Выявление связанных с регуляцией пролиферации генов-мишеней транскрипционных факторов foxa в геноме мыши. (
На правах рукописи
Брызгалов леонид олегович
Выявление связанных с регуляцией пролиферации генов-мишеней транскрипционных факторов FoxA в геноме мыши.
(03.02.07 - генетика)
АВТОРЕФЕРАТ
диссертации на соискание ученой степени
кандидата биологических наук
Новосибирск - 2010
Работа выполнена в лаборатории регуляции экспрессии генов, учреждения Российской академии наук Института цитологии и генетики СО РАН, Новосибирск
Научный руководитель: доктор биологических наук, профессор
Т.И. Меркулова
Институт цитологии и генетики СО РАН
Официальные оппоненты: доктор биологических наук Д. П. Фурман
Институт цитологии и генетики СО РАН
кандидат биологических наук С. П. Коваленко Институт молекулярной биологии и биофизики СО РАМН
Ведущее учреждение: ГНЦ ВБ "Вектор", Новосибирск п.г.т. Кольцово
Защита диссертации состоится 2010г. на утреннем заседании диссертационного совета Д003.011.01 по защите диссертаций на соискание ученой степени доктора наук в Институте цитологии и генетики СО РАН, в конференц-зале Института по адресу 630090, г. Новосибирск, 90, Проспект академика Лаврентьева, 10, т/ф (383) 3331278, e-mail: [email protected]
С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Института цитологии и генетики СО РАН.
Автореферат разослан « » 2010г.
Ученый секретарь
диссертационного совета
доктор биологических наук Т.М. Хлебодарова
Актуальность темы Понимание молекулярных механизмов возникновения и развития злокачественных опухолей является необходимым шагом для разработки эффективных методов лечения и профилактики онкологических заболеваний. Одним из активно развивающихся направлений исследований в этой области является изучение роли различных регуляторных белков (факторов роста, рецепторов, компонентов путей передачи сигналов, факторов транскрипции) в процессах канцерогенеза. Так, изменение экспрессии или активности тех или иных транскрипционных факторов под действием канцерогенных соединений может инициировать каскад событий, ведущих к злокачественному перерождению клетки. При этом в зависимости от того, на какие регуляторные белки влияют эти вещества, могут поражаться лишь определенные ткани, а именно те, в которых данные белки играют ключевую роль в поддержании клеточного фенотипа и/или в контроле пролиферации, что может объяснять тропность многих канцерогенных соединений к тому или иному органу. Таким образом, представляется интересным выяснение механизмов опухолесупрессорного или опухолеиндуцирующего действия факторов транскрипции, экспрессирующихся в ограниченном числе тканей и органов и обеспечивающих дифференцировку различных типов клеток.
Ранее в нашей лаборатории на линиях мышей, устойчивых и чувствительных к действию гепатоканцерогена орто-аминоазотолуола (ОАТ), были получены данные, указывающие на антионкогенные свойства транскрипционных факторов подсемейства FoxA (по старой номенклатуре HNF3), которые играют ведущую роль в становлении и поддержании фенотипа клеток печени и вовлечены в процесс торможения пролиферации гепатоцитов. Было установлено, что ДНК-связывающая активность FoxA белков под действием ОАТ снижается только у взрослых животных тех линий, у которых он вызывает опухоли печени. Были получены также данные о видовой специфичности влияния 3’-метил-4-диметиламиноазобензола (3’-МеДАБ) гепатоканцерогенного для крыс, но не для взрослых мышей и гепатоканцерогенного только для мышей ОАТ на FoxA ДНК-связывающую активность в печени этих животных. В этой связи большой интерес представляло проведение более систематического исследования, включающего как изучение влияния видоспецифичных ОАТ и 3’-МеДАБ, видонеспецифического гепатоканцерогена диэтилнитрозамина (ДЭНА), а также неканцерогенного 4’-метил-4-диметиламиноазобензола (4'-МеДАБ) на активность FoxA белков в печени взрослых мышей и крыс, так и действия ОАТ и 3’-МеДАБ на FoxA ДНК-связывающую активность в печени 12-ти дневных мышат, для которых оба соединения являются гепатоканцерогенами.
Известно, что антионкогенные свойства связанных с дифференцировкой транскрипционных факторов обусловлены их способностью блокировать пролиферацию клеток и/или запускать апоптоз [Timchenko et al., 1996; Wang et al., 2001; Amsterdam et al., 2002]. Поэтому логично предполагать, что среди генов-мишеней факторов FoxA должны находиться гены, продукты которых участвуют в этих процессах. Хотя к настоящему времени выявлено немало генов, контролируемых FoxA белками, круг их ограничен, главным образом, генными сетями метаболизма глюкозы, аминокислот и липидов, а также экспрессирующимися в печени генами, которые кодируют белки плазмы крови [Schrem et al., 2002]. Гены-мишени факторов транскрипции FoxA, связанные с торможением пролиферации и апоптозом, остаются малоизучены. Выявление таких генов внесет существенный вклад в понимание тканеспецифичных механизмов регуляции процессов пролиферации и апоптоза в норме и будет способствовать развитию методов, позволяющих корректировать нарушения этих процессов при злокачественном перерождении клеток.
Цель и задачи исследования Целью работы было выяснение роли транскрипционных факторов FoxA в механизмах гепатоканцерогенеза, включающее дальнейшее изучение влияния гепатоканцерогенов на FoxA белки в печени мышей и поиск генов-мишеней этих факторов, связанных с процессами пролиферации и апоптоза.
Задачи исследования:
- Изучение влияния видонеспецифического гепатоканцерогена ДЭНА и неканцерогенного соединения 4'-МеДАБ на ДНК-связывающую активность FoxA белков в печени мышей линии A/He.
- Исследование влияния гепатоканцерогенных аминоазокрасителей ОАТ и 3’- МеДАБ на FoxA ДНК-связывающую активность в печени 12-ти дневных мышат линии ICR, а также взрослых мышей этой линии.
- Изучение влияния гепатоканцерогенов на взаимодействие FoxA с регуляторными районами их генов-мишеней в условиях in vivo на примере глюкокортикоид-индуцибельных энхансеров гена тирозинаминотрансферазы (ТАТ).
- Поиск потенциальных генов-мишеней FoxA, связанных с контролем пролиферации и апоптоза, с использованием опубликованных данных массового анализа экспрессии генов мыши и компьютерных методов распознавания сайтов связывания FoxA.
- Получение GST-слитых белков, содержащих ДНК-связывающие домены FoxA2 и FoxA3 крысы и мыши соответственно, проверка их активности и специфичности.
- Экспериментальная проверка предсказанных компьютерными методами сайтов связывания FoxA с использованием рекомбинантных белков и белков ядерного экстракта.
- Определение влияния ОАТ (снижающего FoxA ДНК-связывающую активность в печени мышей) на экспрессию потенциальных генов-мишеней FoxA мыши и взаимодействие этих транскрипционных факторов с регуляторными районами таких генов в условиях in vivo.
Новизна и научно-практическая значимость исследования Установлено, что ДНК-связывающая активность транскрипционных факторов FoxA в печени мышей снижается под действием видонеспецифического канцерогена ДЭНА, вызывающего опухоли печени как у крыс, так и у мышей. Показано, что неканцерогенный для обоих видов животных аминоазокраситель 4'-МеДАБ на активность FoxA белков в печени мышей не влияет. Показано, что у 12-ти дневных мышат FoxA ДНК-связывающая активность снижается как под действием «мышиного» гепатоканцерогена ОАТ, так и «крысиного» гепатоканцерогена 3'-МеДАБ, вызывающего развитие опухолей печени и у мышей при условии его введения в возрасте 12-и дней. На мышах линии ICR показана прямая связь между активностью FoxA белков и снижением глюкокортикоидной индукции ТАТ.
Обнаружены два района на расстоянии -2,5 и -6,2 т.п.н. от старта транскрипции гена ТАТ мыши, высокогомологичные глюкокортикоид-индуцибельным энхансерам гена ТАТ крысы, и впервые показано взаимодействие с ними FoxA белков (Foxa2 и FoxA3) in vivo. Впервые показано снижение под действием ОАТ связывания FoxA белков с данными регуляторными районами in vivo. Найден новый тип “сильных” сайтов связывания FoxA белков, организованных в виде трех и более повторов тетрануклеотида TTTG. Выявлено два потенциальных гена-мишени FoxA белков - Cul2 и Cdc73. Показано, что уровень экспрессии гена Cul2 под действием ОАТ, снижающего активность FoxA белков, увеличивается в 10 раз, а Cdc73 в 5 раз, что позволяет предполагать репрессию данных генов этим транскрипционным фактором. Полученные результаты имеют существенное значение для понимания роли тканеспецифичных транскрипционных факторов, в частности FoxA, в механизмах возникновения и формирования опухолей печени под действием гепатоканцерогенов.
Выявленный новый тип сайтов связывания в виде TTTG повторов позволяет проводить предварительный поиск новых генов-мишеней FoxA белков контекстным анализом. Материалы данной диссертации используются при чтении лекций по ряду спецкурсов на ФЕН НГУ.
Положения, выносимые на защиту
- FoxA ДНК-связывающая активность снижается под действием видонеспецифичного гепатоканцерогена ДЭНА в печени мышей и не изменяется при введении неканцерогенного 4'-МеДАБ.
- Под действием ОАТ ДНК-связывающая активность FoxA белков снижается как у взрослых, так и у 12-ти дневных мышей линии ICR. 3'-МеДАБ снижает активность FoxA у мышей линии ICR только в возрасте 12-ти дней, но в меньшей, чем ОАТ степени.
- Транскрипционные факторы FoxA2 и FoxA3 in vivo связываются с районами, расположенными на расстоянии -6,2 и -2,5 т.п.н. от старта транскрипции гена ТАТ мыши. ОАТ снижает связывание FoxA с этими районами in vivo.
- Уровень изменения ДНК-связывающей активности белков FoxA у мышей линий ICR и A/He соответствует изменению уровня глюкокортикоидной индукции гена ТАТ.
- Найдено 12 потенциальных генов-мишеней транскрипционных факторов FoxA.
- Показано, что ОАТ увеличивает экспрессию Cul2 в 10 раз, а Cdc73 – в 5 раз; уровень экспрессии генов Creb3l3, Ppp2r5d, Ptk2b и Pdcd8 изменяется недостоверно.
- Транскрипционные факторы FoxA эффективно связываются с сайтами организованными в виде 3 и более повторов тетрануклеотида TTTG.
Апробация работы. Результаты исследования были представлены на II Съезде общества клеточной биологии совместно с юбилейной конференцией, посвященной 50-летию Института цитологии РАН (Санкт-Петербург, 16-19 октября 2007) и 34th FEBS Congress (Prague, Czech Republic. 2009).
Публикации по теме диссертации. По материалам диссертации опубликовано 4 статьи.
Структура и объем работы. Диссертация состоит из введения, обзора литературы, описания использованных материалов и методов, изложения и обсуждения собственных экспериментальных данных, выводов и списка литературы (189 наименований). Работа изложена на 129 страницах машинописного текста, содержит 6 таблиц и 20 рисунков.
МЕТОДЫ И МАТЕРИАЛЫ
Работа выполнена на 12-ти дневных и взрослых самцах мышей линий А/He и ICR, а также самцах крыс Wistar весом 200-250 г разведения вивария Института цитологии и генетики СО РАН. Связывание белков экстракта ядер и рекомбинантных GST-слитых белков, синтезированных в E.сoli, с различными олигонуклеотидами изучали методом задержки ДНК пробы в геле. Уровень экспрессии измеряли с помощью ПЦР в реальном времени. Для определения связывания белков FoxA2 и FoxA3 с их регуляторными участками в генах в условиях in vivo использовали метод иммунопреципитации хроматина.
СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ
Изучение влияния ДЭНА и 4’-МеДАБ на FoxA ДНК-связывающую активность в печени мышей. Ранее были получены данные, указывающие на связь между видоспецифической гепатоканцерогенной активностью соединений 3’-МеДАБ и ОАТ у крыс и мышей, а также 4’-МеДАБ и ДЭНА у крыс, и их способностью снижать связывание FoxA белков печени этих животных со специфическими ДНК сайтами в условиях in vitro [Kropachev et al., 2001; Меркулова и др., 2003]. Для логического завершения этой работы было необходимо изучить действие 4’-МеДАБ и ДЭНА на ДНК-связывающую активность FoxA белков в печени мышей. В ходе работы были также дополнены данные о действии видоспецифичных 3’-МеДАБ и ОАТ на FoxA белки как в печени взрослых мышей, так и в печени взрослых крыс.
Исследование влияния всех перечисленных соединений на FoxA ДНК-связывающую активность проводили методом задержки в геле ДНК-зонда, соответствующего известному сайту связывания FoxA из промотора гена транстиретина (TTR), белками ядерного экстракта клеток печени (рис. 1). Видно, что взаимодействие FoxA белков экстракта ядер печени с меченым зондом как у взрослых мышей, так и у крыс значительно снижается под действием ДЭНА, вызывающего опухоли печени как у крыс, так и у мышей.
Аминоазокраситель 4’-МеДАБ очень близкий по своей химической структуре как к ОАТ, так и 3’-МеДАБ, но неканцерогенный для обоих видов животных, не влиял на связывание с ДНК-зондом FoxA белков печени взрослых мышей и крыс. Исследование видоспецифичных гепатоканцерогенов ОАТ и 4’-МеДАБ подтвердило ранее полученные результаты [Kropachev et al., 2001; Меркулова и др., 2003], то есть снижение FoxA ДНК-связывающей активности наблюдалось только у животных того вида, у которого данное соединение вызывало опухоли печени: ОАТ - у мышей, 3’-МеДАБ - у крыс.
Таким образом, впервые было показано, что ДНК-связывающая активность FoxA белков в печени мыши снижается под действием гепатоканцерогенного ДЭНА, и не меняется при введении неканцерогенного 4’-МеДАБ. Были также дополнены данные о влиянии гепатоканцерогенных аминоазокрасителей на активность FoxA в печени мышей и крыс, а также ДЭНА в печени крыс.
Влияние ОАТ и 3'-МеДАБ на ДНК-связывающую активность транскрипционных факторов FoxA у мышей линии ICR разного возраста. Для исследования молекулярных механизмов индуцированного гепатоканцерогенеза наиболее удобной моделью являются 12-ти дневные мышата, так как развитие опухолей печени происходит после однократного введения гепатоканцерогена в этом возрасте. Однако существует ряд особенностей действия гепатоканцерогенов на мышей в этом возрасте. Так, неканцерогенный для взрослых мышей 3'-МеДАБ при введении в возрасте 12-ти дней, так же, как и ОАТ обладает, хоть и немного менее выраженной, опухолеиндуцирующей активностью. Для изучения возможного участия FoxA белков в процессах гепатоканцерогенеза у мышат определяли влияние OAT и 3'-МеДАБ на FoxA ДНК-связывающую активность у мышей линий ICR и А/He в возрасте 12-ти дней методом задержки ДНК-зонда (ТТR) в геле (рис. 2). Видно, что введение OAT 12-ти дневным мышатам как линии ICR, так и А/He, приводит к значительному снижению ДНК-связывающей активности FoxA в экстрактах ядер клеток печени. Эта активность снижается и под действием 3'-МеДАБ, но в меньшей степени. При введении исследуемых азокрасителей мышам в возрасте 3 месяцев наблюдается уже существенное различие в действии OAT и 3'-МеДАБ на FoxA ДНК-связывающую активность. Активность FoxA у взрослых снижается под действием ОАТ, так же как и у 12-ти дневных мышат, при этом 3'-МеДАБ, который у взрослых мышей не вызывает образования опухолей печени, на нее практически не влияет (исследования изменения FoxA активности у взрослых мышей линии А/He проведены ранее [Kropachev et al., 2001]). Таким образом, показано, что в ответ на введение соединений, вызывающих впоследствии опухоли печени, в возрасте 12-ти дней, как и при обработке взрослых мышей, происходит снижение FoxA ДНК-связывающей активности. Также показано, что, как и у остальных чувствительных к гепатоканцерогенному действию ОАТ линий мышей, таких как A/He и SWR, у взрослых мышей линии ICR происходит снижение активности FoxA под действием этого гепатоканцерогена.
Влияние ОАТ на связывание FoxA с регуляторными районами гена ТАТ in vivo. При анализе регуляторных районов гена ТАТ мыши и крысы были выявлены схожие районы, степень гомологии которых была более 80%, соответствующие глюкокортикоид-индуцибельнымным энхансерам -2,5 и -5,5 т.п.н. гена ТАТ крысы, которые содержат сайты связывания FoxA.
Методом иммунопреципитации хроматина мы изучили связывание FoxA белков с этими районами у 12-ти дневных мышат линии ICR и A/He in vivo. Результаты эксперимента приведены на рис. 3. Видно, что происходит обогащение данными районами преципитатов ДНК, полученных с использованием антител к FoxA2 и FoxA3.
Введение ОАТ приводит к снижению занятости сайтов связывания FoxA белков в обоих районах гена ТАТ (рис. 3), при этом наблюдается связь между активностью FoxA белков и глюкокортикоидной индукцией гена ТАТ.
Из данных, приведенных на рис. 4, видно, что изменение ДНК-связывающей активности FoxA четко соответствует степени снижения глюкокортикоидной индукции ТАТ. Таким образом, было доказано существование сайтов связывания FoxA в районах, расположенных на расстоянии -2,5 т.п.н. и -6,2 т.п.н. от старта транскрипции гена ТАТ мыши, а также показано, что введение ОАТ приводит к тому, что как FoxA2, так и FoxA3 перестают связываться с этими районами in vivo, что, по-видимому, и приводит к нарушению глюкокортикоидной регуляции данного гена после введения гепатоканцерогенов. Можно предположить, что снижение активности FoxA белков приводит к нарушению регуляции не только гена ТАТ, но и других генов, в том числе и генов, связанных с регуляцией дифференцировки и пролиферации клеток, что, в свою очередь, в дальнейшем может приводить к развитию опухолей печени.
Поиск потенциальных генов-мишеней FoxA, связанных с регуляцией клеточного цикла и апоптоза, с использованием данных массового анализа экспрессии генов. Для первичного выбора генов, продукты которых могут быть связаны с осуществлением или регуляцией процессов пролиферации и апоптоза в печени, были использованы результаты массового анализа экспрессии генов в различных органах взрослых мышей, опубликованные в базе данных Gene Expression Omnibus (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/geo/). Поскольку известно, что в печени взрослых мышей наблюдается высокий уровень экспрессии белков FoxA1 и FoxA2, а в тканях почки их экспрессия отсутствует [Kaestner et al., 1994], нами было отобрано 686 генов, уровень экспрессии которых в печени достоверно (p>0,999), согласно данным базы Gene Expression Omnibus, отличался от такового в почках. Логично ожидать, что такая выборка будет обогащена генами-мишенями FoxA.
Для этих генов была собрана информация о возможности их участия в процессах пролиферации и апоптоза путем анализа данных, опубликованных в базах данных NCBI и литературных источниках. В результате была составлена выборка из 40 генов.
Поиск потенциальных сайтов связывания FoxA белков, и их возможных генов-мишеней с помощью метода SITECON. Нуклеотидные последовательности 40 отобранных генов и прилегающих к ним районов 5000 п.н. выше старта транскрипции были экстрагированы из баз данных GenBank/EMBL.
Затем с помощью биоинформатического метода SITECON [Oschepkov et al., 2004] сотрудником лаборатории теоретической генетики ИЦиГ СО РАН Д. Ю. Ощепковым был проведен поиск потенциальных сайтов связывания FoxA в последовательностях этих генов и прилегающих к ним районах до - 5000 п.н. Для адаптации метода поиска этих сайтов, предварительно на основании данных литературы, нами была сформирована обучающая выборка из 19 сайтов связывания FoxA, выявленных методом футпринтинга с использованием ДНКазы.
Хотя бы один сайт связывания FoxA был обнаружен практически во всех анализируемых генах (38 из 40), в 27 было обнаружено более 2 сайтов связывания. Так как регуляторные районы известных генов-мишеней FoxA, как правило, содержат несколько близкорасположенных сайтов FoxA [Schoneveld et al., 2004; Меркулова и др., 1997], в качестве потенциальных генов-мишеней этих факторов нами рассматривались только те гены, в последовательностях которых находились кластеры из двух и более близко расположенных потенциальных FoxA-сайтов.
Экспериментальная проверка предсказанных сайтов связывания FoxA белков. Для экспериментальной проверки были взяты 9 сайтов с различной первичной структурой из потенциальных генов-мишеней. Проверка проводилась методом задержки ДНК-пробы в геле с использованием соответствующих предсказанным сайтам двуцепочечных олигонуклеотидов и белков ядерного экстракта клеток печени взрослых крыс Wistar. Данные представлены на рис. 5А. Полосы задержки, соответствующие ДНК-белковым комплексам, присутствовали в 6 пробах, при этом только в 4-ой и 7-ой пробах подвижность основных ДНК-белковых комплексов совпадала с подвижностью комплексов с ДНК-зондом, соответствующим известному сайту связывания FoxA из промотора гена транстиретина мыши (дорожка 1). В остальных 4 пробах (2, 3, 5 и 8) подвижность ДНК-белковых комплексов значительно отличалась от контрольной, что может означать, что комплекс сформирован не FoxA белком, либо то, что помимо FoxA белка с данным фрагментом ДНК взаимодействуют
другие ядерные белки.
Для подтверждения взаимодействия белка FoxA с предсказанными для него сайтами нами были получены очищенные GST-слитые белки, содержащие ДНК-связывающие домены FoxA2 (GST-DBD-FoxA2) и FoxA3 (GST-DBD-FoxA3).
Результаты эксперимента по задержке ДНК-зонда в геле с использованием 9 исследуемых олигонуклеотидов и очищенного на глутатион-агарозе GST-DBD-FoxA2 приведены на рис. 5Б. Как видно, данные полученные с химерным белком, хорошо согласуются с результатами по взаимодействию предсказанных сайтов связывания с белками ядерного экстракта клеток печени крысы (рис. 5А). Т.е там, где подвижность ДНК-белковых комплексов соответствовала подвижности в контрольной пробе (рис. 5А, проба 4 и 7), там и наблюдалось сильное связывание с химерным белком (рис. 5Б проба 4 и 7).
Наиболее сильным сайтом оказался участок гена СDС73, содержащий 5 повторов тетрануклеотида TTTG, соответствующий последовательности СDС73_+1302. 3-6 звенные повторы этого тетрануклеотида были обнаружены в 13 генах, причем в 11 из них они образуют кластеры сайтов связывания FoxA. В связи с этим было изучено связывание FoxA2 с сайтами, содержащими разное число тетрануклеотидов TTTG. Для этого была исследована конкуренция немеченых олигонуклеотидов, соответствующих предсказанным сайтам связывания, содержащим разное число повторов, с природным сайтом из гена TTR мыши за связывание с рекомбинантным белком GST-DBD-FoxA2. Как видно из данных, приведенных на рисунке 6, предсказанные сайты связывания, содержащие 3-6 звенные повторы TTTG, эффективно связываются с рекомбинантным белком. В то же время двухзвенный повтор, содержащийся в ряде предсказанных сайтов, не связывался с GST-DBD-FoxA2. Данные повторы образуют кластеры FoxA-сайтов в 11 из 40 найденных потенциальных генов-мишеней FoxA. Для дальнейшего изучения возможной регуляции FoxA белками было отобрано 6 из этих генов - Creb3l3, Ppp2r5d, Cdc73, Cul2, Ptk2b и Pdcd8.
Влияние ОАТ на экспрессию потенциальных генов-мишеней FoxA. Для изучения влияния FoxA белков на экспрессию найденных потенциальных генов-мишеней был использован тот факт, что в результате обработки ОАТ мышей чувствительных к его гепатоканцерогенному действию линий происходит снижение активности этих факторов в печени [Kropachev et al., 2001]. В данной работе в качестве экспериментальной модели были использованы 12-ти дневные мыши линии ICR. Из данных, представленных на рисунках 2 и 4, видно, что обработка ОАТ 12-ти дневных мышат ICR приводит к практически полному ингибированию ДНК-связывающей активности FoxA.
Изучение действия ОАТ при введении его 12-ти дневным мышам ICR на экспрессию 6 генов, содержащих кластеры подтвержденных микросателлитных сайтов FoxA: Creb3l3 (cAMP responsive element binding protein 3-like 3), Ppp2r5d (protein phosphatase 2, regulatory subunit B (B56), delta isoform), Cdc73 (V cell division cycle 73, Paf1/RNA polymerase II complex component, homolog (S. cerevisiae)), Cul2 (Cullin2), Ptk2b (protein tyrosine kinase 2 beta), Pdcd8 (programmed cell death 8) - с помощью ПЦР в реальном времени показало, что наиболее сильно на обработку гепатоканцерогеном реагировали гены Cul2 и Cdc73 (рис. 7). Экспрессия гена Cul2 увеличилась в 10 раз, а Cdc73 – в 5 раз. Экспрессия остальных генов изменялась значительно слабее, либо, как в случае генов Ppp2r5d, Ptk2b и Creb3l3 недостоверно.
Таким образом, принимая во внимание наличие сайтов связывания FoxA белков в районах генов Cul2 и Cdc73 и изменение их экспрессии под действием ОАТ, снижающего FoxA активность, можно предположить прямое участие этих транскрипционных факторов в регуляции этих двух генов.
Исследование участия FoxA белков в регуляции гена Cul2 in vivo. Для дальнейшего исследования возможного участия FoxA белков в регуляции экспрессии гена Cul2 была предпринята попытка обнаружить наличие FoxA белков in vivo в месте их предсказанных сайтов связывания в данном гене с помощью метода хроматин-иммунопреципитации. Для эксперимента были взяты 12-ти дневные мыши линий ICR и A/He. В качестве положительного контроля были использованы обнаруженные нами регуляторные районы гена ТАТ мыши, расположенные на расстоянии 2,5 т.п.н. и 6,2 т.п.н., и содержащие сайты для FoxA белков. Однако нам не удалось показать взаимодействия FoxA белков с районом гена Cul2, содержащим предполагаемый сайт связывания FoxA. Данный результат может быть следствием низкой разрешающей способности используемого нами метода.
Выводы
- Впервые показано, что видонеспецифичный гепатоканцероген ДЭНА снижает FoxA ДНК-связывающую активность в печени мышей, а неканцерогенный 4'-МеДАБ на нее не влияет.
- Показано, что ДНК-связывающая активность FoxA белков снижается под действием ОАТ как у взрослых, так и у 12-ти дневных мышей линии ICR. Показано, что 3'-МеДАБ, гепатоканцерогенный для мышей в возрасте 12 дней, снижает активность FoxA у мышей линии ICR в этом возрасте, но в меньшей, чем ОАТ, степени.
- Методом иммунопреципитации хроматина показано связывание FoxA2 и FoxA3 in vivo с районами, расположенными на расстоянии -6,2 и -2,5 т.п.н. от старта транскрипции гена ТАТ мыши. Показано, что под действием ОАТ уменьшается занятость этих районов FoxA белками in vivo.
- На модели 12-ти дневных и взрослых мышей линии ICR показано, что уровень ДНК-связывающей активности белков FoxA соответствует уровню глюкокортикоидной индукции гена ТАТ мыши.
- C использованием опубликованных данных о профилях экспрессии генов мыши и компьютерного метода SITECON с выборочной экспериментальной проверкой предсказанных этим методом сайтов связывания FoxA найдено 12 потенциальных генов-мишеней этих транскрипционных факторов.
- Методом ПЦР в реальном времени изучено влияние ОАТ, снижающего активность факторов FoxA, на экспрессию 6 потенциальных генов-мишеней: Creb3l3, Ppp2r5d, Cdc73, Cul2, Ptk2b и Pdcd8. Показано, что ОАТ увеличивает экспрессию Cul2 в 10 раз, а Cdc73 – в 5 раз; уровень экспрессии остальных генов изменялся недостоверно.
- Обнаружен новый тип “сильных” сайтов связывания транскрипционных факторов FoxA, организованный в виде 3 и более повторов тетрануклеотида TTTG.
Основные результаты работы содержатся в следующих публикациях
- К.Ю. Кропачев, М.Ю. Пахарукова, Л.О. Брызгалов, В.И. Каледин, В.Ф. Кобзев, Т.И. Меркулова. Неизвестный ядерный белок, снижающий активность HNF3, обеспечивает видоспецифичность действия гепатоканцерогенных аминоазокрасителей // Доклады Академии Наук. - 2004. Т. 397. N 5. С. 694-696.
- Merkulova T.I., Kropachev K.Y., Timofeeva O.A., Vasiliev G.V., Levashova Z.B., Ilnitskaya S.I., Kobzev V.F., Pakharukova M.Y., Bryzgalov L.O., Kaledin V.I. Species-specific effects of the hepatocarcinogens 3'-methyl-4-dimethyl-aminoazobenzene and ortho-aminoazotoluene in mouse and rat liver // Molecular Carcinogenesis. - 2005. - V. 44. - N 4. - P. 223-232.
- Л.О. Брызгалов, Н.И. Ершов, С.И. Ильницкая. Транскрипционные факторы FoxA определяют амплитуду глюкокортикоидной индукции тирозинаминотрансферазы у мышей // Бюллетень Экспериментальной Биологии и Медицины. – 2007. Т. 144. N 11. С. 565-567.
- Л.О. Брызгалов, Н.И. Ершов, Д.Ю. Ощепков, В.И. Каледин, Т.И. Меркулова. Выявление генов-мишеней транскрипционных факторов FoxA, связанных с регуляцией пролиферации // Биохимия. – 2008 Т. 73, N 1, С. 70-75.
