Исследование влияния ионизирующего излучения на биологически активные комплексы лекарстве нных растений
На правах рукописи
Чакчир Олег Борисович
Исследование влияния ИОНИЗИРУЮЩЕГО ИЗЛУЧЕНИЯ НА биологически активнЫЕ комплексЫ
лекарственнЫХ растеНИЙ
14.04.02 – фармацевтическая химия и фармакогнозия
Автореферат
диссертации на соискание ученой степени
кандидата фармацевтических наук
Москва
2013 г
Работа выполнена во Всероссийском научно-исследовательском институте лекарственных и ароматических растений Российской академии сельскохозяйственных наук
Научный руководитель:
доктор фармацевтических наук,
профессор Саканян Елена Ивановна
Официальные оппоненты:
Мирошниченко Юрий Владимирович, доктор фармацевтических наук, профессор, заведующий кафедрой Военно-медицинского снабжения и фармации Военно-медицинской академии им С.М. Кирова г. Санкт-Петербург.
Лякина Марина Николаевна, доктор фармацевтических наук, заместитель начальника управления №3 экспертизы лекарственных средств ФГБУ НЦЭСМП МЗ РФ
Ведущая организация:
ФГБУ Научно-исследовательский институт фармакологии им. В.В. Закусова РАМН
Защита состоится « »______________ 2013 года в ___ часов на заседании Диссертационного совета Д. 006.070.01 при Государственном научном учреждении Всероссийском научно-исследовательском институте лекарственных и ароматических растений Российской академии сельскохозяйственных наук (117216, г. Москва, ул. Грина, 7) по адресу: 123056, г. Москва, ул. Красина, д.2
С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке ГНУ ВИЛАР Россельхоз-
академии по адресу: 117216, г. Москва, ул. Грина, 7
Автореферат разослан «__»__________ 2013 г.
Ученый секретарь
Диссертационного совета
доктор фармацевтических наук Громакова А.И.
ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ
Актуальность темы. Гарантией качества лекарственных средств растительного происхождения является соблюдение на всех этапах сбора и обработки лекарственного растительного сырья (ЛРС) и производства фитопрепаратов правил организации производства и контроля качества лекарственных средств (GMP). Однако на практике ЛРС, соответствующее требованиям нормативной документации (НД) по всем показателям, нередко бракуют по микробиологической чистоте. Это же происходит с фитопрепаратами, которые могут контаминироваться от различных источников в ходе технологического процесса. Учитывая ограниченное количество экологически чистого ЛРС, несомненно актуальны исследования по достижению нормативной микробиологической чистоты изначально контаминированных микроорганизмами ЛРС и фитопрепаратов.
Одним из вариантов решения данной проблемы является бактерицидное и стерилизующее действие ионизирующей радиации (ускоренные электроны, гамма-излучение). Достоинствами радиационной деконтаминации (стерилизации) являются возможность облучения растительных объектов в регламентированной упаковке любого размера, исключающей их вторичную контаминацию при хранении и транспортировании; надежность обработки; простота и эффективность контроля протекания процесса; возможность обеззараживания термолабильных биологически активных веществ (БАВ) и фитопрепаратов.
Однако использование этого способа деконтаминации (стерилизации) возможно только в том случае, когда поглощенная доза радиации обеспечивает необходимую микробиологическую чистоту ЛРС и фитопрепаратов, но при этом не вызывает изменений их химических, фармакологических и других свойств. Поэтому для решения вопроса о возможности обеззараживания какого-либо вида ЛРС или фитопрепарата с помощью ионизирующей радиации необходимо исследовать радиационную стабильность комплекса (БАВ) данного сырья.
В доступной литературе информация о влиянии ионизирующей радиации на ЛРС и фитопрепараты крайне ограничена. В этой связи тема настоящего исследования представляется весьма актуальной.
Цель исследования: изучение влияния ионизирующего излучения на биологически активные комплексы лекарственного растительного сырья и оценка перспективности радиационной деконтаминации (стерилизации) на основе радиационно-химического, химического и фармакологического изучения стабильности биологически активных веществ.
Задачи исследования.
1. Изучить влияние ионизирующего излучения на качественный состав и количественное содержание биологически активных комплексов в исследуемом лекарственном растительном сырье.
2. Определить степень контаминации и качественный состав бактерий исследуемого лекарственного растительного сырья.
3. Оценить влияние ионизирующего излучения на специфическую эффективность биологически активных веществ в исследуемом лекарственном растительном сырье и водных извлечениях из него.
4. Установить зависимость микробиологической чистоты исследуемого ЛРС от поглощенной дозы гамма-излучения сразу после радиационной обработки и в процессе хранения.
5. Определить радиационно-химические выходы разложения и степени радиолитического разложения БАВ в водных извлечениях из исследуемого ЛРС в зависимости от поглощенной дозы гамма-излучения.
6. Определить минимальные дозы гамма-излучения, поглощение которых обеспечивает в условиях эксперимента нормативную микробиологическую чистоту исследуемого лекарственного растительного сырья.
7. Оценить возможность применения метода радиационной деконтаминации (стерилизации) лекарственного растительного сырья.
Научная новизна. Впервые изучено влияние высокоэнергетического гамма-излучения радиоактивного кобальта (60Со) на количественное содержание БАВ листьев дурмана обыкновенного (Datura stramonium L.); листьев белены черной (Hyoscyamus niger L.); листьев красавки (Atropa bella-donna L.s.l.); листьев мяты перечной (Mentha piperita L.); листьев шалфея лекарственного (Salvia officinalis L.); травы чабреца (тимьяна ползучего) (Thymus serpyllum L.); плодов шиповника майского (Rosa majalis Herrm.); плодов рябины обыкновенной (Sorbus aucuparia L.); плодов боярышника сглаженного (Crataegus laevigata Poir.); корневищ с корнями валерианы лекарственной (Valeriana officinalis L.); цветков ноготков лекарственных (Calendula officinalis L.).
Определена радиационная стабильность БАВ (тропановых алкалоидов, эфирных масел, аскорбиновой кислоты, сложных эфиров валереновой кислоты, флавоноидов, дубильных веществ) в указанных видах ЛРС. Показано, что поглощение энергии гамма-квантов в дозах до 25 кГр включительно не влияет на химический состав и фармакологические свойства БАВ в сырье. Установлено отсутствие радиационных постэффектов в гамма-облученном сухом ЛРС.
Оценена специфическая эффективность продуктов радиоиндуцированных превращений БАВ в водных извлечениях из исследуемого ЛРС. Выявлена зависимость радиационных повреждений БАВ от поглощенной дозы гамма-излучения. Определены радиационно-химические выходы разложения G (-M) БАВ. Показано, что радиационно-химические процессы, приводящие к разложению БАВ в исследованных водных извлечениях, протекают по нецепному механизму.
Практическая значимость. Результаты изучения физико-химических и фармакологических свойств ЛРС, содержащего тропановые алкалоиды, эфирные масла, флавоноиды, дубильные вещества, аскорбиновую кислоту, сложные эфиры валереновой кислоты, после радиационной обработки различными дозами фотонного излучения радиоактивного кобальта (60Co) показали возможность внедрения метода радиационной деконтаминации (стерилизации) радиостабильного ЛРС на промышленных предприятиях соответствующего профиля.
Определены дозы гамма-излучения, поглощение которых обеспечивает в условиях эксперимента стерильность (25 кГр) или частичное повышение микробиологической чистоты (для грибов - контаминантов от 2 до 5 кГр; бактерий - контаминантов – 10 кГр) листьев дурмана обыкновенного; листьев белены черной; листьев красавки; листьев мяты перечной; листьев шалфея лекарственного; травы чабреца (тимьяна ползучего); плодов шиповника майского; плодов рябины обыкновенной; плодов боярышника сглаженного; корневищ с корнями валерианы лекарственной; цветков ноготков лекарственных до уровней, установленных действующей НД. Одновременно выявлена бесперспективность радиационной деконтаминации (стерилизации) водных извлечений из ЛРС вследствие существенных радиационных повреждений БАВ.
Положения, выносимые на защиту.
1. Результаты изучения влияния ионизирующего излучения на качественный состав и количественное содержание биологически активных комплексов исследованного лекарственного растительного сырья.
2. Минимальные дозы гамма-излучения, обеспечивающие снижение микробной загрязненности исследованного ЛРС (листьев белены, дурмана, красавки, мяты, шалфея; цветков ноготков; травы чабреца; плодов боярышника, рябины, шиповника; корневищ с корнями валерианы) до нормативных показателей.
3. Значения степеней радиолитического разложения и радиационно- химических выходов разложения БАВ (тропановых алкалоидов, флавоноидов, эфирных масел, аскорбиновой кислоты, дубильных веществ, сложных эфиров валереновой кислоты) в зависимости от природы и концентрации БАВ в водных извлечениях.
4. Характер радиационно-химических превращений, протекающих в водных извлечениях из ЛРС при поглощении гамма-квантов.
5. Зависимость показателя деконтаминации ЛРС (Кд) от величины поглощенной дозы гамма-излучения в диапазоне до 5,0 кГр.
Внедрение результатов в практику. Материалы диссертационного исследования внедрены в учебный процесс Военно-медицинской академии им. С.М.Кирова (акт внедрения).
Апробация работы. Основные результаты доложены на IХ и XI Российских национальных конгрессах «Человек и лекарство» (М., 2002, 2004); юбилейной научной конференции, посвященной 25-летию открытия в Москве ЦНИИ рефлексотерапии (М., 2002); VI и VII Международных съездах «Актуальные проблемы создания новых лекарственных препаратов природного происхождения» (СПб-Пушкин, 2002, 2003, 2004); IV Международной научно-практической конференции «Здоровье и образование в XXI веке» (М., 2003); IV Всероссийской конференции молодых ученых (Саратов, 2003); V Всероссийской конференции по анализу объектов окружающей среды «Экоаналитика-2003» с международным участием (СПб, 2003); Научно-методической конференции «Состояние и перспективы подготовки специалистов для фармацевтической отрасли» (СП, 2004); Международной научно- практической конференции, посвященной 85-летию Санкт-Петербургской государственной химико-фармацевтической академии «Выпускник фармацевтического ВУЗа (факультета) в прошлом, настоящем и будущем» (СПб, 2004); Научно-методической конференции «Разработка, исследование и маркетинг новой фармацевтической продукции» (Пятигорск, 2006, 2007, 2012); Научно-практической конференции «Фармация из века в век» (СПб, 2008); Междунар. науч.-метод. конф. «Сандеровские чтения», посвященной памяти Ю.К. Сандера (СПб, 2012).
Личный вклад автора. Автору принадлежит ведущая роль в постановке задач исследования, выборе объектов исследования, проведении экспериментальных исследований, теоретических изысканиях, обобщению полученных данных. Автором проведена статистическая обработка полученных данных и результатов экспериментов. Автор разработал теорию радиационной деконтаминации (стерилизации) изученных объектов в зависимости от микробиологической загрязненности. Впервые показано влияние высокоэнергетического излучения на количественное содержание БАВ в ЛРС.
Соответствие диссертации паспорту научной специальности. Научные положения диссертации соответствуют формуле специальности 14.04.02 - «фармацевтическая химия, фармакогнозия». Результаты проведенного исследования соответствуют пунктам 1,2,6,7 паспорта фармацевтическая химия, фармакогнозия.
Связь задач исследования с проблемным планом. Диссертационная работа выполнена в соответствии с тематикой и планом научно-исследовательских работ Всероссийского научно-исследовательского института лекарственных и ароматических растений по «Плану Фундаментальных и приоритетных прикладных исследований Российской академии сельскохозяйственных наук по научному обеспечению развития АПК Российской Федерации на 2011-2015 гг.» раздел 04–13.
Публикации. По теме диссертации опубликовано 19 научных работ, в том числе 1 статья – в журнале, рецензируемом ВАК РФ, и 6 тезисов докладов в материалах международных конференций.
Объем и структура диссертации. Диссертация изложена на 135 страницах машинописного текста. Работа состоит из введения, обзора литературы (первая глава), экспериментальной части (вторая, третья, четвертая и пятая главы), общих выводов, списка литературы из 265 источников (из которых 97 зарубежные). Работа иллюстрирована 19 рисунками и 26 таблицами.
Основное содержание работы
Введение Обоснованы актуальность, научная новизна, практическая значимость работы и определены цель и основные задачи исследования.
Глава 1 Современные подходы к радиационной деконтаминации (стерилизации) лекарственных средств
Отражены радиационно-химические и радиобиологические аспекты радиационной деконтаминации (стерилизации) ЛС. Приведены данные о перспективах использования данного способа для достижения требуемой степени микробиологической чистоты различной фармацевтической продукции. Рассмотрены требования НД к микробиологической чистоте ЛРС. Представлен анализ современной отечественной и зарубежной литературы по механизмам радиационной деконтаминации, радиорезистентности микроорганизмов и др.
Глава 2 Материалы и методы экспериментальных исследований
Подробно описаны объекты и методы исследования.
- Глава 3 Исследование микробиологической чистоты лекарственного растительного сырья и фитопрепаратов после радиационной обработки
Изучена микробная загрязненность ЛРС до и после воздействия стерилизующей дозой гамма-излучения (25 кГр) с помощью установки «Исследователь» (табл. 1). Средняя мощность дозы гамма-излучения в рабочем объеме камеры составляла 42,5 Гр/мин. Величину поглощенной дозы варьировали в интервале от 0,5 до 25 кГр и контролировали ферросульфатным дозиметром.
Таблица 1 – Влияние гамма-излучения (доза 25 кГр)
на микробную загрязненность ЛРС
| Лекарственное растительное сырье | Количество жизнеспособных клеток в 1 г ЛРС | |||||||
| образцы исходные | образцы сразу после облучения | образцы после хранения в течение срока годности | ||||||
| исходные | облученные | |||||||
| бактерии | грибы | бактерии | грибы | бактерии | грибы | бактерии | грибы | |
| Плоды шиповника | 1,0103 | 1,7103 | <10 | <10 | 1,3103 | 3,7103 | <10 | <10 |
| Плоды рябины | 1,4103 | 30 | <10 | <10 | 2,3103 | <102 | <10 | <10 |
| Плоды боярышника | 8,5103 | <102 | <10 | <10 | 1,3103 | 40 | <10 | <10 |
| Цветки ноготков | 2,7107 | 1,2104 | <10 | <10 | 3,0107 | 3,0103 | 10 | <10 |
| Листья белены | 2,9107 | 0,8103 | <10 | <10 | 2,5103 | 3,0102 | <10 | <10 |
| Листья дурмана | 8,4106 | 8,0103 | <10 | <10 | 9,0106 | 104 | <10 | <10 |
| Листья красавки | 1,2106 | 2,0103 | <10 | <10 | 1,5106 | <103 | <10 | <10 |
| Листья шалфея | 6,8105 | 4,0103 | <10 | <10 | 7,0104 | <103 | <10 | <10 |
| Листья мяты | 1,2107 | 7,0103 | <10 | <10 | 2,0103 | <104 | 10 | <10 |
| Трава чабреца | 2,2106 | 4,7103 | <10 | <10 | 3,6105 | 1,3104 | <10 | <10 |
| Корневища с корнями валерианы | 1,0105 | 3,0105 | <10 | <10 | 3,0105 | 4,0103 | <10 | <10 |
Большинство исследованных образцов ЛРС изначально соответствуют требованиям НД по микробиологической чистоте (табл. 1). Мало контаминированы жизнеспособными клетками бактерий и грибов плоды боярышника, шиповника, рябины. Значительно большее количество жизнеспособных клеток бактерий и грибов содержат образцы трав и корней. В траве мяты, цветках ноготков и ромашки несколько превышен допустимый уровень бактерий. Все исходные образцы ЛРС не содержат условно-патогенных микроорганизмов. Для некоторых необлученных образцов установлено незначительное изменение числа жизнеспособных клеток бактерий и грибов после хранения в течение срока годности. В плодах боярышника, траве шалфея и чабреца снижается численность жизнеспособных бактерий, в листьях белены – грибов. Это согласуется с данными литературы о поведении микроорганизмов в объектах, содержащих незначительное количество свободной воды. В этих условиях микроорганизмы могут постепенно отмирать. Небольшое увеличение числа клеток для некоторых образцов в процессе хранения укладывается в предел ошибки микробиологических анализов (20 %).
Облучение дозой 25 кГр значительно уменьшило количество жизнеспособных клеток микроорганизмов в пересчете на 1,0 г ЛРС. Это проявилось в их отсутствии в смывах с образцов исследуемых видов ЛРС. Все облученные образцы практически полностью сохранили низкий уровень содержания микроорганизмов в течение всего периода хранения. Только в цветках ноготков и траве мяты обнаружены единичные жизнеспособные клетки микроорганизмов
Изучение качественного состава бактерий в исследуемом ЛРС по макро - и микроморфологическим характеристикам показало наличие следующих основных групп: нормальной микробиоты растений (грамотрицательные), спорообразующих (грамположительные) бактерий, плесневых грибов. Наибольшее количество споровых форм обнаружено в цветках ноготков. Грибы представлены традиционными для растительных объектов родами Aspergillus, Mucor, Penicillium, Trichoderma. Качественные характеристики микробиоты сырья обнаруживают ее случайный характер, не зависящий от вида ЛРС. Как указано выше, доза облучения 25 кГр является минимальной для обеспечения стерильности объекта. Деконтаминировать ЛРС до необходимого уровня микробиологической чистоты позволяют значительно меньшие дозы облучения, чем 25 кГр. Поэтому на следующем этапе изучена зависимость числа жизнеспособных клеток грибов и бактерий от дозы гамма-облучения ЛРС, различающиеся видами сырья (корни, цветки, трава и др.), содержанием групп БАВ (алкалоиды, флавоноиды и др.), исходным уровнем загрязнения (4107-1105). Закономерности деконтаминации ЛРС отражает зависимость lg N (число жизнеспособных клеток) от дозы облучения (рис. 1-2). Нами установлено, что в основном кривые зависимости радиоиндуцированного снижения числа жизнеспособных клеток микроорганизмов от дозы облучения носят квазиэкспоненциальный характер: с увеличением дозы постепенно уменьшается число клеток (рис. 2). Для цветков ноготков и листьев красавки кривая отмирания бактерий имеет сигмоидный вид, что отражает гибель наименее устойчивой части популяции в начальный период (рис. 1). Для всех образцов ЛРС наиболее интенсивно показатель деконтаминации изменяется при дозах облучения 0,5-1 кГр. Затем кривая практически выходит на плато (рис. 1-2). Во всех видах ЛРС грибы - контаминанты полностью инактивируются радиационной обработкой дозами 2-5 кГр, бактерии – контаминанты - 10 кГр.
Рисунок 1 – Численность микроорганизмов при радиационной деконтаминации цветков ноготков (А); листьев красавки (В): 1 – бактерий, 2 – грибов
Рисунок 2 - Численность микроорганизмов при радиационной деконтаминации травы чабреца (А); корневищ с корнями валерианы (В): 1 – бактерий, 2 – грибов
Эффективность радиационной деконтаминации ЛРС оценивали по показателю деконтаминации (Кд). Он рассчитан как отношение lg N (число погибших клеток) к величине поглощенной дозы гамма-излучения (табл. 2). Число погибших клеток рассчитывали как lg Nо - lg Nд, где Nо и Nд – содержание клеток в образцах соответственно до и после облучения.
Таблица 2 – Показатели деконтаминации ЛРС (Кд) в зависимости от дозы облучения
| Лекарственное растительное сырье | Показатель деконтаминации (Кд) при дозе гамма-излучения, кГр | |||||||||
| 0,0 | 0,5 | 1,0 | 2,5 | 5,0 | ||||||
| бактерии | грибы | бактерии | грибы | бактерии | грибы | бактерии | грибы | бактерии | грибы | |
| Цветки ноготков | 7,4 | 3,0 | 3,0 | 3,2 | 1,3 | 1,7 | 1,2 | - | 0,9 | - |
| Листья красавки | 6,6 | 3,8 | 4,2 | 2,6 | 2,2 | 1,8 | 0,9 | 0,8 | 0,9 | - |
| Трава чабреца | 5,9 | 3,7 | 3,6 | 2,7 | 1,1 | 1,4 | 1,0 | 1,1 | 0,8 | - |
| Корневища с корнями валерианы | 5,0 | 3,5 | 2,8 | 4,9 | 1,8 | - | 1,0 | - | 1,3 | - |
Облучение ЛРС минимальной дозой гамма-излучения (0,5 кГр) достоверно снижает численность бактерий и грибов (табл. 2), но снижение не пропорционально поглощенной дозе радиации. Наиболее заметно число клеток бактерий и грибов снижается при облучении ЛРС дозой 0,5 кГр. Доза гамма-излучения в 1 кГр снижает показатель Кд более чем в 2 раза (трава чабреца, корневища с корнями валерианы). При дальнейшем увеличении дозы гамма-излучения до 2,5 и 5 кГр выявленные закономерности сохраняются. Исключение составляют бактерии в цветках ноготков, отличающиеся повышенной устойчивостью к ионизирующему излучению из-за спорообразования. Показатель Кд увеличивается в интервале доз 0,5-2,5 кГр.
Проведенные исследования позволили определить дозы гамма-излучения, практически полностью инактивирующие смешанные популяции контаминантов исследуемого ЛРС. При облучении дозой 10 кГр в образцах не обнаруживаются жизнеспособные бактерии. Для губительного действия радиации на грибы достаточно дозы 5 кГр.
Глава 4 Фитохимическое исследование лекарственного растительного сырья и водных извлечений из него, подвергшихся воздействию ионизирующей радиации
Выявление возможного образования продуктов радиационно-химических превращений БАВ при радиационной деконтаминации исследуемого ЛРС проводили физико-химическими методами (ТСХ, ГЖХ, ИК - и ЯМР - спектроскопия).
На хроматограммах хлороформных извлечений из необлученного и облученного дозой 25 кГр ЛРС, содержащего тропановые алкалоиды, идентифицированы пятна скополамина и гиосциамина. Пятен продуктов радиолиза тропановых алкалоидов не обнаружено (табл.3).
В УФ свете на ТСХ спиртовых извлечений из образцов цветков ноготков до и после облучения дозами 10 и 25 кГр идентифицированы рутин (фиолетовое пятно; Rf 0,31±0,03), гиперозид (голубое пятно; Rf 0,92±0,03); травы чабреца - лютеолин (желтое пятно; Rf 0,40±0,03) и ряд дополнительных пятен; листьев мяты - 3 темных пятна, 2 из которых идентифицированы как лютеолин (Rf 0,88±0,02) и лютеолин-7-гликозид (Rf 0,57±0,02).
Таблица 3 – Результаты хроматографирования (ТСХ) образцов ЛРС
| Объект исследования | Система растворителей | Детекция пятен | Идентифицированы БАВ | ||
| Доза облучения | |||||
| 0 | 10 кГр | 25 кГр | |||
| Листья красавки | Метанол–хлороформ-аммиак (20:10:1) | Реактив Драгендорфа | скополамин; гиосциамин | ||
| Цветки ноготков | Изопропанол–хлороформ- -кислота уксусная ледяная (15:15:0,5) | УФ-облучение | рутин (фиолетовое пятно; Rf 0,31±0,03); гиперозид (голубое пятно; Rf 0,92±0,03) | ||
| Плоды боярышника | этилацетат–кислота муравьиная–вода (10:2:3) | УФ-облучение | рутин (фиолетовое пятно; Rf 0,31±0,03); гиперозид (голубое пятно; Rf 0,92±0,03); | ||
| Плоды рябины | этилацетат–кислота муравьиная – вода (10:2:3) | УФ-облучение | рутин (фиолетовое пятно; Rf 0,31±0,03); гиперозид (голубое пятно; Rf 0,92±0,03); | ||
| Трава чабреца | бензол–этилацетат-кисло- -та уксусная лед. (5:5:1) | УФ-облучение | лютеолин (желтое пятно; Rf 0,40±0,03); ряд дополнительных пятен | ||
| Листья мяты | этилацетат–кислота му- равьиная – вода (10:2:3) | УФ-облучение | Лютеолин (Rf 0,88±0,02); лютеолин-7-гликозид (Rf 0,57±0,02). | ||
| Корневища с корнями валерианы | гексан-метилэтилкетон (7:3) | Кислота уксусная лед. -кислота соляная конц. (25:36); 105-110 С (5-10 мин) | Красное пятно (Rf 0,35±0,02) Красное пятно (Rf 0,63±0,02) Розовое пятно (Rf 0,70±0,03) Сине-зеленое пятно (Rf 0,24±0,02) | ||
На хроматограммах корневищ с корнями валерианы идентифицированы 2 темно-красных пятна с Rf (0,35±0,02) и (0,63±0,02), розовое пятно с Rf (0,70±0,03) и сине-зеленое пятно с Rf (0,24±0,02). Хроматограммы облученных (доза 25 кГр) и необлученных образцов исследованных видов ЛРС не отличались друг от друга.
Для выявления возможных структурных изменений БАВ в исследуемом ЛРС (тропановые алкалоиды, флавоноиды, эфирные масла и др.), вызванных поглощением энергии гамма-излучения, предварительно были изучены ИК- и ЯМР- спектры некоторых фармацевтических субстанций, отвечающих требованиям НД. В качестве примера приведены ИК- и ЯМР- спектры атропина сульфата и скополамина гидробромида (рисунки 4-5), тимола (рисунки 6-7) до и после облучения.
ИК-спектры поглощения субстанций скополамина гидробромида и атропина сульфата до и после облучения совпадают по положению полос поглощения (по частотам) и их относительным интенсивностям и отражают отсутствие каких-либо изменений под воздействием гамма-излучения в дозе 25 кГр (рис. 4).
А. В.
Рисунок 4 – ИК-спектры субстанций скополамина гидробромида (А); атропина сульфата (В): 1 – до облучения, 2 – после гамма-облучения (доза 25 кГр)
Также установлена идентичность ЯМР - спектров на ядрах 1Н и 13С субстанции скополамина гидробромида до и после облучения: положение, форма и характер мультиплетности сигналов до и после облучения дозой 25 кГр совпадают (рис. 5). Это свидетельствует об отсутствии радиоиндуцированных изменений в радиационно-чувствительных функциональных группах тропановых алкалоидов и их высокой радиационной стабильности.
А. В.
Рисунок 5 – Спектры ЯМР 1Н субстанции скополамина гидробромида: (А) - после радиационной обработки (доза 25 кГр); (В) – до обработки
Рисунок 6 – ИК-спектры субстанции тимола: 1 – до облучения; 2 – после облучения (25 кГр)
А. В.
Рисунок 7 – Спектр ЯМР 1Н субстанции тимола: после радиационной обработки (доза 25 кГр) – (А); до облучения - (В)
На примере тимола установлено совпадение полос поглощения и относительных интенсивностей ИК-спектров (рис. 6) и отсутствие различий ЯМР-спектров (рис. 7) по положению, форме, и характеру мультиплетности сигналов необлученных и облученных (доза 25 кГр) образцов.
Методом ГЖХ в экспериментально подобранных оптимальных условиях изучен компонентный состав эфирных масел до и после радиационной деконтаминации ЛРС. Установлено, что доза облучения 25 кГр не приводит к появлению продуктов радиационно-химических превращений БАВ. Компонентный состав и количественное содержание каждого компонента эфирного масла шалфея (пинена, цинеола, ментола и тимола) практически не изменяются после воздействия стерилизующей дозы радиации. Аналогично методом ГЖХ показано отсутствие продуктов радиолиза в эфирных маслах листьев мяты перечной и травы чабреца, полученных из ЛРС до и после облучения стерилизующей дозой гамма-излучения.
Количественное определение БАВ описанными в НД методами показало достаточно высокую устойчивость ЛРС к радиационной деконтаминации (табл.4).
Таблица 4 – Зависимость количественного содержания БАВ от дозы излучения
| Исследуемое сырье | Поглощенная доза гамма-излучения, кГр | |||
| 0 | 10 | 25 | ||
| Тропановые алкалоиды (в пересчете на гиосциамин), % (метод обратной алкалиметрии после соответствующей очистки) | ||||
| Листья красавки | 0,33±0,01 | 0,32±0,01 | 0,32±0,01 | |
| Листья дурмана | 0,27±0,02 | 0,27±0,01 | 0,27±0,01 | |
| Листья белены | 0,06±0,01 | 0,06±0,01 | 0,06±0,01 | |
| Эфирные масла, % (ГФ, метод 1) | ||||
| Листья мяты | 1,26±0,10 | 1,20±0,11 | 1,21±0,09 | |
| Листья шалфея | 1,96±0,10 | 1,90±0,07 | 1,95±0,17 | |
| Трава чабреца | 0,92±0,04 | 0,92±0,03 | 0,92±0,04 | |
| Флавоноиды, % (Е-вариант дифференциальной спектрофотометрии по реакции с алюминия хлоридом) | ||||
| Цветки ноготков | 1,76±0,03 | 1,76±0,03 | 1,66±0,02 | |
| Листья мяты | 1,94±0,08 | 1,92±0,08 | 1,82±0,08 | |
| Плоды рябины | 0,37±0,01 | 0,34±0,01 | 0,34±0,01 | |
| Плоды боярышника | 0,12±0,01 | 0,12±0,01 | 0,12±0,01 | |
| Трава чабреца | 1,14±0,03 | 1,14±0,03 | 1,02±0,03 | |
| Дубильные вещества, % (метод перманганатометрии) | ||||
| Листья шалфея | 4,70±0,10 | 4,80±0,10 | 4,40±0,10 | |
| Аскорбиновая кислота, % (титрование 2,6-дихлорфенолиндофенолятом натрия) | ||||
| Плоды шиповника | 0,83±0,02 | 0,84±0,02 | 0,80±0,02 | |
| Сложные эфиры в пересчете на этиловый эфир валереновой кислоты, % (спектрофотометрия по реакции с гидроксиламином и железа (III) хлоридом) | ||||
| Корневища с корнями валерианы | 2,62±0,11 | 2,45±0,09 | 2,20±0,08 | |
| Экстрактивные вещества, % (метод гравиметрии) | ||||
| Цветки ноготков | 44,42±0,90 | 43,93±1,30 | 42,04±1,00 | |
| Корневища с корнями валерианы | 32,71±0,73 | 32,32±0,83 | 30,92±0,73 | |
| Трава чабреца | 22,82±0,53 | 22,43±0,62 | 21,60±0,52 | |
| Плоды рябины | 37,03±0,62 | 34,03±0,53 | 31,90±0,50 | |
Доза гамма-излучения 10 кГр не изменяет количественное содержание БАВ, но не создает нормативную микробиологическую чистоту. В то же время стерилизующая доза гамма-излучения 25 кГр не влияет на количественное содержание БАВ (табл.4).
В отличие от ЛРС, водные извлечения из ЛРС обладают относительно высокой радиационной чувствительностью. На хроматограммах настоя красавки после облучения наряду с исходными тропановыми алкалоидами обнаружены от одного до трех азотсодержащих продукта радиолиза. Один из них идентифицирован как спирт тропин, что подтверждает данные литературы о радиоиндуцированной деструкции тропановых алкалоидов по сложноэфирной связи с образованием соответствующего аминоспирта и троповой кислоты. Одновременно протекают и другие реакции, не затрагивающие сложноэфирную группировку.
Для изучения радиационного воздействия определяли количественное содержание БАВ до и после гамма-облучения водных извлечений из ЛРС дозами 0,5 и 10 кГр. Результаты использовали для расчета степени радиолитического разложения БАВ и радиационно-химического выхода разложения G (-M) (табл. 5).
Таблица 5 – Зависимость степени радиолитического разложения и радиационно-химический выход разложения БАВ G (-M) от дозы гамма-излучения
| Водное извлечение из ЛРС | Поглощенная доза гамма-излучения, кГр | |||
| 0,5 | 10 | |||
| Степень радиолитического разложения, % | G(-M), мол./100 эВ | Степень радиолитического разложения, % | G(-M), мол./100 эВ | |
| Тропановые алкалоиды в пересчете на гиосциамин, % (метод экстракционной фотометрии по реакции с метиловым оранжевым) | ||||
| Листья дурмана, настой | 13,0 ± 0,4 | 3,61 | 34,9 ± 0,8 | 0,50 |
| Листья красавки, настой | 11,4 ± 0,3 | 3,22 | 29,9 ± 0,7 | 0,41 |
| Листья белены, настой | 45,7 ± 0,6 | 12,73 | 100,0±0,4 | - |
| Эфирные масла, % (ГФ, метод 1) | ||||
| Трава чабреца, настой | 15,5±0,4 | 9,87 | 67,4±0,9 | 2,14 |
| Листья эвкалипта, настой | 6,1±0,2 | 7,65 | 14,2±0,4 | 0,89 |
| Листья мяты, настой | 7,5±0,2 | 9,14 | 18,0±0,5 | 1,10 |
| Листья шалфея, настой | 8,7±0,3 | 8,77 | 46,5±0,6 | 2,39 |
| Флавоноиды, % (Е- метод дифференциальной спектрофотометрии по реакции с алюминия хлоридом) | ||||
| Плоды рябины, отвар | 28,6 ± 0,7 | 3,58 | 61,4 ± 0,9 | 0,38 |
| Плоды боярышника, настой | 39,6 ± 0,8 | 1,62 | 73,6 ± 0,9 | 0,15 |
| Цветки ноготков, настой | 10,0 ± 0,3 | 5,95 | 32,2 ± 0,7 | 0,96 |
| Трава чабреца, настой | 12,0 ± 0,3 | 4,64 | 40,1 ± 0,8 | 0,77 |
| Листья мяты, настой | 8,5 ± 0,3 | 5,71 | 25,6 ± 0,7 | 0,86 |
| Дубильные вещества, % (метод перманганатометрии в модификации Е.И.Саканян) | ||||
| Листьев шалфея, отвар | 5,3 ± 0,7 | 3,08 | 12,9 ± 0,8 | 0,37 |
| Аскорбиновая кислота (титрование 2,6-дихлорфенолиндофенолятом натрия) | ||||
| Плоды шиповника, отвар | 32,7±0,8 | 6,94 | 85,4±1,1 | 0,91 |
| Сложные эфиры валереновой кислоты (спектрофотометрия по реакции с гидроксиламином и железа (III) хлоридом) | ||||
| Корневища с корнями валерианы, настой | 5,9±0,2 | 5,66 | 15,7±0,4 | 0,76 |
Установлена относительно высокая радиационная чувствительность БАВ во всех водных извлечениях (табл. 5). Гамма-излучение дозой 0,5 кГр разлагает от (39,6±0,8)% до (5,3±0,7)% БАВ в зависимости от ЛРС. Доза гамма-излучения 10 кГр значительно снижает содержания БАВ во всех водных извлечениях. Радиационно-химические выходы разложения БАВ в водных извлечениях при дозе гамма- излучения 0,5 кГр не превышают 10 мол./100 эВ и свидетельствуют о нецепном механизме радиационно-химических превращений.
Доза радиации 10 кГр в несколько раз снижает радиационно-химические выходы разложения БАВ в водных извлечениях из ЛРС из-за накопления при относительно высоких дозах ионизирующей радиации достаточно больших количеств продуктов радиолиза, способных участвовать в последующих радиационно-химических процессах. При всех исследованных дозах гамма-излучения степень радиолитического разложения БАВ в облученных водных извлечениях была тем выше, чем ниже их начальная концентрация в каждом необлученном водном извлечении.
Определение товароведческих показателей ЛРС «Зола общая» и «Влажность» (табл.6) показало, что они практически не изменяются до и после облучения дозами 10 и 20 кГр, обеспечивающими соответственно деконтаминацию и стерилизацию.
Таблица 6 – Влияние облучения на товароведческие показатели качества ЛРС
| Лекарственное растительное сырье | До облучения | После облучения | |
| доза 10 кГр | доза 20 кГр | ||
| «Влажность», % | |||
| Корневища с корнями валерианы | 7,26±0,11 | 7,15±0,14 | 7,22±0,10 |
| Листья белены | 6,75±0,12 | 6,82±0,10 | 6,68±0,14 |
| Листья дурмана | 6,85±0,11 | 6,74±0,11 | 6,79±0,10 |
| Листья красавки | 7,11±0,14 | 6,95±0,14 | 6,86±0,11 |
| Листья мяты перечной | 9,57±0,20 | 9,62±0,20 | 9,53±0,20 |
| Листья шалфея | 6,46±0,12 | 6,32±0,10 | 6,37±0,10 |
| Плоды боярышника | 6,53±0,13 | 6,44±0,13 | 6,38±0,12 |
| Плоды рябины | 10,63±0,14 | 10,20±0,14 | 10,23±0,11 |
| Плоды шиповника | 9,28±0,15 | 9,02±0,18 | 9,16±0,20 |
| Трава чабреца | 7,46±0,10 | 7,52±0,15 | 7,38±0,12 |
| Цветки ноготков | 7,21±0,11 | 7,26±0,15 | 7,17±0,12 |
| «Зола общая», % | |||
| Корневища с корнями валерианы | 12,56±0,15 | 12,28±0,11 | 12,32±0,18 |
| Листья белены | 15,26±0,11 | 15,38±0,18 | 15,12±0,15 |
| Листья дурмана | 11,26±0,18 | 11,28±0,15 | 11,74±0,20 |
| Листья красавки | 12,32±0,15 | 12,05±0,12 | 12,25±0,10 |
| Листья мяты | 9,14±0,15 | 8,65±0,17 | 8,78±0,15 |
| Листья шалфея | 9,75±0,13 | 9,76±0,15 | 9,56±0,17 |
| Плоды боярышника | 2,58±0,25 | 2,88±0,10 | 2,67±0,15 |
| Плоды рябины | 2,96±0,20 | 2,87±0,15 | 3,01±0,12 |
| Плоды шиповника | 3,31±0,15 | 2,98±0,15 | 3,14±0,12 |
| Трава чабреца | 6,60±0,15 | 6,50±0,12 | 6,35±0,14 |
| Цветки ноготков | 7,27±0,20 | 7,32±0,14 | 7,17±0,12 |
- Таким образом, отсутствие заметных различий в количественном содержании БАВ до и после облучения исследованного ЛРС дозой 25 кГр указывает на возможность радиационной деконтаминации (стерилизации). Относительно высокая радиационная чувствительность водных извлечений из ЛРС делает их радиационную деконтаминацию (стерилизацию) мало перспективной.
Глава 5 Фармакологическое исследование лекарственного растительного сырья и водных извлечений из него, подвергшихся воздействию гамма-излучения
На модели острой интоксикации мышей аминостигмином изучена радиационная стабильность тропановых алкалоидов в ЛРС и водных извлечениях. Установлено, что ЛРС до и после облучения проявляют высокую специфическую холинолитическую защитную активность при острой интоксикации животных (табл. 8).
Таблица 8 - Влияние дозы излучения на защитную активность ЛРС и водных извлечений, содержащих тропановые алкалоиды, при острой интоксикации мышей
аминостигмином
| Исследуемое ЛРС (препарат) | Доза гамма- излучения, кГр | LD50 аминостигмина на фоне введения алкалоидов из сырья (препарата), мг/кг | Коэффициент защиты животных |
| Листья дурмана | 0 | 1,73 (1,54±1,92) | 7,86 |
| Листья дурмана | 25 | 1,82 (1,59±2,04) | 8,27 |
| Листья дурмана, настой | 0 | 1,78 (1,57±1,99) | 8,09 |
| Листья дурмана, настой | 0,5 | 1,43 (1,23±1,62) | 6,50 |
| Листья дурмана, настой | 10 | 1,21 (0,98±1,42)* | 5,50* |
| Листья белены | 0 | 1,05 (0,89±1,19) | 4,77 |
| Листья белены | 25 | 0,98 (0,82±1,12) | 4,45 |
| Листья белены, настой | 0 | 0,77 (0,62±0,92) | 3,5 |
| Листья белены, настой | 0,5 | 0,44 (0,40±0,49)* | 2,0* |
| Листья белены, настой | 10 | 0,28 (0,24±0,32)* | 1,27* |
| Листья красавки | 0 | 1,86 (1,61±2,01) | 8,45 |
| Листья красавки | 25 | 1,91 (1,64±2,16) | 8,68 |
| Листья красавки, настой | 0 | 1,77 (1,62±1,99) | 8,04 |
| Листья красавки, настой | 0,5 | 1,47 (1,25±1,58)* | 6,68* |
| Листья красавки, настой | 10 | 1,26 (1,06±1,46)* | 5,72* |
| Примечание: (n=6); * - отличия достоверны (Р0,05) по сравнению с необлученным настоем | |||
Наиболее выражено протекторное действие листьев красавки, наименее – листьев белены. Введение мышам, отравленным аминостигмином, водных извлечений из нативного и гамма-облученного ЛРС (доза 25 кГр) значительно повышает LD50 аминостигмина и КЗ животных. Однако воздействие даже небольшой дозы гамма-излучения (0,5 кГр) на водные извлечения из ЛРС снижает LD50 аминостигмина и КЗ животных. Степень инактивации образцов возрастает с повышением поглощенной дозы радиации, что, по-видимому, обусловлено радиационно-химическими превращениями тропановых алкалоидов в водных извлечениях из-за протекания радикал-радикальных, радикал-молекулярных и других процессов.
Противомикробную активность ЛРС и водных извлечений из него до и после гамма-облучения определяли на модели неклостридиальной анаэробной инфекции, вызванной В.fragilis (штамм 2393) на беспородных белых мышах-самцах (табл. 9).
Таблица 9 - Влияние дозы излучения на защитную эффективность ЛРС и водных извлечений при неклостридиальной анаэробной инфекции у мышей, вызванной В.fragilis (n=6)
| Лекарственное растительное сырье (препарат) | Поглощенная доза гамма-излучения, кГр | Выживаемость животных, % |
| Физиологический раствор (контроль) | 0 | 40 |
| Листья шалфея | 0 | 80* |
| Листья шалфея | 25 | 70* |
| Листья шалфея, отвар | 0 | 80* |
| Листья шалфея, отвар | 0,5 | 50 |
| Листья шалфея, отвар | 10 | 30 |
| Физиологический раствор (контроль) | 0 | 50 |
| Трава чабреца | 0 | 80* |
| Трава чабреца | 25 | 80* |
| Листья шалфея, настой | 0 | 90* |
| Листья шалфея, настой | 0,5 | 40 |
| Листья шалфея, настой | 10 | 30 |
| Примечание: * - отличия достоверны (Р0,05) по сравнению с соответствующим контролем | ||
Установлено (табл. 9), что ЛРС после воздействия гамма-излучения в дозах до 25 кГр полностью сохраняют протекторное действие при экспериментальной неклостридиальной инфекции у мышей, вызванной В.fragilis. Однако водные извлечения из ЛРС существенно снижают защитную эффективность вплоть до полной инактивации (доза 10 кГр) из-за протекания радикал-молекулярных, радикал-радикальных и других радиационно-химических процессов.
Таблица 10 - Влияние дозы излучения на противовоспалительную эффективность ЛРС и водных извлечений из него при воспалении, вызванном конканавалином А у мышей (n=10)
| Лекарственное растительное сырье (препарат) | Доза гамма-излучения, кГр | Индекс реакции воспаления, % |
| Физиологический раствор (контроль) | 0 | 70±2,6 |
| Цветки ноготков | 0 | 36±1,8* |
| Цветки ноготков | 25 | 32±1,5* |
| Цветки ноготков, настой | 0 | 41±2,3* |
| Цветки ноготков, настой | 0,5 | 58±2,8 |
| Цветки ноготков, настой | 10 | 64±3,0 |
| Физиологический раствор (контроль) | 0 | 62±3,2 |
| Плоды рябины | 0 | 40±2,3* |
| Плоды рябины | 25 | 39±2,6* |
| Плоды рябины, отвар | 0 | 43±3,0* |
| Плоды рябины, отвар | 0,5 | 51±2,9 |
| Плоды рябины, отвар | 10 | 60±3,4 |
| Примечание: * - отличия достоверны (Р0,05) по сравнению с соответствующим контролем | ||
Противовоспалительное действие ЛРС и водных извлечений из него до и после облучения определяли методом отека лапы мыши на введение конканавалина А (Кон А) (табл. 10). Рассчитанные индексы реакции воспаления отражают отсутствие достоверных различий в противовоспалительной активности необлученных и облученных образцов ЛРС даже после поглощения стерилизующей дозы гамма-излучения (25 кГр). При этом доза ионизирующей радиации 0,5 кГр значительно снижает противовоспалительную активность водных извлечений из ЛРС, а 10 кГр практически полностью инактивирует БАВ вследствие реакций с продуктами радиолиза воды.
- Антиаритмическую активность до и после воздействия ионизирующей радиации на ЛРС и водные извлечения из него изучали на крысах по данным электрокардиографии: длительность аритмии, частота возникновения фибрилляции, время наступления гибели, исход аритмий (выживаемость), используя модели хлоркальциевой и аконитиновой аритмий (табл. 11, 12).
Таблица 11 - Влияние дозы излучения на антиаритмическую активность
плодов боярышника и настоев из них при хлоркальциевой аритмии (n=6)
| ЛРС (препарат), доза облучения | В Восстановление синусового ритма, % | Длительность аритмии, с | Гибель, % | Частота фибрил-ляции, % | Время наступле- ния гибели, с |
| Кальция хлорид, 250,0 мг/кг | 17 | 210,0±50,0 | 83 | 83 | 75,6±14,2 |
| Плоды боярышника необлученные | 33 | 129,0±38,2* | 83 | 33 | 115,8±26,6* |
| Плоды боярышника (доза 25 кГр) | 17 | 118,0±42,8 | 83 | 33 | 126,0±34,0* |
| Плоды боярышника, настой необлученный | 33 | 112,0±46,3 | 67 | 33 | 141,8±35,6* |
| Плоды боярышника, настой (доза 5 кГр) | 17 | 169,0±32,6 | 67 | 50 | 97,5±19,2 |
| Плоды боярышника, настой (доза 25 кГр) | 17 | 180,0±35,3 | 83 | 83 | 86,3±20,5 |
| Примечание: * - отличия достоверны (Р0,05) по сравнению с контролем | |||||
Таблица 12 - Влияние дозы излучения на антиаритмическую активность
плодов боярышника и настоев из них при аконитиновой аритмии у крыс (n=6)
| ЛРС (препарат), доза облучения | Частота разви- тия аритмии, % | Длительность латентного периода, с | Длительность аритмии, с | Гибель, % | Время наступле- ния гибели, с |
| Аконитин, 35,0 мг/кг | 67 | 170,0±30,6 | 1080,0±108,2 | 33 | 1370,0±211,0 |
| Плоды боярышника, необлученные | 50 | 250,0±22,8* | 820,0±22,8* | 17 | 2190,0±160,4* |
| Плоды боярышника, 25 кГр | 67 | 285,0±22,8 | 910,0±22,8 | 17 | 1980,0±242,8* |
| Плоды боярышника, настой необлученный | 67 | 225,0±22,8 | 810,0±22,8 | 17 | 2210,0±234,0* |
| Плоды боярышника, настой, 10 кГр | 83 | 205,6±22,8 | 980±22,8 | 33 | 1620,0±186,8 |
| Плоды боярышника, настой, 25 кГр | 83 | 188,8±22,8 | 1120,0±22,8 | 36 | 1458±162,6 |
| Примечание: * - отличия достоверны (Р0,05) по сравнению с контролем | |||||
Установлено (табл. 11), что в контрольной группе животных после введения кальция хлорида возникала аритмия в виде политопной экстрасистолии, переходившей в 83 % случаев в фибрилляцию желудочков. У 17 % животных синусовый ритм восстанавливался самостоятельно через 210 с. Плоды боярышника до и после облучения дозами до 25 кГр проявляют защитную эффективность при хлоркальциевой аритмии, сокращая длительность аритмии, восстанавливая синусовый ритм, отодвигая сроки гибели животных, уменьшая частоту возникновения фибрилляций.
Данные табл. 12 показывают, что необлученное и радиостерилизованное ЛРС не предотвращает аритмию и гибель животных, но заметно удлиняет латентный период и замедляет гибель животных. Плоды боярышника после гамма-облучения в дозах до 25 кГр практически полностью сохраняют антиаритмическое действие. Однако воздействие ионизирующей радиации на настои из плодов боярышника снижает противоаритмическую активность. Все показатели при использовании радиостерилизованного настоя не отличаются от контрольной группы животных.
- Изучение адаптационной (актопротекторной) активности ЛРС и водных извлечений из него по общей физической выносливости, отражающей аэробные процессы, показало, что ЛРС до и после гамма-облучения значительно стимулирует общую физическую работоспособность животных (табл. 13).
- Даже поглощение стерилизующей дозы радиации (25 кГр) почти не влияет на способность повышать общую, скоростную и силовую выносливость животных и отражает высокую радиационную стабильность БАВ плодов шиповника и рябины.
- Вместе с тем показатели физической выносливости животных заметно снижаются после гамма-облучения (0,5-10 кГр) отваров из ЛРС и свидетельствуют о радиоиндуцированном снижении актопротекторного эффекта за счет взаимодействия БАВ с продуктами радиолиза воды.
Таблица 13 - Влияние дозы излучения на актопротекторную эффективность плодов
шиповника, плодов рябины и отваров из них у мышей (n=6)
| Лекарственное растительное сырье (препарат) | Доза гамма-облучения, кГр | Средняя продолжительность физической нагрузки, мин | ||
| плавание | бег в третбане | вис на шесте | ||
| Физиологический раствор (контроль) | 0 | 4,62±0,42 | 6,36±0,80 | 6,80±1,74 |
| Плоды шиповника | 0 | 6,40±0,44* | 10,23±1,72* | 14,23±2,25* |
| Плоды шиповника | 25 | 6,52±0,32* | 8,94±1,17* | 12,46±1,18* |
| Плоды шиповника, отвар | 0 | 6,22±0,36* | 9,32±1,46* | 12,88±2,06* |
| Плоды шиповника, отвар | 0,5 | 5,20±0,54 | 7,12±1,40 | 9,72±1,25 |
| Плоды шиповника, отвар | 10 | 5,06±0,34 | 6,88±0,98 | 7,52±2,10 |
| Физиологический раствор (контроль) | 0 | 5,20±0,67 | 7,28±0,64 | 6,23±1,46 |
| Плоды рябины | 0 | 9,05±1,89* | 12,32±0,68* | 12,66±2,84* |
| Плоды рябины | 25 | 8,82±0,48* | 13,14±1,60* | 12,70±2,10* |
| Плоды рябины, отвар | 0 | 9,20±2,02* | 11,68±1,92* | 11,80±2,53* |
| Плоды рябины, отвар | 0,5 | 7,20±0,32* | 8,21±1,08 | 10,50±2,28* |
| Плоды рябины, отвар | 10 | 4,96±0,65 | 8,73±0,72 | 8,20±2,60 |
| Примечание: * - отличия достоверны (Р0,05) по сравнению с соответствующим контролем | ||||
- Седативную эффективность ЛРС и настоев из них до и после облучения изучали с помощью теста «открытое поле». У всех животных наблюдали развитие тормозных процессов в ЦНС, проявлявшееся в угнетении спонтанной двигательной активности, снижении уровня тревожности и ситуации новизны обстановки (табл. 14).
Таблица 14 – Зависимость уровня тревожности и эмоциональной
реактивности у крыс от дозы гамма-облучения ЛРС и настоев из них (n=6)
| ЛРС (препарат) | Доза, кГр | Этологические показатели, M ± m | ||||
| Ц | СИД | ГР | БОЛ | П | ||
| Физиологический раствор (контроль) | 0 | 1,571±0,318 | 0,013±0,010 | 0,04±0,01 | 2,71±0,88 | 45,7±4,1 |
| Листья мяты | 0 | 1,923±0,742* | 0,046±0,010 | 0,09±0,02* | 3,91±1,18 | 30,3±5,2* |
| Листья мяты | 25 | 1,784±0,521* | 0,038±0,005 | 0,10±0,03* | 2,75±0,92 | 35,8±4,1* |
| Листья мяты, настой | 0 | 1,827±0,114* | 0,044±0,017 | 0,09±0,03* | 2,89±0,97 | 34,0±5,3* |
| Листья мяты, настой | 0,5 | 1,360±0,088 | 0,025±0,021 | 0,06±0,02 | 1,43±0,53 | 42,1±5,8 |
| Листья мяты, настой | 10 | 1,140±0,076 | 0,022±0,019 | 0,07±0,01 | 1,41±0,76 | 47,1±6,9 |
| Физиологический раствор (контроль) | 0 | 1,000±0,180 | 0,01±0,008 | 0,06±0,008 | 1,13±0,81 | 48,8±9,9 |
| Трава чабреца | 0 | 1,623±0,162* | 0,02±0,009 | 0,03±0,006 | 1,61±0,98 | 34,6±4,1 |
| Трава чабреца | 25 | 1,784±0,191* | 0,03±0,005 | 0,03±0,009 | 1,75±0,81 | 31,1±3,8 |
| Трава чабреца, настой | 0 | 1,527±0,211* | 0,03±0,007 | 0,04±0,007 | 1,23±0,77 | 34,0±5,3 |
| Трава чабреца, настой | 0,5 | 1,260±0,128 | 0,02±0,008 | 0,05±0,004 | 1,32±0,58 | 38,6±6,4 |
| Трава чабреца, настой | 10 | 1,140±0,176 | 0,02±0,005 | 0,06±0,009 | 1,12±0,98 | 45,6±7,4 |
| Физиологический раствор (контроль) | 0 | 1,143±0,102 | 0,025±0,009 | 0,05±0,01 | 1,29±0,84 | 33,0±7,3 |
| Плоды боярышника | 0 | 1,324±0,132 | 0,032±0,008 | 0,03±0,01 | 1,42±0,73 | 28,6±4,1 |
| Плоды боярышника | 25 | 1,404±0,156* | 0,037±0,005 | 0,03±0,02 | 1,60±0,88 | 24,2±2,6 |
| Плоды боярышника, настой | 0 | 1,383±0,181 | 0,034±0,006 | 0,04±0,02 | 1,53±0,67 | 26,7±3,3 |
| Плоды боярышника, настой | 0,5 | 1,156±0,142 | 0,027±0,009 | 0,04±0,01 | 1,38±0,65 | 30,2±6,2 |
| Плоды боярышника, настой | 10 | 1,212±0,164 | 0,022±0,008 | 0,05±0,02 | 1,26±0,90 | 35,8±5,3 |
| Физиологический раствор (контроль) | 0 | 1,125±0,245 | 0,024±0,009 | 0,09±0,01 | 0,75±0,08 | 47,1±3,8 |
| Корневища с корнями валерианы | 0 | 1,825±0,168* | 0,040±0,008 | 0,11±0,03* | 0,91±0,02 | 30,3±5,2* |
| Корневища с корнями валерианы | 25 | 1,784±0,218* | 0,035±0,005 | 0,12±0,03* | 0,75±0,07 | 35,8±4,1* |
| Корневища с корнями валерианы, настой | 0 | 1,627±0,106* | 0,049±0,007 | 0,10±0,01* | 0,89±0,18 | 34,0±5,3* |
| Корневища с корнями валерианы, настой | 0,5 | 1,252±0,264 | 0,023±0,009 | 0,05±0,01 | 1,43±0,53 | 42,1±5,8 |
| Корневища с корнями валерианы, настой | 10 | 1,180±0,189 | 0,026±0,006 | 0,04±0,01 | 1,41±0,48 | 47,1±6,9 |
| Примечания: * - отличия достоверны (Р0,05) относительно соответствующего контроля СИД – частота возникновения реакции замирания; ГР – частота реакции груминга; Ц – количество заходов в центр поля; БОЛ – количество болюсов; П – число продемонстрированных поз | ||||||
Необлученное и облученное ЛРС достоверно изменяет паттерн поведения крыс относительно контрольной группы. Количество пересеченных квадратов, подъемов на задние лапы, локомоций и уровень активности уменьшается по сравнению с контролем соответственно на (32,9–36,2) %, (37,4–41,9) % и 30,4 %. Интегральный показатель общей активности животных ниже, чем в контрольной группе на (17,4–18,9) %.
Радиационное воздействие на ЛРС в дозах до 25 кГр практически не влияет на двигательную и исследовательскую активность крыс. Для радиостерилизованных и необлученных видов ЛРС количество локомоций, заходов в центр поля, частота возникновения вертикальных стоек, заглядываний в «норки», реакций груминга, возникновения реакции замирания и другие этологические показатели достоверно не отличаются друг от друга. В то же время указанные показатели водных извлечений из ЛРС после воздействия гамма-излучения в дозе 25 кГр снижаются по сравнению с контролем соответственно на 38,9 %, 49,0 % и 20,6 %, а показатель количества заходов в центр поля возрастает на 78,4 %.
Из результатов таблицы 14 следует, что ЛРС обладает достаточно выраженной седативной активностью даже после воздействия гамма-излучения в дозах до 25 кГр и подтверждает возможность применения радиационной деконтаминации и стерилизации. Однако сопоставление результатов фармакологического исследования настоев из облученного и необлученного ЛРС свидетельствует об отсутствии у продуктов радиолиза БАВ седативного эффекта и указывает на относительно высокую радиационную чувствительность настоев из травы чабреца, листьев мяты, корневищ с корнями валерианы и плодов боярышника. Поэтому радиационная деконтаминация и стерилизация указанных водных извлечений представляется малоперспективной.
Антигипоксическую активность ЛРС и отвары из них до и после воздействия гамма-излучения изучали на модели острой гипобарической гипоксии в опытах на белых беспородных мышах (табл. 15)..
Таблица 15 - Антигипоксическая активность у мышей (n=6) в зависимости от дозы облучения образцов ЛРС и водных извлечений из них
| ЛРС (препарат) | Доза гамма- излучения, кГр | Выживаемость животных, % | Средняя продолжительность жизни, мин |
| Физиологический раствор (контроль) | 0 | 17 | 4,16±0,82 |
| Плоды шиповника | 0 | 50* | 7,17±2,14* |
| Плоды шиповника | 25 | 33 | 6,53±1,06* |
| Плоды шиповника, отвар | 0 | 33 | 6,96±0,78* |
| Плоды шиповника, отвар | 0,5 | 17 | 4,66±0,88 |
| Плоды шиповника, отвар | 10 | 17 | 4,36±1,25 |
| Физиологический раствор (контроль) | 0 | 0 | 3,89±0,92 |
| Плоды рябины | 0 | 33 | 6,86±1,44* |
| Плоды рябины | 25 | 33 | 5,87±0,84* |
| Плоды рябины, отвар | 0 | 50* | 7,02±1,18* |
| Плоды рябины, отвар | 10 | 0 | 4,94±0,86 |
| Плоды рябины, отвар | 25 | 17 | 4,21±1,24 |
| Примечание: * - отличия достоверны (Р0,05) по сравнению с соответствующим контролем | |||
Установлено (табл. 15), что радиационное воздействие в дозах до 25 кГр практически не влияет на антигипоксическую активность всех исследованных образцов ЛРС. При этом наиболее выраженное антигипоксическое действие проявляют плоды шиповника. В то же время воздействие даже относительно небольшой дозы гамма-излучения (0,5 кГр) на настои из ЛРС снижает выживаемость мышей и среднюю продолжительность жизни. Облучение гамма-квантами в большей дозе приводит к дальнейшему сокращению указанных показателей
Таким образом, результаты экспериментальных исследований на животных подтверждают возможность применения методов радиационной деконтаминации (стерилизации) исследованного ЛРС. Вместе с тем фармакологические исследования указывают на относительно высокую радиационную чувствительность водных извлечений из всех видов исследованного ЛРС. По этой причине их непосредственная радиационная деконтаминация (стерилизация) малоперспективна и требует специальных условий облучения для обеспечения устойчивости БАВ.
- ОБЩИЕ ВЫВОДЫ
1. Изучено влияние ионизирующего излучения на качественный состав и количественное содержание биологически активных комплексов и товароведческие показатели (влажность и общая зола) исследованного ЛРС. Установлено, что поглощение энергии гамма-квантов в дозах, не превышающих стерилизующую (25 кГр), практически не изменяет состав биологически активных комплексов ЛРС.
2. Определена степень контаминации и качественный состав бактерий исследованного ЛРС. Показано что качественный состав бактерий носит случайный характер и представлен нормальной микробиотой растений (грамотрицательные), спорообразующими (грамположительные) бактериями, плесневыми грибами.
3. Установлено сохранение специфической активности биологически активных веществ в лекарственном растительном сырье под действием стерилизующих доз ионизирующего излучения. Водные извлечения из ЛРС после облучения минимальными дозами гамма-излучения (0,5 кГр) не обладают характерной для исходного ЛРС фармакологической активностью вследствие радиолиза БАВ. Степень радиоиндуцированной инактивации БАВ в водных извлечениях возрастает с увеличением поглощенной дозы гамма-излучения.
4. Показано, что число микроорганизмов в ЛРС наиболее интенсивно снижается при поглощенной дозе гамма-излучения 1 кГр, которая сокращает количество бактерий в 10-100 раз и грибов в 20-200 раз по сравнению с исходным уровнем.
5. Определены радиационно-химические выходы разложения G(-M) биологически активных комплексов ЛРС в водных извлечениях. Установлено, что они, как правило, не превышают 1,0 Мол/100эВ при дозе 10 кГр и 10,0 Мол/100 эВ при дозе 0,5 кГр поглощенной энергии. В обоих случаях радиолиз БАВ протекает по нецепному механизму. Степень радиоиндуцированной инактивации БАВ возрастает с повышением поглощенной дозы гамма-излучения.
6. Определены минимальные дозы гамма-излучения радиоактивного кобальта (60Со), полностью инактивирующие смешанные популяции контаминантов в исследованных образцах ЛРС, которые составляют для бактерий и грибов соответственно 10 и 5 кГр.
7. Установлена перспективность деконтаминации (стерилизации) изученного ЛРС радиационным методом вследствие отсутствия негативного воздействия на содержащиеся в нем биологически активные комплексы и специфическую активность.
- Список работ, опубликованных по теме диссертации
1. Чакчир, О.Б. К вопросу об использовании ионизирующей радиации для деконтаминации лекарственного растительного сырья / О.Б. Чакчир, Т.С. Потехина, Е.И. Саканян // Итоги и перспективы развития традиционной медицины в России: материалы науч. - юбил. конф., посвященной 25-летию открытия в Москве ЦНИИ рефлексотерапии. – М., 2002. – С. 223 – 224.
2. Чакчир, О.Б. Исследование влияния гамма-излучения на микробиологическую чистоту лекарственного растительного сырья / О.Б. Чакчир, Е.И. Саканян, Т.С. Потехина // Человек и лекарство: тез. докл. 9 Рос. нац. конгр. 8-9 апреля 2002 г. – М., 2002. – С.719.
3. Чакчир, О.Б. Влияние ионизирующей радиации на содержание флавоноидов в плодах боярышника / О.Б. Чакчир, Е.И. Саканян // Актуальные проблемы создания новых лекарственных препаратов природного происхождения: сб. науч. тр. 6 Междунар. съезда 4-6 июля 2002 г. – СПб., 2002. – С. 49 – 51.
4. Чакчир, О.Б. Исследование влияния гамма-излучения на содержание аскорбиновой кислоты и каротиноидов в плодах шиповника / О.Б. Чакчир, Е.И. Саканян //Здоровье и образование в XXI веке: материалы 4 Междунар. науч. - практ. конф. – М., 2003. – С. 655 - 656.
5. Чакчир, О.Б. Оценка радиационной стабильности лекарственного растительного сырья, содержащего эфирные масла / О.Б. Чакчир, Е.И. Саканян, Т.С. Потехина // Актуальные проблемы создания новых лекарственных препаратов природного происхождения: сб. науч. тр. 7 Междунар. съезда 3-5 июля 2003 г. – СПб., 2003. – С. 559 – 562.
6. Чакчир, О.Б. Некоторые закономерности деконтаминации лекарственного растительного сырья (ЛРС) ионизирующими излучениями / О.Б. Чакчир, Т.С. Потехина, Е.И. Саканян // Актуальные проблемы создания новых лекарственных препаратов природного происхождения: сб. науч. тр. 7 Междунар. съезда 3-5 июля 2003 г. – СПб., 2003. – С. 557 – 559.
7. Чакчир, О.Б. Оценка чувствительности каротиноидов и флавоноидов, содержащихся в плодах рябины, к воздействию гамма-излучения / О.Б. Чакчир // Современные проблемы теоретической и прикладной химии: тез. докл. 4 Всерос. конф. молодых ученых – Саратов, 2003. – С. 125.
8. Чакчир, О.Б. Анализ лекарственного растительного сырья, подвергшегося радиационной обработке / О.Б. Чакчир, Е.И. Саканян, Т.С. Потехина // Экоаналитика – 2003: тез. докл. 5 Всерос. конф. с международным участием по анализу окружающей среды. – СПб., 2003. – С. 393.
9. Чакчир, О.Б. Влияние гамма-излучения на специфическую активность плодов боярышника и водных извлечений из него / О.Б. Чакчир // Состояние и перспективы подготовки специалистов для фармацевтической отрасли: материалы. – СПб., 2004. – С. 127 – 128.
10. Чакчир, О.Б. Исследование радиационной стабильности корневищ с корнями валерианы лекарственной / О.Б. Чакчир // Человек и лекарство: тез. докл. 12 Рос. нац. конгр. 19-23 апреля 2004 г. – М., 2004. – С. 628.
11. Чакчир, О.Б. Влияние ионизирующей радиации на противовоспалительную активность цветков календулы и водных извлечений из них / О.Б. Чакчир, Е.И. Саканян, Е.Е. Лесиовская // Актуальные проблемы создания новых лекарственных препаратов природного происхождения: сб. науч. тр. 8 Междунар. съезда – СПб., 2004. – С. 176.
12. Чакчир, О.Б. Влияние ионизирующей радиации на содержание тропановых алкалоидов в лекарственном растительном сырье и водных извлечениях из него / О.Б. Чакчир, Е.И. Саканян, Е.Е. Лесиовская // Растительные ресурсы. - 2005. – Вып. 1. - С. 99 – 107.
13. Чакчир, О.Б. Влияние гамма-излучения на актопротекторную активность плодов рябины и настоев из них / О.Б. Чакчир, Е.И. Саканян // Разработка, исследование и маркетинг новой фармацевтической продукции: сборник научных трудов. - Пятигорск: Пятигорская ГФА, 2006. – Вып. 61. – С. 398 – 399.
14. Чакчир, О.Б. Влияние ионизирующей радиации на содержание эфирных масел в лекарственном растительном сырье и водных извлечениях из него / О.Б. Чакчир, Е.И. Саканян // Разработка, исследование и маркетинг новой фармацевтической продукции: сборник научных трудов. - Пятигорск: Пятигорская ГФА, 2007. – Вып. 62. – С. 412-414.
15. Чакчир, О.Б. Влияние гамма-излучения на актопротекторную активность плодов рябины и водных извлечений из них / О.Б. Чакчир, Е.И. Саканян // Юбилейная конф., посвященная 60-летию ФПТЛ: сб. науч. тр. – СПб.,2005. – С. 128 – 130.
16. Чакчир, О.Б. Исследование влияния фотонного излучения на антиаритмическую активность плодов боярышника и настоя из них /О.Б. Чакчир, Е.И. Саканян, Б.А.Чакчир // Фармация из века в век. Часть III. Анализ и стандартизация лекарственных средств: сб. тр. науч.- практ. конф. – СПб., 2008. – С. 179 – 182.
17. Чакчир, О.Б. Оценка противовоспалительной активности лекарственного растительного сырья и водных извлечений из него после радиационной деконтаминации (стерилизации) / О.Б. Чакчир [и др.] // Междунар. науч. - метод. конф. 3-4 февраля 2012 г. «Сандеровские чтения», посвященная памяти Ю.К. Сандера: сб. науч. трудов. – СПб: Изд-во СПХФАП, 2012. – С. 68-71.
18. Чакчир, О.Б. Исследование противомикробной активности лекарственного растительного сырья и водных извлечений из него после радиационной деконтаминации / О.Б. Чакчир // Разработка, исследование и маркетинг новой фармацевтической продукции: сборник научных трудов. - Пятигорск: Пятигорская ГФА, 2012. – Вып. 67. - С. 388-389.
19. Чакчир, О.Б. Определение адаптационной активности лекарственного растительного сырья и водных извлечений из него после радиационной деконтаминации / О.Б. Чакчир, В.Ц. Болотова // Разработка, исследование и маркетинг новой фармацевтической продукции: сборник научных трудов. - Пятигорск: Пятигорская ГФА, 2012. – Вып. 67. – С. 389-390.
Чакчир Олег Борисович
Исследование влияния ИОНИЗИРУЮЩЕГО ИЗЛУЧЕНИЯ НА биологически активнЫЕ комплексЫ
лекарственнЫХ растеНИЙ
14.04.02 – фармацевтическая химия и фармакогнозия
Автореферат
диссертации на соискание ученой степени
кандидата фармацевтических наук
Подписано в печать _____________. Формат бумаги 60х90/16
Бумага книжно-журнальная. Печать офсетная. Усл. печ. л 1,0
Тираж 100 экз. Заказ № ____ от ____________.
Отпечатано в типографии
