Связь полиморфизма c 1473 g гена tph2 с активностью триптофангидроксилазы-2 в мозге и поведением мышей генетика –
На правах рукописи
Осипова Дарья Вениаминовна
Связь полиморфизма C1473G гена Tph2 с активностью триптофангидроксилазы-2 в мозге и поведением мышей
Генетика – 03.02.07
АВТОРЕФЕРАТ
диссертации на соискание ученой степени
кандидата биологических наук
Новосибирск 2010
Работа выполнена в лаборатории нейрогеномики поведения Учреждения российской академии наук Института цитологии и генетики СО РАН,
г. Новосибирск.
Научный руководитель: доктор медицинских наук, профессор
Попова Н.К.
Институт цитологии и генетики СО РАН,
г. Новосибирск
Официальные оппоненты: доктор биологических наук, профессор
Бородин П.М.
Институт цитологии и генетики СО РАН,
г. Новосибирск
доктор биологических наук
Дубровина Н.И.
ГУ НИИ физиологии СО РАМН,
г. Новосибирск
Ведущее учреждение: Московский государственный
университет им. М.В. Ломоносова,
г. Москва
Защита диссертации состоится «___» ____________ 20___ г. на утреннем заседании диссертационного совета Д 003.011.01 по защите диссертаций на соискание ученой степени доктора наук в Институте цитологии и генетики СО РАН в конференц-зале Института по адресу:
630090, г. Новосибирск, проспект ак. Лаврентьева, 10, т. (383)363-49-06,
факс (383) 333-12-78, e-mail: [email protected].
С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Института цитологии и генетики СО РАН.
Автореферат разослан «___» _____________ 20___ г.
Ученый секретарь
диссертационного совета,
доктор биологических наук Т.М. Хлебодарова
Общая характеристика работы
Актуальность проблемы
Одной из главных задач генетики поведения является изучение полиморфизма генов, которые кодируют белки, участвующие в нейробиологических процессах. Большой интерес вызывает исследование роли функционально значимых полиморфных вариантов таких генов в реализации отдельных поведенческих признаков, а также выявление молекулярных механизмов, из которых состоит путь от гена к признаку.
Серотониновая система мозга вовлечена в регуляцию множества физиологических функций и видов поведения (Попова и др., 1978; Lucki, 1998). Имеется много данных об участии серотониновой системы мозга в механизмах возникновения клинической депрессии (Lesch, 2004), биполярного аффективного расстройства (Serretti, Mandelli, 2008), патологической тревожности (Arnold et al., 2004) и агрессии (Craig, Halton, 2009). Были показаны ассоциации с психическими патологиями человека полиморфных вариантов генов основных компонентов серотониновой системы мозга: серотониновых рецепторов (Lemonde et al., 2003; Rothe et al., 2004), переносчика серотонина, осуществляющего обратный захват нейромедиатора из синаптической щели (Murphy et al., 2004; Cho et al., 2005; Kiyohara, Yoshimasu, 2009), фермента катаболизма серотонина – моноаминоксидазы A (Brunner et al., 1993; Caspi et al., 2002; Kim-Cohen et al., 2006).
Триптофангидроксилаза (ТПГ) является ключевым ферментом синтеза серотонина, определяющим скорость обмена медиатора (Fitzpatrick, 1999). До недавнего времени считалось, что ТПГ кодируется единственным геном, расположенным у человека на хромосоме 11 (Ledley et al., 1987). Множество работ было направлено на поиск ассоциаций между полиморфными вариантами этого гена и различными психическими патологиями человека, однако результаты таких исследований были противоречивыми (Nielsen et al., 1994; Abbar et al., 1995; Mann et al., 1997; Bellivier et al., 1998; Furlong et al., 1998; Du et al., 2000; Ono et al., 2000; Souery et al., 2001).
В 2003 г. выяснилось, что существует ещё один ген, кодирующий ТПГ, и именно он отвечает за синтез серотонина в мозге. Новый ген, находящийся на хромосоме 10 мыши и хромосоме 12 человека, был назван Tph2, а соответствующий ему фермент – триптофангидроксилаза-2 (ТПГ2). Ранее же известный ген, который, как оказалось, экспрессируется только в периферических органах и эпифизе, стали обозначать Tph1 (Walther, Bader, 2003).
Разными авторами были обнаружены ассоциации полиморфных вариантов гена Tph2 человека с клинической депрессией (Zill et al., 2004a; Zhou et al., 2005; Van Den Bogaert et al., 2006; Haghighi et al., 2008), биполярным аффективным расстройством (Harvey et al., 2004; Harvey et al., 2007; Lin et al., 2007; Lopez et al., 2007; Cichon et al., 2008; Roche, McKeon, 2009), суицидом (Zill et al., 2004b; Ke et al., 2006; Lopez de Lara et al., 2007; Zhang et al., 2007), тревожностью (Lin et al., 2009b; Serretti et al., 2009) и агрессией (Oades et al., 2008).
Среди множества описанных полиморфных вариантов гена Tph2 человека известно 9 мутаций, приводящих к замене аминокислоты в молекуле фермента, и показано, что некоторые из них ведут к уменьшению стабильности, растворимости и активности ТПГ2 (McKinney et al., 2009). Были обнаружены ассоциации S41Y и P206S с биполярным аффективным психозом (Lin et al., 2007; Cichon et al., 2008), R441H с клинической депрессией (Zhang et al., 2005), R303W с синдромом дефицита внимания и гиперактивности (McKinney et al., 2008).
Несмотря на обилие данных об ассоциации полиморфных вариантов генов серотониновой системы с психическими функциями человека, механизмы влияния этих генетических изменений на поведение во многом остаются неизвестными. Для детального изучения биологического пути, ведущего от гена к поведенческому признаку, целесообразно использовать в качестве модели лабораторных животных.
В гене Tph2 мыши был обнаружен однонуклеотидный полиморфизм C1473G, приводящий к замене остатка пролина-447 на остаток аргинина в молекуле ТПГ2 (Zhang et al., 2004). Этот полиморфизм функционально аналогичен замене R441H в аминокислотной последовательности ТПГ2 человека, которая приходится на тот же участок молекулы фермента и приводит к снижению синтеза серотонина в культуре клеток на 80% (Zhang et al., 2005). Замена C1473G в гене Tph2 мыши уменьшает на 55% уровень серотонина в культуре клеток, экспрессирующей Tph2 (Zhang et al., 2004). Были обнаружены различия в скорости синтеза и концентрации серотонина в мозге между инбредными линиями мышей, несущих 1473C- и 1473G-аллели (Zhang et al., 2004). Однако эта работа была выполнена лишь на нескольких линиях, и оставалось непонятным, является ли данный полиморфизм главным фактором, определяющим существующие различия в активности ТПГ2 между инбредными линиями (Kulikov, Popova, 1996).
Пролин-447 является консервативным: он присутствует в соответствующих позициях в последовательностях ТПГ2 других видов, а также в последовательностях гидроксилаз ароматических аминокислот, принадлежащих к этому же семейству белков (Zhang et al., 2004). Поэтому возникал вопрос, является ли замена пролина-447 на аргинин, которая приводит к снижению скорости синтеза серотонина в мозге, эволюционно значимой. Косвенно об этом можно судить по распространённости соответствующего аллеля, 1473G, в природных популяциях домовой мыши. До сих пор таких данных не имелось.
Полиморфизм C1473G в гене Tph2 мыши представляет перспективную модель для изучения наследственно-обусловленного снижения функции серотониновой системы мозга, однако до начала настоящей работы не имелось сведений о влиянии этой замены на поведение мышей.
Целью данного исследования было изучение влияния полиморфизма C1473G гена Tph2 на активность фермента ТПГ2 и поведение. В связи с этим были поставлены следующие задачи:
1) Определение генотипов по полиморфизму C1473G у мышей инбредных линий и исследование его ассоциации с активностью ТПГ2 в мозге.
2) Изучение распределения аллелей полиморфизма C1473G в природных популяциях мышей.
3) Исследование связи активности ТПГ2 и поведенческих характеристик на контрастных по полиморфизму C1473G линиях мышей C57BL/6 и CC57BR/Mv, а также их гибридах F1 и F2.
4) Получение линий B6-1473C и B6-1473G, гомозиготных соответственно по 1473C- и 1473G-аллелям гена Tph2 и обладающих существенно однородным генетическим фоном, близким к геному линии C57BL/6.
5) Изучение влияния полиморфизма C1473G на активность ТПГ2, а также агрессивное, депрессивно-подобное и тревожное поведение на мышах линий B6-1473C и B6-1473G.
Поскольку у человека серотониновая система мозга участвует в регуляции тревожности и агрессии, а также механизмах возникновения депрессии, при исследовании поведения мышей были использованы тест принудительного плавания (Порсолта) для изучения депрессивно-подобного поведения (Willner, 1990; Petit-Demouliere et al., 2005), тест открытого поля для оценки тревожности и общей двигательной активности (Prut, Belzung, 2003; Sousa et al., 2006) и тест «резидент-интрудер» для определения агрессивности мышей (Куликов, Попова, 1980; Olivier, Young, 2002).
Научная новизна
- Выявлена ассоциация между полиморфизмом C1473G гена Tph2 и межсамцовой агрессией у мышей инбредных линий.
- Впервые изучено распределение аллелей полиморфизма C1473G в естественных популяциях мышей и показано, что аллель 1473G в природе встречается крайне редко.
- Показано, что введение аллеля 1473G гена Tph2 в геном линии C57BL/6 приводит к снижению активности ТПГ2, а также уменьшению показателей агрессивного и депрессивно-подобного поведения мышей.
Научно-практическая ценность
Результаты данной работы углубляют представления о влиянии сниженной активности ТПГ2 в мозге на агрессивное и депрессивно-подобное поведение мышей, что в перспективе может помочь в выявлении механизмов возникновения повышенной агрессивности и депрессии у людей.
Полученные данные о вариантах гена Tph2 у лабораторных мышей могут быть использованы при планировании этологических и фармакологических экспериментов, проводимых на инбредных линиях.
На основе созданной в ходе данной работы линии мышей B61473G будет получена конгенная линия, несущая аллель 1473G гена Tph2 на фоне генома линии C57BL/6; эта конгенная линия позволит более полно и детально изучить влияние сниженной активности ТПГ2 на поведение мышей.
Положения, выносимые на защиту
- В инбредных линиях мышей преобладает аллель дикого типа гена Tph2 1473C. Аллель 1473G (ведущий к замене консервативного аминокислотного остатка в молекуле ТПГ2) встречается у нескольких родственных линий и ассоциирован с пониженной активностью фермента и меньшей интенсивностью межсамцовой агрессии.
- В природных популяциях мышей аллель 1473G гена Tph2 встречается крайне редко.
- Аллель 1473G гена Tph2 наследуется совместно с низкой активностью ТПГ2, сниженной интенсивностью межсамцовой агрессии и малой неподвижностью в тесте принудительного плавания у мышей.
Апробация работы
Результаты данной работы были представлены и обсуждены: на отчётных сессиях ИЦиГ СО РАН в 2007 и 2010 гг., XLIII международной научной студенческой конференции “Студент и научно-технический прогресс” (Новосибирск, 2005), Международной школе по нейрогенетике поведения (Москва, 2005), Всероссийской конференции «Нейрохимия: фундаментальные и прикладные аспекты» (Москва, 2005), Международной конференции «Генетика в России и мире» (Москва, 2006), XXI международной междисциплинарной конференции "Stress and Behavior" (Санкт-Петербург, 2008), VI Сибирском физиологическом съезде (Барнаул, 2008), Международной конференции «EHRLICH II –2nd World Conference on Magic Bullets» (Нюрнберг, 2008) и V съезде Вавиловского общества генетиков и селекционеров (Москва, 2009).
Публикации
Материал диссертации представлен в 13 публикациях, в том числе в 5 статьях в отечественных (2) и зарубежных (3) реферируемых журналах.
Структура и объём работы
Работа включает следующие разделы: введение, обзор литературы, материалы и методы, результаты и их обсуждение, выводы, список использованной литературы (263 источника), приложение. Общий объем составляет 98 машинописных листов. Представлено 18 рисунков и 5 таблиц.
материалы и методы
Лабораторные мыши. Для изучения распределения аллелей полиморфизма C1473G гена Tph2 в инбредных линиях мышей были использованы линии PT/Y, YT/Y, DD/He, DBA/2, AKR/J, A/sn, C57BL/6J, C3H/HeJ, CBA/Lac, CC57BR/Mv, BALB/cJLac, A/He, содержащиеся в виварии ИЦиГ СО РАН.
Дикие мыши. Исследование распределения аллелей полиморфизма C1473G в природе проводилось на мышах, относящихся к виду Mus musculus (предположительно, к подвиду M. m. musculus). Образцы тканей мышей, выловленных на территории Московской области (n=10), Армении (n=11) и республики Калмыкия (n=21), были любезно предоставлены д.б.н. Е.В. Котенковой (Институт проблем экологии и эволюции им. А.Н. Северцова РАН). Остальные мыши были пойманы сотрудниками лаборатории нейрогеномики поведения ИЦиГ СО РАН на территории Новосибирского научного центра (n=34) и п. Ратта Ямало-Ненецкого автономного округа (n=2).
Гибридологический эксперимент был проведён на инбредных линиях C57BL/6J (B6) и CC57BR/Mv (BR), гомозиготных соответственно по C- и G-аллелю. Гибриды F1 (B6BR) были скрещены между собой для получения гибридов F2. Также гибриды F1 были трижды последовательно скрещены с родительской линией B6 для получения бэккроссов третьего поколения. В результате скрещивания последних между собой были получены линии B6-1473C и B6-1473G, гомозиготные соответственно по C- и G-аллелю. Линии B6 и BR, гибриды F1 и F2, а также линии B6-1473C и B6-1473G были использованы для определения активности фермента ТПГ2 в мозге и тестирования поведения. Опыты проводились на половозрелых самцах.
Выделение ДНК из кончиков хвостов включало обработку протеиназой K и последующую солевую экстракцию (Miller et al., 1988, с модификациями).
Генотипирование на полиморфизм C1473G проводилось методом аллель-специфичной полимеразной цепной реакции (ПЦР), описанной ранее (Zhang et al., 2004), для этого использовались праймеры, специфично отжигающиеся на C- или G-аллеле, а также пара внешних праймеров для положительного контроля.
Активность ТПГ2 у мышей определяли в экстрактах среднего мозга, так как именно в этой структуре располагаются тела серотониновых нейронов. Была использована описанная ранее методика (Куликов и др., 1988), основанная на проведении реакции гидроксилирования триптофана, переводе образовавшегося 5-гидрокситриптофана в серотонин и измерении его концентрации флюориметрическим методом. Активность ТПГ выражалась как скорость образования 5-гидрокситриптофана (пмоль/мин), отнесенная на количество белка в пробе (мг).
Тест открытого поля. Мышь помещали в чистый белый цилиндр из оргстекла, имеющий полупрозрачный пол и освещённый снизу галогеновыми лампами. Перемещение мыши в течение 5 минут регистрировалось с помощью цифровой камеры и обрабатывалось программой Ethostudio (Kulikov et al., 2008; www.ethostudio.com). Результаты такой обработки включали пройденный путь (в см) и долю времени, проводимого мышью в центральной части арены.
Тест принудительного плавания (Порсолта). Мышь помещали в чистый контейнер из оргстекла, наполненный водой, имеющей температуру 25-26°C. После 40-секундного периода адаптации движения мыши записывались с помощью цифровой камеры в видеофайл в течение 3 минут. Время неподвижности (прекращение движения, за исключением подёргивания задними лапами) регистрировалось наблюдателем.
Межсамцовую агрессию измеряли в тесте «резидент-интрудер» по ранее описанному протоколу (Popova, Kulikov, 1986). В домашнюю клетку с тестируемым самцом помещали незнакомого ему беспородного самца (чужака) того же возраста и массы. После начала драки число и длительность нападений тестируемого самца на чужака регистрировались наблюдателем в течение 2 мин. Самцы, не нападающие на чужака за время теста (10 мин), квалифицировались как неагрессивные. Агрессивное поведение оценивали двумя индексами: 1) уровень агрессивности – процент агрессивных животных в линии; 2) интенсивность агрессии – число нападений на чужака за 2 мин. Чтобы избежать влияния опыта драк, самцов тестировали только один раз. Каждый чужак использовался не более пяти раз. Среднее число нападений определялось только для агрессивных самцов.
Статистическая обработка результатов. Данные по активности ТПГ2, интенсивности межсамцовой агрессии, неподвижности в тесте принудительного плавания, двигательной активности и времени, проводимом в центре открытого поля, выражались как m ± SEM и сравнивались методом однофакторного дисперсионного анализа. Уровни агрессивности (доли агрессивных животных в группах) выражались в процентах и сравнивались с помощью 2 критерия. Ассоциацию между полиморфизмом C1473G и активностью ТПГ2 у мышей инбредных линий оценивали методом иерархического двухфакторного дисперсионного анализа.
результаты и обсуждение
Полиморфизм С1473G у мышей инбредных линий
Генотипирование инбредных линий мышей на полиморфизм C1473G показало преобладание 1473C-аллеля: 7 линий из 11 (CBA/Lac, PT, C57BL/6, C3H/He, AKR, YT и DD) имели генотип C/C, и лишь 4 линии (BALB/c, A/He, CC57BR и DBA/2) – генотип G/G.
Линия CC57BR/Mv была получена из потомства от скрещивания мышей BALB и C57BL (Медведев, 1961) и, очевидно, получила аллель 1473G от линии BALB. Остальные лабораторные линии, несущие аллель 1473G (BALB/c, A, DBA/2), восходят к одному источнику – гетерогенному стоку, использовавшемуся в лаборатории генетика Вильяма Касла в США (Beck et al., 2000). Примечательно, что все классические лабораторные линии, выведенные до 1922 года (например, DBA, BALB/c, A, C3H, C57BL), а также многие более новые линии (например, DD/He) несут один и тот же гаплотип мтДНК, относящийся к западноевропейскому подвиду домовых мышей – Mus musculus domesticus (Ferris et al., 1983; Bayona-Bafaluy et al., 2003). В то же время в природных популяциях M. m. domesticus данный гаплотип встречается с частотой лишь 4% (Ferris et al., 1983). Это означает, что все классические лабораторные линии восходят по материнской линии к одному стоку, состоявшему из близкородственных особей. Таким образом, присутствие аллеля 1473G в линиях BALB/c, A, DBA/2 и CC57BR/Mv не говорит о его распространённости в дикой природе, так как все они являются родственными.
Полиморфизм С1473G в природных популяциях мышей
Для изучения распространённости аллеля 1473G гена Tph2 в природных популяциях домовой мыши, было генотипировано 78 образцов ДНК диких мышей, выловленных в разных регионах России (табл. 1). Среди исследованных мышей только одна, пойманная в Новосибирском научном центре, была гетерозиготна по полиморфизму C1473G гена Tph2, остальные образцы были гомозиготны по C-аллелю.
Таблица 1. Распределение полиморфизма C1473G в популяциях мышей
| Популяция | Изучено мышей | Генотип | |||
| C/C | C/G | G/G | |||
| Москва | 10 | 10 | 0 | 0 | |
| Армения | 11 | 11 | 0 | 0 | |
| Калмыкия | 21 | 21 | 0 | 0 | |
| п. Ратта (ЯНАО) | 2 | 2 | 0 | 0 | |
| Новосибирск | 34 | 33 | 1 | 0 | |
Хотя численность изученной выборки диких мышей не очень велика, в ней представлены географически удалённые популяции, что повышает точность определения средних частот аллелей. Показано, что частота аллеля 1473G в популяциях M. m. musculus не превышает 0.7%, то есть этот вариант является редкой мутацией. По всей видимости, в природе существует отбор, направленный на элиминацию аллеля 1473G, так как эта замена существенно влияет на метаболизм серотонина и поведение мышей.
Влияние полиморфизма C1473G на активность фермента ТПГ2
После того как были определены генотипы инбредных линий по полиморфизму C1473G, возник вопрос о том, в какой степени данная замена определяет наблюдаемые генетические различия в активности фермента ТПГ2 между этими линиями. Анализ имеющихся данных по активности фермента в экстрактах среднего мозга мышей десяти инбредных линий показал (Kulikov, Osipova et al., 2005), что у мышей, гомозиготных по аллелю 1473G, активность в среднем на 40% ниже по сравнению с линиями, гомозиготными по Cаллелю (F1,8 = 35.9, p<0.001, рис. 1).
Хотя показано существование других факторов, влияющих на межлинейные различия в активности ТПГ2, полиморфизм C1473G определяет бльшую часть генетической вариации. Это подтверждается данными по активности ТПГ2 в мозге гибридов F2(B6BR): животные с генотипами C/C и G/G различались между собой (F1,13 = 27.74, p<0.001) и не отличались от соответствующих родительских линий (рис. 2). Таким образом, полиморфизм C1473G является главным фактором, определяющим генетически обусловленные различия в активности ТПГ2 между инбредными линиями (Куликов, Осипова, Попова, 2007).
 |
| Рис. 1. Активность ТПГ в экстрактах среднего мозга у мышей 10 инбредных линий. *** p<0.001 по сравнению с C/C. |
 |
| Рис. 2. Активность ТПГ в среднем мозге мышей линий B6 и BR и их гибридов F1 и F2. Измерение проводилось на 7-8 животных в группе, в двух повторах для каждого. * p<0.05 по сравнению с B6, *** p<0.001 по сравнению с F2 C/C. |
Несмотря на существенные различия по активности ТПГ2, гибриды F2 с разными генотипами по полиморфизму C1473G не различались между собой в тестах на агрессивное, депрессивно-подобное и тревожное поведение. Это, вероятнее всего, свидетельствует о том, что эффект гена Tph2 маскируется расщеплением по другим генам, участвующим в регуляции межсамцовой агрессии и неподвижности в тесте принудительного плавания, а таких генов-кандидатов выявлено множество (Maxson, 1996; Urani et al., 2005).
Поэтому для минимизации влияния других генов, способных нивелировать эффект от замены C1473G, была поставлена задача переноса аллелей 1473C и 1473G на более однородный генетический фон. С этой целью было проведено три цикла бэккроссирования, начиная с гибридов F1, на родительскую линию B6. Были получены линии B6-1473C и B6-1473G, гомозиготные соответственно по 1473C- и 1473G-аллелям гена Tph2. Геном этих линий содержал около 15/16 генома B6 и 1/16 генома BR.
Активность ТПГ2 в среднем мозге мышей линии B6-1473G была снижена на 34% по сравнению с линией B6-1473C (F1,17 = 5.54, p<0.05, рис. 3).
 |
| Рис. 3. Активность ТПГ2 в мозге мышей линий B6-1473C и B6-1473G. Измерение проводилось на 9-10 животных в группе, в двух повторах для каждого. * p<0.05. |
Влияние полиморфизма C1473G на агрессивность
Между инбредными линиями мышей, гомозиготными по 1473C или 1473G аллелю, была обнаружена разница в интенсивности межсамцовой агрессии (Kulikov, Osipova et al., 2005): мыши с генотипом G/G нападали на интрудера в среднем вдвое меньше, чем самцы с генотипом C/C (F1,6 = 20.0, p<0.01, рис. 4). При этом наблюдается положительная межлинейная корреляция между числом атак и активностью ТПГ2 у разных линий (r = 0.71, p<0.05).
 |
| Рис. 4. Межсамцовая агрессия у мышей инбредных линий. ** p<0.01 по сравнению с C/C |
Влияние полиморфизма C1473G и обусловленных им различий в активности ТПГ2 на агрессивное поведение было подтверждено при переносе аллеля 1473G на геном линии B6 (Osipova et al., 2009): количество атак у самцов линии B6-1473G было на 36% ниже по сравнению с линией B6-1473C (F1,52 = 7.23, p<0.05, рис. 5).
 |
| Рис. 5. Интенсивность межсамцовой агрессии у мышей линий B6-1473C и B6-1473G. Число агрессоров в группах составило соответственно 30 и 24. * p<0.05. |
Доля агрессоров (уровень агрессивности) в инбредных линиях не коррелировала с количеством атак и не различалась между генотипами. Линии B6-1473C и B6-1473G также не отличались по доле агрессивных самцов (83% и 73%, 2 = 0.60, p>0.05). Это служит доказательством того, что признаки, соответствующие склонности к нападению на чужака и интенсивности уже возникшего агрессивного ответа, находятся под разным генетическим контролем (Popova et al., 1993).
Примечательно, что по данным картирования количественного признака (QTLанализа) межсамцовой агрессии у мышей (Brodkin et al., 2002), одним из двух локусов сцепления для агрессивности является участок хромосомы 10 между 65.5 и 70 сМ, тогда как ген Tph2 находится в районе 62 сМ. Учитывая высокую погрешность метода QTLанализа, можно предположить, что в данном исследовании интенсивность агрессии определялась именно геном Tph2.
В литературе описаны противоположные закономерности, связывающие уровень серотонина в мозге и агрессивность животных и человека. С одной стороны, снижение функции центральной серотониновой системы традиционно связывают с повышением агрессивности. Так, у мышей, селекционированных на высокие показатели межсамцовой агрессии, было отмечено снижение уровня серотонина в префронтальной коре (Caramaschi et al., 2007). У самцов резус-макак сниженный уровень основного метаболита серотонина в спинномозговой жидкости коррелировал с проявлениями грубой агрессии по отношению к соплеменникам (Mehlman et al., 1994). С другой стороны, имеется множество данных, указывающих на существование прямой зависимости между активностью серотониновой системы мозга и агрессивностью. Так, введение самцам зелёных мартышек триптофана (предшественника серотонина) или флуоксетина (ингибитора обратного захвата серотонина) приводило к приобретению ими статуса доминанта (Raleigh et al., 1991). Трансгеннные мыши Tg8, лишённые фермента МАО А, разрушающего серотонин, характеризовались повышенным уровнем серотонина в мозге и повышенной межсамцовой агрессивностью (Cases et al., 1995). Снижение активности МАО А также ассоциировано с повышенной агрессивностью у резус-макак (Newman et al., 2005) и у людей (Brunner et al., 1993).
Недавно были получены мыши, несущие искусственно созданный аналог человеческой мутации G1463A, ведущий к замене R439H в гене Tph2 (Beaulieu et al., 2008). У мышей, гомозиготных по данной мутации (mTPH21449A/A), активность ТПГ2 была снижена на 80%, и содержание серотонина и его основного метаболита в мозге было существенно меньше, чем у животных с неизменённым геном Tph2. Однако в тесте на межсамцовую агрессию мыши mTPH21449A/A характеризовались повышенным количеством нападений на чужака по сравнению с животными дикого типа (Beaulieu et al., 2008). Одной из возможных причин противоположных эффектов снижения активности ТПГ2 на межсамцовую агрессию, наблюдаемых у мышей B6-1473G и mTPH21449A/A, является разный генетический фон, на который перенесены мутации гена Tph2. Другая возможная причина наблюдаемого противоречия состоит в использовании разных моделей агрессивного поведения: изоляционной агрессии в работе Beaulieu с соавт. (2008) и спонтанной агрессии в настоящей работе. Ранее было показано, что разные модели агрессии находятся под независимым генетическим контролем (Popova et al., 1993).
Таким образом, наблюдаемая разница в механизмах формирования агрессивной реакции, описываемых разными авторами, во многом обусловлена влиянием генетического контекста и использованием различных моделей. В случае спонтанной межсамцовой агрессивности, используемой в данной работе в качестве модели нормального взаимодействия особей в группах, способствующего установлению иерархической структуры, однозначно наблюдается прямая связь между скоростью синтеза серотонина в мозге и интенсивностью агрессии.
Влияние полиморфизма C1473G на депрессивно-подобное поведение
На грызунах в качестве модели депрессивно-подобного поведения применяется тест принудительного плавания (Порсолта), так как распространённые антидепрессанты снижают время неподвижности животных в этом тесте (Willner, 1990; Petit-Demouliere et al., 2005).
Мыши линии B6-1473G в тесте принудительного плавания на 40% меньше времени проводили в состоянии неподвижности по сравнению с линией B6-1473C (F1,62 = 7.11, p<0.05), аналогично родительским линиям (рис. 6). Следовательно, снижение активности ТПГ2 приводит к уменьшению выраженности депрессивно-подобного поведения.
Параллельно с нами работу по переносу аллеля 1473G на геном линии B6 осуществляла другая группа исследователей (Tenner et al., 2008). В результате 8 поколений бэккроссирования гибридов B6DBA/2 на родительскую линию B6 были созданы линии mTPH21473C/C и mTPH21473G/G, гомозиготные соответственно по аллелям 1473C и 1473G. Однако авторы не обнаружили различий между полученными линиями по неподвижности в тесте принудительного плавания. Противоречие с нашими результатами объясняется, скорее всего, методическими расхождениями (Osipova et al., 2009).
 |
| Рис. 6. Время неподвижности в тесте принудительного плавания для мышей (A) родительских линий B6 и BR, (Б) линий B6-1473C и B6-1473G. Измерение проводилось для 29-32 животных в группе. ** p<0.01 по сравнению с B6, * p<0.05 по сравнению с B6-1473C |
Аналогичный полученному в нашей работе «антидепрессантный» эффект в тесте принудительного плавания был обнаружен у нокаутов по гену Tph2 (Savelieva et al., 2008). Такая закономерность расходится с общепризнанными представлениями, согласно которым депрессия у людей вызывается именно недостатком медиатора в мозге (Mann et al., 2001). Но, во-первых, неподвижность в тесте принудительного плавания не является однозначной моделью депрессивных состояний у людей и имеет ряд ограничений по экстраполяции на человека (Holmes, 2003). Во-вторых, сама связь между сниженной функцией серотониновой системы и депрессией не представляется такой очевидной. Так, имеется множество работ, описывающих повышенную концентрацию мРНК и белка ТПГ2 в мозге больных аффективными расстройствами (Crowley, Lucki, 2005; De Luca et al., 2005; Bach-Mizrachi et al., 2006; Bonkale et al., 2006; Bach-Mizrachi et al., 2008). Вопрос о механизмах возникновения депрессии остаётся самым актуальным в современной нейрогенетике.
Полиморфизм C1473G, двигательная активность и тревожное поведение
Линии B6-1473C и B6-1473G, в отличие от родительских линий, не различались по длине пути, пройденного в тесте открытого поля (F1,62 < 1, p>0.05). Это говорит о том, что серотониновая система мозга не участвует в определении общей двигательной активности. Наши результаты согласуются с данными Beaulieu и соавт. (2008): у мышей, имеющих разные генотипы по замене G1449A, локомоторная активность была одинаковой.
Мыши B6-1473C и B6-1473G одинаковую долю времени проводили в центре арены открытого поля (F1,62 < 1, p>0.05, рис. 7), что может указывать на отсутствие различий в тревожном поведении между этими линиями. Это согласуется с данными, полученными на нокаутах по Tph2 в тесте открытого поля (Savelieva et al., 2008). Однако вопрос о влиянии активности ТПГ2 на показатели в тестах, направленных на оценку тревожного поведения мышей, требует дальнейшего прояснения на моделях, подобных нашей.
 |
| Рис. 7. Доля времени в центре арены открытого поля для (A) родительских линий B6 и BR, (Б) линий B6-1473C и B6-1473G. Измерение проводилось для 16-32 животных в группе. * p<0.05 по сравнению с B6 |
Заключение
При изучении пути от отдельного гена к сложным поведенческим признакам доказана роль гена Tph2 в определении активности ТПГ2 и регуляции агрессивного и депрессивно-подобного поведения.
Показано, что полиморфизм C1473G гена Tph2 является главным фактором, определяющим различия в активности фермента ТПГ2 между инбредными линиями мышей. Активность ТПГ2, в свою очередь, в существенной мере определяет интенсивность межсамцовой агрессии у мышей инбредных линий. На основе линий C57BL/6 (генотип 1473C/C) и CC57BR/Mv (генотип 1473G/G) созданы линии B6-1473C и B6-1473G, различающиеся по полиморфизму C1473G и обладающие относительно выровненным генетическим фоном. С помощью созданных линий подтверждено совместное наследование аллеля 1473G, ведущего к уменьшению активности ТПГ2, и сниженной агрессивности. Обнаружено, что аллель 1473G также совместно сегрегирует с меньшей выраженностью депрессивно-подобного поведения.
Таким образом, замена C1473G в гене Tph2 существенно влияет на поведение мышей. И хотя линии с генотипом G/G хорошо размножаются в лабораторных условиях, в дикой природе аллель 1473G, по всей видимости, элиминируется естественным отбором, так как интенсивность агрессии в борьбе за территорию определяет иерархический статус самца и влияет на его репродуктивный успех (Осадчук, Науменко, 1981). Подтверждением этому служит крайне низкая частота аллеля 1473G, обнаруженная в выборке диких мышей Mus musculus.
Полученные линии B6-1473C и B6-1473G могут быть использованы для моделирования влияния низкой активности ТПГ2 на различные характеристики, исследуемые в этологических, фармакологических, молекулярных и популяционных экспериментах.
ВЫВОДЫ
- Обнаружена ассоциация между полиморфизмом C1473G гена Tph2 и активностью ТПГ2 в мозге мышей 10 инбредных линий.
- На интеркроссах F2 линий C57BL/6 (генотип C/C) и CC57BR/Mv (генотип G/G) показано, что полиморфизм C1473G гена Tph2 является главным фактором, определяющим различия в активности ТПГ2 между этими линиями.
- Выявлена ассоциация между полиморфизмом C1473G гена Tph2 и интенсивностью межсамцовой агрессии у мышей 8 инбредных линий.
- При переносе аллеля 1473G гена Tph2 из генома линии CC57BR/Mv в геном линии C57BL/6 показано, что аллель 1473G наследуется совместно со сниженной межсамцовой агрессией и меньшей выраженностью депрессивно-подобного поведения в тесте принудительного плавания; в то же время двигательная активность и тревожность в тесте открытого поля сегрегируют независимо от полиморфизма C1473G гена Tph2.
- Установлено, что в природных популяциях мышей подвида Mus musculus musculus частота аллеля 1473G гена Tph2 не превышает 0.7%.
Список работ по теме диссертации
- Куликов А.В., Осипова Д.В., Науменко В.С., Попова Н.К. Полиморфизм С1473G в гене триптофангидроксилазы и выраженность агрессивного поведения мышей // Докл. Акад. Наук, 2005. Т. 403. № 4. С. 571-573.
- Kulikov A.V., Osipova D.V., Naumenko V.S., Popova N.K. Association between Tph2 gene polymorphism, brain tryptophan hydroxylase activity and aggressiveness in mouse strains // Genes Brain Behav., 2005. V. 4. № 8. P. 482-485.
- Куликов А.В., Осипова Д.В., Попова Н.К. Полиморфизм C1473G в гене tph2 – основной фактор, определяющий генетическую изменчивость активности триптофангидроксилазы-2 в головном мозге мышей // Генетика, 2007. Т. 43. № 12. С. 1676-1681.
- Osipova D.V., Kulikov A.V., Popova N.K. C1473G polymorphism in mouse tph2 gene is linked to tryptophan hydroxylase-2 activity in the brain, intermale aggression, and depressive-like behavior in the forced swim test // J. Neurosci. Res., 2009. V. 87. № 5. P. 1168-1174.
- Osipova D.V., Kulikov A.V., Mekada K., Yoshiki A., Moshkin M.P., Kotenkova E.V., Popova N.K. Distribution of the C1473G polymorphism in tryptophan hydroxylase 2 gene in laboratory and wild mice // Genes Brain Behav., 2010. V. 9. № 5. P. 537-543.
- Осипова Д.В., Науменко В.С. Связь С1473G-полиморфизма в гене триптофангидроксилазы-2 с агрессивным поведением самцов мышей // Материалы XLIII международной научной студенческой конференции "Студент и научно-технический прогресс", Новосибирск, 2005. С. 101.
- Osipova D.V., Kulikov A.V. The association of C1473G polymorphism in tryptophan hydroxylase-2 gene and intermale aggression in mice // International Summer School in Behavioural Neurogenetics, Moscow, 2005. P. 74.
- Куликов А.В., Осипова Д.В., Попова Н.К. Молекулярные механизмы регуляции активности триптофангидроксилазы в головном мозге мышей // «Нейрохимия: фундаментальные и прикладные аспекты». Тезисы докладов и стендовых сообщений, Москва, 2005. С. 23.
- Осипова Д.В., Куликов А.В. Связь C1473G полиморфизма в гене Tph2 с активностью триптофангидроксилазы-2 в мозге мышей // Материалы Международной конференции «Генетика в России и мире», посвященной 40-летию Института общей генетики им. Н.И. Вавилова РАН, Москва, 2006. С. 146.
- Osipova D.V., Kulikov A.V. Influence of the C1473G polymorphism in tryptophan hydroxylase 2 gene on the enzyme activity, intermale aggression and immobility in the forced swim test in mice // Proceedings of the 11-th Multidisciplinary International Neuroscience and Biological Psychiatry Conference "Stress and Behavior" (1st ISBS Conference), St-Petersburg, 2008. P. 52.
- Осипова Д.В., Куликов А.В. Влияние C1473G полиморфизма в гене триптофангидроксилазы-2 на межсамцовую агрессию и неподвижность в тесте принудительного плавания у мышей // VI Сибирский физиологический съезд. Тезисы докладов, Барнаул, 2008. Т. 2, С. 7.
- Kulikov A.V., Bazovkina D.V., Osipova D.V. New animal models for psychotropic drug-drug interactions // EHRLICH II –2nd World Conference on Magic Bullets Celebrating the 100th Anniversary of the Nobel Prize Award to Paul Ehrlich. Abstract book, Nurnberg, 2008. P. A-169.
- Осипова Д.В., Попова Н.К. Сцепление полиморфизма C1473G в гене tph2 с активностью триптофангидроксилазы-2, межсамцовой агрессией и неподвижностью в тесте принудительного плавания у мышей // V Съезд Вавиловского Общества Генетиков и Селекционеров, Москва, 2009. Часть II. С. 126.
