Клинико-диагностическое и прогностическое значение маркеров эндотелиоза при гестозе
На правах рукописи
Шеманаева
Татьяна Викторовна
Клинико-диагностическое и прогностическое значение маркеров эндотелиоза при гестозе
14.00.01 – акушерство и гинекология
03.00.04. – биохимия
АВТОРЕФЕРАТ
на соискание ученой степени
кандидата медицинских наук
Москва – 2008
Работа выполнена в ГОУ ВПО Московская медицинская академия
им. И.М. Сеченова
Научные руководители:
Заслуженный деятель науки РФ,
член-корреспондент РАМН,
доктор медицинских наук, профессор Сидорова Ираида Степановна
доктор медицинских наук, профессор Гурина Ольга Ивановна
Официальные оппоненты:
доктор медицинских наук, профессор Зуев Владимир Михайлович
заслуженный деятель науки РФ,
академик РАМН,
доктор медицинских наук, профессор Панченко Леонид Федорович
Ведущее учреждение:
Московский областной научно-исследовательский институт акушерства и гинекологии
Защита диссертации состоится «___ » _________2008 г. в ____ часов на заседании диссертационного совета Д.208.040.03 при Московской медицинской академии им. И.М. Сеченова по адресу: 119991, г.Москва, ул. Трубецкая, д. 8, стр.2.
С диссертацией можно ознакомиться в Центральной медицинской научной библиотеке по адресу: 117998, г. Москва, Нахимовский проспект, д. 49.
Автореферат разослан «___» _____________ 2008 г.
Ученый секретарь диссертационного совета
доктор медицинских наук, профессор Шулутко Александр Михайлович
ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА ДИССЕРТАЦИИ
Актуальность темы
Используемые в настоящее время клинико-лабораторные показатели не позволяют достоверно оценить истинную степень тяжести гестоза, а тем более – составить прогноз его дальнейшего течения. Частота гестоза не снижается, материнская и перинатальная смертность от этого осложнения беременности практически сохраняет стабильное значение [В.И. Кулаков, 2005; И.С. Сидорова, 1997, 2003; А.Н. Стрижаков, 2000; З.З. Токова, 2004; О.Г. Фролова, 2004]. Современные методы лечения, по существу, малоэффективны, основной тактикой при тяжелом гестозе является прерывание опасной беременности. Все это обусловлено отсутствием конкретных знаний о природе возникновения гестоза, недостаточностью достоверных критериев в оценке истинной его тяжести, невозможностью прогнозировать исходы для матери и плода [Sibai B., Dekker G., 2005; Solomon CG, Seely EW., 2004; И.С. Сидорова, 2003; Freidman S.A., Taylor R.N., 1991], особенно в тех случаях, когда гестоз протекает атипично, с нерезко выраженной клинической симптоматикой и отсутствием тяжелых изменений в лабораторных показателях: белок в моче в виде следовых реакций, нормальные биохимические параметры, мало измененные показатели реологических и коагуляционных свойств крови. Одними из основных критериев в оценке истинного состояния пациентов остаются раннее (32 – 34 нед. беременности) начало и длительное (свыше 4 нед.) течение гестоза. Нарушение маточно-плацентарного и плодового кровотока, ЗРП, гипоксия достаточно часто наблюдаются при других осложнениях беременности, таких как плацентарная недостаточность без гестоза, тяжелые соматические заболевания, многоплодная беременность, нарушение сократительной деятельности матки, угроза преждевременных родов и др. С другой стороны, известно, что конечная стадия гестоза – эклампсия внезапно развивается при относительно невысокой гипертензии и не резко выраженной протеинурии. Достоверно ранними признаками гестоза являются одновременное повышение артериального давления и протеинурия после 20 – 22 недель беременности, но до настоящего времени не удалось объяснить эту специфическую особенность – почему гестоз развивается только во второй половине беременности. Поэтому поиск дополнительных и достоверных методов оценки степени тяжести гестоза имеет несомненную актуальность в научном и практическом значении.
В последние годы все больше исследователей склонны считать, что гестоз – это реакция системного воспалительного ответа вследствие поражения эндотелия [В.Н.Серов, 1999, 2006, М.А. Репина, 2005; Л.А Иванова, 2003; Н.Н. Петрищев, 2003] и эндотелиальной дисфункции, [И.С. Сидорова, 2003], когда нарушается продукция и соотношение вазоконстрикторов, коагулянтов, агрегантов с вазодилятаторами, антиагрегантами и антикоагулянтами. Основные симптомы гестоза (гипертензия, протеинурия и отеки) и развивающаяся полиорганная недостаточность обусловлены именно повреждениями эндотелия. Но возможно ли с помощью основных маркеров эндотелиальной дисфункции оценить степень тяжести эндотелиоза, выявить роль и значение НСБ быстро развивающегося мозга плода в развитии системного эндотелиоза? Ведь известно, что у взрослых здоровых людей НСБ отмечаются в незначительной концентрации. Они определяются только при травме и заболеваниях головного мозга человека, нейроинфекции, повреждении ГЭБ. Однако, у плода человека они интенсивно экспрессируются во второй половине его внутриутробного развития (20 – 22 недели гестационного возраста и позднее). При повышении проницаемости ГЭБ (гипоксия, инфекция, нарушение мозгового кровотока у плода) НСБ могут проникнуть в кровоток матери. И так как НСБ плода являются чужеродными для материнского организма иммуногенами, они могут вызвать повреждение эндотелия (эндотелиоз) системы микроциркуляции. Роль НСБ в развитии гестоза в настоящее время не выявлена, как и значение VCAM в оценке степени тяжести гестоза.
Цель исследования
Целью исследования является клиническая оценка маркеров эндотелиальной дисфункции у пациенток с гестозом разной степени тяжести.
Задачи исследования
1. Провести клиническую оценку развития гестоза у пациенток с факторами риска в сопоставлении с содержанием в сыворотке крови НСБ (NSE и GFAP) и VCAM в сравнении с показателями у здоровых небеременных и здоровых женщин с физиологически протекающей беременностью.
2. Исследовать диагностическую и прогностическую значимость определения VCAM, НСБ (NSE и GFAP) у беременных в различные сроки беременности (18 – 40 недель).
3. Выявить корреляционную связь между концентрацией VCAM, NSE и GFAP в сыворотке крови беременных с гестозом разной степени тяжести и клинико-лабораторными данными, исходами беременности и родов.
4. Провести ретроспективный анализ эффективности комплексной терапии гестоза, с применением количественного динамического исследования VCAM, NSE, GFAP.
Научная новизна
Доказано отсутствие у здоровых небеременных и здоровых беременных женщин клинических признаков и лабораторных критериев активации эндотелия. Установлено отсутствие достоверной разницы в концентрации VCAM в сыворотке крови здоровых небеременных и здоровых женщин с физиологически протекающей беременностью.
Доказана прогностическая значимость повышения концентрации VCAM, NSE и GFAP в сыворотке крови беременных при прогнозировании возникновения гестоза: появление клинических признаков гестоза и повышения уровней VCAM, NSE и GFAP находятся в соответствии с нарастанием степени тяжести гестоза.
Выявлена прямая корреляционная связь между повышением уровней VCAM и уровнями НСБ (NSE и GFAP) в сыворотке крови матери при гестозе, что свидетельствует о наличии прямых причинно-следственных связей иммунного повреждения эндотелиоцитов матери в период интенсивного развития ЦНС плода (вторая половина гестации).
Практическая значимость
1. Исследование VCAM, NSE и GFAP в сыворотке крови беременных группы риска по развитию гестоза позволяет своевременно диагностировать возникновение этого осложнения, выработать тактику ведения беременности и терапию, а также прогнозировать степень его тяжести, что наблюдается при повышении содержания VCAM, NSE и GFAP выше нормативных значений.
2. Основными критериями тяжелого гестоза, при котором определяются максимальные уровни VCAM, NSE и GFAP, являются: манифестация гестоза до 30 - 34 недель беременности, длительность его течения свыше 6 недель и более, максимальная выраженность хотя бы одного из клинических симптомов гестоза (отеки, протеинурия, гипертензия), наличие фетоплацентарной недостаточности.
3. Понимание гестоза как иммунокомлексного повреждения эндотелия сосудов системы микроциркуляции позволяет применить новые методы диагностики, профилактики гестоза, оценить эффективность лечения, решить вопрос о возможности пролонгирования беременности, более точно оценить степень тяжести гестоза.
Основные положения, выносимые на защиту
1. У здоровых небеременных и беременных женщин с физиологически протекающей беременностью концентрации VCAM, NSE и GFAP в сыворотке крови не превышают установленных нормативных показателей, вне зависимости от возраста и срока беременности.
2. Повышение концентраций VCAM, NSE и GFAP в сыворотке крови беременных с высокой вероятностью позволяет прогнозировать развитие гестоза за 1 – 2 недели до его клинической манифестации.
3. Клинико-лабораторные признаки далеко не всегда отражают степень тяжести гестоза, тогда как маркеры активации эндотелия достоверно указывают на его возникновение. Количественное определение уровней VCAM, NSE и GFAP методом ИФА в сыворотке крови беременных позволяет оценить степень тяжести гестоза, независимо от типичного или атипичного его течения.
Внедрение результатов работы. Полученные результаты включены в лекционный курс кафедры акушерства и гинекологии ФППОВ ММА им. И.М. Сеченова.
Апробация работы. Материалы диссертации доложены на XIV Российском национальном конгрессе «Человек и лекарство», Москва (2007, 2008), IX Всероссийском научном форуме "Мать и дитя", Москва, 2-5октября 2007 г., региональном форуме «Мать и дитя» (Сочи, 2008).
Структура и объем диссертации. Структура диссертации традиционна, ее текст изложен на 175 страницах машинописного текста и состоит из введения, обзора литературы, 2 глав, посвященных материалам и методам исследования и результатам собственных данных, обсуждения полученных результатов, выводов, практических рекомендаций и списка литературы. Библиография включает 131 отечественного и 170 иностранных авторов. Текст диссертации проиллюстрирован 51 таблицей, 16 рисунками.
Содержание диссертации
Обследованы 106 женщин с гестозом разной степени тяжести (основная группа). Из них проспективный анализ произведен у 68 беременных женщин с развившимся гестозом разной степени тяжести и 38 беременных женщин с факторами риска, у которых впоследствии развился гестоз. Сформированы контрольная группа из 25 здоровых беременных с физиологически протекающей беременностью и группа из 20 здоровых небеременных женщин репродуктивного возраста (для исключения влияния беременности на уровень VCAM, NSE, GFAP).
Критерии включения беременных в группу риска по развитию гестоза: отсутствие нейроинфекций, черепно-мозговых травм в анамнезе, нейродегенеративных заболеваний, опухолей головного мозга; наличие факторов риска возникновения гестоза: сердечно-сосудистые заболевания (ГБ, НЦД), нейрообменно-эндокринные заболевания, заболевания печени и почек.
Критерии включения беременных в контрольную группу: срок беременности 12 недель и более, физиологическое течение беременности, отсутствие симптомов гестоза, признаков НМППК, ФПН и ЗВРП во время настоящей беременности, нейроинфекций, черепно-мозговых травм, нейродегенеративных заболеваний, опухолей головного мозга.
Критериями включения пациенток в группу здоровых небеременных являются отсутствие в анамнезе нейроинфекций, черепно-мозговых травм, нейродегенеративных заболеваний, опухолей головного мозга.
Уровни VCAM, NSE, GFAP в контрольной группе определяли в сыворотке крови с 12 недель беременности 1 раз в месяц до родоразрешения. В группе здоровых небеременных женщин концентрацию VCAM, NSE, GFAP определяли однократно в 1-ой фазе менструального цикла. В сыворотке крови беременных группы риска производили с 12 до 20 недель ежемесячно; с 20 недель – 1 раз в 2 недели.
Здоровые беременные и небеременные женщины сопоставимы по возрасту, паритету беременности и родов.
Среди экстрагенитальных заболеваний у беременных с факторами риска по гестозу у каждой второй встречались нейрообменно-эндокринные заболевания (45 %), у каждой третьей беременной - заболевания сердечно-сосудистой системы (32,5 %), у каждой шестой - заболевания почек и мочевыводящих путей (17,5%).
В структуре гинекологических заболеваний среди беременных с факторами риска по развитию гестоза и в контрольной группе чаще всего встречались хронические воспалительные заболевания матки и придатков (32,5% и 8 % соответственно), эктопия и лейкоплакия шейки матки (37,5% и 4 % соответственно), инфекции половых органов (35 % и 8 % соответственно). У 12,5 % беременных с факторами риска по развитию гестоза отмечена дисфункция яичников, 5% женщин страдали бесплодием.
У беременных с факторами риска по развитию гестоза первый триместр настоящей беременности протекал без осложнений у 13 (32,5 %). Наиболее распространенными осложнениями беременности в первом триместре являлись ранний токсикоз (47,5%) и угроза прерывания (22,5%). У 4 (10%) женщин отмечалось ОРВИ в ранние сроки беременности. Анемия выявлена у 4 (10%) беременных.
Во втором триместре у беременных с факторами риска по развитию гестоза среди осложнений беременности преобладали угроза прерывания - у 10 (25%) и анемия - у 12 (30%). ОРВИ перенесли 5 (12,5%) пациенток. Второй триместр не был осложнен у 14 (35%) женщин.
Третий триместр у беременных с факторами риска по развитию гестоза был осложнен анемией (22,5%) и угрозой преждевременных родов (10%).
У 38 (95%) беременных с факторами риска по развитию гестоза зарегистрированы признаки гестоза в различные сроки беременности (беременные с повышенными уровнями VCAM, NSE, GFAP). При этом у 47,4 % зарегистрирован гестоз легкой степени, у 52,6 % – средней степени. Степень тяжести гестоза оценивалась по шкале Goeсke в модификации Г.М. Савельевой и соавт. Появление первых симптомов гестоза у 38 пациенток основной группы отмечено в сроки от 31 до 37 недель беременности. У 57,9 % беременных гестоз начался в сроки 30-35 недель, у 42,1 % - после 35 недель беременности.
Длительность гестоза при легком его течении составила от 2 до 5 недель (в среднем 3,5 ± 1,1 недели), в группе с гестозом средней тяжести - от 3 до 7 недель (в среднем 5,4 ± 0,9 недель), разница в группах достоверна (p < 0,05).
Систолическое, диастолическое и среднее артериальное давление (САД) в подгруппе с легким гестозом были достоверно ниже, чем в подгруппе с гестозом средней тяжести. У трети пациенток (33,3 %) с легким гестозом и одной (5 %) с гестозом средней тяжести гипертензия отсутствовала.
В большинстве наблюдений выявлена незначительная протеинурия в обеих подгруппах основной группы: 77,8% в подгруппе с гестозом легкой степени и 65 % в подгруппе с гестозом средней степени. Лишь у 4 (20 %) беременных с гестозом средней тяжести она превышала 0,132 г/л.
Классическая триада симптомов (отеки, протеинурия, гипертензия) достоверно регистрируется с нарастанием тяжести гестоза (38,9 % при легком гестозе и 85 % при гестозе средней степени).
В подгруппе с легким гестозом родоразрешены в доношенном сроке 16 (88,9 %) пациенток; у 1 (5,5 %) беременность закончилась преждевременными родами, у 1 (5,5 %) - запоздалыми. В подгруппе с гестозом средней степени достоверно выше частота преждевременных родов - у 3 (15 %), своевременные роды произошли у 17 (85 %) пациенток.
Родоразрешены через естественные родовые пути 14 (77,8 %) женщин с легким гестозом, что практически в 2 раза выше, чем в подгруппе с гестозом средней степени - 9 (45 %). В 2,5 раза чаще произведено оперативное родоразрешение у пациенток с гестозом средней степени - в 11 (55 %) наблюдениях по сравнению с 4 (22,2 %) наблюдениями в подгруппе с легким гестозом.
Средний вес новорожденных в подгруппах составил 3392,2 ± 301,5 г при легком гестозе, 3061 ± 274,1 г при гестозе средней тяжести. Гипотрофия отмечена у 1 (5,6 %) и 4 (20 %) новорожденных соответственно подгруппам. У каждого пятого новорожденного при гестозе средней степени (25 %) выявлено гипоксически-ишемическое поражение ЦНС, что в 4 раза чаще, чем при легком гестозе (5,6 %).
Недоношенность составила 5,6 % в подгруппе с легким гестозом и 15 % в подгруппе с гестозом средней степени тяжести. Учитывая перенесенную внутриутробную гипоксию, гипоксически-ишемическое поражение ЦНС, недоношенность 1 (5 %) новорожденный в подгруппе с гестозом средней тяжести переведен на второй этап выхаживания в детское лечебное учреждение.
Среди 68 беременных женщин с развившимся гестозом (основная группа) у 24 выявлен гестоз легкой степени (1-ая подгруппа); у 25 – гестоз средней степени (2-ая подгруппа); у 19 - гестоз тяжелой степени (3-ая подгруппа).
Определение VCAM, NSE, GFAP в сыворотке крови беременных основной группы проводилось в день госпитализации до начала инфузионной и гипотензивной терапии.
Беременные основной и контрольной групп сопоставимы по возрасту.
В структуре экстрагенитальных заболеваний у основной группы существенное место занимали заболевания сердечно-сосудистой системы (20,8 %, 44 % и 63,2% соответственно подгруппам), органов мочевыделительной системы (12,5 %, 12 % и 36 %), нейрообменно-эндокринные заболевания (54,2 %, 52 % и 73 %).
Отмечен высокий процент беременных с избыточной массой тела и ожирением. Индекс массы тела свыше 30 кг/м2, что соответствует ожирению, выявлен у 3 (12,5 %) беременных в 1-ой подгруппе, 6 (24 %) во 2-ой подгруппе и 8 (41 %) в 3-й подгруппе.
Различные гинекологические заболевания в анамнезе в подгруппах с гестозом выявлены в 75 %, 72 % и 78,9 % случаев соответственно. Наиболее распространенными из них как в основной, так и в контрольной группе являлись: эктопия шейки матки и хронический сальпингоофорит. Достоверно чаще (p<0,05) пациентки основной группы страдали хроническими воспалительными заболеваниями органов малого таза, бесплодием, инфекциями половых путей (уреаплазмоз, трихомониаз, хламидиоз, микоплазмоз, токсоплазмоз, ВПЧ, ВПГ-2, CMV) по сравнению с контрольной группой.
Число первобеременных женщин в основной группе составило 37,5%, 36% и 52,6 % соответственно подгруппам, в контрольной группе - 48 %. Число первородящих в основной группе составило 62,5 %, 60 %, 68,4 % соответственно подгруппам, в контрольной группе - 68 %. Время начала гестоза и длительность его течения находятся в прямой зависимости от степени тяжести данного осложнения беременности. В частности, гестоз в 1-ой подгруппе в среднем начинается в 35,2 ± 1,05 нед. беременности, во 2-ой – в 32,9 ± 1,7 нед., в 3-й – в 28,5 ± 2,6 нед. Длительность течения гестоза от момента появления первых его клинических признаков до родоразрешения составила 3,4 ± 1,0; 4,9 ± 1,02 и 7,1 ± 2,3 нед. соответственно подгруппам.
Достоверные различия между основной группой (беременные с развившимся гестозом разной степени тяжести) и контрольной группой выявлены при анализе следующих лабораторных показателей: снижение общего белка в сыворотке крови при гестозе (гипопротеинемия); повышение величины гематокрита, свидетельствующее о нарастании гемоконцентрации с утяжелением гестоза; увеличение уровня мочевины крови (отмечено только при тяжелом гестозе); снижение количества тромбоцитов при средней степени тяжести гестоза и тяжелых его формах; укорочение АЧТВ во всех подгруппах с гестозом. Средние значения фибриногена плазмы выше при гестозе средней и тяжелой степени.
При анализе срока родов в 1-ой подгруппе роды в срок произошли у 20 (83,3 %) обследуемых женщин, во 2-ой подгруппе – у 19 (76 %), в 3-й подгруппе – у 7 (36,8 %) женщин. Соответственно нарастанию тяжести гестоза достоверно чаще беременность заканчивается преждевременными родами: в 1-ой подгруппе у 1 (4,2 %), во 2-ой – у 5 (20 %), в 3-й – у 12 (63,2 %). В контрольной группе отмечено у всех беременных родоразрешение в доношенном сроке.
Родоразрешены через естественные родовые пути в 1-ой подгруппе 20 (83,3 %), во 2-ой - 13 (52 %) и в 3-й – 1 (5,3 %) беременные; в контрольной группе - 22 (88 %) беременные. Оперативным путем родоразрешены 4 (16,7 %), 12 (48 %) и 18 (94,7 %) в подгруппах основной группы, 3 (12 %) беременные контрольной группы.
Вес новорожденных в 1-ой подгруппе и контрольной группе достоверно не отличался, во 2-ой и 3-й подгруппах – достоверно ниже, чем в контрольной группе. Гипотрофия различной степени выявлена у 3 (12,5 %) новорожденных в 1-ой подгруппе, у 9 (36 %) – во 2-ой подгруппе и у 14 (73,7 %) – в 3-й подгруппе.
В состоянии асфиксии средней степени тяжести в 1-ой подгруппе родился 1 (4,2 %) новорожденный, во 2-ой подгруппе - 1 (4%), в 3-й подгруппе - 7 (36,8 %) и у одного (5,3 %) новорожденного отмечена тяжелая асфиксия.
Обращает на себя внимание высокий процент гипоксически-ишемического поражения ЦНС у новорожденных при тяжелом гестозе – у 12 детей (63,2 %), что превышает те же показатели в 1-ой и 2-ой подгруппах в несколько раз (4,2% и 20 % соответственно). Высока частота синдрома дыхательных расстройств (СДР) – 1 (4 %) и 8 (42,1 %) случаев во 2-ой и 3-й подгруппе при отсутствии таковых в 1-ой подгруппе, причем во 2-ой подгруппе СДР купировался уже в 1-2-е сутки, а в 3-й подгруппе – только к 3-5 суткам. В одном (5,3 %) случае в 3-й подгруппе отмечено развитие аспирационного синдрома и аспирационной пневмонии у новорожденного.
Проведение реанимационных мероприятий потребовалось 6 (31,6 %) новорожденным 3-й подгруппы, что в 3 раза чаще, чем во 2-ой подгруппе - 2 (8%), (р < 0,05). В 1-ой подгруппе реанимационные мероприятия не проводились.
Учитывая тяжелое состояние новорожденных, недоношенность, морфофункциональную незрелость, 10 (52,6 %) детей 3-й подгруппы переведены на II этап выхаживания, что превышает тот же показатель во 2-ой подгруппе в 4 раза - 2 детей (8 %), (р < 0,05). В контрольной группе и 1-ой подгруппе все дети выписаны домой.
Методы исследования. Комплексное обследование беременных включало: сбор анамнеза соматического здоровья женщин, менструальной, репродуктивной функции, особенностей течения предыдущих беременностей.
Общеклиническими методами оценено состояние сердечно-сосудистой системы, системы органов дыхания, системы органов пищеварения, мочевыводящей системы. Лабораторная диагностика включала следующие методы: клинический анализ крови, биохимический анализ крови, коагулограмма, общий анализ мочи (в т.ч. исследование суточной потери белка). Ультразвуковое исследование во втором и третьем триместрах беременности осуществлялось с применением стандартных методик эхографии – трансабдоминального сканирования и допплерометрического исследования кровотока в маточных артериях, артерии пуповины. Все исследования проводились на ультразвуковых аппаратах с использованием конвексного датчика 3,5 МГц в двухмерном эхорежиме.
Иммунохимическое исследование. Оценка состояния ГЭБ осуществлялась на основании исследования концентрации в сыворотке крови нейроспецифических белков – глиофибриллярного кислого протеина (GFAP) и нейроспецифической енолазы (NSE), являющихся маркерами патологических процессов в ткани головного мозга. Количественное определение концентраций НСБ в сыворотке крови осуществлялось при помощи "сэндвич" - варианта (Voller A. et all., 1976) иммуноферментного анализа в модификации (Чехонин В.П. и соавт., 1988). Данное исследование проводилось в лаборатории иммунохимии Отдела биологической психиатрии ФГУ “ГНЦССП им. В.П. Сербского (Руководитель отдела – академик РАМН д.м.н., профессор Чехонин В.П.). Исследование NSE и GFAP в сыворотке крови пациенток проводили методом твердофазного иммуноферментного анализа (ELISA).
Для постановки реакции осуществляли забор периферической венозной крови в объеме 2 мл в сухую пробирку. Образцы крови отстаивали до образования плотного сгустка и центрифугировали. Сыворотку крови собирали в пробирки типа «Эппендорф» и хранили при температуре -20°С не более 3 месяцев. В качестве твердой матрицы применялся 96-луночный полистирольный планшет фирмы «Costar» (USA).
Проведение иммуноферментного анализа включает несколько этапов, необходимых для экспериментального подбора оптимальных концентраций «посадочных» антител и стандартных проб с заданной концентрацией антигена для построения калибровочной кривой: 1). активация планшета путем внесения образцов посадочных антител в различных концентрациях с интервалом от 0,00075 до 0,075 %; 2). внесение в ячейки планшета образцов стандартного АГ в различных концентрациях (пробы для построения калибровочных кривых); 3). внесение в ячейки планшета различных разведений конъюгата АТ с пероксидазой хрена для определения наиболее оптимальных концентраций вторых антител. Раствор антител готовили на покрывающем буфере, приготовленном по прописи: 1,59 г Nа2СО3, 2,93 г NаНСО3, вода до 1000 мл. Процедуру инкубирования антител проводили в течение 12 ч при 4 С. За это время, происходит адсорбция антител на поверхности полистирольной твердой фазы дна и стенок ячеек (так называемая активация твердой фазы). Затем активирующий раствор сливали и ячейки промывали отмывающим буфером (рН 7,0), приготовленным по прописи:Трис – 6,05г, СаСI2 – 1,11 г, NaСI - 0,2 г, Тритон Х-100 – 1,0 мл, Н2О - до 1000 мл. После промывки в ячейки вносили по 100 мкл исследуемой биологической жидкости или другого раствора определяемого антигена; в отдельные ряды ячеек вносятся стандартные пробы с известной концентрацией антигена. Эти растворы оставляются в ячейках на 2 ч при комнатной температуре. За это время происходит связывание антигена с адсорбированными антителами. Несвязавшиеся белки отмываются тем же промывочным буфером, и ячейки заполняются разведенным конъюгатом фермента с соответствующими антителами, приготовленным по методике, описанной выше. Инкубация с конъюгатом продолжается 3 ч при комнатной температуре, после чего несвязавшийся конъюгат тщательно отмывается тем же буфером. Проявление ферментативной активности пероксидазы в связанном конъюгате проводится с использованием субстратного буфера. В качестве хромогенного субстрата применяли ортофенилендиамин в концентрации 0,4 мг/мл в цитрат-фосфатном буфере рН 4,5 (7,3г лимонной кислоты, 11,86 г NaH2PO42H2O, вода до 1000 мл). В субстратную смесь непосредственно перед внесением в ячейки, добавляли 10 мкл 30 % перекиси водорода. Полную субстратную смесь разливали по лункам (по 100 мкл) и инкубировали 10-20 минут при комнатной температуре. Затем ферментативную реакцию останавливали внесением 100 мкл 4 М H2SO4. Считывание результатов проводили с помощью многоканального спектрофотометра Elx 800 (Bio–Tek Instruments) при длине волны 490 нм. По результатам определения оптической плотности и известным концентрациям антигенов в стандартных пробах строили калибровочные кривые, которые использовали в дальнейшей работе для определения концентраций НСБ в исследуемых образцах биологических жидкостей. Конечный расчет концентрации NSE и GFAP производили по стандартной для ИФА технологии.
Для количественного определения VCAM в сыворотке крови, содержащих эти антигены лишь в очень низких концентрациях мы применяли метод иммуноферментного анализа с пределом чувствительности 3,13 нг/мл. В качестве твердой матрицы применялся 96-луночный полистирольный планшет фирмы Bender MedSystems, коммерческой тест-системы.
По результатам определения оптической плотности и известным концентрациям антигенов в стандартных пробах строили калибровочные кривые, которые использовали в дальнейшей работе для определения концентраций НСБ и VCAM в исследуемых образцах сыворотки крови. Конечный расчет концентрации NSE, GFAP и VCAM производили по стандартной для ИФА технологии.
Статистическую обработку полученных данных производили по общепринятому методу вариационной статистики с вычислением средней арифметической (М), ошибки средней арифметической (m), стандартного отклонения (SD).
Результаты исследования
В группе здоровых беременных женщин концентрации NSE, GFAP, VCAM достоверно не отличались от показателей у здоровых небеременных женщин и не зависели от возраста и срока беременности, что свидетельствует об отсутствии влияния физиологических изменений при беременности на проницаемость ГЭБ, активацию эндотелия.
После обработки данных о концентрации VCAM, NSE, GFAP у беременных контрольной группы в разные сроки беременности получена средняя величина, принятая за норму у здоровых беременных женщин с физиологически протекающей беременностью – 12,1 ± 0,1 нг/мл для NSE; 3,75 ± 0,1 нг/мл для GFAP и 14,96 ± 0,33 нг/мл для VCAM. В сроки до 20 недель беременности уровни NSE, GFAP, VCAM в основной группе достоверно не отличались от уровней данных маркеров у контрольной группы и здоровых небеременных женщин.
Наиболее ранний срок беременности, в котором отмечено достоверное повышение концентрации VCAM, NSE, GFAP в сыворотке крови беременных с гестозом - 22 недели гестации; при этом в большинстве наблюдений этот подъем впервые зарегистрирован в 24-30 недель. Начальный подъем уровней VCAM в сыворотке беременных основной группы составил 32,81±0,18 нг/мл, NSE - 13,32 ± 0,1 нг/мл, GFAP - 5,13 ± 0,15 нг/мл (M ± m), разница с исходными уровнями достоверна (p < 0,05) Чем выше первоначальный подъем VCAM, NSE, GFAP, тем тяжелее протекает развивающийся в последующем гестоз.
Для изучения прогностической значимости патологических уровней VCAM, NSE, GFAP в сыворотке крови беременных в развитии гестоза, проспективно обследованы 50 беременных группы риска в сроки от 12 до 41 недели. Выборочную совокупность составили 40 пациенток с повышенными уровнями VCAM, NSE, GFAP. Из них у 38 беременных отмечены достоверно более высокие уровни GFAP по отношению к контрольной группе (у оставшихся 10 пациенток группы риска, концентрация белков не превышала соответствующих показателей в контрольной группе, развитие гестоза не зарегистрировано ни в одном случае). В ходе наблюдения развитие гестоза зарегистрировано у 38 из 40 беременных с повышенными уровнями VCAM, NSE, GFAP. Рассчитана прогностичность положительного результата определения VCAM, NSE, которая равна: 38 / 40 100% = 95%.
При исследовании уровней GFAP, NSE и VCAM при гестозе разной степени тяжести получены следующие результаты. При обследовании сыворотки крови беременных с гестозом выявлено статистически достоверное повышение концентраций GFAP, NSE и VCAM по сравнению с таковыми у здоровых беременных (p<0,05). Данные об изменении уровней GFAP, NSE и VCAM приведены в таблицах 1, 2.
Таблица 1
Результаты количественного определения GFAP, NSE у беременных с гестозом различной степени тяжести
| Средние концентрации НСБ в сыворотке крови (нг/мл) | ||||
| Нейроспецифические белки | здоровые беременные | беременные с гестозом | ||
| Легкой степени | Средней степени | Тяжелой степени | ||
| GFAP | 3,75 ± 0,16 | 4,47 ± 0,1 | 6,55 ± 0,2 | 10,79 ± 0,69 |
| NSE | 12,1 ± 0,1 | 13,19 ± 0,1 | 14,9±0,22 | 19,66 ± 0,5 |
Примечание: значимость различий при сравнении показателей достоверна (p < 0,05): * - при сравнении уровней NSE; - при сравнении уровней GFAP.
Выявлено статистически достоверное повышение концентрации VCAM в сыворотке крови беременных с гестозом по сравнению с таковыми у здоровых беременных (p<0,05).
Таблица 2
Результаты количественного определения VCAM у беременных с гестозом разной степени тяжести
| Средняя концентрация VCAM в сыворотке крови (нг/мл) | ||||
| Молекула адгезии | Здоровые беременные | беременные с гестозом | ||
| Легкой степени | средней степени | Тяжелой степени | ||
| VCAM | 14,96±0,33 | 32,29 ± 0,48* | 34,85 ± 0,44* | 40,2 ± 1,16* |
Примечание: значимость различий при сравнении показателей достоверна (p < 0,05): * - при сравнении уровней VCAM.
При длительности течения гестоза от 1 до 3 нед. (21 беременная) концентрация NSE составила 13,05 ± 0,17 нг/мл, GFAP– 4,5 ± 0,11 нг/мл и VCAM - 32,38 ± 0,51 нг/мл. При более длительном течении гестоза (4 - 7 нед.) уровни белков постепенно нарастают (37 беременных), их концентрации увеличиваются: NSE – до 15,9 ± 0,42 нг/мл, GFAP - до 7,3 ± 0,38 нг/мл и VCAM до - 35,8 ± 0,65 нг/мл. При длительности гестоза более 8 нед. (10 беременных) концентрации белков увеличиваются: NSE - до 20,2 ± 0,58 нг/мл, GFAP - до 10,95 ± 0,83 нг/мл и VCAM - до 41,1 ± 1,45 нг/мл. Таким образом, чем дольше протекает гестоз, тем выше уровни данных маркеров в сыворотке крови беременных.
При появлении первых клинических симптомов гестоза после 32 нед. (40 беременных) уровни NSE составили в среднем 13,9 ± 0,3 нг/мл, GFAP – 5,4 ± 0,3 нг/мл, VCAM - 32,8 ± 0,6 нг/мл. При манифестации гестоза до 32 нед. (28 беременных) отмечено достоверное повышение концентрации данных белков, уровни NSE составили 17,9 ± 0,61 нг/мл, GFAP – 9,1 ± 0,6 нг/мл, VCAM - 38,8 ± 0,9 нг/мл. Таким образом, чем раньше развился гестоз, тем выше уровни NSE, GFAP и VCAM в сыворотке крови беременных с гестозом.
Оценивая клинические данные у беременных женщин с гестозом, получены следующие результаты. У 28 (41,2 %) беременной отмечена умеренная гипертензия (САД до 110 мм рт.ст.), концентрация NSE составила в среднем 14,25 ± 0,21 нг/мл и GFAP - 5,6 ± 0,23 нг/мл. Уровень VCAM - 33,99 ± 0,44 нг/мл (p < 0,05 при сравнении с беременными без гипертензии).
Из 30 (44,1 %) женщин с тяжелой гипертензией у 26 (38,2 %) САД находилось в пределах 111-129 мм рт.ст., у 4 (5,9 %) – свыше 130 мм рт.ст. Концентрация NSE в первом случае составила 17,3 ± 0,56 нг/мл, GFAP - 9,0 ± 0,7 нг/мл, VCAM - 37,5 ± 0,87 нг/мл. В первом случае (при САД 111-129 мм рт.ст) концентрация NSE, GFAP и VCAM достоверно не отличалась от уровней белков во втором случае (при САД свыше 130 мм рт.ст, где концентрация NSE составила 21,7 ± 0,8 нг/мл, GFAP - 10,65 ± 0,56 нг/мл, VCAM - 44,55 ± 1,79 нг/мл). Различия по сравнению с уровнями белков при САД до 110 мм рт.ст. высоко достоверны (p < 0,005).
Результаты проведенного анализа показали, что при массивной протеинурии (более 3 г/л) определяются наиболее высокие концентрации NSE до 18,79 ± 0,54 нг/мл и GFAP до 10,84 ± 1,22 нг/мл, VCAM до 42,81 ± 1,13 нг/мл, что всегда свидетельствует о тяжелом течении гестоза. При потере белка до 1 г/л уровни маркеров варьируют в широком диапазоне: NSE от 13,9 ± 0,24 нг/мл до 16,46 ± 0,57 нг/мл; GFAP от 5,15 ± 0,29 нг/мл до 7,84 ± 0,55 нг/мл; VCAM от 33,31 ± 0,73 нг/мл до 36,68 ± 0,84 нг/мл.
При изучении уровней NSE, GFAP, VCAM в зависимости от выраженности отеков у беременных с гестозом выявлено: отеки I степени отмечены у 25 (36,8 %) беременных основной группы (у 15 женщин 1-ой подгруппы, у 5 – во 2-ой подгруппе, и у 5 женщин в 3-й подгруппе); концентрация NSE и GFAP у этих женщин составила в среднем 14,31 ± 0,4 нг/мл и 6,3 ± 0,71 нг/мл, VCAM – 34,79 ± 0,95 нг/мл. Отеки II степени отмечены у 27 (39,7 %) беременных (у 9 женщин 1-ой подгруппы, у 15 – во 2-ой подгруппе и 3 - в 3-й подгруппе); уровни NSE, GFAP, VCAM практически не отличались, в среднем 15,27 ± 0,41 нг/мл; 6,32 ± 0,38 нг/мл и 34,0 ± 0,59 нг/мл, разница с соответствующими показателями в предыдущей группе недостоверна (p > 0,05). Лишь при наличии выраженных отеков III и IV степени получены достоверно более высокие концентрации NSE, GFAP и VCAM: 17,24 ± 0,78 нг/мл; 8,28 ± 0,79 нг/мл и 38,35 ± 0,95 нг/мл (при отеках III степени). При отеках IV степени NSE, GFAP и VCAM: 23,43 ± 0,97 нг/мл; 11,7 ± 1,28 нг/мл и 43,87 ± 2,17 нг/мл.
Анализируя изменения концентрации VCAM, NSE и GFAP до и после проводимой комплексной терапии (с применением антиагрегантов, антиоксидантов) беременным с тяжелым гестозом, выявлено незначительное нарастание уровней данных маркеров. Возможно, данный феномен объясняется тем, что родоразрешение является единственно возможным методом, предотвращающим дальнейшее прогрессирование гестоза.
При анализе перинатальных исходов получены следующие результаты. Гипотрофия у новорожденных в нашем исследовании выявлена в 3 (12,5 %) случаях при легком гестозе (1-ая подгруппа), в 12 (48 %) при гестозе средней степени тяжести (2-ая подгруппа) и в 14 (73,7 %) при тяжелом гестозе (3-я подгруппа).
При изучении уровней NSE, GFAP, VCAM у матерей этих новорожденных оказалось, что концентрация NSE у беременных, родивших гипотрофичных детей в 1-ой подгруппе составила 13,8 ± 0,4 нг/мл, по сравнению с 13,0 ± 0,1 нг/мл у матерей новорожденных с нормальным весом в данной подгруппе (p < 0,05). Уровни GFAP составили соответственно 5,2 ± 0,1 нг/мл и 4,4 ± 0,1 нг/мл (p < 0,05), уровни VCAM составили соответственно 34,3 ± 0,3 нг/мл и 32,1 ± 0,6 нг/мл (p < 0,05).
Во 2-ой подгруппе концентрация NSE и GFAP у матерей гипотрофичных новорожденных составила 15,4 ± 0,31 нг/мл и 6,9 ± 0,4 нг/мл соответственно по сравнению с 14,5 ± 0,26 нг/мл и 5,7 ± 0,2 нг/мл у женщин, родивших детей, соответствующих по весу и сроку гестации. Уровни VCAM составили соответственно 36,3 ± 0,6 нг/мл и 33,7 ± 0,4 нг/мл (различия достоверны, p < 0,05).
В 3-й подгруппе различия между уровнями NSE, GFAP, VCAM у беременных, родивших гипотрофичных детей и детей с нормальным весом, недостоверны (p > 0,05), однако необходимо учитывать тот факт, что в подгруппе с тяжелым гестозом имели место тяжелые осложнения, влияющие на уровни нейроспецифических белков (NSE и GFAP), VCAM в крови беременных (декомпенсированное нарушение маточно-плацентарного и плодово-плацентарного кровотока, преждевременная отслойка плаценты).
При проведении корреляционного анализа, выявлена прямая высоко достоверная связь между уровнями NSE, GFAP и VCAM в подгруппах с гестозом разной степени тяжести. Установлена прямая высоко достоверная связь между уровнями NSE и VCAM (p < 0,001), коэффициент корреляции rs равен 6,89. Так же установлена прямая высоко достоверная связь между уровнями GFAP и VCAM (p < 0,001), коэффициент корреляции rs равен 6,44. Данный анализ подтверждает корреляцию между повышением проницаемости ГЭБ и активацией эндотелия, имеющие место при гестозе.
В ходе проведенного исследования выявлено:
- в сыворотке крови беременных с гестозом определяются достоверно более высокие концентрации NSE, GFAP и VCAM по сравнению со здоровыми беременными с физиологически протекающей беременностью;
- выявлена достоверная связь между уровнями NSE, GFAP и VCAM в сыворотке крови беременных женщин с гестозом и выраженностью отечного синдрома, тяжестью гипертензии и величиной протеинурии;
- максимальные уровни NSE, GFAP и VCAM определяются при массивной протеинурии, генерализованных отеках и тяжелой гипертензии;
- высокие уровни NSE, GFAP и VCAM отмечаются при НМППК и сочетании нескольких симптомов фетоплацентарной недостаточности (нарушении МПК и ФПК, ЗВРП, преждевременное созревание плаценты, маловодие);
- выявлена высоко достоверная связь между уровнями исследуемых маркеров (NSE, GFAP и VCAM) в сыворотке крови беременных с гестозом и перинатальными исходами;
- при уровне NSE 13,19 ± 0,1 нг/мл, GFAP 4,47 ± 0,1 нг/мл, VCAM 32,29 ± 0,48 нг/мл гестоз имеет легкое течение и благоприятные исходы беременности и родов для матери и плода. Концентрация NSE 19,66 ± 0,5 нг/мл, GFAP 10,79 ± 0,69 нг/мл, VCAM 40,2 ± 1,16 нг/мл свидетельствует о тяжелом гестозе и необходимости родоразрешения не зависимо от срока беременности. Промежуточные значения NSE, GFAP, VCAM характерны для гестоза средней степени тяжести, при котором необходимо исследование белков в сыворотке крови беременных в динамике: нарастание уровней NSE, GFAP и VCAM является неблагоприятным прогностическим признаком.
Таким образом, количественное определение уровней VCAM, NSE и GFAP методом иммуноферментного анализа в сыворотке крови беременных с гестозом позволяет оценить степень тяжести данного осложнения беременности, в качестве дополнительного диагностического критерия.
Выводы
- У здоровых небеременных и беременных женщин при нормальном течении беременности не выявлена активация эндотелиоцитов. Концентрация маркера эндотелиоза VCAM находится в пределах нормальных значений (VCAM – 14,96 ± 0,33 нг/мл, NSE – 12,1 ± 0,1 нг/мл, GFAP – 3,75 ± 0,16 нг/мл), а клинические признаки (умеренное снижение АД, САД, отражающие ОПСС), подтверждают, что эндотелиоциты системы общей гемодинамики и микроциркуляции интактны.
- Клинические симптомы гестоза и степень их выраженности имеют различные варианты, однако стабильное повышение концентрации NSE и GFAP в сыворотке крови матери, а так же маркера эндотелиоза VCAM с высокой степенью вероятности отражают возникновение и степень тяжести этого осложнения.
- Диагностика гестоза, основанная на оценке клинико-лабораторных и инструментальных показателей, не всегда отражает истинную тяжесть его течения. Определение маркеров эндотелиоза позволяет прогнозировать прогрессирование гестоза: при максимальном проявлении одного или нескольких клинических признаков (отеки, артериальная гипертензия, протеинурия) и повышении концентрации NSE, GFAP и VCAM более чем в 1,6; 2,9 и 2,7 раз соответственно, с высокой вероятностью свидетельствует о возможности развития тяжелого гестоза.
- Максимальные уровни NSE, GFAP, VCAM определяются, прежде всего, при начавшемся до 30 - 34 недель беременности и длительно текущем (8 недель и более) гестозе, а также при тяжелой гипертензии, массивной протеинурии (>1г/л), генерализованных отеках, прогрессировании ФПН.
- Лечение тяжелого гестоза малоэффективно. Об этом свидетельствует высокое содержание НСБ и маркера эндотелиоза, неуклонное его прогрессирование, ухудшение состояния матери и плода, а так же отсутствие снижения маркера активации эндотелия - VCAM, маркеров повреждения нейронов и клеток глии – NSE и GFAP после проводимой терапии.
Практические рекомендации
- Для диагностики и прогнозирования развития гестоза у беременных целесообразно исследовать уровни NSE, GFAP, VCAM в сыворотке крови с 22 недель беременности. При уровнях NSE выше 12,1 ± 0,1 нг/мл, GFAP выше 3,75 ± 0,16 нг/мл, VCAM более 14,96 ± 0,33 нг/мл, вероятность развития гестоза составляет 95 %.
- Повышение уровней NSE, GFAP и VCAM до 30 недель беременности, исходные их уровни более 13,32 ± 0,1 нг/мл; 5,13 ± 0,15 нг/мл, 32,81 ± 0,18 нг/мл, свидетельствуют о развитии тяжелых форм гестоза.
- Начало гестоза до 30-32 недель беременности, длительность его течения более 7-8 недель независимо от степени выраженности отеков, протеинурии и гипертензии, максимальная выраженность хотя бы одного из клинических симптомов (отеков, протеинурии, гипертензии), наличие признаков фетоплацентарной недостаточности, тромбоцитопения, признаки выраженной гемоконцентрации, ДВС-синдрома, лабораторные признаки нарушения функций печени, почек, уровни NSE свыше 19,66 ± 0,5 нг/мл, GFAP свыше 10,79 ± 0,69 нг/мл и VCAM свыше 40,2 ± 1,16 нг/мл являются критериями тяжелого гестоза, требующими срочного родоразрешения.
По теме диссертации опубликовано 6 работ
- Сидорова И.С., Боровкова Е.И., Шеманаева Т.В. Возможности прогнозирования развития гестоза на основании оценки концентрации факторов клеточной адгезии. // Тезисы докладов. XIV Российский национальный конгресс «Человек и лекарство». – Москва, 16-20 апреля 2007. – С. 332.
- Сидорова И.С., Боровкова Е.И., Шеманаева Т.В. Роль факторов ангиогенеза в развитии гестоза. // Тезисы докладов. XIV Российский национальный конгресс «Человек и лекарство». – Москва, 16-20 апреля 2007. – С. 31.
- Сидорова И.С., Боровкова Е.И., Шеманаева Т.В. Роль окислительного стресса в патогенезе гестоза. // Акушерство и гинекология. – 2007. – №3. – С. 3-5.
- Сидорова И.С., Боровкова Е.И., Шеманаева Т.В., Солоницын А.Н., Прогностические критерии тяжести течения гестоза. // Проблемы беременности. Научно-практический журнал. Москва. – 2007. – № 17. – С. 49-54.
- Сидорова И.С., Боровкова Е.И., Шеманаева Т.В. Роль иммунного воспаления плаценты в генезе осложненного течения беременности. // Вестник РАМН. – 2007. – № 9– С. 32-37.
- Шеманаева Т.В., Сидорова И.С., Гурина О.И. Прогностическая значимость VCAM в оценке тяжести гестоза. // Акушерство и гинекология. – 2008. – №2. – С. 16-18.
