,11 | <0,001 |
РАЗРАБОТКА ХАРАКТЕРИСТИК ПОДЛИННОСТИ И ПОКАЗАТЕЛЕЙ КАЧЕСТВА ТРАВЫ МАНЖЕТКИ
Результаты морфолого-анатомического и фитохимического изучения травы манжетки легли в основу разработки характеристик подлинности по разделам: «Внешние признаки», «Микроскопия» и «Качественный анализ». Результаты изучения внешних признаков сырья представлены в таблице 2.
Таблица 2. Диагностические (внешние) признаки травы манжетки
| Диагностический признак | Характеристика признака |
| СТЕБЕЛЬ | |
| Форма | округлый |
| Характер поверхности | опушенный |
| Характер ветвления | разветвленный |
| Размеры Длина Диаметр | 10 см 4 мм |
| Цвет | Светло-зеленый |
| ЛИСТЬЯ | |
| Листорасположение | очередное |
| Форма листовой пластинки | Округло-почковидная и веерообразная |
| Размеры Длина Ширина | 6 см 4 см |
| Наличие черешка Стеблевые Розеточные | Сидячие Длиной 5 см |
| Строение листа | Простые, лопастные |
| Жилкование | Пальчато-нервное |
| Край | зубчатый |
| Опушение С верхней стороны С нижней стороны | Малоопушенная Более опушенная |
| Цвет С верхней стороны С нижней стороны | Зеленый Светло-зеленый |
| ЦВЕТКИ | |
| Тип соцветия | Дихазиальное, клубочковидное |
| Строение цветка Строение околоцветника | Актиноморфный Простой 4-х-мерный, чашечковидный с подчашием |
| Цвет | Желто-зеленый |
| Запах | Слабый, своеобразный, кумариновый |
| Вкус | Травянистый, слегка терпкий |
Анатомическое изучение травы манжетки позволило выявить микроскопические признаки сырья. Эти данные представлены в таблице 3. На рисунках 3 и 4 представлены такие устойчивые диагностические микроскопические признаки, как одноклеточные простые волоски и друзы.
 Рис.3. Микропрепарат листа с поверхности (край листа). Увеличение 200 1-место прикрепления простого волоска 2-части простых волосков |  Рис. 4. Микропрепарат листа с поверхности. Увеличение 740 1-друзы по жилке |
Фитохимическое изучение биологически активных веществ (БАВ) травы манжетки позволило установить качественный состав сырья. Хроматографические пробы позволили идентифицировать флавоноиды, среди которых преобладал рутин. Таким образом, для раздела «Качественный анализ» нами разработан метод тонкослойной хроматографии (ТСХ) для спиртового извлечения травы манжетки. Установлено, что на хроматограмме раствора сравнения (РСО рутина) обнаруживается зона адсорбции коричневого цвета с Rf около 0,18 (рутин).
На хроматограмме испытуемого раствора обнаруживались зоны адсорбции коричневого цвета с Rf (по рутину): около 1,0 (рутин); зона адсорбции синего цвета с Rf около 2,0; зона адсорбции голубого цвета с Rf около 2,50 (рис. 5).
После опрыскивания пластинки 2% спиртовым раствором алюминия хлорида и нагревания на хроматограмме раствора сравнения обнаруживалась
зона адсорбции зеленовато-желтого цвета с Rf (по рутину) 1,0 (рутин) и зоны адсорбции голубого цвета с Rf около 1,75-2,50.
Таблица 3. Микроскопические признаки травы манжетки
| Диагностический признак | Характеристика признака | |
| ЭПИДЕРМИС | ||
| Характер клеточной стенки | Верхний эпидермис – более прямостенный, с четковидными утолщениями. Нижний – извилистостенный | |
| Устьичный комплекс | На нижнем эпидермисе, устьица погруженные, округлые, с узкой щелью | |
| Волоски | Простые, удлиненные, до 1 мм, с толстостенной кутикулой | |
| МЕЗОФИЛЛ | ||
| Строение | Палисадная паренхима, как правило, двухрядная. Губчатая паренхима мезофилла лопастная | |
| Кристаллические включения | По жилкам располагаются тупоконечные друзы, с выраженным центром срастания и кристаллообразования | |
 | Рис. 5. Хроматограмма спиртового извлечения из травы манжетки |
Фитохимическое изучение травы манжетки позволило установить нормы содержания основных БАВ сырья. Эти данные дополняют раздел «Числовые показатели» проекта ФС «Herba Alchemillae - трава манжетки» 2009 г. Результаты приведены в таблице 4.
Таблица 4. Числовые показатели травы манжетки
| Числовой показатель, % | Норма значения |
| Суммы флавоноидов в пересчете на рутин | Не менее 4% |
| Суммы полисахаридов в пересчете на абсолютно сухое сырье | Не менее 7,5% |
| Пролина | Не менее 0,9% |
| Оксилизина | Не менее 0,2% |
| Калия | Не менее 0,04% |
| Магния | Не менее 0,004% |
| Цинка | Не менее 0,003% |
| Кремния | Не менее 0,002% |
| Влажность | Не более 12% |
| Зола общая | Не более 12% |
| Зола, нерастворимая в 10% растворе хлористоводородной кислоты | Не более 2% |
| Пожелтевших листьев | Не более 5% |
| Черешков и стеблей длиннее 10см | Не более 5% |
| Органической примеси | Не более 2% |
| Минеральной примеси | Не более 1% |
Для установления дозы вводимого настоя, необходимо было определить содержание действующих веществ, поэтому в собранных образцах травы манжетки методом дифференциальной спектрофотометрии определили содержание суммы флавоноидов в пересчете на рутин (таблица 4).
Для подтверждения отсутствия систематической ошибки методики проводили опыты с добавлением раствора стандартного образца (РСО) рутина. Относительная и абсолютная ошибки опытов с добавками РСО рутина находятся в пределах случайной ошибки использованного метода, что свидетельствует об отсутствии систематической ошибки.
Валидацию методики проводили по специфичности, линейности, повторяемости, воспроизводимости и правильности. Статистическую обработку данных проводили по ГФXI, используя программу Microsoft Exсel.
Валидационная оценка методики, проведённая по характеристикам: специфичность, линейность, правильность и прецизионность в соответствии с проектом ОФС «Валидация фармакопейных методов», подтвердила её пригодность для количественного определения суммы флавоноидов в траве манжетки.
Таблица 5. Метрологические характеристики методики (Р=95%, n=9)
| параметры | f | x | S2 | S | P,% | t(P,f) |  | , % | относит,% |
| значения | 8 | 4,12 | 0,0479 | 0,2189 | 95 | 2,26 | 0,385 | 3,95% | 1,27% |
РАЗРАБОТКА НОРМ КАЧЕСТВА ДЛЯ НАСТОЯ ТРАВЫ МАНЖЕТКИ
Настой травы манжетки готовили согласно методике ГФXI, с учетом коэффициента водопоглощения (Квп=4).
В результате фитохимического изучения настоя травы манжетки установили нормы содержания основных БАВ. Данные представлены в таблице 6.
В связи с фармакологическим изучением, необходимо было получить стандартное водное извлечение из травы манжетки.
Для этого провели оценку окраски настоя травы манжетки 1:10 в сравнении с эталонами цветности. Приготовленная серия настоев соответствовала фармакопейным эталонам от 1а до 1б.
Установили, что приготовленная серия настоев травы манжетки имеет слабокислую реакцию среды (pH от 4,0 до 4,6), также определили сухой остаток настоя травы манжетки.
Таблица 6. Нормы качества настоя травы манжетки
| Показатель | Норма значения |
| Сухой остаток настоя, % | Не менее 2,5% |
| Рутина, % | Не менее 0,09% |
| Хлорогеновой кислоты, % | Не менее 0,03% |
| Аскорбиновой кислоты, % | Не менее 0,04% |
| Суммы полисахаридов, % | Не менее 4% |
| Пролина, % | Не менее 0,05% |
| Оксилизина, % | Не менее 0,015% |
| Калия, % | Не менее 0,03% |
| Магния, % | Не менее 0,002% |
| Цинка, % | Не менее 0,002% |
| Кремния, % | Не менее 0,002% |
| pH | Не менее 4,0 Не более 4,6 |
| Окраска настоя | От темно-желтого до желто-зеленого |
ФАРМАКОЛОГИЧЕСКОЕ ИЗУЧЕНИЕ НАСТОЯ, СУММЫ ПОЛИФЕНОЛОВ И АГРИМОНИИНА ТРАВЫ МАНЖЕТКИ
Изучение антиметастатической и противоопухолевой активности настоя травы манжетки. Изучили антиметастатическую и противоопухолевую активность настоя травы манжетки, используя в качестве модели перевиваемую карциному легкого Льюис (LLC). Полученные результаты представлены в таблицах 7, 8, 9, 10.
Таким образом, на фоне проведенного лечения отметили снижение интенсивности метастазирования карциномы легкого Льюис.
Кроме того, эффект лечения настоем травы манжетки оценили с учетом общепринятых критериев - ТРО% и ТРМ% (торможение роста опухоли и торможение роста метастазов в %). Интенсивность метастазирования оценивали по приросту средней массы легких. Полученные результаты после статистической обработки представлены в таблицах 9 и 10.
Таблица 7. Выраженность процесса метастазирования опухоли карциномы легкого Льюис у мышей
| Группа мышей | Высокая интенсивность метастазирования, % |
| 1 | 33 |
| 2 | 20 |
| 3 | 40 |
| 4 контроль | 63 |
Таблица 8. Влияние настоя травы манжетки на интенсивность метастазирования карциномы легкого Льюис
| Группа мышей | Схема лечения | Интенсивность метастазирования, % |
| 1 | настой травы манжетки 1:5 0,5 мл/мышьХ10 per os | 33 |
| 2 | настой травы манжетки 1:10 0,5 мл/мышьХ10 per os | 20 |
| 3 | настой травы манжетки 1:50 0,5 мл/мышьХ10 внутрибрюшинно | 40 |
| 4 контроль | вода очищенная 0,5 мл/мышьХ10 per os | 63 |
Таблица 9. Влияние настоя травы манжетки на рост первичного опухолевого узла карциномы легкого Льюис
| Группа мышей | Средний объем опухоли в мм3 на сутки опыта | ТРО% на сутки опыта | ||||||
| 7-е | 12-е | 14-е | 18-е | 7 | 12 | 14 | 18 | |
| 1 | 330,5± 191,2 | 1462,0 ±555,9 | 2397,5 ±1106,2 | 3671,0 ±1469,6 | 42 | 17 | 32 | 28 |
| 2 | 137,3± 273,0 | 1474,7 ±351,3 | 2322,7 ±77,9 | 3646,3 ±217,5 | 76 | 17 | 34 | 29 |
| 3 | 180,0± 81,6 | 1263,0 ±175,3 | 2204,0 ±261,6 | 4178,0 ±644,2 | 68 | 29 | 37 | 20 |
| 4 | 569,3± 120,6 | 1768,0 ±220,1 | 3525,3 ±477,7 | 5122,5 ±224,8 | - | - | - | - |
Таблица 10. Влияние настоя травы манжетки на процесс метастазирования карциномы легкого Льюис
| Группа мышей | Схема лечения | Средняя масса легких в мг | ТРМ% |
| 1 | настой травы манжетки 1:5 0,5 мл/мышьХ10 per os | 392,5±110,1 | 28 |
| 2 | настой травы манжетки 1:10 0,5 мл/мышьХ10 per os | 370,0±79,2 | 32 |
| 3 | настой травы манжетки 1:50 0,5 мл/мышьХ10 внутрибрюшинно | 467,7±66,3 | 14 |
| 4 контроль | вода очищенная 0,5 мл/мышьХ10 per os | 541,7±127,2 | - |
Как видно из данных, представленных в таблицах 7, 8 и 10, настой травы манжетки обладает значимым антиметастатическим действием. ТРМ% более 25%.
Изучение противоопухолевой и антиметастатической активности настоя травы манжетки на модели опухоли саркома-37 (S-37). Изучили антиметастатическую и противоопухолевую активность настоя травы манжетки, используя в качестве модели перевиваемую опухоль саркома-37 (S-37) (табл. 11 и 12).
Таблица 11. Влияние настоя травы манжетки на процесс метастазирования саркомы-37
| Группа мышей | Схема лечения | Суммарная масса метастазов в мг | Масса метастазов в мг на одну мышь |
| 1 | настой травы манжетки 1:10 0,5 мл/мышьХ10 per os | 739,0 | 105,6 (-29%) |
| 2 контроль | вода очищенная 0,5 мл/мышьХ10 per os | 1045,0 | 149,3 |
В результате анализа полученных экспериментальных данных показали, что пероральное введение мышам настоя травы манжетки ингибирует процесс лимфогенного метастазирования саркомы-37 на 29%.
При изучении активности настоя травы манжетки выявили его способность пролонгировать продолжительность жизни животных с саркомой-37.
Таблица 12. Влияние настоя травы манжетки на среднюю продолжительность жизни мышей с саркомой-37
| Группа мышей | Схема лечения | СПЖ, дни | УПЖ, % |
| 1 | настой травы манжетки 1:10 0,5 мл/мышьХ10 per os | 46,3 ± 2,6 | 34 |
| 2 контроль | вода очищенная 0,5 мл/мышьХ10 per os | 34,5 ± 1,9 | - |
При оценке УПЖ, установили, что средняя продолжительность жизни мышей в контрольной группе составила 34,5±1,9 дня, в группе, получавшей лечение настоем травы манжетки 1:10 – 46,3 ± 2,6 дня. Таким образом, показатель УПЖ составил 34%.
- Изучение влияния настоя травы манжетки на общетоксическое действие циклофосфамида. Изучили влияние настоя травы манжетки 1:10 на общетоксическое действие противоопухолевого препарата циклофосфамид.
За критерий оценки общетоксического действия взяли среднюю продолжительность жизни (СПЖ) в 2-х группах животных.
Определили, что настой травы манжетки 1:10 снижает общетоксическое действие циклофосфамида. Средняя продолжительность жизни у мышей в группе при сочетанном применении циклофосфамида и настоя травы манжетки 1:10 в 1,8 раза больше, чем в группе, получавшей монотерапию циклофосфамидом.
- Изучение влияния агримониина и суммы полифенолов на общетоксическое действие циклофосфамида. Изучили влияние агримониина и суммы полифенолов, выделенных из травы манжетки на общую токсичность циклофосфамид.
За критерии оценки общетоксического действия взяли среднюю продолжительность жизни (СПЖ), изменение массы тела и поведение мышей в 3-х группах. Выявили, что агримониин и сумма полифенолов травы манжетки снижают общетоксическое действие циклофосфамида. Выживаемость и общее состояние животных в группах, получавших сочетанное лечение водными растворами агримониина и суммы полифенолов выше, чем в группе, получавшей монотерапию циклофосфамидом.
- Изучение цитотоксической активности суммы полифенолов и агримониина, выделенных из травы манжетки. Изучили цитотоксическую активность суммы полифенолов и агримониина, выделенных из травы манжетки в МТТ-тесте. Полученные данные представлены на рисунках 6 и 7.
Кривая, отображающая выживаемость (в %) опухолевых клеток меланомы В-16 при добавлении в культуральную среду агримониина в концентрации от 1х10-3 до 1х10-9 моль свидетельствует о слабой цитотоксической активности препарата. Лишь при концентрации агримониина больше 1х10-4 моль отметили снижение выживаемости опухолевых клеток (рис.6).
Суммарный препарат (сумма полифенолов) в том же тесте продемонстрировал значительную цитотоксичность. Индекс IC50 (показатель
концентрации, при которой выживаемость опухолевых клеток ингибируется на 50%) находился на уровне 5х10-6 моль (рис. 7).
 Рис.6. Цитотоксическая активность агримониина в отношении клеток экспериментальной меланомы В-16(линия F-10) |  Рис.7. Цитотоксическая активность суммы полифенолов в отношении клеток экспериментальной меланомы В-16(линия F-10) |
ОБЩИЕ ВЫВОДЫ
- Проведено фитохимическое изучение травы манжетки и настоя из нее. Методом высокоэффективной жидкостной хроматографии (ВЭЖХ) в настое травы манжетки определено качественное и количественное содержание флавоноидов (рутин, кверцетин, гиперозид, лютеолин), фенолкарбоновых кислот (кофейная, хлорогеновая) и некоторых других фенольных соединений (арбутин, галловая кислота), витаминов (аскорбиновая кислота, рибофлавин). Получены данные о присутствии азотистых оснований нуклеиновых кислот.
- Методом ТСХ после гидролиза установлен состав моносахаров полисахаридного комплекса травы и настоя манжетки: ксилоза, глюкоза и галактоза. Определено количественное содержание полисахаридов в траве и настое манжетки – в среднем - 10,09±0,12% и 5,95±0,09%;
- Выявлено, что в траве и настое манжетки содержатся 18 аминокислот, в том числе 7 незаменимых (валин, лейцин, изолейцин, треонин, метионин, лизин, фенилаланин). В настое определено наиболее высокое содержание пролина и оксилизина, а в траве – аспарагиновой кислоты, глютаминовой кислоты, глицина, валина и лизина;
- Установлено содержание эссенциальных и условно-эссенциальных макро- и микроэлементов в траве и настое манжетки. Выявлено, что некоторые элементы переходят в настой;
- Разработаны характеристики подлинности и показатели качества для травы манжетки;
- Валидирован метод дифференциальной спектрофотометрии для количественного определения суммы флавоноидов в траве манжетки в пересчете на рутин. Предложенная методика анализа обеспечивает получение достоверных и воспроизводимых результатов;
- Разработаны нормы качества для настоя травы манжетки;
- Впервые выявлено, что настой травы манжетки проявляет определенную противоопухолевую и антиметастатическую активность в отношении карциномы легкого Льюис (LLC) (ТРО% от 20 до 37%, ТРМ% от 28 до 32%);
- Установлено, что настой травы манжетки ингибирует процесс лимфогенного метастазирования саркомы-37 (S-37) на 29 %, и способен увеличивать продолжительность жизни мышей (УПЖ=34%);
- Выявлено, что настой травы манжетки снижает общетоксическое действие циклофосфамида;
- Определено, что агримониин и сумма полифенолов из травы манжетки снижают общетоксическое действие циклофосфамида, а сумма полифенолов также обладает определенной цитотоксической активностью.
Список опубликованных работ:
- Баева В.М., Мурин И.И. Изучение аминокислотного состава настоя и порошка травы манжетки // Традиционная медицина. - 2007. - №1[8]. - С. 53-56.
- Мурин И.И., Баева В.М., Козлов А.М. Поиск потенциальных ингибиторов метастазирования злокачественных опухолей среди агентов растительного происхождения // Разработка, исследование и маркетинг новой фармацевтической продукции: сб. науч. тр. / под ред. М.В. Гаврилина / Пятигорская ГФА. – Пятигорск, 2008. – Вып. 63. – С. 455-457.
- Мурин И.И., Баева В.М., Козлов А.М. Влияние настоя травы манжетки на общую токсичность противоопухолевого препарата – циклофосфамида // сб.тез. V конференции молодых ученых с международным участием «Фундаментальные науки и прогресс клинической медицины», 2008. – С. 307.
- Мурин И.И., Баева В.М., Козлов А.М. Влияние агримониина и суммы полифенолов, выделенных из травы манжетки на общую токсичность противоопухолевого препарата – циклофосфамида // Российский биотерапевтический журнал. – 2009. - №2(8). – С. 55.
5. Мурин И.И., Баева В.М., Козлов А.М. Оценка влияния препаратов растительного происхождения на процесс рецидивирования злокачественных опухолей // Изыскание и создание природных лекарственных средств: Межвузовский сборник научных трудов с международным участием, посвященный 25-летию кафедры фармакогнозии и ботаники Яросл. гос.мед. академии / под ред.проф. Н.С. Фурсы. – Ярославль : ООО «ЯрМедиаГруп», 2009. – С. 210-213, 396 с.
- Мурин И.И., Баева В.М. Изучение полифенольных соединений настоя травы манжетки методом ВЭЖХ // Мат. VII Междунар. Симпоз. по фенольным соединениям: фундаментальные и прикладные аспекты. – М., 19-23 октября 2009. – С. 180-181.
- Мурин И.И., Баева В.М. Элементный состав травы и настоя манжетки // Фармация. - 2009. - №7. - С. 23-25.
