Ультраструктурные и гистохимические особенности половой системы бескишечных турбеллярий (acoela) и их филогенетическое значение

На правах рукописи

ПЕТРОВ Анатолий Александрович

УЛЬТРАСТРУКТУРНЫЕ И ГИСТОХИМИЧЕСКИЕ ОСОБЕННОСТИ ПОЛОВОЙ СИСТЕМЫ БЕСКИШЕЧНЫХ ТУРБЕЛЛЯРИЙ (ACOELA) И ИХ ФИЛОГЕНЕТИЧЕСКОЕ ЗНАЧЕНИЕ

Специальность: 03.00.08 – зоология

АВТОРЕФЕРАТ

диссертации на соискание ученой степени кандидата биологических наук

Санкт-Петербург

2007

Работа выполнена в Лаборатории эволюционной морфологии Зоологического института Российской Академии наук.

Научный руководитель: доктор биологических наук,

профессор Ю.В. Мамкаев

Официальные оппоненты: доктор биологических наук,

А.Б. Шатров

доктор биологических наук,

Г.С. Слюсарев

Ведущее учреждение: Российский государственный

педагогический университет

им. А.И. Герцена

Защита состоится 28 февраля 2007 г. в 14 часов на заседании Диссертационного Совета Д 002 223.02 при Зоологическом институте РАН по адресу: 199034, Санкт-Петербург, Университетская набережная 1, факс (812) 328-2941.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Зоологического института РАН.

Автореферат разослан «___» ___________ 2007 г.

Ученый секретарь

Диссертационного Совета,

доктор биологических наук В.Г. Сиделева

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность проблемы. Трудно назвать другую группу среди низших беспозвоночных, столь же парадоксальную с точки зрения морфологии и физиологии, какой являются бескишечные турбеллярии (Acoela), мелкие морские червеобразные животные, населяющие различные прибрежные биотопы. Для этого отряда характерна уникальная организация пищеварительного аппарата, и почти столь же необычно строение их нервной системы и половых органов. По существу, бескишечные турбеллярии устроены проще, чем любые другие свободноживущие билатерии, причем простота их организации, скорее всего, отражает филогенетическую примитивность – молекулярные данные показывают, что Acoela являются сестринской группой для всех ныне живущих трехслойных животных (см. обзор в Bagu & Ruitort 2004).

Простота организации бескишечных турбеллярий служит серьезным препятствием при установлении филогенетических связей в пределах группы, существенно ограничивая число признаков, которые могут быть использованы при построении таксономической системы. В этой ситуации органы половой системы, достигающие у Acoela сложности, необычной на фоне примитивности других систем, становятся незаменимыми (а иногда и единственными) источниками филогенетической информации. В то время как признаки мужских копулятивных органов широко используются в принятой сегодня системе (Drjes, 1968), органы женского полового аппарата (бурсы и их наконечники) изучены мало и, по существу, остаются за пределами внимания исследователей. Наконечники бурс представляют собой сложные многоклеточные образования и, очевидно, что стандартные гистологические методики недостаточны для их всестороннего изучения. В этой ситуации неоценимую помощь могут оказать методы электронной микроскопии. К сожалению, в настоящее время существует лишь одна работа (Brggemann 1985), в которой наконечники бурс рассматриваются на ультраструктурном уровне.

Особенности ультраструктуры спермиев активно используются систематиками при исследовании самых разных групп беспозвоночных. Недавно было показано их потенциальное значение и в систематике бескишечных турбеллярий (Raikova et al. 2001; Hooge et al. 2002). К сожалению, на текущий момент ультраструктура спермиев известна только для 32 видов Acoela и лишь примерно половина спермиев из этого списка исследована достаточно детально для того, чтобы на основе этой информации можно было делать таксономические или филогенетические выводы.

В целом, построение таксономической системы Acoela еще далеко от завершения, и комплексное исследование спермиев и женских половых органов, предпринятое в данной работе, может привести к существенному прогрессу в этом вопросе.

Цели и задачи исследования. Цель исследования – дать сравнительную и функциональную характеристику спермиев и наконечников бурс бескишечных турбеллярий и выявить таксономически значимые признаки.

В задачи работы входило:

• выбрать представителей с неясным или спорным таксономическим положением;
• провести ультраструктурное исследование спермиев;
• выяснить функциональную роль элементов цитоскелета в локомоции спермиев;
• провести комплексное (ультраструктурное и гистохимическое) исследование бурс и их склеротизированных придатков;
• выяснить функциональную роль склеротизированных придатков бурс и вероятные пути их эволюции;
• провести таксономическую оценку рассмотренных семейств Acoela.

Научная новизна работы. Проведен анализ ультраструктурной организации спермиев у 11 представителей бескишечных турбеллярий. Кроме четырех типов ацельных спермиев, уже описанных другими авторами, выявлены два новых типа с промежуточными характеристиками микротрубочкого цитоскелета. Впервые описаны цитоплазматические микротрубочки у спермиев сем. Mecynostomidae. Обосновано положение о функциональной взаимосвязи между двигательным аппаратом спермия (аксонемами) и его цитоскелетом. Рассмотрены особенности эволюции спермиев в пределах отряда, представлена эволюционная схема, обобщающая молекулярные и ультраструктурные данные.

Проведено первое детальное сравнительно-анатомическое исследование бурс и их склеротизированных придатков. Впервые применен комплексный подход к изучению строения наконечников с использованием электронной микроскопии и гистохимических методов (окраска фаллоидином). Органы женской половой системы были исследованы у 7 представителей Acoela. Выявлена высокая морфологическая изменчивость наконечников бурс. Одновременно в работе были обнаружены также и общие признаки, характеризующие все исследованные склеротизированные придатки. В частности, показано, что наконечники, также как и стенка бурсы, во всех случаях состоят из специализированных уплощенных клеток, расположенных концентрическими слоями. В целом выделено четыре основных типа склеротизированных придатков. Установлено, что так называемые клеточные колпачки представляют собой специализированную форму наконечников. Приводятся новые данные о функциональной роли наконечников и об их участии в оплодотворении. В качестве обобщения представлена картина формирования вооружения и опорных структур в разных группах низших билатерий: показано, что во многих случаях эти структуры являются дериватами элементов цитоскелета, в состав которых входят актиновые микрофиламенты.

Теоретическое и практическое значение. Данные по ультраструктуре спермиев могут послужить хорошей теоретической основой для установления таксономических групп ранга семейства и надсемейства, как было показано на примере конволютид и изодиаметрид. Эти результаты также важны для понимания закономерностей эволюции спермиев как в пределах Acoela, так и в других группах беспозвоночных. Техника фаллоидиновой окраски может в дальнейшем быть использована для уточнения морфологических данных по наконечникам бурс, так как она предоставляет исключительно точную информацию по распределению актиновых микрофиламентов в клетках и не требует сложного оборудования и больших затрат времени. Новые данные по морфологии спермиев и наконечников бурс могут найти свое отражение в учебниках и монографиях по бескишечным турбелляриям.

Публикации. По теме диссертации опубликовано 7 научных работ, из них 5 на английском языке.

Апробация работы. Результаты исследований были доложены на Международных конференциях: Twelfth International Meiofauna Conference (TWIMCO) (Равенна, 2004 г.), Society of Integrative and Comparative Biology (SICB) Annual Meetings (Новый Орлеан, 2004 г. и Сан Диего, 2005 гг.), а также на Отчетной сессии Зоологического ин-та РАН (Санкт-Петербург, 2006 г.)

Структура и объем работы. Основной текст диссертации изложен на 152 страницах, состоит из введения, 4 глав, общего заключения, выводов и списка литературы. Список литературы содержит 25 отечественных и 134 иностранных названий. Иллюстративный материал включает 51 рисунок и 2 таблицы.

Благодарности. Автор выражает глубокую и искреннюю благодарность своим научным руководителям: проф. С. Тайлеру (S. Tyler) и проф. Ю.В. Мамкаеву. Австралийский материал (Daku woorimensis, Stomatricha hochbergi и Wulguru cuspidata) был любезно предоставлен д-ром Мэттью Хуги (Matthew Hooge). Беломорский материал Aphanostoma virescens был собран проф. Ю.В. Мамкаевым и д-ром О.И. Райковой. Работа выполнена при поддержке гранта РФФИ № 06-04-48053.

СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ

ГЛАВА 1. СРАВНИТЕЛЬНАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА ПОЛОВОЙ СИСТЕМЫ БЕСКИШЕЧНЫХ ТУРБЕЛЛЯРИЙ

1.1. Общий обзор половой системы. В разделе приводится краткая характеристика половой системы Acoela – особое внимание уделяется мужским и женским копулятивным органам.

1.2. Ультраструктура спермиев. На светооптическом уровне спермии, принадлежащие разным группам Acoela, лишь незначительно отличаются друг от друга. Сперматозоиды бескишечных турбеллярий имеют нитевидную или лентовидную форму и неизменно несут две аксонемы, инкорпорированные в цитоплазму клетки. В спермиях бескишечных турбеллярий обычно можно различить три отдела. В проксимальном участке сперматозоида расположено удлиненное ядро. Далее следует промежуточный, или средний, отдел, включающий все крупные клеточные органеллы (митохондрии и цитоплазматические гранулы). Последний, дистальный, участок спермия образует узкий хвостовой отдел – в этот отдел заходят лишь аксонемы, прочие цитоплазматические органеллы в нем отсутствуют. В спермиях обнаруживаются два типа включений, отграниченных от цитоплазмы мембраной. Более крупные преломляющие гранулы хорошо видны при изучении мазков спермиев методами фазово-контрастной микроскопии, благодаря своим светопреломляющим свойствам. Так называемые плотные включения обычно мельче преломляющих гранул и на светомикроскопическом уровне, как правило, не просматриваются.

Ультраструктурные исследования выявили существенные вариации во внутренней организации спермиев. Это разнообразие в значительной степени определяется составом и расположением микротрубочек, как тех, что формируют аксонемы, так и тех, что лежат непосредственно в цитоплазме спермия. У большинства представителей Acoela аксонемы спермиев имеют конфигурацию (далее обозначаемую как 9+2), обычную для ресничек и жгутиков: девять дуплетов по периферии аксонемы и пара синглетов в центре (рис. 1а, б). Описаны еще два варианта организации аксонем (9+1 и 9+0): в первом случае редуцируется одна из центральных микротрубочек (рис. 1в), во втором – исчезают оба центральных синглета (рис. 1г).

Рис. 1. Типы спермиев бескишечных турбеллярий. а – аксонемы 9+2 и кортикальные микротрубочки; б – аксонемы 9+2 и аксиальные микротрубочки; в – аксонемы 9+1, конфигурация цитоплазматических микротрубочек неизвестна; г – аксонемы 9+0 и аксиальные микротрубочки.

У большинства исследованных спермиев с аксонемами 9+2 цитоплазматические микротрубочки располагаются в кортикальной области клетки и ориентированы более или менее параллельно продольной оси спермия (рис. 1а). У некоторых спермиев с аксонемами 9+2 и у всех спермиев с аксонемами 9+0 цитоплазматические микротрубочки расположены одной или несколькими группами ближе к центру клетки (аксиальные микротрубочки - рис. 2б, г). Спермии с аксонемами формулы 9+1 тоже, как правило, относят к этой группе (см., например, Raikova 2001), однако на самом деле цитоплазматические микротрубочки у этих спермиев неизвестны (рис. 2в).

1.3. Семенные сумки и их придатки. Женские копулятивные органы бескишечных турбеллярий имеют весьма разнообразное строение. Как правило, присутствует одна или несколько семенных сумок (бурс), чаще всего открывающихся на поверхность эпителизованным каналом (вагиной, или влагалищем) – бурсы служат резервуарами для хранения спермы партнера, прежде чем та поступит к оплодотворяемому яйцу.

У многих видов семенные сумки образуют придатки в форме жестких склеротизированных трубок (мундштуков, или наконечников, бурс). Принято считать, что наконечник представляет собой специализированный семенной канал (ductus spermaticus), служащий для подведения спермиев к оплодотворяемым яйцеклеткам.

Детали ультраструктуры наконечника известны лишь для одного вида бескишечных турбеллярий – Philocelis cellata (Brggemann 1985, 1986). Наконечник образован склеротизированной трубкой, отходящей от стенки бурсы в направлении ооцитов, конусовидно сужаясь к своему дистальному концу. Основу трубки составляют дисковидные склеротизированные клетки, расположенные в ряд наподобие стопки тарелок. В центре каждая клетка пронизана отверстием, причем отверстия расположены друг над другом, образуя единый канал. Клеточные тела, содержащие уплощенные ядра, занимают периферию дисков, формируя расширенный внешний край. Внутренний край клеток, прилегающий к просвету канала, также образует шайбовидное расширение, причем цитоплазма этой центральной части заполнена плотным фибриллярным материалом, укрепляющим канал наконечника. Таким образом, каждая склеротизированная клетка имеет вздутые края по внешней и внутренней окружностям, между которыми цитоплазма сужена в тонкую пластинку. Промежуточные клетки расположены в пространствах, образованных тонкими участками дисков; эти клетки не содержат фибриллярного вещества и никогда не достигают просвета канала.

Для некоторых видов бескишечных турбеллярий было недавно показано, что фибриллярный материал, участвующий в склеротизации наконечников, представлен актиновыми филаментами (Hooge & Tyler 2001).

1.4. Функциональная роль наконечников. Согласно мнению, которое разделяет сегодня большинство исследователей, наконечники используются в качестве каналов, по которым хранящаяся в семенных сумках сперма партнера поступает в область яичников, где осуществляется оплодотворение. Тем не менее, высказывались и другие гипотезы – предполагалось, что наконечники могут резорбировать избыточную сперму (Graff 1874; Costello & Costello 1968), прокалывать покровы партнера перед осеменением (Gardiner 1898), осуществлять сортировку, дозировку (Henley 1974; Богута 1971; Brggemann 1985) или модификацию спермы (Богута 1971), принимать участие в наружно-внутреннем оплодотворении (Мамкаев, 1967).

1.5. Замечания по терминологии. В разделе приводится список ключевых терминов, используемых в диссертации.

ГЛАВА 2. МАТЕРИАЛ И МЕТОДИКА

Использованные в работе животные (табл. 1) экстрагировались из грунта или с водорослей с помощью водных растворов хлористого или сернокислого магния изотонических морской воде (Sterrer 1971). Для исследования ультраструктуры материал фиксировался в 2,5%-ном растворе глутаральдегида на фосфатном буфере при температуре 4С. Далее животных постфиксировали в 1%-ном растворе OsO4 на фосфатном буфере с последующим проводкой через серию водных растворов ацетона повышающейся концентрации. В качестве заливочных смол использовалась смесь Аралдита с Эпоном (EMBed/Araldite). Полутонкие и ультратонкие срезы получали на ультратоме Sorval 2MT-B с использованием стеклянных и алмазных ножей. Полутонкие срезы (3-5 мкм толщиной) окрашивались раствором толуидинового синего. Контрастирование ультратонких срезов проводилось на сетках в водном растворе уранилацетата и цитрата свинца. Фиксация и проводка были ускорены посредством микроволнового излучения (на микроволновой печке Samsung – 7-секундное излучение при 650 Вт, разделенное 20-секундным интервалом: Giberson & Demaree 1995). Материал изучался на электронном микроскопе Philips CM10. Электронные микрофотографии были получены с помощью цифровой камеры (CCD Camera, BioScan, Gatan).

Животных, приготовленных для исследования посредством конфокальной лазерной микроскопии, фиксировали в растворе 4%-ного формалина и окрашивали снабженным флуоресцентной меткой фаллоидином (Alexa 488; Molecular probes, Eugene, OR) по Hooge (2001).

Для изготовления мазков спермиев и последующего их изучения методами контрастной микроскопии, животные придавливались покровным стеклом с постепенным увеличением давления, пока спермии не выходили наружу через разрыв в стенке тела.

Таблица 1. Исследованный материал

Вид	Место сбора
Isodiametridae Hooge & Tyler, 2005
Aphanostoma bruscai Hooge & Tyler 2003	Wadsworth Cove, Кастин, шт. Мэн, США
Aphanostoma virescens rsted, 1845	Bamfield Marine Science Centre, Бэмфилд, Канада; Orr Cove, шт. Мэн, США; м. Картеш, Белое море, РФ
Isodiametra pulchra (Smith & Bush, 1991)	Mt. Desert Island, шт. Мэн, США
Praeconvoluta tigrina Hooge & Tyler, 2003	Reid State Park, шт. Мэн, США
Pseudaphanostoma smithrii Hooge & Tyler, 2003	Reid State Park, шт. Мэн, США
Convolutidae Graff, 1905
Wulguru cuspidata Winsor, 1988	Bribie Island, Квинслэнд, Австралия
Dakuidae Hooge, 2003
Daku woorimensis Hooge, 2003	Stradbroke Island, Квинслэнд, Австралия
Mecynostomidae Drjes, 1968
Paedomecynostomum bruneum Drjes, 1968	Reid State Park, шт. Мэн, США
Pseudmecynostomum phoca Hooge & Tyler, 2003	Reid State Park, шт. Мэн, США
Otocelididae Westblad, 1948
Notocelis gullmarensis (Westblad, 1946)	Mt. Desert Island, шт. Мэн, США
Otocelis sandara Hooge & Tyler, 2003	Cobscook Bay, шт. Мэн, США
Philocelis brueggemanni Hooge & Tyler 2003	Cobscook Bay, шт. Мэн, США
Stomatricha hochbergi Hooge, 2003	Bribie Island, Квинслэнд, Австралия

ГЛАВА 3. УЛЬТРАСТРУКТУРА СПЕРМИЕВ

3.1. Результаты. Раздел посвящен описанию ультраструктуры спермиев у 11 представителей бескишечных турбеллярий.

3.1.1, 3.1.2. Praeconvoluta tigrina, Isodiametra pulchra, Pseudaphanostoma smithrii, Aphanostoma bruscai (рис. 2а). Аксонемы имеют обычную структуру 9+2 и заходят далеко в проксимальный отдел спермия, перекрываясь с ядром почти на всем его протяжении. У спермиев P. smithrii центральная пара микротрубочек исчезает у дистального конца ядра и аксонемы принимают форму 9+0. Кортикальные микротрубочки тянутся по всей длине среднего отдела, располагаясь на равном расстоянии друг от друга. У всех четырех видов поверхность клетки покрыта мембранной орнаментацией в виде регулярно расположенных продольных гребней.

Рис. 2. Схема, иллюстрирующая ультраструктуру спермиев у исследованных видов (поперечные профили зрелых спермиев).

3.1.3. Otocelis sandara. Спермий обладает выраженной билатеральной симметрией: аксонемы расположены не по бокам ядра, но сближены на одной стороне спермия. Аксонемы имеют структуру 9+2 и тянутся по всей длине клетки, оканчиваясь почти у самого проксимального конца ядра. В ядросодержащем отделе все цитоплазматические микротрубочки лежат на периферии клетки (в кортикальной позиции – рис. 2, b1), но дистальнее ядра некоторые из них сдвигаются к центру клетки, образуя две латеральные полуцилиндрические группы вблизи аксонем – эти микротрубочки желобообразно охватывают скопление плотных гранул, так что последние оказываются «зажатыми» между ними и поверхностной мембраной спермия (рис. 2, b2). В среднем отделе цитоплазматические микротрубочки формируют два диагональных ряда ближе к центру спермия (рис. 2, b3).

3.1.4. Philocelis brueggemanni. Аксонемы формулы 9+2 заканчиваются в проксимальной части ядросодержащего отдела, перекрываясь с ядром почти по всей его длине. Цитоплазматические микротрубочки аксиального типа. Начинаясь у основания ядра, они образуют на этом участке 4 узкие ленты по 3 или 4 микротрубочки в каждой. Ленты расположены в виде креста с центром приблизительно вдоль главной оси спермия, однако микротрубочки не встречаются на перекрестье, но лежат на значительном расстоянии друг от друга; по центру же креста (то есть вдоль продольной оси спермия) расположена цепочка преломляющих гранул (рис. 2, g1). На некотором удалении от ядра ряды микротрубочек, образующие «перекладины» креста, сливаются попарно, образуя две новые ленты по 7 микротрубочек в каждой; эти ленты идут более или менее параллельно друг другу и лежат в плоскости, перпендикулярной плоскости аксонем (рис. 2, g2).

3.1.5. Notocelis gullmarensis. Аксонемы тянутся по бокам ядра и оканчиваются на самом проксимальном конце спермия. Конфигурация микротрубочек имеет вид 9+2 в дистальной области спермия (ближе к центриолям – рис. 2, c3), но принимает форму 9+0 в проксимальной части среднего отдела и в районе ядра (рис. 2, c1, c2). В хвостовой части спермия и в дистальной половине среднего отдела цитоплазматические микротрубочки занимают кортикальное положение (рис. 2, c3). Начинаясь непосредственно на границе между средним и хвостовым отделами, кортикальные микротрубочки уменьшаются в числе в проксимальном направлении, исчезая совсем, немного не доходя до ядра. В той части спермия, где аксонемы сопровождаются кортикальными микротрубочками, они сохраняют структуру 9+2. Уникальной чертой сперматозоидов N. gullmarensis является присутствие осевого стержня, органеллы узкоцилиндрической формы, состоящей из 5 или 6 тесно прилегающих аксиальных микротрубочек. Осевой стержень направлен более или менее параллельно продольной оси спермия, начинаясь у его проксимального конца и заканчиваясь несколько позади ядра. Осевой стержень, таким образом, проходит вдоль всей ядросодержащей части спермия, смещая ядро в эксцентрическое положение (рис. 2, c2). В той своей части, где аксонемы сопутствуют осевому стержню, они имеют структуру 9+0. Спермиогенез N. gullmarensis обнаруживает необычные черты. Все сперматиды имеют характерную особенность: одна из аксонем у такой сперматиды инкорпорирована в цитоплазму, а вторая остается свободной. Асимметрия спермиогенеза, по-видимому, связана с присутствием в цитоплазме осевого стержня, который смещает ядро на периферию клетки и тем самым затрудняет инкорпорацию ундулиподии на этой стороне спермия.

3.1.6. Paedomecynostomum bruneum (рис. 2, f). Аксонемы организованы по типу 9+1. Цитоплазматические микротрубочки аксиального типа; в данном случае они не собраны в группы, но лежат обособленно друг от друга, концентрируясь вокруг расположенных вдоль оси клетки митохондрий. Микротрубочки связаны с митохондриями и плотными гранулами посредством тонких актиноподобных филаментов.

3.1.7. Daku woorimensis (рис. 2, d). Спермий несет на поверхности многочисленные нитевидные придатки (микроподии). Аксонемы имеют типичную организацию 9+2 и проходят по всей длине спермия, заканчиваясь проксимальнее ядра. В проксимальной части ядросодержащего отдела, цитоплазматические микротрубочки занимают кортикальное положение, образуя две узкие ленты по 4-10 микротрубочек в каждой (рис. 2, d1).

Дистальнее, число микротрубочек в каждой группе увеличивается до 20, а сами ленты желобообразно изгибаются, охватывая ядро с противоположных сторон (рис. 2, d2). В дистальной части среднего отдела оба кластера микротрубочек, как правило, объединяются в центре спермия, образуя на поперечных срезах фигуру, напоминающую восьмерку. В хвостовом отделе спермия микротрубочки снова разделяются, принимая вид пары цилиндров, каждый из которых окружает цепочку плотных гранул (рис. 2, d3).

3.1.8. Stomatricha hochbergi. Кариоплазма имеет характерную слоистую структуру. Аксонемы формулы 9+0 оканчиваются немного не доходя до ядра, в среднем отделе они несколько обособлены от тела спермия в виде ундулирующих мембран. Непосредственно позади ядра расположен короткий правильный цилиндр, составленный из 8 связанных между собой микротрубочек (рис. 2, e1). В среднем отделе спермия цилиндр распадается на две ленты по 4 микротрубочки в каждой (рис. 2, e2, e3). В дистальной части среднего отдела правильность лент несколько нарушается: в некоторых случаях крайние микротрубочки в каждом ряду смещаются вовнутрь и обе группы приобретают форму четырехгранных стержней (рис. 2, e2). В хвостовом отделе остаются лишь 4 микротрубочки, лежащие на периферии клетки (рис. 2, e4).

3.1.9. Wulguru cuspidata. Аксонемы формулы 9+0 заходят в ядросодержащий отдел, несколько перекрываясь с ядром. Микротрубочки аксиального типа. Начинаясь у основания ядра, они образуют широкий цилиндр, состоящий из 11-15 микротрубочек (рис. 2, h1). В поперечном сечении симметрия цилиндра чаще всего нарушена, и тот принимает веретеновидную или каплевидную форму. Дистальнее, микротрубочки расщепляются на две параллельные ленты (по 5-7 микротрубочек в каждой), расположенные по оси клетки перпендикулярно плоскости, в которой лежат аксонемы (рис. 2, h2).

3.2. Обсуждение. В разделе обсуждаются ультраструктурные особенности спермиев, их таксономическое и филогенетическое значение. Показаны возможные пути эволюционных преобразований спермиев в пределах отряда.

3.2.1. Типы спермиев Acoela и их таксономическое значение. Результаты исследований ультраструктуры спермиев в целом подтверждают валидность тех групп ранга надсемейства, которые были установлены в процессе анализа гена 18S рибосомной ДНК (Hooge et al. 2002). Варианты организации спермиев, выявленные мной у 11 видов бескишечных турбеллярий соответствуют четырем группам, выделенным в статьях Raikova et al. 2001 и Hooge et al. 2002; кроме того, мной были описаны спермии, которые могут представлять собой промежуточные состояния.

По морфологическим признаками и по молекулярным данным семейство Convolutidae распадается на две неродственные группы. Обозначенные в статье Hooge et al. 2002 как «крупные» и «мелкие» конволютиды (в соответствии с размерами тела), эти группы недавно приобрели официальный таксономический статус – «мелкие конволютиды» были выделены в отдельное семейство Isodiametridae (см. Hooge & Tyler 2005), «крупные конволютиды» остались в семействе, за которым было сохранено прежнее название. В настоящей работе исследовано 4 вида турбеллярий, относящихся к сем. Isodiametridae - Aphanostoma bruscai, Praeconvoluta tigrina, Isodiametra pulchra, Pseudaphanostoma smithrii – ­и один вид - Wulguru cuspidata - относящийся к сем. Convolutidae. У всех изученных представителей изодиаметрид были обнаружены сперматозоиды одного типа: с аксонемами формы 9+2 и симметрично расположенными кортикальными микротрубочками, проходящими по всему промежуточному отделу спермия. Другой особенностью, обнаруженной у всех 4-х видов, является мембранная орнаментация в виде продольных гребней или ребер. В отличие от изодиаметрид, сперматозоиды представителей конволютид (включая Wulguru cuspidata) имеют аксиальные микротрубочки и аксонемы с формулой 9+0. Конфигурация цитоплазматических микротрубочек сходна у всех 5 исследованных видов семейства – непосредственно под ядром они образуют цилиндр, который распадается далее на две параллельные ленты. Таким образом, строение спермиев подтверждает монофилетичность как конволютид, так и изодиаметрид, и служит убедительным аргументом в пользу их филогенетической обособленности.

Еще одним видом, попадающим в группу 9+0, является Stomatricha hochbergi. Изначально S. hochbergi была описана как представитель Otocelididae, однако ее спермии оказались практически идентичными по своей структуре спермиями, описанным ранее у двух видов конволютид – Convoluta boyeri и C. philippinensis (см. Boyer & Smith 1982). Мускулатура цирруса Stomatricha состоит из анастомозирующих продольных волокон, что в соответствии с новой системой является ключевым диагностическим признаком конволютид. Форма тела Stomatricha с подогнутыми краями весьма характерна для конволютид, и совсем не встречается у отоцелидид. Перечисленные признаки оправдывают перенесение этого вида в семейство Convolutidae (Hooge & Tyler 2005). Выделение Stomatricha из отоцелидид, несмотря на наличие признака, считающегося диагностическим для этого семейства, подчеркивает сомнительный таксономический статус этой группы.

Разнообразие типов спермиев, обнаруженное у 3-х других представителей семейства, также говорит о полифилетическом характере отоцелидид. В то время как спермий Otocelis sandara имеет строение, считающееся исходным для бескишечных турбеллярий (аксонемы формулы 9+2 и кортикальные микротрубочки, хотя некоторые из них и погружаются в цитоплазму), у Philocelis brueggemanni мы находим спермии с типичными аксиальными микротрубочками, а спермии Notocelis gullmarensis демонстрируют промежуточное состояние, имея аксонемы структуры 9+2 и кортикальные микротрубочки дистально, но аксонемы вида 9+0 и аксиальные микротрубочки (осевой стержень) проксимально. Конфигурация цитоплазматических микротрубочек у Philocelis brueggemanni имеет существенное сходство с таковой спермиев Philactinoposthia saliens (см. Raikova & Justine 1999), что свидетельствует о родственных отношениях между этими видами.

В настоящей работе впервые описаны аксиальные микротрубочки для спермиев с формулой аксонем 9+1, у представителя семейства Mecynostomidae – Paedomecynostomum bruneum. В отличие от других спермиев с аксиальными микротрубочками, микротрубочки у этого вида не собраны в группы, а распределены по всей цитоплазме и ассоциированы с митохондриями и плотными гранулами. Анализ литературы показывает, что сходные по строению аксиальные микротрубочки могут быть найдены и у других представителей семейства Mecynostomidae.

3.2.2. Эволюция спермиев. В качестве одного из возможных путей эволюции цитоплазматических микротрубочек предлагается следующий эволюционный ряд, включающий описанные в работе спермии как промежуточные варианты (рис. 3). Исходным считается состояние, когда все цитоплазматические микротрубочки занимают кортикальное положение. У Otocelis sandara значительная часть микротрубочек еще располагается в кортикальной позиции, но некоторые из них уже вытесняются плотными гранулами к центру клетки и формируют две зеркально-симметричные полуцилиндрические группы. Организация микротрубочек Otocelis sandara представляет, вероятно, первый шаг на пути, ведущем к появлению аксиальных микротрубочек. У Daku woorimensis наблюдается более продвинутое состояние – сходные парные группы микротрубочек уже почти полностью отделены от плазматической мембраны и имеют вид нерегулярных цилиндрических лент, каждая из которых окружает цепочку плотных гранул. У бескишечных турбеллярий с аксонемами формулы 9+0 (Sagittiferidae, Convolutidae и часть Anaperidae) сохраняется только один из этих микротрубочковых цилиндров, в спермиях этого типа он занимает центральное (аксиальное) положение в клетке. Потеря одного микротрубочкового цилиндра у высших Acoela подтверждается тем, что у D. woorimensis число аксиальных микротрубочек приблизительно вдвое выше, чем у представителей конволютид и анаперид.

Рис. 3. Морфологический ряд, показывающий возможный путь эволюционных изменений спермиев от состояния с кортикальными микротрубочками (слева) до состояния, характерного для спермиев с аксонемами 9+0 (справа).

3.2.3. Цитоскелет спермиев: морфофункциональные аспекты. В соответствии с общепринятой сегодня скользящей моделью, конформационные изменения динеиновых ручек, связанных с периферическими микротрубочками, вызывают изгиб аксонемы, при этом центральная пара микротрубочек вместе с окружающим ее цилиндром благодаря своей упругости обеспечивает возвратное движение, приводящее к выпрямлению ундулиподии. Приведенная схема верна для движения свободных жгутиков, но у спермиев бескишечных турбеллярий аксонемы инкорпорированы в цитоплазму и, следовательно, существующая модель нуждается в некоторых уточнениях. У Acoela все цитоплазматическое тело спермия изгибается как единое целое – в этой ситуации роль упругого стержня, опосредующего выпрямление спермия при возвратном движении аксонем, принимают на себя цитоплазматические (в основном, аксиальные) микротрубочки. В связи с этим интересно отметить, что отсутствие центральных микротрубочек в аксонемах почти всегда коррелирует с наличием аксиальных микротрубочек в цитоплазме. Это правило распространяется и на аберрантные спермии Notocelis gullmarensis – в дистальной части спермия мы встречаем кортикальные микротрубочки и аксонемы 9+2, а в проксимальной части, где расположен аксиальный стержень, аксонемы приобретают структуру 9+0. Вероятно, когда аксиальные микротрубочки принимают на себя функцию разгибателей, центральные микротрубочки в аксонемах, ранее выполнявшие аналогичные задачи, становятся ненужными, и, как следствие, полностью пропадают в этой эволюционной линии.

Таким образом, как и следовало ожидать, эволюционные изменения спермиев и их цитоскелета определяются, прежде всего, локомоторными задачами – необходимостью находить путь к яйцеклетке, двигаясь в вязкой среде, каковой являются межклетники паренхимы. Эта необходимость привела к возникновению инкорпорированных в цитоплазму аксонем, что, в свою очередь, определило дальнейшее направление эволюции по совершенствованию и дифференцировке элементов цитоскелета. При движении к более продвинутым формам происходит постепенная консолидация цитоплазматических микротрубочек с образованием осевого цилиндра в центре клетки, что, в конечном счете, приводит к появлению спермиев с более совершенными морфодинамическими характеристиками.

ГЛАВА 4. УЛЬТРАСТРУКТУРА И ГИСТОХИМИЯ БУРС И ИХ НАКОНЕЧНИКОВ

4.1. Результаты. Раздел посвящен описанию бурс и их склеротизированных придатков у 7 представителей бескишечных турбеллярий.

4.1.1. Notocelis gullmarensis. Небольшая бурса овальной формы с каудальной стороны открывается на поверхность широкой безресничной вагиной. Короткий бочонковидный наконечник направлен вперед, к яичнику. Стенка бурсы составлена из серии тонких, плотно упакованных, концентрических слоев. Уплощенные ядра располагаются в стенке бурсы без какой-либо упорядоченности. Наконечник состоит из 10-12 расширенных на концах отростков, принадлежащих клеткам стенки; отростки несколько отогнуты внутрь, в полость бурсы. Преддверие и промежуточные клетки отсутствуют. Актиновые микрофиламенты сосредоточены в основном в концевых участках отростков, окружающих канал наконечника.

4.1.2. Daku woorimensis. Вытянутая в дорсо-вентральном направлении бурса занимает положение непосредственно перед мужским совокупительным аппаратом. С фронтальной стороны стенка бурсы утолщена, образуя клеточный колпачок, обычно упирающийся и даже вдавленный в яйцо. Колпачок содержит тела клеток уплощенной формы, чьи периферические отростки образуют собственно стенку бурсы, так что последняя составлена из серии тонких концентрических клеточных слоев (n > 20) и лишена ядер. БольDefault (Version 1): Global-Right-Button05b.pngшинство ядер лежит ближе к периферии клеточного колпачка, а их центральные отростки формируют серию склеротизированных сегментов (n>10). Колпачок состоит из клеток двух типов. Эти клетки отчетливо различаются по электронной плотности, и так как они расположены чередующимися рядами, создается впечатление, что электронноплотные слои перемежаются в колпачке с электронносветлыми. Клетки с более электронноплотной цитоплазмой принимают участие в формировании склеротизированных сегментов, а электронносветлые клетки заполняют пространство между сегментами. Сегменты расположены в виде цепочки и уменьшаются в размере к периферии колпачка. В покоящемся состоянии, когда колпачок лишен спермы, канал каждого склеротизированного сегмента закрыт, наподобие пробки, так называемой осевой клеткой. В колпачке, через который проходит сперма, осевые клетки в канале либо отсутствуют, либо демонстрируют признаки дегенерации. У некоторых экземпляров колпачок содержит крупные лакуны, расположенные между соседними сегментами и заполненные плотно упакованными спермиям.

4.1.3. Aphanostoma bruscai. Вытянутая в дорсо-вентральном направлении бурса открывается в общий антрум короткой ресничной вагиной. В месте соединения с вагиной стенка бурсы образует пузыревидное расширение, обособленное от остальной бурсы узкой трубковидной перетяжкой. Вентрально стенка бурсы утолщается, формируя клеточный колпачок. На ультраструктурном уровне клеточный колпачок представляет собой стопку уплощенных клеток, расположенных в виде розетки вокруг общего центра. Стенка бурсы образована уплощенными периферическими отростками, отходящими от клеток колпачка и окружающими бурсу 25-30 плотно упакованными слоями. Все ядросодержащие части клеток расположены внутри клеточного колпачка и в прилегающем к вагине пузыревидном придатке – стенки же бурсы полностью лишены ядер. Склеротизированные сегменты образованы центральными отростками клеток колпачка, усиленными сетью актиновых микрофиламентов. Микрофиламенты заполняют все пространство клеточного отростка в той его части, которая прилегает к просвету канала. Напротив, на периферии склеротизированных сегментов актин наблюдается лишь в тонком слое непосредственно вдоль клеточных мембран, а вся центральная часть цитоплазмы заполнена многочисленными секреторными гранулами. Цепочка склеротизированных сегментов (n=8-12) тянется более или менее вдоль центральной (дорсо-вентральной) оси клеточного колпачка. Неясно, связаны ли отдельные сегменты между собой единым каналом или, по крайней мере, системой лакун, найденных у D. woorimensis, но позади сегментов, прилегающих к полости бурсы, иногда обнаруживаются небольшие межклеточные пространства. Только те склеротизированные сегменты, которые прилегают к полости бурсы, содержат спермии, просветы сегментов, расположенных в толще клеточного колпачка, закрыты осевыми клетками.

4.1.4. Aphanostoma virescens. Наконечник и бурса A. virescens исследовались гистологическими и гистохимическими методами. Ультраструктурное исследование не проводилось. Вагина и мужской совокупительный орган открываются в общий антрум так, что мужское отверстие лежит слева от женского. Вагина несет реснички и заканчивается мощным мускульным сфинктером на границе с бурсой. Вентрально стенка бурсы образует утолщение (клеточный колпачок), составленное из расположенных слоями уплощенных клеток. На остальном своем протяжении стенка бурсы не содержит ядер и состоит из плотно упакованных цитоплазматических ламелл. Конфокальные микрофотографии показывают, что колпачок содержит 5-7 склеротизированных колец (сегментов составного наконечника), усиленных актиновыми филаментами.

4.1.5. Wulguru cuspidata. Крупная двулопастная бурса несет два длинных боковых наконечника, ориентированных косо назад, в направлении противоположном яичнику. Стенка бурсы составлена несколькими рядами уплощенных клеток, образующих тонкие пластинчатые отростки. Эти отростки вытягиваются на значительное расстояние, охватывая полость бурсы концентрическими слоями. Наконечник представляет собой слоистую пирамидальную структуру, состоящую из 60-70 рядов склеротизированных клеток, чьи клеточные тела расположены на периферии придатка, а центральные отростки формируют скелетную основу семенного канала. Склеротизированная часть канала образуется за счет аккумуляции актина в отростках склеротизированных клеток, направленных к центральной оси наконечника. Эти отростки образуют вздутие, неизменно ориентированное своим утолщенным краем к дистальному концу наконечника. В радиальном направлении содержание актина в клетках постепенно уменьшается. Между центральным утолщением и ядросодержащей частью цитоплазма отростка образует тонкую пластинку. В пространствах между пластинками расположены бедные актином промежуточные клетки. Пара длинных, тонких клеточных отростков проходит внутри семенного канала по всей его длине, третий отросток доходит только до половины длины канала. Не исключено, что эти отростки представляют собой истонченные проксимальные участки спермиев, проникающие в просвет семенного канала. Снаружи наконечник целиком окружен несколькими рядами кроющих клеток. Структура, образованная этими клетками, является непосредственным продолжением стенки бурсы, и, наконечник, таким образом, целиком погружен в полость семенной сумки. У выхода из наконечника кроющие клетки оставляют довольно широкое овальное отверстие. По краям этого отверстия отростки кроющих клеток заворачиваются вовнутрь и идут в обратном направлении – в образованной ими петле располагаются кольцевые мышечные волокна (мускульный сфинктер).

4.1.6. Pseudmecynostomum phoca. Стенка бурсы состоит из двух или трех слоев уплощенных клеток. Структура, напоминающая склеротизированный наконечник (вагинальный наконечник), отходит от вентральной стороны бурсы. Клеточные тела склеротизированных клеток расположены наподобие долек апельсина вокруг центрального канала (вагины?), открывающегося на поверхность слабо выраженным половым отверстием. Дорсально каждая клетка продолжается в виде тонкого цитоплазматического отростка (всего удалось насчитать 24-26 таких отростков) – эти отростки следуют вертикально вверх, сходясь вместе в виде параллельного пучка с трубковидным просветом в центре. Образованный таким способом проток содержит густую сеть актиновых филаментов и представляет собой склеротизированный канал наконечника. Отростки склеротизированных клеток расположены в стенке канала 12-13 концентрическими слоями. Ближе к просвету бурсы отростки поворачивают под острым или прямым углом наружу и продолжаются в радиальном направлении в виде широких пластинок, содержащих уже довольно рассеянную сеть микрофиламентов. Поверхность отростков на радиальном участке образует извилистые выпячивания, которые вклиниваются в противолежащие впадины соседних отростков – возникает своего рода «губчатая» масса, составленная из зигзагообразно сцепленных друг с другом цитоплазматических слоев. Отростки склеротизированных клеток оканчиваются на периферии наконечника в виде образующих петли и изгибы пластинок, теперь уже полностью лишенных микрофиламентов.

4.2. Обсуждение. В разделе обсуждаются общие особенности бурс и их наконечников, наконечники классифицируются по типам, приводятся филогенетические выводы.

4.2.1. Общая характеристика бурс и их склеротизированных придатков. Проведенное комплексное исследование показывает, что все наконечники бурс имеют сходную организацию и, следовательно, ведут начало от общего предкового состояния. Для исследованных склеротизированных придатков, включая клеточные колпачки и вагинальные наконечники, характерны следующие общие признаки: 1) многослойная клеточная структура; 2) образование канала (серии каналов) за счет отростков мезенхимных клеток; 3) склеротизация путем усиления внутриклеточных элементов цитоскелета (актиновых филаментов в точечных контактах).

На ультраструктурном уровне склеротизированные участки наконечников выглядят как электронноплотные образования, составленные из филаментов диаметром 6-7 нм. Вид этих микрофиламентов типичен для актина, что подтверждается также и данными конфокальной лазерной микроскопии с использованием флуоресцентных красителей на основе фаллоидина. У всех изученных на сегодняшний день бескишечных турбеллярий, включая 7 видов, исследованных в настоящей работе, наконечники дают положительную реакцию на актин. Бурсы и их придатки имеют несомненную мезенхимную природу, возникая первоначально как лакуны в паренхиме, не имеющие каких-либо оформленных стенок. В дальнейшем охватывающие бурсу клетки паренхимы специализируются и образуют уже настоящую стенку, отграничивающую полость семенной сумки от окружающих тканей. Клетки стенки бурсы и их дериваты, склеротизированные наконечники, лишены признаков, определяющих принадлежность тканей к эпителиям: они не имеют общей апикально-базальной поляризации и не несут опоясывающих клеточных контактов. Однако, несмотря на свою мезенхимную природу, клетки бурсы вынуждены решать задачи, предназначенные для пограничных тканей – а именно, осуществлять функцию изоляции двух сред друг от друга. Но решают они эти задачи при использовании тех скудных «технических средств», которые могут предоставить мезенхимные клетки, то есть путем образования уплощенных листовидных отростков, которые окружают полость бурсы в виде концентрических слоев (структура «кочана капусты»). Слоистое строение семенной сумки характерно для всех исследованных мной видов, различия касаются в основном положения ядросодержащих участков – иногда они располагаются в самой стенке, а иногда обособляются от нее в виде клеточных колпачков. Считать подобную организацию эпителием было бы, конечно же, неправомерно.

Расположение клеток в виде цепочки (стопки) характеризует все изученные мной наконечники. В некоторых случаях склеротизация ограничена чередующимися клетками (Daku woorimensis, Wulguru cuspidata), оставляя каждую вторую клетку в ряду свободной от актина – эти промежуточные клетки имеют секреторную природу. Брюггеманн (Brggemann 1985) представлял склеротизированные клетки как имеющие дисковидную или воронковидную форму, однако приведенные в моей работе ультраструктурные данные не подтверждают это утверждение – все клетки наконечника имеют форму подковы, охватывающей лишь часть окружности канала.

4.2.2. Пути формирования скелетных структур у низших билатерий. Настоящая кутикула и кутикулярные образования у плоских червей отсутствуют и поэтому опорные структуры и вооружение могут возникать у них одним из двух путей: в результате развития уплотненного внеклеточного матрикса («псевдокутикула»: Karling 1985) или благодаря усилению элементов цитоскелета – актиновых микрофиламентов, поперечно-исчерченных фибрилл или микротрубочек (Rieger & Doe 1975; Doe 1986a, b; Brggemann 1986; Rieger et al. 1991 и др.)

С этой проблемой сталкиваются и бескишечные турбеллярии. Однако особенности их организации накладывают на них еще большие ограничения. Объем внеклеточного матрикса у Acoela крайне незначителен, и в таких условиях наиболее приемлемым решением проблемы формирования опорных структур и органов вооружения является использование внутриклеточных ресурсов, включающих, прежде всего, элементы цитоскелета. У ряда бескишечных турбеллярий склеротизированные структуры возникают на основе соединенных поперечными сшивками микротрубочек (стилеты совокупительных органов Childiidae: Tekle 2006; Tekle et al. в печати) или посредством развития поперечно-исчерченных фибрилл, вероятно, гомологичных корешкам локомоторных ресничек (стилет Philocelis cellata: Brggemann 1986). У других бескишечных турбеллярий склеротизация, по-видимому, протекает за счет формирования сети актиновых филаментов.

Какими путями возникают скелетные структуры на базе фибриллярного актина? Логично предположить, что появляются они не на “пустом месте”, но развиваются на основе тех систем, которые уже представлены в клетках. Такие внутриклеточные источники актина должны удовлетворять двум основным критериям: во-первых, микрофиламенты должны объединяться между собой поперечными связками (например, посредством таких промежуточных белков как фимбрины или валлины), и, во-вторых, часть микрофиламентов должна быть ассоциирована с плазматической мембраной. Существует два типа внутриклеточных структур, удовлетворяющих перечисленным критериям – пучки осевых филаментов в микроворсинках, и актин, связанный с клеточными контактами (опоясывающие контакты и терминальная паутина в эпителиях и точечные контакты в клетках паренхимы).

Стилеты совокупительных органов и игловидные наконечники вооруженных желез (грушевидных органов и железистых шипов), характерные для некоторых групп бескишечных турбеллярий, скорее всего, являются производными гипертрофированных микроворсинок с исключительно хорошо развитой осевой сетью микрофиламентов. За пределами Acoela микроворсинки образуют поверхностное вооружение и шипы циррусов у паразитических плательминтов, стилеты копулятивных органов гнатостомулид и шипы в хоботке гнаторинхид (Kalyptorhynchia). Нужно отметить, что способ формирования скелетных структур посредством модификации микроворсинок открыт лишь для тканей, имеющих эпидермальную природу. Для мезенхимных клеток нехарактерно присутствие микроворсинок и потому склеротизация (например, в случае наконечников бурс) идет путем усиления точечных контактов. Опорная эпителиальная пластинка коловраток и скребней возникает за счет актина клеточной паутины (Ruppert 1991).

4.2.3. Типы наконечников. Разная степень оформленности и склеротизации наконечников позволяют разделить их на несколько типов. Наиболее простыми, по-видимому, являются клеточные колпачки, для которых и склеротизация, и наличие семенного канала описываются в настоящей работе впервые. Данные конфокальной и электронной микроскопии показывают, что клеточный колпачок Daku woorimensis, Aphanostoma bruscai и A. virescens содержит ряд коротких, дискретных, склеротизированных участков (составной наконечник), и что клетки и их отростки, образующие колпачок, располагаются в виде последовательных слоев. У D. woorimensis склеротизированные секции расположены цепочкой вдоль оси колпачка, клетки колпачка дифференцированы на два типа: те, которые участвуют в склеротизации канала (склеротизированные клетки) и те, которые заполняют пространство между соседними секциями (промежуточные клетки). У A. bruscai такой дифференцировки отмечено не было.

Более типичное расположение клеток мы находим у Notocelis gullmarensis – данный вариант наконечника также характерен для многих изодиаметрид и ряда видов отоцелидид. Это относительно короткий склеротизированный придаток, который, по существу, представляет собой продолжение стенки бурсы.

Наконечник, описанный у Wulguru cuspidata, является наиболее типичной, «классической» формой склеротизированных придатков. В общих чертах он сходен с наконечником, описанным для Philocelis brueggemanni, и представлен регулярной пирамидальной стопкой, составленной из большого числа клеток, чьи ядросодержащие участки лежат на периферии структуры, а центральные отростки образуют склеротизированный канал. Между склеротизированными клетками расположены бедные актином секреторные промежуточные клетки. Снаружи наконечник окружен так называемыми кроющими клетками – эти клетки принадлежат стенке бурсы, и, таким образом, наконечник целиком погружен в полость семенной сумки.

4.2.4. Функциональные особенности наконечников. Как отмечалось выше, наиболее популярная точка зрения рассматривает наконечники в качестве путей, по которым сперма партнера поступает к месту оплодотворения яиц. Это предположение действительно находит подтверждение в данных, полученных мной при исследовании ультраструктуры наконечников. Мне удалось обнаружить сперму непосредственно в просветах наконечников, по крайней мере, у трех исследованных видов (Aphanostoma bruscai, Daku woorimensis и Notocelis gullmarensis). Хотя пучок спермиев, проходящий через канал наконечника у N. gullmarensis можно объяснить артефактом, вызванным сокращением мышц тела во время фиксации, характер расположения спермиев в склеротизированных сегментах у A. bruscai и D. woorimensis безусловно отражает процесс транспортировки спермиев в его естественной форме.

Трактовка всех наконечников только как путей передачи спермы, является явным упрощением проблемы. Наконечники бурс у большинства бескишечных турбеллярий, скорее всего, принимают на себя дополнительные функции. Одна из таких функций – сортировка и подготовка спермиев к оплодотворению (капацитация). Процесс капацитации состоит из нескольких последовательных фаз. На первом этапе происходит активация спермия в семенном пузыре или уже во время осеменения – спермий становится подвижным и приобретает способность перемещаться в паренхиме или в половых путях. Во время второй фазы спермии очень многих Acoela экзоцитируют свои цитоплазматические включения (в основном, преломляющие гранулы), что происходит, вероятно, во время проникновения в семенную бурсу или уже непосредственно в ее полости (как показано в работе на примере спермиев D. woorimensis). Следующая фаза – модификация спермиев в наконечнике. У Daku woorimensis нитевидные микроподии, связанные с поверхностью спермиев, сбрасываются по мере прохождения спермиев через просветы в склеротизированных сегментах. Освобождение спермия от микроподий обусловлено чисто механическими причинами – трением при прохождении через узкий семенной канал. Логично предположить, что пока спермии несут на своей поверхности нитевидные отростки, они не способны к оплодотворению.

У Acoela с массивными наконечниками мы обнаруживаем наиболее необычную форму модификации/капацитации спермиев. Судя по моим ультраструктурным данным, спермии Wulguru cuspidata втыкаются в основание наконечника и начинают активно менять свою форму. Проксимальная часть спермия утолщается, аксонемы выталкиваются из клетки, а ядро скручивается в спираль.

Обнаруженные мной цитоплазматические отростки, следующие по всей длине семенного канала у W. cuspidata, могут представлять истонченные проксимальные участки спермиев, проникающие в наконечник. Концентрические мембранные структуры, обнаруженные в просвете наконечника, вероятно, представляют собой избыточную плазматическую мембрану, сброшенную спермием при вхождении в семенной канал. Нужно подчеркнуть, что все виды, у которых описаны модификации спермиев со «сбрасыванием» цитоплазмы, относятся к группе, характеризующейся аксонемами 9+0 (Convolutidae, Symsagittiferidae и Anaperidae), и такая форма капацитации, очевидно, специфична только для этих бескишечных турбеллярий.

В некоторых случаях происходит субституция функции наконечника в результате изменения его положения и функциональной поляризации. У видов рода Pseudmecynostomum имеются так называемые вагинальные наконечники, которые ранее принимались за вагинальные мускульные сфинктеры. Структура, описанная мной на электронно-микроскопическом уровне у Pseudmecynostomum phoca, не содержит мышечных волокон, но состоит из усиленных актином и расположенных слоями отростков клеток, чьи ядросодержащие элементы лежат непосредственно вблизи вагинального отверстия. Прочие виды Pseudmecynostomum – а именно, P. folium, P. bruneum, P. pelophilum, P. pellucidum и P. bruneophilum – имеют сходные вагинальные наконечники.

Для того чтобы ответить на вопрос, является ли вагинальный наконечник новообразованием или происходит от наконечника, имеющего обычное строение, следует рассмотреть, как устроены склеротизированные придатки у других представителей семейства Mecynostomidae. Наконечник Paedomecynostomum bruneum имеет типичное положение, открываясь в паренхиму вблизи яичников. Предварительные ультраструктурные данные показывают значительное сходство этого наконечника со склеротизированным вагинальным каналом P. phoca. В обоих случаях основная часть придатка образована зигзагообразно сцепленными пластинками, включающими диффузную сеть актиновых филаментов. Различия касаются расположения склеротизированных клеток: у P. phoca все ядросодержащие элементы сконцентрированы у дистального конца наконечника (т.е. непосредственно под вентральным эпидермисом), а у P. bruneum клеточные тела лежат на периферии придатка, в положении, типичном для большинства наконечников. Тем не менее, наличие общих признаков, столь нехарактерных для других исследованных склеротизированных придатков, а также филогенетическая близость P. phoca и P. bruneum, дают основания говорить о несомненной гомологии наконечников у этих двух видов. Ориентация наконечника в направлении яичника представляет, скорее всего, плезиоморфное состояние – вагинальный канал P. phoca происходит, таким образом, путем реверсии положения от обычного склеротизированного наконечника, открывающегося в паренхиму.

4.2.5. Эволюция придатков бурс. Морфотипы наконечников, выявленные у изученных на ультраструктурном уровне видов, можно расположить в форме эволюционного ряда. Учитывая, что некоторые из описанных мной типов распределены среди подгрупп бескишечных турбеллярий на первый взгляд случайным образом, на данный момент представляется невозможным выстроить эти состояния в виде единого древа. Скорее, возникновение этих типов является результатом параллельного развития в нескольких филогенетических линиях от общего предкового состояния.

У анцестральных форм семенной канал, по-видимому, был представлен участком стенки бурсы – в этой точке края клеточных отростков сходились вместе и были связаны точечными контактами. Возможно, кадгерины или аналогичные им белки клеточных контактов в данной точке на поверхности бурсы были способны реагировать на некоторые лиганды в плазматической мембране спермиев, что приводило к ослаблению связей между соседними клетками и, как следствие, к локальному прорыву стенки бурсы. Склеротизация отростков, окружающих этот участок, могла способствовать улучшению контроля по освобождению спермы, что было осуществлено путем усиления актина клеточных контактов. Такой примитивный наконечник обнаружен у Notocelis gullmarensis. Более специализированный вариант представлен бурсой, в которой все ядросодержащие участки клеток сосредоточены в одном районе стенки, называемом клеточным колпачком. Как было показано на примере D. woorimensis, склеротизированные клетки формируют дискретные сектора, перемежающиеся с несклеротизированными участками, образованными промежуточными клетками – таким образом складывается составной наконечник. У Aphanostoma bruscai склеротизированные сегменты могут возникать на основе обособленных семенных каналов. Расщепление цилиндрических наконечников с образованием дискретных склеротизированных сегментов наблюдалось у аберрантных экземпляров N. gullmarensis. Не исключено, что такой атипичный наконечник представляет собой прототип примитивного клеточного колпачка. Обособление дополнительных наконечников отмечалось также и у Convoluta convoluta (Мамкаев 1967; Дробышева, Мамкаев 1971; Исаева 1972). Дискретная природа наконечников, скорее всего, играет важную роль в капацитации и сортировке спермиев. Именно усложнение функциональных задач, возлагаемых на наконечники бурс, могло послужить основной причиной возникновения клеточных колпачков.

Наиболее сложный тип наконечника – массивный – представляет собой коническое или муфтообразное тело, в котором склеротизированные клетки перемежаются с несклеротизированными промежуточными клетками (зачатки такой организации видны уже в структуре клеточного колпачка у D. woorimensis). Кроме W. cuspidata этот тип наконечника представлен у некоторых отоцелидид (Philocelis) и у бескишечных турбеллярий со спермиями типа 9+0 (Convolutidae, Anaperidae, Symsagittiferidae). В случае массивного наконечника склеротизированные клетки уже полностью независимы от клеток бурсы, а сам наконечник закреплен в семенной сумке с помощью отростков промежуточных клеток.

Хотя наконечники бурс как источники филогенетической информации имеют меньшее значение, чем органы мужской половой системы, это объясняется отнюдь не бедностью признаков, но, прежде всего, сложностью их адекватной идентификации на светооптическом уровне, онтогенетической и эволюционной пластичностью наконечников и наличием множества параллельных линий развития в разных группах Acoela. Разнообразие наконечников отчасти определяется многообразием их функций. В работе показано, что наряду с основной (и, вероятно, первоначальной) задачей по подведению спермы партнера к яйцеклетке, наконечники часто принимают на себя дополнительные функции, такие, как дозировка, сортировка и капацитация спермиев. Не исключено, что в некоторых случаях (например, при возникновении вагинальных наконечников) может происходить и полная субституция функции.

В эволюции семенных сумок и их придатков намечается пять основных тенденций: 1) постепенное увеличение упорядоченности в расположении ядросодержащих участков и клеточных отростков в стенке бурсы; 2) полимеризация и олигомеризация наконечников (множественные и составные наконечники); 3) прогрессивное обособление клеток наконечника от стенки бурсы; 4) дифференцировка клеток наконечника на несколько морфофункциональных типов; 5) расширение или субституция функции (экзаптация).

ОСНОВНЫЕ РЕЗУЛЬТАТЫ И ВЫВОДЫ

1. Исследование сперматозоидов у 11 видов Acoela показывает хорошее соответствие информации о тонкой организации спермиев (структура аксонем и конфигурация цитоплазматических микротрубочек) молекулярно-филогенетическим данным по гену 18S рДНК.

2. Судя по собственным данным и по предыдущим исследованиям, у бескишечных турбеллярий имеется три основных типа спермиев, а также промежуточные состояния, выявленные впервые и характерные для представителей семейств Otocelididae и Dakuidae.

3. Данные по ультраструктуре спермиев 5 представителей Isodiametridae и 2 представителей Convolutidae подтверждают монофилетичность этих семейств и их филогенетически независимый статус.

4. На основании морфологических особенностей спермиев и некоторых других данных показана принадлежность Stomatricha hochbergi к семейству Convolutidae.

5. У представителей Otocelididae выявлено три типа спермиев, что доказывает полифилетичность этой группы. В частности, показано, что сперматозоиды Philocelis brueggemanni имеют большее сходство со спермиями Philactinoposthia saliens (Actinoposthiidae), чем со спермиями других представителей отоцелидид.

6. Показана морфофункциональная взаимосвязь между двигательным аппаратом спермиев (аксонемы) и их цитоскелетом (цитоплазматические микротрубочки), на основе этой информации предложена схема эволюционных преобразований ацельных спермиев.

7. Ультраструктурное и гистохимическое исследование склеротизированных придатков бурс у 7 видов Acoela позволило выделить 4 морфологических типа наконечников (простой бочонковидный наконечник, клеточный колпачок, массивный наконечник и вагинальный наконечник).

8. Все изученные наконечники характеризуются рядом общих признаков (многослойная структура, формирование канала за счет клеточных отростков, склеротизация посредством актиновых филаментов) и, вероятно, представляют собой гомологичные образования.

9. Сведения о наконечниках, полученные методом дифференциальной окраски фаллоидином, хорошо согласуются с ультраструктурными данными. Гистохимический метод флуоресценции фаллоидина может, таким образом, служить надежным источником информации в морфологических исследованиях склеротизированных придатков.

10. На основании собственных и литературных данных сделаны выводы о функциональной роли наконечников. Показано, что наряду с основной и, вероятно, первоначальной задачей по подведению спермиев к яйцеклеткам, наконечники могут принимать на себя ряд дополнительных функций (сортировка, дозировка, модификация спермиев и подготовка их к оплодотворению).

11. Жесткие структуры Acoela формируются внутриклеточно за счет усиления элементов цитоскелета. При этом скелетные образования эпидермального происхождения (шипы мужских совокупительных органов и вооруженных желез) являются производными микроворсинок и связанной с ними клеточной паутины, а склеротизированные структуры мезенхимной природы (наконечники бурс) возникают за счет усиления актина точечных контактов.

Работы, опубликованные по теме диссертации:

Petrov A, Hooge MD, S. Tyler. 2004. Ultrastructure of sperm in acoels (Acoela, Acoelomorpha). Abstracts. Twelfth International Meiofauna Conference (TWIMCO), Ravenna, Italy: 215.

Petrov A, Hooge MD, S. Tyler. 2004. Ultrastructure of sperms in Acoela (Acoelomorpha) and its concordance with molecular systematics. SICB 2004. Annual Meeting. Final Program & Abstracts, January 5-9, New Orleans: 168.

Petrov A, Hooge MD, S. Tyler. 2004. Ultrastructure of sperms in Acoela (Acoelomorpha) and its concordance with molecular systematics. Invertebrate Biology, 123(3): 183-197.

Petrov A, Hooge MD, S. Tyler. 2005. Bursal nozzles in Acoela (Acoelomorpha): comparative morphology and taxonomic implications. SICB 2005. Annual Meeting. Final Program & Abstracts, January 4-8, San Diego: 322.

Petrov A, Hooge MD, S. Tyler. 2006. Comparative morphology of the bursal nozzles in acoels (Acoela, Acoelomorpha). Journal of Morphology, 267(5): 634-48.

Петров А.А. 2006. Наконечники бурс бескишечных турбеллярий (Acoela): ультраструктура, актиновые филаменты и таксономическое значение. Отчетная научная сессия по итогам работ 2005 г. Тезисы докладов: 35-36.

Петров А.А. 2007. Особенности мужских копулятивных органов бескишечных турбеллярий (Acoela) и их таксономическое значение. Доклады АН (общая биология), 413(2): 1-4.