Генетика пшенично-ржаных гибридов и первичных октоплоидных тритикале
САНКТ-ПЕТЕРБУРГСКИЙ ГОСУДАРСТВЕННЫЙ УНИВЕРСИТЕТ
На правах рукописи
ТИХЕНКО
Наталья Дмитриевна
Генетика пшенично-ржаных гибридов и первичных октоплоидных
тритикале
Специальность: 03.02.07 – «генетика»
АВТОРЕФЕРАТ
диссертации на соискание ученой степени
доктора биологических наук
Санкт-Петербург
2011
Работа выполнена в Санкт-Петербургском государственном университете на
кафедре генетики и селекции, в лаборатории генетики и биотехнологии растений Санкт-Петербургского филиала Института общей генетики им. Н.И. Вавилова РАН.
Научный консультант: доктор биологических наук
Анатолий Васильевич Войлоков,
Санкт-Петербургский филиал Института
общей генетики им. Н.И. Вавилова, РАН
Официальные оппоненты: доктор биологических наук
Константин Васильевич Квитко,
профессор каф. микробиологии
Санкт-Петербургского государственного
университета
доктор биологических наук
Ольга Павловна Митрофанова,
Зав. отделом ГР пшеницы ГНУ
ВИР им. Н.И. Вавилова РАСХН,
Санкт-Петербург
доктор биологических наук
Галина Александровна Макарова
глав.н.сотр. лаб. экофизиологии
растений Агрофизического научно-
исследовательского института, РАСХН
Ведущее учреждение: Ботанический институт им. В.Л. Комарова РАН
Защита состоится ______________________ в ______ на заседании
совета Д 212.232.12 по защите докторских и кандидатских диссертаций при Санкт-Петербургском государственном университете по адресу: 199034, Санкт-Петербург, Университетская наб., 7/9. Санкт-Петербургский государственный университет, кафедра генетики и селекции, ауд. 1.
С диссертацией можно ознакомиться в научной библиотеке им. М.Горького
Санкт-Петербургского государственного университета
Автореферат разослан ________________ 2011
Ученый секретарь диссертационного совета
д.б.н. Л.А. Мамон
Введение
Актуальность проблемы. Полиплоидия, особенно аллополиплоидия, объединение наследственного материала двух различных видов в одно генетическое целое с новыми признаками и свойствами – является одним из наиболее важных эволюционных процессов в растительном мире, в конечном счете, приводящим к формированию новых таксонов. Тритикале являются синтетическими аллополиплоидами, возникшими в результате удвоения хромосом у пшенично-ржаных гибридов. Эти синтетические амфидиплоиды объединяют в себе хромосомы различных видов пшеницы (чаще всего гексаплоидных или тетраплоидных) и ржи (как правило, Secale cereale L.). В этом случае два полных набора генов, выполняющих более или менее схожие функции у родителей должны найти пути кооперации друг с другом за короткий период. Тритикале, являясь успешной новой зерновой культурой, в тоже время могут быть модельным объектом для изучения эволюции полиплоидных видов (Lelley, 2006).
Далеко не всякое скрещивание между пшеницей (тетраплоидной или гексаплоидной) и рожью позволяет получить жизнеспособный гибрид. При получении пшенично-ржаных гибридов и первичных тритикале описаны многочисленные случаи несовместимости геномов родительских форм (Mntzing, 1979; Lelly, 1996, 2006; Oettler, 1998). Одним из первых, кто высказал предположение, что в основе несовместимости геномов разных видов лежит идея о различиях по единичным генам специфического действия, как причине постзиготической несовместимости, был Г. Д. Карпеченко (1935). В целом, процесс генной адаптации, возникающей в результате совмещения геномов разных видов в одно целое у отдаленного гибрида, реализуется как бесчисленные взаимодействия, и понимание механизмов, функций и их значимости находится еще в зачаточном состоянии (Wendel, 2000; Ozkan et al., 2001; Liu and Wendel, 2003; Feldman and Levy, 2005; Chen, 2007). Пшенично-ржаные гибриды и первичные тритикале дают уникальную возможность наиболее близко подойти к пониманию, что является необходимым для определения путей становления нового вида, возникшего в результате отдаленной гибридизации.
Пшеница (твердая и мягкая) - самоопыляющаяся культура и природный аллополиплоид, что предполагает аддитивное действие генов в формировании признаков. Рожь – строгий перекрестно опыляемый диплоидный вид с гаметофитной системой самонесовместимости, обеспечивающей высокую генетическую изменчивость и жизнеспособность отдельных особей сортовых популяций. Внутрипопуляционная изменчивость ржи может быть выявлена путем преодоления самонесовместимости и создания инбредных линий на основе мутаций автофертильности, позволяющих зафиксировать в гомозиготном состоянии широкий спектр доминантных, а также рецессивных аллелей, скрытых в гетерозиготном состоянии. Получение пшенично-ржаных гибридов и первичных тритикале на основе одного генотипа пшеницы и большой серии инбредных линий ржи позволяет выявлять и изучать особенности взаимодействия генов родительских видов, контролирующих широкий спектр хозяйственно ценных признаков, и генов, определяющих механизмы межвидовой репродуктивной изоляции.
Цель исследований – используя уникальную Петергофскую генетическую коллекцию инбредных автофертильных линий ржи и оригинальный вариант гибридологического анализа изучить особенности проявления и взаимодействия генов родительских форм у пшенично-ржаных гибридов и первичных тритикале, разработать новые подходы к решению научных и практических задач, возникающих при работе с аллополиплоидами.
Задачи:
1) изучить проявление и взаимодействие генов родительских форм, участвующих в формировании ряда качественных (устойчивость к патогенным грибам) и количественных (высота растения, фертильность) признаков, выявить признаки, специфически проявляющиеся у пшенично-ржаных гибридов и тритикале;
2) изучить генетический контроль эмбриональной летальности и гибридной карликовости, возникающих при скрещивании мягкой пшеницы с отдельными линиями ржи;
3) с помощью серии рекомбинантных инбредных линий (РИЛ) и серии нулли-тетрасомных линий установить хромосомную локализацию генов эмбриональной летальности;
4) разработать методы, позволяющие преодолеть эмбриональную летальность и получить пшенично-ржаные гибриды с «летальным» генотипом;
5) на основе собственных и литературных данных проследить параллелизм в формировании барьеров постзиготической репродуктивной изоляции у цветковых растений.
Научная новизна. Показано, что специальная генетическая модель, основанная на использовании двух генетических коллекций: инбредные автофертильные линии из Петергофской коллекции ржи и генетические линии мягкой пшеницы сорта Chinese Spring и сам сорт, с участием которых получали пшенично-ржаные гибриды и первичные тритикале, по оригинальной схеме скрещиваний (Voylokov, Tikhenko, 1998), является универсальной моделью, позволяющей выявлять, картировать и изучать взаимодействия генов родительских форм в геноме аллополиплоидов.
Впервые выявлены и проведена хромосомная локализация генов Eml-R1 ржи и Eml-A1 пшеницы, отвечающих за эмбриональную летальность пшенично-ржаных гибридов. Показано, что взаимодействие генов Eml-R1b ржи и Eml-A1 пшеницы приводит к остановке развития и последующей деградации апикальной меристемы у 16-дневных гибридных зародышей. Разработан эффективный метод культуры тканей незрелых зародышей для преодоления данной эмбриональной летальности у пшенично-ржаных гибридов, позволяющий получить растения с «летальным» генотипом. Впервые получены результаты, позволяющие оценить влияние мутаций автофертильности в локусах несовместимости ржи S, Z и T на фертильность первичных октоплоидных тритикале.
При оценке устойчивости линий тритикале к патогенным грибам выявлены различные эффекты взаимодействия геномов родительских форм: фенотипическое проявление или подавление устойчивости, проявление устойчивости в результате взаимодействия геномов восприимчивых форм. Впервые проведена оценка устойчивости инбредных линий ржи к темно-бурой листовой пятнистости и корневой гнили, вызываемых патогенным грибом Bipolaris sorokiniana. Изучен генетический контроль устойчивости к темно-бурой листовой пятнистости у инбредных линий ржи и показано, что устойчивость определяется рецессивными аллелями двух генов.
Систематизированы данные, позволяющие утверждать о наличии параллелизма в формировании барьеров постзиготической репродуктивной изоляции у цветковых растений.
Теоретическое и практическое значение работы. Результаты работы содержат новые знания по генетике пшеницы, ржи и тритикале и имеют значение для частной и сравнительной генетики злаков, селекции пшеницы и тритикале.
В работе реализован подход по обнаружению и картированию генов, специфически проявляющихся у пшенично-ржаных гибридов и тритикале, что позволило идентифицировать новые гены у ржи и пшеницы. Установлено, что аллели генов Eml-R1b, Eml-A1, Hdwb отвечают за несовместимость геномов при отдаленной гибридизации пшеницы и ржи. Показано, что хромосомы 1B, 1D и 6B мягкой пшеницы несут гены, присутствие которых необходимо для развития гибридного зародыша, т.е. обеспечивают стабилизацию структуры и функций генома в ходе эволюции на основе отдаленной гибридизации. Показана возможность преодоления гибридной эмбриональной летальности методом индукции первичного каллуса из аномальных зародышей с последующей индукцией регенерации и получением пшенично-ржаных гибридов с «летальным» генотипом. Предложена модельная система для изучения дифференциальной экспрессии генов постзиготической несовместимости родительских видов на одинаковом генотипическом фоне.
Создана коллекция первичных октоплоидных тритикале из 55 линий и проведена ее комплексная оценка по хозяйственно значимым признакам. Первичные октоплоидные тритикале Ad7a, Ad7b, Ad17 выделенные как устойчивые к бурой ржавчине пшеницы, рекомендуются в качестве новых источников устойчивости к этой болезни. Линии Ad76 и Ad39 обладают устойчивостью к обыкновенной корневой гнили и рекомендуются в качестве новых источников для использования в селекционных программах тритикале. Автофертильные линии ржи Л6, 478, 410 рекомендованы как новые источники короткостебельности для получения тритикале с высотой соломины 60-90см. Линия Л6 содержит в своем генотипе как новый ген короткостебельности, так и ген(ы) устойчивости к обыкновенной корневой гнили, проявляющиеся у первичных тритикале.
Результаты работы расширяют теоретическую и практическую базу для проведения исследовательских работ студентами и аспирантами кафедры генетики и селекции СПбГУ.
Основные положения, выносимые на защиту:
- оригинальная схема генетического анализа позволяет выявлять, картировать и определять характер взаимодействия генов не только у пшенично-ржаных гибридов и первичных октоплоидных тритикале, она также может быть использована в качестве универсальной генетической модели, для изучения генетики любых отдаленных видов, у которых есть генетические коллекции;
- выявлены сходные ряды изменчивости систем постзиготической изоляции у растений согласующиеся с законом гомологических рядов наследственной изменчивости Н.И. Вавилова.
- эмбриональная летальность, возникающая при скрещивании мягкой пшеницы с отдельными инбредными линиями ржи является результатом комплементарного взаимодействия аллели Eml-R1b ржи и Eml-A1 пшеницы; каллусогенез в культуре in vitro незрелых аномальных пшенично-ржаных зародышей позволяет преодолеть данный тип летальности и получить растения-регенеранты с «летальным» генотипом;
- использование отдельных инбредных линий ржи с мутациями автофертильности в локусе T в качестве отцовского компонента позволяет значительно повысить фертильность первичных тритикале;
- устойчивость к темно-бурой листовой пятнистости (возбудитель Bipolaris sorokiniana) у ржи определяется рецессивными аллелями двух генов, устойчивость к корневой гнили у первичных тритикале может быть результатом взаимодействия генов восприимчивых форм.
Апробация работы: Материалы диссертации были представлены на следующих отечественных и международных совещаниях, конференциях и симпозиумах: Всесоюзном совещании по цветению, опылению и семенной продуктивности растений (Пермь, 1987); Конференциях молодых ученых и студентов ЛСХИ (Ленинград, 1988, 1990); на V и VI Всесоюзных съездах ВОГиС им. Н.И. Вавилова (Москва, 1987; Минск, 1992); Всероссийской научно-производственной конференции «Интродукция нетрадиционных и редких сельскохозяйственных растений» (Пенза, 1998); 4-ом и 5-ом Международных симпозиумах по Тритикале (Канада, 1998; Польша, 2002); Международной конференции, посвященной 100-летию со дня рождения академика Н.В.Цицина (Москва, 1998); 3-ем, 4-ом, 5-ом Международных симпозиумах «Новые и нетрадиционные растения и перспективы их использования», (Пущино, 1999, 2001; Москва, 2003); 2-ом и 3-ем Всероссийских съездах ВОГиС (Санкт-Петербург, 2000; Москва, 2004); 1-ой Центрально-Азиатской конференции по пшенице (Алматы, 2003); Международной конференции по отдаленной гибридизации (Москва, 2003); 3-ем Международном конгрессе «Биотехнология: состояние и перспективы развития» (Москва, 2005); Международном симпозиуме по генетике и селекции ржи (Германия,2006); Международной Конференции «Генетика в России и мире» (Москва, 2006); 2-ой Вавиловской международной конференции «Генетические ресурсы культурных растений в XXI веке» (Санкт-Петербург, 2007); Международная конференция памяти Е.Н. Синской «Генетические ресурсы культурных растений» (Санкт-Петербург, 2009); Вавиловском семинаре в Институте генетики и селекции растений ((IPK) (Германия, 2010); 8-ой Международной конференции по пшеницы (Санкт-Петербург, 2010).
Публикации. По материалам диссертации опубликовано 40 печатных работы, из них 22 в сборниках и ведущих отечественных и международных журналах, в том числе 9 в изданиях, рекомендованных перечнем ВАК.
Структура и объем работы. Диссертация состоит из введения, обзора литературы, экспериментальной части, включающей материалы и методы, результаты и их обсуждение, заключения и выводов, а также списка цитированной литературы, насчитывающего 507 источников. Работа изложена на 313 страницах машинописного текста, включая приложение, иллюстрирована 20 рисунками и 50 таблицами.
Содержание работы
Материалы и методы исследования
В основу генетических исследований, представленных в данной работе, положена оригинальная схема генетического анализа, разработанного в лаборатории генетики растений СПбГУ (Voylokov, Tikhenko, 1998), позволяющая выявлять, картировать и определять характер взаимодействия генов родительских форм у пшенично-ржаных гибридов и первичные октоплоидных тритикале. Данная схема генетического анализа предполагает использование генетической коллекции инбредных линий ржи и одного сорта мягкой пшеницы, обладающего рецессивными аллелями генов kr1 и kr2, обеспечивающих высокую завязываемость семян при скрещивании с рожью.
Первым этапом такого анализа является получение гибридов и первичных тритикале на основе пшеницы, выбранной в качестве материнской формы, и возможно большим числом инбредных линий ржи. На этом этапе выявляются различия между гибридами или первичными тритикале в проявлении ранее установленных у ржи генов или различия в признаках, которые могут объясняться специфическим взаимодействием генов ржи и пшеницы в генотипе гибрида или тритикале (схема 1).
Вторым этапом предлагаемого подхода является анализ расщепления для установления числа, эффектов, характера взаимодействия и картирования генов, полиморфизм которых был выявлен на первом этапе при сравнении F1 или амфидиплоидов.
Для проведения этого анализа линии ржи с различным проявлением установленных генов ржи у пшенично-ржаных гибридов F1 или тритикале скрещиваются между собой для получения межлинейных
Генетический анализ F1 пшенично-ржаных гибридов (n) и первичных октоплоидных тритикале (2n) (Voylokov, Tikhenko, 1998)
Схема 1. Получение и изучение особенностей развития пшенично-ржаных гибридов и первичных тритикале (2n)
Пшеница x Инбредные линии ржи
AABBDD [RR(1/1)*, RR(2/2)*, RR(1/1) ….]
F1(n) : ABDR(1), ABDR(2),......
(2n) : AABBDDRR(1/1), AABBDDRR(2/2),....
*1 и 2 аллели генов ржи, ответственных за альтернативное проявление признаков у пшенично-ржаных гибридов и тритикале
Схема 2. Анализ расщепления по анализируемым признакам у F1 пшенично-ржаных гибридов (n) и первичных тритикале (2n)
Пшеница x Межлинейный гибрид ржи
AABBDD RR(1/2)
Ожидаемое расщепление
F1(n) 1 [ABDR(1)] : 1 [ABDR(2)]
(2n) 1 [AABBDDRR(1/1)] : 1 [AABBDDRR(2/2)]
1 и 2 аллели генов ржи, ответственных за альтернативное проявление признаков у пшенично-ржаных гибридов и тритикале
гибридов ржи. Пыльцой этих гибридов опыляется та же материнская форма пшеницы (схема 2). Необходимое число пшенично-ржаных амфигаплоидов и/или первичных тритикале, полученных на их основе, используется для проведения анализа расщепления по качественным и количественным признакам. В обоих случаях подразумевается использование молекулярных маркеров, полиморфных у ржи в такой степени, что две неродственные линии ржи различаются по маркерам, перекрывающим все хромосомы ржи (Korzun et al., 2001). Таким образом, можно идентифицировать и картировать соответствующие гены ржи, а также оценить их взаимодействие c генами пшеницы при формировании анализируемого признака у пшенично-ржаных гибридов и первичных тритикале.
В работе были использованы также следующие методы: методы классического гибридологического анализа, оценка устойчивости пшеницы ржи и тритикале к патогенным грибам родов Puccinia и Bipolaris по общепринятой методике (Михайлова и др., 2000); гистологический анализ пшенично-ржаных зародышей и апикальных меристем у проростков и растений пшенично-ржаных гибридов; in situ гибридизации геномной ДНК (GISH); тест на апоптоз; цитофотометрический анализ количества ДНК в ядрах клеток пшенично ржаных зародышей; анализ полиморфизма фрагментов ДНК (SSR-маркеров); методы культивирования незрелых зародышей in vitro; методы вариационной статистики, дисперсионный анализ, метод 2, входящие в пакет программ STATISTICA for WINDOWS (версия 5.0).
В работе использованы следующие сорта, линии и гибриды: 8 форм и сортов мягкой пшеницы, серия нулли-тетрасомных линий мягкой пшеницы сорта Chinese Spring (CSNT), любезно предоставленная John Innes Centre, Norwich, UK; три пшенично-ржаные линии CS, дополненных по хромосоме 6R (WRA6R, WRA6RS и WRA6RL) из коллекции IPK (Gatersleben, Germany); инбредные поколения 116 автофертильных линий ржи лаборатории генетики растений СПбГУ, серия из 79 рекомбинантный линий (РИЛ) ржи, межлинейные гибриды ржи, полученные путем индивидуальных скрещиваний между отдельными растениями инбредных линий с альтернативным проявлением признаков. В ходе выполнения работы было получено и проанализировано 67 линий первичных октоплоидных тритикале.
Автор приносит благодарность коллегам: А.В. Войлокову, Н.В. Цветковой, Л.Г. Тырышкину, В.Г. Смирнову, О. Добровольской, Т. Руттену (T. Rutten), А. Хоубену (A. Houben), А. Бернеру (A. Brner), Н.С. Ростовой, С.Н. Прияткиной, принимавшим участие в данной работе, что отражено в публикациях.
РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ
Анализ влияния генотипа инбредных линий ржи на формирование количественных признаков первичных октоплоидных тритикале
Для изучения генетики тритикале был предложен оригинальный вариант гибридологического анализа (Voylokov, Tikhenko, 1998), который позволяет выявить изменчивость и картировать гены ржи, отвечающие за все возможное разнообразие признаков у тритикале, полученных на основе одного и того же генотипа пшеницы. Очевидно, что выявляемые при этом различия между гибридами F1 и/или амфидиплоидами, в конечном счете, определяются различиями между генотипами родительских линий ржи.
Высота растения
Высота растения – сложный количественный признак. У отдаленного гибрида высота растения может определяться как генами материнской формы, так и отцовской, а также их взаимодействием. Все вовлеченные в анализ первичные октоплоидные тритикале были получены на основе одной материнской формы Chinese Spring (CS), которая не несет известных генов короткостебельности. Линии ржи, использованные нами в качестве отцовского компонента, можно разделить на две группы: короткостебельные - носители доминантной аллели гена Ddw1, и высокорослые - носители рецессивной аллели этого гена. Таким образом, мы получили возможность изучить проявление гена Ddw1 на генотипических фонах, включающих один и тот же генотип пшеницы и генотипы ржи, различающиеся по генам, контролирующим высоту растений. Кроме того, на формирование высоты растения значительное влияние оказывают погодные условия. За годы изучения, средние значения высоты растений у полученных первичных октоплоидных тритикале варьировали от 60,0 до 125,1см в 1998 году и от 33,5 до 104,0см в 1999 году. У материнской формы пшеницы CS высота растений составила в среднем 99,0см в 1998 и 98,5см в 1999. Особенно наглядно влияние внешних условий на высоту растений проявляется при сравнении ранжированных данных 1998г. по 25 линиям тритикале с данными по тем же линиям, полученными в 1999г. (рис. 1). Так, у линий тритикале, имеющих в своем генотипе доминантную аллель гена Ddw1, высота растений составила 60,0-118,2см в 1998г. и 33,5-73,0см в 1999г., а у линий тритикале с рецессивной аллелью этого гена 78,7-125,1см и 58,5-104,0см соответственно. Полученные результаты свидетельствуют, что у амфидиплоидов различия по признаку "высота растения" могут быть обусловлены иными генетическими факторами ржи помимо главного гена Ddw1. Эффект генов-модификаторов и использование инбредных линий ржи, несущих доминантную аллель гена короткостебельности Ddw1, позволяет получить в скрещиваниях со среднерослой пшеницей Chinese Spring первичные октоплоидные тритикале высотой менее 70см, высотой 70-90см и среднерослые с высотой растения 90-118см.
К низкорослым тритикале, помимо тритикале с генами короткостебельности от ржи, можно отнести еще три образца: Ad19, Ad35 и Ad47 (рис. 1). Эти тритикале получены на основе линий ржи Л6 (Ст190-2/60),
Рис. 1. Распределение первичных октоплоидных тритикале по высоте растений (ось ординат): - линии с аллелью Ddw1 1998г., - линии аллелью ddw1, 1998г., – линии с аллелями Ddw1 или ddw1 1999г.
478 (Б-26/58) и 410 (БВКуО-9/72) (Смирнов, Соснихина, 1984), имеющих по 7-9 поколений строгого инбридинга. Все эти линии разного происхождения и не несут известных аллелей генов, обусловливающих короткостебельность
Таким образом, линии Л6, 478 и 410, несут не идентифицированные ранее ген(ы) ржи, специфически экспрессирующиеся у тритикале и приводящие к снижению высоты растений. Эффект этих генов проявляется на фоне гомозиготности по аллелям высокорослости ddw1. Он сопоставим по величине с действием доминантной аллели гена Ddw1 (рис. 1).
Продуктивность главного колоса
Продуктивность главного колоса является сложным признаком, основными составляющими которого являются такие признаки как длина колосовой оси, число колосков, число цветков в колоске и фертильность колоса. В наших исследованиях большинство линий тритикале в течение двух лет превосходили материнскую форму пшеницы по длине колоса и числу колосков. Сравнительное изучение в течение трех лет (1998-2000 гг.) длины колоса и числа колосков в нем у 10 наиболее озерненных линий тритикале подтвердило, что длина главного колоса и число колосков в нем у данных линий достоверно превышали материнскую форму пшеницы (табл. 1). Это позволяет предположить, что основной вклад в формирование данных признаков вносит генотип родительских линий ржи.
Таблица 1.
Длина колоса и число колосков в колосе у 10 наиболее озерненных первичных октоплоидных тритикале и мягкой пшеницы Chinese Spring (CS)
| Номер линии тритикале | Длина колоса | Число колосков в колосе** | ||||
| 1998 | 1999 | 2000 | 1998 | 1999 | 2000 | |
| X±Sx | X±Sx | |||||
| 7а | 10,4±0,2 | 9,9±0,2 | 10,4±0,3 | 24,8±0,3 | 21,4±0,2 | 22,3±0,6 |
| 7b | 10,9±0,2 | 9,8±0,2 | 10,1±0,4 | 25,5±0,2 | 21,7±0,3 | 19,3±0,7 |
| 17 | 11,3±0,3 | 10,2±0,2 | 10,9±0,4 | 25,9±0,5 | 22,5±0,2 | 20,1±0,7 |
| 40а | 10,6±0,2 | 9,8±0,2 | 8,7±0,3* | 23,1±0,2 | 21,7±0,4 | 19,3±0,7 |
| 49 | 11,4±0,2 | 10,3±0,2 | 9,7±0,4 | 24,9±0,3 | 21,3±0,3 | 21,7±0,7 |
| 52 | 11,1±0,2 | 10,1±0,1 | 11,4±0,3 | 23,7±0,3 | 20,0±0,3 | 22,8±0,4 |
| 73 | 11,0±0,1 | 9,7±0,1 | 9,4±0,5 | 25,1±0,4 | 21,7±0,2 | 19,0±0,9 |
| 30 | 10,1±0,3 | 9,6±0,1 | 10,7±0,3 | 21,6±0,4 | 19,7±0,1 | 19,5±0,3 |
| 65 | 11,3±0,2 | 10,4±0,3 | 11,7±0,3 | 25,8±0,4 | 21,9±0,6 | 22,1±0,4 |
| 50b | 10,8±0,2 | 10,5±0,3 | 12,2±0,2 | 25,1±0,2 | 22,3±0,3 | 24,5±0,3 |
| CS | 8,2±0,1 | 7,2±0,1 | 7,4±0,1 | 17,6±0,3 | 18,9±0,1 | 16,8±0,3 |
* - различия с контролем не достоверны при Р > 0,05; ** - различия с контролем достоверны при Р< 0,05
Фертильность колоса. Многочисленные исследования показали, что у первичных гексаплоидных тритикале ранних поколений (C1-C3) завязываемость выше, чем у октоплоидных (Гордей, 1992; Oettler, 1991; Кulminskaya еt al., 1998). Однако даже у эуплоидных растений первичных гексаплоидных тритикале более поздних поколений (С4-С5) она колеблется от 23 до 76% и в среднем составляет 59% (Lelley, Gimbel, 1989). По нашим данным, первичные октоплоидные тритикале, полученные на основе различных инбредных линий ржи и гексаплоидной пшеницы CS, также значительно различались по уровню фертильности. У полученных нами линий октоплоидных тритикале среднее число зерен в главном колосе фертильных растений колебалось в 1998г. от 0,3 до 25,3 и в 1999г. от 0,4 до 25,1. У мягкой пшеницы в 1998г. формировалось 48,3 и в 1999г. 49,4 зерна на колос. Как видно из полученных данных, все образцы первичных октоплоидных тритикале уступали по числу зерен в колосе материнской форме пшеницы.
В литературе отсутствуют данные о влиянии мутаций автофертильности ржи на завязываемость семян у первичных тритикале. У двадцати семи из шестидесяти одной инбредной линии ржи, используемых в нашей работе, идентифицированы мутации автофертильности (мутации sf), которые нарушают функционирование системы несовместимости. У 17 из 27 линии ржи мутации автофертильности были локализованы с помощью генетического анализа (Егорова, Войлоков, 1998), у остальных 10 – по родословным. Таким образом, мы получили возможность сравнить завязываемость семян у первичных тритикале, полученных с использованием автофертильных линий, несущих мутации sf в различных локусах несовместимости S (1R), Z(2R) или T(5R). Обсуждая связь между мутациями автофертильности у родительских линий ржи и завязываемостью семян у более высоко озерненных первичных тритикале, можно сделать предположение о положительном влиянии мутаций в локусе Т, по сравнению с мутациями sf в локусах S и Z. В среднем завязываемость семян у тритикале с мутациями sf в локусах S, Z и T составляет соответственно 7,9, 5,2 и 13,8% в 1998г. и 10,5, 11,7 и 27,4% в 1999г (табл. 2). Предположение о положительном
Таблица 2.
Средняя завязываемость семян у первичных октоплоидных тритикале, полученных на основе инбредных линий ржи с идентифицированными
мутациями автофертильности (sf)
| мутации sf у линии ржи в локусе | Завязываемость семян, % | |||||
| 1998 г. | 1999 г. | |||||
| число линий трити кале | min-max | X* | число линий трити кале | min-max | X* | |
| S | 9 | 0-20,5 | 7,9 (2,6-15,6) | 9 | 0-28,4 | 10,5 (4.1-19,4) |
| Z | 8 | 0-13,7 | 5,2 (1,8-10,2) | 9 | 0,1-18,2 | 11,7 (6,1-18,9) |
| T | 14 | 0-30,8 | 13,8 (8,2-20,6) | 13 | 7,4-44.7 | 27,4 (20,2-35,3) |
*доверительные интервалы рассчитаны с помощью -преобразования Фишера (Урбах, 1963)
влиянии мутации в локусе Т на озерненность тритикале подтверждается следующим. Во-первых, тем, что большей завязываемостью семян обладают тритикале, полученные на основе линий ржи, несущих разные, независимо выделенные мутации sf в этом локусе. Во-вторых, большинство этих линий неродственны и, следовательно, значительно различаются по генотипическому фону, сопровождающему эти мутации (табл. 3).
Таблица 3
Завязываемость семян (в %) у 10 наиболее озерненных первичных октоплоидных тритикале и мягкой пшеницы Chinese Spring
| Номер линии тритикале | Год изучения | ||
| 1998 | 1999 | 2000 | |
| 7a(Tf)* | 21,0±13,5 | 32,9 ± 2,9 | 13,4 ±1,0 |
| 7b(Tf) | 24,2 ±2,1 | 40,9 ± 4,4 | 22,6 ± 0,5 |
| 17(Tf) | 26,7 ± 2,6 | 40,6 ± 3,7 | 24,1 ±2,6 |
| 40а(?) | 14,9 ± 3,2 | 23,4 ± 2,7 | 6,6 ± 2,8 |
| 49(Tf1) | 7,6 ±1,4 | 25,4 ±3,2 | 5,0 ±1,9 |
| 52(Tf1) | 30,8 ± 3,4 | 44,7 ± 4,0 | 15,0 ± 0,7 |
| 73(?) | 11,8 ± 2,6 | 22,5 ± 1,9 | 5,3 ± 1,6 |
| 50b(Tf1) | 19,1±3,0 | 30,9 ± 3,2 | 13,5 ± 2,4 |
| 30(Tf2) | 28,0 ± 2,6 | 39,2 ± 3,2 | 17,0 ±0,6 |
| 65(?) | 28,4 ± 3,0 | 31,7 ±3,7 | 26,0 ± 0,6 |
| Chinese Spring | 89,5±1,6 | 84,5 ± 0,6 | 85,7 ±1,2 |
*В скобках указаны аллельные мутации автофертильности в Т-локусе, полученные от одного и того же или разных (Tf, Tf1, Tf2) источников автофертильности; ? – неидентифицированная мутация sf.
Часть образцов тритикале с низкой завязываемостью семян (менее 10%) Ad9, Ad45, Ad46, Ad49 и одна стерильная линия тритикале Ad14 также несет в своем генотипе мутации sf в локусе T. В связи с этим ясно, что наличия только этой мутации недостаточно для повышения завязываемости семян у тритикале. Очевидно, что высокая стерильность амфидиплоида может быть следствием как нерегулярного течения мейоза, так и нарушений в процессе гаметогенеза. С этой точки зрения, несомненно, большой интерес представляет тритикале Ad55. Изучение мейоза и гаметогенеза у этого полностью стерильного тритикале в поколении C1, не имеющего отклонений в формировании вегетативных органов, позволит получить новые данные о взаимовлиянии хромосом пшеницы и ржи у отдаленного гибрида.
Устойчивость первичных октоплоидных тритикале и их родительских форм к патогенным грибам
Поскольку тритикале объединяют в своем генотипе наследственный материал двух разных родов злаков, то устойчивость к болезням, вызываемым патогенными грибами может определяться как генами одного из родителей, так и взаимодействием генов обеих родительских форм. Для выявления всех эффектов взаимодействия нами был проведен анализ устойчивости не только самих амфидиплоидов, но и родительских форм.
Возделываемые сорта ржи, как правило, не поражаются бурой ржавчиной пшеницы. В литературе имеются единичные сообщения о восприимчивых генотипах, обнаруженных при изучении сортовых популяций (Bcsa, Kiss, 1966; Rubliales et al., 1993). Г. Муса с коллегами (Musa et al., 1984) для изучения генетического контроля устойчивости инбредных линий ржи к Puccinia recondita sp.f. tritici использовали восприимчивую автофертильную линию ржи. Это позволило им установить, что устойчивость к бурой ржавчине пшеницы контролируется у шести устойчивых линий ржи различным числом генов от одного до трех (Musa еt al. 1984). Полученные нами результаты свидетельствуют о том, что среди линий ржи Петергофской генетической коллекции имеются генотипы восприимчивые к этому патогену. Оценку устойчивости к ржавчинным грибам и Bipolaris sorokiniana проводили по методике Л.А. Михайловой с соавторами (Михайлова и др., 2000). При анализе устойчивости к бурой ржавчине пшеницы из 96 инбредных линий ржи только 41 линия были устойчивы к этой болезни, а у растений шестнадцати линий ржи отрезки листьев сильно поражались ржавчиной, балл поражения 3-4 по пятибалльной шкале (табл. 4). Полученные нами результаты дают основания предположить, что у ржи могут присутствовать генетические факторы восприимчивости к болезни неспецифичной для этого рода, которые не проявляются у сортовых популяций вследствие высокого уровня гетерогенности популяций и гетерозиготности отдельных растений.
Таблица 4.
Устойчивость инбредных линий ржи к грибным болезням
| Возбудитель | Изучено линий | Из них с реакцией | ||
| R | RS | S | ||
| Puccinia recodita(бурая ржавчина пшеницы) | 96 | 41 | 39 | 16 |
| P.dispersa (бурая ржавчина ржи) | 91 | 4 | 28 | 59 |
| Bipolaris sorokiniana (темно-бурая листовая пятнистость) | 97 | 16 | 52 | 29 |
| Bipolaris sorokiniana (обыкновенная корневая гниль) | 94 | 6 | 16 | 74 |
*-R-устойчивость, S- восприимчивость, RS- гетерогенность - здесь и далее в других таблицах
Проведенное нами исследование устойчивости инбредных линий ржи к природной популяции бурой ржавчины ржи (Puccinia dispersa) также показало, что изучаемые формы бедны устойчивыми генотипами, выделились четыре устойчивые не родственные друг другу линии (572, Н9, Н8, Н6).
Устойчивость инбредных линий ржи к возбудителю темно-бурой листовой пятнистости и обыкновенной корневой гнили (Bipolaris sorokiniana) была предварительно обнаружена нами в совместных исследованиях с Л.Г. Тырышкиным (Тырышкин и др., 1998) при тестировании небольшого числа автофертильных линий ржи из Петергофской генетической коллекции. В настоящей работе при анализе устойчивости к этим болезням 97 инбредных линий ржи мы выделили 6 (Л6, 515, 516, 474, Ф14, Н2) устойчивых к обыкновенной корневой гнили и 16 линий (Т5, Ф6, Ф21, Ф32, Ф40, 490, 489, 517, 479, 559, 401, 423, 384, 410, 541, 543) устойчивых к темно-бурой листовой пятнистости, балл поражения 0-2 по 7 бальной шкале (Михайлова и др., 2000). Из проанализированных линий ржи не выделено форм с устойчивостью одновременно к двум болезням, вызываемым грибом B. Sorokiniana (табл. 4). Это может свидетельствовать о том, что устойчивость к каждой из этих болезней контролируется у ржи различными генами. На отсутствие корреляции между устойчивостью к темно-бурой листовой пятнистости и обыкновенной корневой гнили у 17 сортов яровой пшеницы указывал Р. Коннер (Conner, 1990).
Таблица 5
Расщепление по устойчивости к темно-бурой листовой пятнистости в F2 от скрещивания устойчивых и восприимчивых инбредных линий ржи
| Комбинация скрещивания | Тип реакции родител. формы | Число семейF2 | Соотношение фенотипов R:S | Гены устойчивос-ти | 2 3:1 15:1* | ||
| P1 | P2 | Fфакт | Fтеор | ||||
| 453р.3Ф14р.1 | R | S | 10 | 30:410 | 30,1:409,9 | 2 рецессивных | 0,001* |
| 453р.6518р.3 | R | S | 3 | 5:29 | 8,5:25,5 | 1 рецессивный | 2,0 |
| 453р.7518р.3 | R | S | 10 | 30:111 | 35,3:105,7 | 1 рецессивный | 1,07 |
| 518р.6Т5р.1 | S | R | 13 | 18:357 | 23,4:351,6 | 2 рецессивных | 1,33* |
| 518р.5Т5р.1 | S | R | 10 | 23:450 | 29,6:443,4 | 2 рецессивных | 1,55* |
| 2 | 22:58 | 20:60 | 1 рецессивный | 0,25 | |||
| 518р.7517р.1 | S | R | 9 | 2:84 | 5,4:80,6 | 2 рецессивных | 2,28* |
| Ф14р.2517р.1 | S | R | 5 | 12:173 | 11,6:173,4 | 2 рецессивных | 0,01* |
У ряда линий ржи идентифицирована гетерогенность по устойчивости к патогенным грибам. Нами выдвинуто несколько предположений о возможной природе гетерогенности инбредных линий ржи: 1) отсутствие отбора по устойчивости, в результате чего ряд растений в пределах линии могут сохранять исходную гетерозиготность по аллелям гена (генов), определяющих реакцию на заражение грибом. Сохранение этой гетерозиготности наиболее вероятно в случае линий с малым числом инбредных поколений; 2) полигенное наследование устойчивости с аддитивным действием «малых» генов; 3) неполная пенетрантность и вариабильность экспрессивности генов, контролирующих реакцию на заражение грибом.
Результаты проведенного гибридологического анализа показывают, что устойчивость к темно-бурой листовой пятнистости у трех линий ржи контролируется взаимодействием двух рецессивных генов (табл. 5). Расщепления в семьях F2 комбинаций (453р.6518р.3, 453р.7518р.3, 518р5Т5р.1) указывают на то, что восприимчивая инбредная линия ржи 518 содержит растения гомозиготные (р.3) и гетерозиготные (р.5) по рецессивным аллелям одного из генов устойчивости. Полученные данные свидетельствуют о том, что у инбредных автофертильных линий ржи может сохраняться гетерогенность по генам устойчивости.
Использование разработанного нами оригинального варианта генетического анализа (Voylokov and Tikhenko, 1998) позволило показать, что в результате взаимодействия генов Triticum aestivum и Secale cereale, возникает разнообразие в отношении реализации признака устойчивости тритикале к фитопатогенным грибам, поражающим и пшеницу, и рожь.
Для создания тритикале в скрещивания был вовлечен один генотип мягкой пшеницы сорт Chinese Spring, восприимчивый к Puccinia recondita. Однако линии первичных октоплоидных тритикале, полученные от скрещивания СS с устойчивыми к бурой ржавчине пшеницы инбредными линиями ржи, показали различную реакцию на заражение возбудителем этой болезни. У трех линий тритикале (Ad7a, Ad7b, Ad17) наблюдалось проявление устойчивости ржи. Устойчивость, привносимая геномом ржи, проявляется у линий тритикале Ad7a и Ad17 и в поздних инбредных поколениях (С2 - С4). В остальных комбинациях скрещиваний восприимчивой к бурой ржавчине пшеницы CS с устойчивыми линиями ржи не отмечено проявление генов устойчивости. Таким образом, можно предположить, что один из геномов пшеницы А, В или D является носителем генов, которые специфически взаимодействуют с генами устойчивости ржи, т.е. показано генотип-специфическое подавление устойчивости.
Наше исследование показывает, что получение тритикале устойчивых к бурой ржавчине пшеницы зависит от комбинации исходных родительских форм и является следствием взаимодействий между геномами исходных родительских форм пшеницы и ржи. От скрещивания восприимчивой пшеницы (CS) и восприимчивых инбредных линий ржи не наблюдали появления устойчивых первичных тритикале, поэтому для получения устойчивых к бурой ржавчине пшеницы линий тритикале необходимо вовлекать в скрещивания устойчивые линии ржи. В нашей работе показано, что для получения тритикале, устойчивых к бурой (листовой) ржавчине, вызываемой возбудителем Puccinia reconditа f.sp. tritici, в фазе проростков и фазе кущения на основе сорта Chinese Spring могут служить две родственные инбредные линии ржи 377 и 371.
Устойчивость тритикале к физиологической форме бурой ржавчины, поражающей рожь, обусловлена генетическими факторами, привносимыми пшеницей. Однако появление восприимчивых растений у некоторых линий тритикале позволяет предположить, что эта устойчивость может подавляться генами ржи.
Известно, что тритикале поражаются темно-бурой листовой пятнистостью и обыкновенной корневой гнилью, поэтому выделение и вовлечение устойчивых к B. sorokiniana форм ржи для получения тритикале можно рассматривать как один из способов создания устойчивых сортов этой новой культуры. В связи с тем, что дикорастущие формы тритикале в природе отсутствуют, необходимо расширять число доноров этого признака, вовлекая в скрещивания устойчивые родительские формы. В нашем исследовании материнская форма пшеницы восприимчива к темно-бурой листовой пятнистости. Инбредные линии ржи имели различную реакцию на это заболевание (табл. 4). Среди первичных тритикале, полученных нами на основе устойчивых или гетерогенных к темно-бурой листовой пятнистости линий ржи, не выделено устойчивых форм. Кроме этого нами показано, что использование устойчивости от ржи, контролируемой рецессивными генами, неэффективно для создания устойчивых форм тритикале. Линии тритикале Ad37 и Ad82, полученные на основе инбредных линий ржи 517 и Т5 были высоко восприимчивы к темно-бурой листовой пятнистости в фазе проростков.
Особое значение имеют результаты анализа устойчивости первичных октоплоидных тритикале к обыкновенной корневой гнили, возбудителем которой также является B.sorokiniana. Появление устойчивых растений тритикале от скрещивания восприимчивых родительских форм позволяет сделать предположение о комплементарном взаимодействии генов пшеницы и ржи, приводящим к устойчивости у отдаленного гибрида (табл. 6).
Анализ двух последовательных поколений потомства устойчивых растений C1 линий Ad76 и Ad39 показал расщепление изучаемых семей на восприимчивые и устойчивые, что свидетельствует о сложной природе этого признака у тритикале. Нами показано, что генетические факторы, обусловливающие устойчивость линии ржи Л6 к корневой гнили, могут проявляться в геноме отдаленного гибрида. Линия Ad19, полученная от скрещивания CS с линией ржи Л6, характеризовалась устойчивостью к обыкновенной корневой гнили.
Для всех изученных болезней у ряда линий тритикале при анализе семей была выявлена гетерогенность по устойчивости: либо отмечали различия в устойчивости отдельных семей, либо даже отдельных растений внутри семьи.
Таблица 6.
Устойчивость первичных октоплоидных тритикале и родительских линий ржи к обыкновенной корневой гнили (B.sorokiniana)
| Линия тритикале | Число семей с реакцией | Исходные инбредные линии ржи | Реакция линий ржи | ||
| S | RS | R | |||
| 17 | 10 | 2 | 0 | 377 | RS |
| 84 | 2 | 0 | 2 | N21 | RS |
| 39 | 2 | 5 | 2 | 393 | RS |
| 97 | 5 | 0 | 0 | 396 | RS |
| 76 | 0 | 0 | 1 | A40 | S |
| 93 | 0 | 0 | 4 | 515(2) | S |
| 89 | 2 | 3 | 3 | N39 | S |
| 65 | 11 | 0 | 0 | Ф9 | S |
Возможно несколько гипотез, объясняющих это явление:
- Неполная пенетрантность и вариабильность экспрессивности устойчивости в результате действия генов-модификаторов у ряда линий. Для проверки этой гипотезы необходим дальнейший посемейный анализ гетерогенных семей.
- Потеря хромосом ржи, в которых локализованы генетические факторы, обусловливающие устойчивость к болезни. Для проверки этой гипотезы необходимо провести цитологическую оценку растений соответствующих линий тритикале.
- После удвоения числа хромосом у линий тритикале могут происходить генетические перестройки, которые приводят к изменению проявления устойчивости. Теоретически потомство одного колхицинированного растения в генетическом отношении гомозиготно. Однако появление гетерогенности у линий тритикале дает основание предполагать, что это может быть связано как реорганизацией родительских геномов в пределах растений С0, так и в результате перестроек генетического материала в последующих инбредных поколениях. Это явление известно у аллополиплоидов, полученных в скрещиваниях Triticum (aestivum, durum) и Secale cereale (Xue-Feng et al., 2002), Triticum и Aegilops ((Liu et al., 1998; Ozkan et al., 2001; Shaked et al., 2001).
В большинстве случаев устойчивость изученных нами линий первичных октоплоидных тритикале к облигатным патогенам обусловлена генами одной из родительских форм. Сопоставление полученных в нашем исследовании результатов по изучению устойчивости линий первичных октоплоидных тритикале к патогенным грибам (ржавчине пшеницы, ржавчине ржи, темно-бурой листовой пятнистости и обыкновенной корневой гнили) и исходных родительских форм, позволило нам выделить следующие взаимодействия генов пшеницы и ржи в комплексном геноме отдаленного гибрида:
1) фенотипическое проявление генетических факторов устойчивости либо ржи, либо пшеницы.
2) генотип-специфическое подавление устойчивости.
3) проявление устойчивости у амфидиплоидов от скрещивания восприимчивых родительских форм, в результате специфического взаимодействия генов.
Взаимодействие генов пшеницы и ржи в процессе формирования барьеров постзиготической изоляции.
Выявление форм Triticum aestivum L., имеющих в своем генотипе рецессивные аллели генов kr1 и kr2, позволяющих преодолеть презиготические барьеры несовместимости и обеспечивающие высокий процент (более 50%) завязывания семян при скрещивании с рожью, значительно облегчило задачу по отдаленной гибридизации между этими культурными злаками. Однако не всякое скрещивание между гексаплоидной пшеницей и рожью реализуется в жизнеспособное потомство (Jung and Lelley, 1985). За последнее столетие накоплены сведения, описывающие различные типы проявления постзиготической изоляции между пшеницей и рожью на разных этапах онтогенеза пшенично-ржаных гибридов (обзоры Mntzing, 1979; Lelley, 2006). Однако до настоящего времени не было предложено метода, позволяющего выявить все многообразие взаимодействия генов родительских форм, возникающее в результате объединения их геномов, в том числе и участвующих в формировании межвидовых барьеров. Оригинальный вариант гибридологического анализа разработанный и использованный нами (Voylokov and Tikhenko, 1998, 2002) позволил выявить широкий спектр новых генов ржи и пшеницы, как участвующих в формировании барьеров позтзиготической репродуктивной изоляции, так и генов, способствующих сбалансированному функционированию родительских геномов в генотипе гибрида. С помощью данного анализа были идентифицированы инбредные линии ржи, которые несут гены, вызывающие формирование различных аномалий у пшенично-ржаных гибридов F1 (отсутствие нормального зародыша в гибридных зерновках, слабость и стерильность гибридов, аномалии морфологии листа и колоса, гибридная карликовость). Всего нами выявлено семь различных эффектов взаимодействия генов мягкой пшеницы CS с генами ржи (табл. 7).
Присутствие соответствующих генов (аллелей) в геноме ржи не имеет аномального фенотипического проявления в пределах вида Secale cereale L., но обнаруживается при отдаленной гибридизации. Таким образом, эти гены можно отнести к генам специфически экспрессирующимся у пшенично-ржаных гибридов или первичных тритикале. Наиболее подробно нами были изучены фенотипическое проявление и генетический контроль эмбриональной летальности (Embryo lethality), возникающей при скрещивании мягкой пшеницы с четырьмя линиями ржи (Л2, Л3, 564 и 535), а также фенотипическое проявление и генетический анализ гибридной карликовости, возникающей при скрещивании мягкой пшеницы с двумя неродственными линиями ржи Ф1 и Ф10.
Таблица 7
Новообразования, выявленные у пшенично-ржаных гибридов F1 (n) и первичных тритикале (2n)
| Морфологическое проявление | Уровень плоидности отдалённого гибрида* | Число линий ржи | Возможность получения потомства |
| Эмбриональная летальность | n | 4 | - |
| Гибридная карликовость | n | 2 | - |
| Гибридная слабость | n | 2 | - |
| Сближенные междоузлия | n | 1 | - |
| Луковые листья и редукция колоса | n | 2 | - |
| Луковые листья | 2n | 2 | + |
| Хлороз и некроз (леталь) | n | 3 | - |
| Хлороз и некроз нижних листьев | n, 2n | 4 | -, + |
| стерильность | 2n | 8 | - |
*n – пшенично-ржанной амфигаплоид (F1), 2n – первое поколение пшенично-ржаного амфидиплоида (С1) на следующий год после колхицинирования.
Эмбриональная летальность и карликовость пшенично-ржаных гибридов
При изучении эмбриональной летальности и гибридной карликовости пшенично-ржаных гибридов наиболее полно проявились преимущества оригинального варианта генетического анализа (Voylokov and Tikhenko, 1998) позволяющего выявлять, изучать и картировать гены родительских видов, взаимодействующие в генотипе гибрида и приводящие к формированию барьеров постзиготической репродуктивной изоляции. Как показало изучение эмбриональной летальности, развитие эндосперма гибридных зерновок, полученных от скрещивания мягкой пшеницы с линиями ржи, носителями гена Eml-R1, не отличается от гибридных зерновок, полученных в контрольных скрещиваниях (Тихенко и др., 2005) и, следовательно, нарушения в развитии эндосперма не могут быть основной причиной аномалии в развитии гибридного зародыша в скрещиваниях CS x Л2 и CS x 535. Использование метода гибридизации геномной ДНК in situ (GISH-анализ) и теста на апоптоз (TUNEL-тест) позволили установить, что остановка развития не связана с элиминацией хромосом одного из родителей или деградацией и фрагментацией хроматина ДНК в ядрах гибридных зародышей как на ранних (5 дней после опыления), так и на более поздних этапах эмбриогенеза (10 и 16 дней после опыления). Темпоральная фиксация гибридных зародышей и их гистологическое изучение позволили выявить время возникновения и характер аномалии, вызываемый мутацией Eml-R1. У 10-дневных аномальных и нормальных гибридных зародышей не выявило значимых морфологических отличий. Изучение зародышей старшего возраста показало, что в контрольном скрещивании морфогенез зародыша заканчивается к 16 дню после опыления. Зародыши, полученные от скрещивания CS с линией ржи Л2, являющейся носителем гена Eml-R1, имеют четкие отличия от зародышей, полученных в контрольных скрещиваниях. В возрасте 16 дней после опыления у них полностью отсутствует апикальная меристема. На ее месте находится небольшое число деградирующих клеток. Щиток слабо развит и имеет несформированную проводящую систему, однако зародышевый корешок имеет типичное строение и размеры и покрыт корневым чехликом. Таким образом, нами было показано, что мутация Eml-R1, блокирует развитие апикальной меристемы в гибридном зародыше и не влияет на развитие корневой меристемы (Tikhenko et al, 2008).
Таблица 8
Расщепление по степени развития зародыша в гибридных зерновках от скрещивания двух сортов мягкой пшеницы с межлинейными гибридами ржи
| Родительские формы | Степень развития зародыша | 2 1:1 | ||
| Пшеница | Гибрид ржи | дифференциро-ванный | недифференци-рованный | |
| Chinese Spring | Л2 x Л6 | 63 67 | 74 71 | 0,73 0,12 |
| Л6 x Л2 | 66 343 | 82 319 | 1,73 0,88 | |
| Л2 x Л7 | 91 | 90 | 0.00 | |
| Л7 x Л2 | 66 | 76 | 0,70 | |
| Приекульская 421 | Л2 x Л6 | 104 | 101 | 0,04 |
| Л7 x Л2 | 132 84 | 144 87 | 0,52 0,51 | |
| Всего по линии Л2 | F1 | 1016 | 1044 | 0,38 |
| Chinese Spring | Л6 x 535 | 130 | 149 | 1,29 |
| Всего по двум линиям ржи | F1 | 1146 | 1193 | 0,94 |
Генетический анализ (табл. 8) с использованием межлинейных гибридов ржи показал, что нарушения в развитии апикальной меристемы пшенично-ржаных зародышей обусловлены взаимодействием гена ржи, названного нами Eml-R1 (Embryo lethality) с генетическим материалом мягкой пшеницы. Хромосомная локализация мутантного гена ржи Eml-R1 была проведена с использованием отдельных растений 75 рекомбинантных инбредных линий ржи (РИЛ) пятого поколения, полученных на основе гибрида F2 (Л7хЛ2), путем анализа расщеплений по каждому маркеру отдельно для двух групп растений: группы растений F5 (Л7 х Л2), которые при скрещивании с мягкой пшеницей давали только семена с нежизнеспособными зародышами и группы, дающей семена только с жизнеспособными зародышами. Тест на сцепление был основан на анализе расщепления по молекулярным маркерам в исходной популяции растений F2 (Л7хЛ2), разделенной на группы согласно генотипу по гену Eml-R1, установленному при анализе гибридов растений F5 с пшеницей. В случае тесного сцепления маркера и гена Eml-R1 это сцепление сохраняется в ряду поколений, что должно вести к отклонению в расщеплении по этому маркеру среди растений с разными генотипами по гену Eml-R1. Таким образом, тест на сцепление может быть проведен как 2-тест на гетерогенность в расщеплении по маркеру между группами растений с разными генотипами по Eml-R1, либо как 2-тест на соответствие расщепления по моногибридной схеме в каждой из трех групп (гомо- и гетерозигот по гену Eml-R1). Для хромосомной локализации гена Eml-R1 были использованы данные по 42 кодоминантным маркерам, расщепление по которым было учтено в популяции F2 (L7xL2). Только для двух микросателлитных маркеров Xgwm1103 и Xgwm732, локализованных на хромосоме 6R, было получено ожидаемое отклонение Расщепление определялось среди потомков поколения F2 для двух групп растений, выделенных на основании анализа генотипов растений поколения F5 – гомозиготных по аллели Eml-R1 и гомо- и гетерозиготных по аллели «дикого типа», объединенных вместе. Таким образом, можно утверждать, что ген Eml-R1 расположен в районе двух микросателлитных локусов Xgwm1103 и Xgwm732 (Tikhenko et al., 2007).
Анализ наследования эмбриональной летальности, возникающей при скрещивании мягкой пшеницы с отдельными инбредными линиями ржи, показал, что существует, по крайней мере, две функционально различных аллели этого гена. Одну аллель, аллель «дикого типа», обеспечивающую нормальное развитие пшенично-ржаного зародыша, несут линии Л6, Л7 и большая часть протестированных нами линий. Эта аллель была обозначена нами как Eml-R1a. Другую, мутантную аллель, несут линия Л2 и другие три линии (Л3, 564 и 535) Петергофской генетической коллекции (Tikhenko et al 2007). Она была обозначена нами как Eml-R1b. Согласно частоте их встречаемости у линий генетической коллекции и проявлению у пшенично-ржаных гибридов F1 аллель Eml-R1a (линии Л6, Л7 …) может быть названа как нормальная (аллель дикого типа), а аллель Eml-R1b (линии Л2, 535) как мутантная, аномальная. Поскольку была установлена хромосомная локализация гена Eml-R1 в хромосоме 6R ржи, у нас появилась возможность изучить проявление доминантно-рецессивных взаимоотношений между мутантной аллелью и аллелью дикого типа, совместив их в одном генотипе в гетерозиготном состоянии. В эксперименте были использованы пшенично-ржаные линии CS (WRA6R, WRA6RL и WRA6RS), дополненные по хромосоме 6R ржи от сорта Imperial (Driscoll and Sears, 1971), являющимся носителем аллели дикого типа Eml-R1a. Перед скрещиванием материнские
растения дополненных линий и сорта CS были протестированы с помощью молекулярных маркеров на наличие или отсутствие дополненной хромосомы 6R или ее плеч. Все гибридные зерновки, полученные от скрещивания CS и линий WRA с линией ржи Л2 имели аномальные недифференцированные зародыши, тогда как 77,8 -93,1 % гибридных зерновок, полученных от опыления этих же растений с линиями ржи Л6 или Л7, имели нормальный дифференцированный зародыш. Таким образом результаты данного теста позволяют утверждать, что мутантная аллель Eml-R1b линии Л2 является доминантной, а аллель дикого типа – рецессивной Eml-R1a.
Генетический анализ гибридной карликовости показал, что инбредные линии ржи Ф1 и Ф10 являются носителями мутантной аллели гена Hdwb (Hybrid dwarfness) ржи, проявляющейся на генотипическом фоне мягкой пшеницы (табл. 9). Остальные (99) протестированные нами инбредные линии ржи имеют в своем генотипе аллель Hdwa (аллель дикого типа), обеспечивающую нормальное развитие пшенично-ржаных гибридов.
Таблица 9
Расщепление по фенотипу «гибридная карликовость» у пшенично-ржаных гибридов от скрещивания двух сортов мягкой пшеницы с межлинейными гибридами ржи
| Родительские формы | Пшенично-ржаные гибриды F1 | ||||
| Пшеница | Гибрид ржи | Количество растений | Фенотип | 2 1:1 | |
| норма | карликовость | ||||
| CS | Ф1 х Л4* | 41 | 22 | 19 | 0.22 |
| Ф1 х Л4* | 21 | 13 | 8 | 1,22 | |
| Ф1 х Л4* | 42 | 25 | 17 | 1,52 | |
| Приекуль-ская 421 | Ф1 х Л4 | 128 | 64 | 64 | 0,0 |
| Л4 х Ф1 | 63 | 33 | 30 | 0,14 | |
| Всего по линии Ф1 | 295 | 157 | 138 | 1,22 | |
| CS | Л7 х Ф10 | 111 | 55 | 56 | 0,01 |
| Всего по двум линиям ржи | 406 | 212 | 194 | 0.88 | |
* - результаты получены в разные годы
Одним из важных этапов для разработки модели, позволяющей начать изучение молекулярных механизмов взаимодействия генов у отдаленных гибридов, было изучение аллельных отношений между мутациями эмбриональной летальности, и мутациями гибридной карликовости, выявленных нами у неродственных линий ржи. Для тестов на аллелизм для мутаций, приводящих к эмбриональной летальности, был получен межлинейный гибрид ржи F1 (535хЛ2), для мутаций гибридной карликовости – гибрид F1 (Ф10хФ1). Пыльца отдельных растений данных гибридов использовалась для опыления мягкой пшеницы CS и Приекульская 421. В случае использования пыльцы гибрида ржи F1 (535хЛ2) все гибридные зерновки (1878 шт.) содержали аномальный недифференцированный зародыш, а в случае опыления данных сортов пшеницы пыльцой гибрида F1 (Ф10хФ1) – все (409) гибридные проростки имели карликовый фенотип. Таким образом, было показано, что как в случае эмбриональной летальности, так и в случае гибридной карликовости мутации у независимо выделенных линий ржи аллельны.
Проявление «нового» признака у гибридов F1, в том числе и у пшенично-ржаных гибридов, предполагает комплементарное взаимодействие между генами родительских видов (Карпеченко, 1935). Согласно модели Добжанского-Мёллера (Dobzhansky, 1937; Mller, 1942) гибридная стерильность и летальность являются следствием серии взаимодействий «комплементарных генов» родительских форм и могут проявляться как на межвидовом, так и на внутривидовом уровне. Мы предположили, что аллель Eml-R1b ржи может быть комплементарна соответствующей аллели пшеницы. Хромосомная локализация гена (генов) мягкой пшеницы, комплементарно взаимодействующего(их) с геном Eml-R1b ржи, была осуществлена с помощью скрещиваний линии Л2 с серией нули-тетрасомных линий CS. В соответствии с проверяемой моделью гомеоаллели пшеницы комплементарно взаимодействующие с Eml-R1b алеллью ржи могут быть локализованы во всех трех гомеологичных хромосомах (например, 1A, 1B и 1D) двух из трех (например, 1A и 1B) или только в одной (например, 1A). В первых двух случаях во всех комбинациях скрещиваний будут получены невсхожие зерновки, что не позволит установить хромосому пшеницы несущую ген(ы) комплементарный(е) гену Eml-R1b ржи. В последнем случае, если этот комплементарный ген (аллель) несёт только одна хромосома в любом из гомеологичных геномов - А, В или D, в комбинациях скрещивания нуллисомных линий по хромосоме, несущей комплементарную аллель, с линиями ржи Л2 или 535 должны формироваться нормальные, всхожие зерновки. Мы провели скрещивание 37 нулли-тетрасомных линий CS с линиями ржи Л2, Л6 с последующим анализом гибридных зерновок. Нормальное развитие гибридных зародышей наблюдали только в зерновках от скрещивания линии Л2 с двумя нулли-тетрасомными линиями N6AT6B и N6AT6D, у которых отсутствует хромосома 6А. Этот результат позволяет утверждать, что хромосома 6А пшеницы несет ген, комплементарный гену ржи Eml-R1b. Ген пшеницы, комплементарно взаимодействующий с аллелью Eml-R1b и приводящий к эмбриональной летальности у пшенично-ржаных гибридов, мы назвали Eml-A1, руководствуясь правилами для обозначения генов пшеницы (McIntosh et al., 2008).
Эксперимент по скрещиванию серии нули-тетрасомных линий с инбредными линиями ржи позволил не только выявить и установить хромосомную локализацию гена пшеницы, комплементарного аллели Eml-R1b ржи, но и позволил выявить группу генов в геноме мягкой пшеницы, присутствие которых является необходимым или синхронизирует работу геномов исходных видов при их объединении в гибридном геноме. Если ген Eml-A1 пшеницы, взаимодействуя с аллелью Eml-R1b ржи, блокирует развитие апикальной меристемы пшенично-ржаного зародыша, то хромосомы 1B, 1D и 6B мягкой пшеницы, несут генетические факторы (гены) необходимые для формирования гибридных зерновок в скрещиваниях мягкой пшеницы с рожью. Нуллисомия по этим хромосомам приводит к остановке развития гибридных зародышей в контрольных скрещиваниях на ранних этапах эмбриогенеза. Эти гены, как и гены постгамной несовместимости, проявляются, как правило, при взаимодействии с генами другого вида. Можно предположить, что в процессе видообразования происходит фиксация, как генов репродуктивной изоляции, так и генов, действие которых нормализует функционирование генов родительских форм в генотипе отдаленного гибрида. Следовательно, вполне правомерно ставить вопрос о выделении таких генов в особую группу и отнести их также к «видообразующим генам».
Преодоление эмбриональной летальности у пшенично-ржаных гибридов
Разработка методов, позволяющих преодолеть барьеры постзиготической изоляции при отдаленной гибридизации, является одним из основных этапов изучения механизмов видообразования и поиска подходов для выявления генов-кандидатов, определяющих формирование репродуктивной изоляции у растений. Мы изучили возможность преодоления эмбриональной летальности пшенично-ржаных гибридов как методами прямой регенерации при культивировании in vitro незрелых аномальных зародышей на среде Kruze, так и через индукцию первичного каллуса c использованием различных сред и световых режимов. Было установлено, что при культивировании на среде Kruze часть аномальных зародышей (70%) формируют зародышевый корешок длиной 2-3мм и не образуют проросток. Таким образом, преодолеть данный тип эмбриональной летальности методом культивирования незрелых аномальных зародышей на среде Kruze не представляется возможным, так как у аномальных зародышей отсутствует апикальная меристема.
Вторая серия экспериментов была направлена на изучение возможности индукции каллуса у пшенично-ржаных зародышей, не имеющих апикальной меристемы и возможность получения жизнеспособных растений-регенерантов с «летальным» генотипом. Работа по культивированию незрелых пшенично-ржаных зародышей проводилась в два этапа. На первом этапе был осуществлен подбор сред и условий для индукции первичного каллуса у аномальных зародышей. На втором этапе был осуществлен подбор сред и оптимальных условий, способствующих индукции морфогенеза в клетках первичного каллуса, и получению жизнеспособных растений-регенерантов с «летальным» генотипом. Было показано, что число регенерационных событий определяется в первую очередь условиями культивирования на первом этапе. Наибольшая регенерационная способность была получена у 16-дневных зародышей при использовании светового режима (16ч свет/8ч темнота) на среде, содержащей сахарозу (30 г/л) в качестве источника углерода на первой стадии (индукция каллуса). Такой режим культивирования позволил получить 6,8 регенерационных событий (адвентивные почки (4,7) + растения регенеранты (2,1)) на один первичный эксплант у 95,5% аномальных зародышей. Регенерационная способность 16-дневных нормальных гибридных зародышей при таком режиме культивирования была несколько выше и составила 9,7 регенерационных событий (адвентивные почки (6,9) + растения регенеранты (2,8) на один первичный эксплант у 100,0% зародышей.
Наши эксперименты по разработке методов преодоления эмбриональной летальности преследовали несколько целей. Во-первых, нам удалось показать возможность преодоления данного типа эмбриональной летальности методом индукции первичного каллуса из аномальных незрелых зародышей с последующей индукцией регенерации. Получение растений-регенерантов «летального» генотипа свидетельствует об изменении экспрессии генов репродуктивной изоляции в результате дедифференцировки и вторичной дифференцировки клеток каллуса. Во-вторых, возможность получения жизнеспособных пшенично-ржаных гибридов «летального» генотипа позволяет нам приступить к созданию модельной системы (рис. 2) для изучения дифференциальной экспрессии генов постзиготической несовместимости у каждого родителя на идентичном генотипическом фоне.
Рис. 2. Модельная система для изучения взаимодействия генов Eml-A1 и Eml-R1b в генотипе отдаленного гибрида
Эта «модель» включает изучение морфогенетических событий и экспрессии генов при:
а) развитие зародыша при гибридизации пшеницы и ржи в результате двойного оплодотворения – обе несовместимых аллели (Eml-A1 и Eml-R1b) присутствуют и взаимодействуют в генотипе гибрида – апикальная меристема отсутствует;
б) формирование «зародышей» в культуре каллуса – двойное оплодотворение отсутствует - обе несовместимых аллели (Eml-A1 и Eml-R1b) присутствуют и взаимодействуют (да или нет?) в генотипе гибрида – апикальная меристема нормально развивается;
в) развитие зародышей у тритикале с «летальным генотипом» (процессы формирования гамет, возможность процесса оплодотворения и развития зародыша пока не изучены).
В-третьих, преодоление постзиготических барьеров, несомненно, представляет большой интерес для исследователей, так как открывает возможность преодоления несовместимости отдельных видов и тем самым расширяет возможности отдаленной гибридизации, как метода интрогрессии ценных признаков от одной формы в другую или получения новых полиплоидных форм. Таким образом, разработанный нами подход, включающий в себя оригинальный вариант гибридологического анализа для выявления и изучения генов ржи, специфически экспрессирующихся на фоне генома пшеницы, и методы, позволяющие изменять экспрессию этих генов в генотипе отдаленного гибрида, является эффективным инструментом для изучения генов, участвующих в формировании постзиготических барьеров при отдаленной гибридизации растений.
Полученные нами результаты и имеющиеся в научной литературе сведения свидетельствуют, что в основе формирования барьеров репродуктивной изоляции у растений различных систематических групп лежат механизмы, проявляющиеся в сходных фенотипах, т.е. наблюдается проявление Закона гомологических рядов в наследственной изменчивости (Вавилов, 1935). Иллюстрацией к данному обоснованию может служить таблица 10, в которой показана гомология наследственной изменчивости по фенотипическому проявлению постзиготических барьеров при межвидовой и межродовой отдаленной гибридизации. В данной таблице отражен только очень небольшой спектр данных для поколения F1, накопленных в результате более чем столетней истории отдаленной гибридизации растений. Более того, даже у представителей разных классов (двудольных и однодольных) мы встречаем параллелизм – гомологию по проявлению генов постзиготической репродуктивной изоляции. Так, например, гибель гибридных зародышей на ранних этапах эмбриогенеза в стадии 6-8 клеток описана как при межвидовой гибридизации в родах Nicotiana (Kostoff, 1930; McCray, 1932), так и в роде Gossypium (Gerstel, 1954). Сходные нарушения в развитии гибридного эндосперма были описаны у межвидовых гибридов табака (Kostoff, 1930; McCray, 1932), арабидопсиса (Bushell et al., 2003), межвидовых и межродовых гибридов злаков (Sax, 1921; Sharma, 1995). Проростковая летельность со сходным фенотипическим проявлением, зависимая от температуры окружающей среды, была описана при гибридизации Crepis capillaries L. с C. tectorum L. ( Hollingshead, 1930), у гибридов Nicotiana suaveolens x N. tabacum (Yamada et al., 2000) и N. glutinosa x N. repanda ( Marubashi et al., 1999), на стадии проростков у растений пшеницы дисомных по транслокации 2RS/2BL (May and Appels, 1984). Очень часто несовместимость геномов родительских форм проявляется в виде гибридной слабости, карликовости или гибридного некроза
Таблица 10
Закон гомологических рядов наследственной изменчивости
Н.И. Вавилова в проявлении репродуктивной постзиготической изоляции
у растений
| Фенотип | Поколе-ние | Nicotiana | Phaseolus | Oriza | Gossipium | Пшенично-ржаные гибриды |
| Эмбриональная летальность | F1 | + | + | + | + | + |
| Нарушения эндосперма | F1 | + | + | - | + | + |
| Гибель проростков | F1 | + | + | + | + | + |
| Гибриная карликовость | F1 | - | + | - | + | + |
| Гибридная слабость | F1 | - | + | + | + | + |
| Гибридный некроз | F1 | + | + | + | + | + |
| Гибридный хлороз | F1 | - | + | - | + | + |
| Сближенные междоузлия | F1 | - | + | - | + | + |
| Луковые листья | F1 | + | + | - | + | + |
| Стерильность F1* | F1 | + | - | + | - | + |
- - при наличии регулярного мейоза или после удвоения хромосом
Знаком «плюс» обозначаются фактически установленные формы к моменту написания данной работы, (2010г.).
(обзор Stebbins, 1958). Фенотипически гибридный некроз, гибридная карликовость и гибридная слабость схожи по проявлению у двудольных и однодольных, у гибридов внутри различных семейств, родов, или внутривидовых гибридов, как это описано для риса (Oka, 1957) или мягкой пшеницы (Thompson, 1928; Hermsen, 1962; Moore, 1966).
Исходя из закона гомологических рядов наследственной изменчивости, следует принять, что если, например, будут идентифицированы последовательности ДНК для генов Eml-R1 ржи и Eml-A1 пшеницы, блокирующие развитие апикальной меристемы у пшенично-ржаных гибридов, и установлен молекулярный механизм их взаимодействия, то это значительно расширит наши познания о генах, участвующих в формировании апикальной меристемы не только пшенично-ржаного гибридного зародыша, но и у зародышей цветковых растений в целом. Поэтому можно ожидать, что при дальнейшем детальном изучении каждого конкретного случая будет установлено как число генов, участвующих со стороны обеих родителей в формировании репродуктивного барьера, так и изучен его механизм. В перспективе это позволит создать стройную систему, описывающую взаимодействие генов различных видов на разных этапах онтогенеза гибридного растения.
ЗАКЛЮЧЕНИЕ
Классический вариант гибридологического анализа представляет собой специфический метод и является одним из основных в генетике. Метод гибридологического анализа, заключающийся в гибридизации и последующем учете расщеплений, в законченной форме был предложен Г. Менделем. Им были сформулированы непреложные правила, которым следуют все генетики. Первое правило гласит: «Скрещиваемые организмы должны принадлежать к одному виду» (Инге-Вечтомов, 2010). Разработанный нами вариант гибридологического анализа для отдаленных гибридов представляет собой систему скрещиваний, позволяющих выявлять, изучать и картировать гены родительских видов, участвующих в формировании конкретного признака. Ключевая особенность данного варианта гибридологического анализа заключается в том, что серия отдаленных гибридов создается на основе одного генотипа материнской формы, например мягкой пшеницы, и большой серии «константных» форм второго вида, большого (100 и более) набора, например, инбредных автофертильных линий ржи, используемых в качестве опылителя. Такой подход позволяет провести сравнительный анализ экспрессии генов ржи на фоне одного и того же генотипа пшеницы и идентифицировать генотипы, различающиеся по отдельным генам и их взаимодействиям, контролирующих как качественные, так и количественные признаки в генотипе отдаленного гибрида. На втором этапе этого варианта гибридологического анализа, инбредные линии ржи, с альтернативным проявлением признака в генотипе гибрида, скрещиваются между собой. Такой межлинейный гибрид F1 далее используется в качестве опылителя для того же самого генотипа материнской формы, что позволяет проанализировать расщепление у гибридов, установить число генов и характер наследования изучаемого признака. Картирование идентифицированных генов можно проводить с использованием серии РИЛ, полученных на основе данного гибрида F1. Данный подход может быть использован и для выявления полиморфизма генов мягкой пшеницы, специфически экспрессирующихся в генотипе пшенично-ржаного гибрида, что было показано нами при скрещивании серии нули-тетрасомных линий CS с отдельными линиями ржи. Эта задача значительно будет облегчена, если будет выявлен генотип ржи с измененной системой презиготической изоляции, позволяющей пыльцевым зернам ржи успешно преодолевать презиготические барьеры на рыльце и в тканях пестика пшеницы.
Наше исследование продемонстрировало, что взаимодействие генов (геномов) пшеницы Triticum aestivum и ржи Secalre cereale, может приводить к появлению наследуемой изменчивости по устойчивости к болезням, вызываемым как патогенными грибами пшеницы, так и ржи. Гены устойчивости обоих родительских видов, объединяясь в комплексном геноме тритикале, не дают простого суммарного эффекта в результате экспрессии генов устойчивости обоих видов. С другой стороны, полученные нами устойчивые к корневой гнили первичные тритикале, являются продуктом гибридизации двух восприимчивых генотипов. Это наглядно подтверждает ранее высказанное предположение, что устойчивость тритикале к грибным болезням в ряде случаев определяется именно взаимодействием генов пшеницы и ржи (Ригин, Орлова, 1977). Тоже самое надо отметить и в отношении количественных признаков, например высоты растения и фертильности первичных тритикале. Несомненно, идентификация данных генов и их картирование в геномах пшеницы и ржи будет иметь большое теоретическое и практическое значение.
Одним из перспективных и важных направлений является изучение взаимодействия геномов пшеницы и ржи в отношении экспрессии у тритикале генов, контролирующих запасные белки эндосперма зерновки. Важность этой работы вытекает из ведущей роли этих белков в определении кормовых и пищевых достоинств зерна пшеницы, ржи и тритикале. Начатые нами исследования по изучению спектров запасных белков первичных тритикале, выявили наряду с кодоминантным типом наследования, как репрессию отдельных генов, так и появление новых белковых продуктов (Drzewiecki et al., 2008). Развитие этих исследований позволит получить информацию о механизмах регуляции гомеологичных генов у аллополиплоидов.
К настоящему времени разработан ряд методов, позволяющих изучать проявление и взаимодействие генов разных видов в генотипе отдаленного гибрида. Большая часть подходов использует метод введения небольшой части генетического материала одного вида в геном другого. В основе этих подходов лежит создание и использование замещенных, дополненных линий или линий с транслокациями небольших фрагментов, как правило, одной из хромосом одного вида на генотипическом фоне другого. Эти методы информативны в выявлении и изучении ограниченного числа взаимодействий и не могут быть полностью перенесены на процессы, происходящие при объединении полных геномов исходных видов. Проведенное нами исследование показало, что с этой точки зрения, пшенично-ржаные гибриды и первичные тритикале являются информативной моделью для выявления и изучения взаимодействия как генов (аллелей), отвечающих за формирование барьеров репродуктивной изоляции, так и генов (аллелей), обеспечивающих нормализацию функционирования чужеродных геномов в одном ядре. К таким генам (аллелям) можно отнести гены пшеницы, локализованные в хромосомах 1B, 1D и 6B. Присутствие данных хромосом является обязательным условием нормального развития пшенично-ржаных зародышей. Выявление, изучение и картирование генов первой группы позволит изучить генетический контроль основных этапов морфогенеза, как гибридного растения, так и общих закономерностей морфогенеза цветковых растений. Выявление, изучение и картирование генов второй группы позволит продвинуться в понимании процессов стабилизации геномов и неаддитивной экспрессии генов, являющейся молекулярной основой для гетерозиса и фенотипической изменчивости у полиплоидов.
ВЫВОДЫ
- С помощью оригинального варианта гибридологического анализа, основанного на использовании генетических коллекций автофертильных линий ржи и линий мягкой пшеницы сорта Chinese Spring, показана возможность использования пшенично-ржаных гибридов и первичных тритикале в качестве модели для выявления взаимодействия генов родительских форм, определяющих качественные, количественные признаки, и генов (аллелей), отвечающих, как за формирование барьеров репродуктивной изоляции, так и генов (аллелей), обеспечивающих нормализацию функционирования геномов родительских видов у аллополиплоидов.
- Установлено, что у инбредных линий ржи присутствуют гены, аллели которых действуют как в направлении снижения, так и увеличения высоты растений первичных тритикале в присутствии доминантной аллели гена короткостебельности ржи Ddw1. Идентифицированы три линии ржи с генами, детерминирующими снижение высоты растений тритикале в присутствии рецессивной аллели этого гена.
- Показано положительное влияние мутаций автофертильности (sf) в локусе несовместимости Т ржи на фертильность первичных тритикале по сравнению с мутациями в двух других локусах несовместимости S и Z. В среднем завязываемость семян у тритикале с мутациями sf в локусах T, S и Z составляет соответственно 20,6, 9,2 и 8,5%.
- Впервые установлено, что устойчивость к темно-бурой листовой пятнистости (возбудитель Bipolaris sorokiniana) у ржи определяется рецессивными аллелями двух генов, устойчивость к корневой гнили у первичных тритикале может быть результатом взаимодействия генов восприимчивых форм.
- Доказано, что эмбриональная летальность, возникающая при скрещивании мягкой пшеницы с линиями ржи Л2, Л3, 564 и 535 является результатом комплементарного взаимодействия доминантной аллели Eml-R1b ржи и гена Eml-A1 пшеницы, которые блокируют развитие апикальной меристемы гибридного зародыша, но не влияют на развитие корневой меристемы. Скрещивание дополненных по хромосоме 6R и 6RL дисомных линий CS с линией Л2 ржи позволило оценить проявление мутации ржи Eml-R1 в гетерозиготном состоянии и показало, что мутантная аллель Eml-R1b от линии Л2 является доминантной, а аллель дикого типа (Eml-R1a) – рецессивной..
- Установлена аллельность для двух мутаций эмбриональной летальности, выявленных у неродственных линий ржи Л2 и 535 и двух мутаций гибридной карликовости, выявленных у линий Ф1 и Ф10.
- Впервые установлена хромосомная локализация генов эмбриональной летальности пшенично-ржаных гибридов. Хромосомная локализация гена Eml-R1 в хромосоме 6R ржи была осуществлена с помощью анализа молекулярных маркеров в поколении F2 и учета развития зародышей у пшенично-ржаных гибридов, полученных на основе растений F5 одного и того же межлинейного гибрида Л7хЛ2. Для выявления и хромосомной локализации гена Eml-A1 была использована серия нулли-тетрасомных линий CS.
- Впервые показано, что хромосомы мягкой пшеницы 1B, 1D и 6B несут генетические факторы необходимые для формирования гибридных зерновок в скрещиваниях мягкой пшеницы с рожью.
- Предложен метод получения растений с «летальным» генотипом, несущих гены Eml-R1b ржи и Eml-A1 пшеницы, приводящих к эмбриональной летальности. Разработана система для изучения дифференциальной экспрессии этих генов на одинаковом генотипическом фоне.
- Выявлены сходные ряды наследственной изменчивости в проявлении барьеров репродуктивной изоляции у растений различных систематических групп, отражающие проявление Закона гомологических рядов в наследственной изменчивости Н. И. Вавилова.
Список основных публикаций по материалам диссертации:
в журналах рекомендованных ВАК
- Цветкова Н.В., Ростова Н.С., Тихенко Н.Д. Изменчивость признаков колоса у первичных яровых октоплоидных тритикале // Сельскохозяйственная биология. 2002. №5. С. 23-28.
- Тихенко Н.Д., Цветкова Н.В., Войлоков А.В. Анализ влияния генотипа родительских линий ржи на формирование количественных признаков у первичных октоплоидных тритикале. Высота растения // Генетика. 2003. Т.39. №1. С. 64-69.
- Тихенко Н.Д., Цветкова Н.В., Войлоков А.В. Анализ влияния генотипа родительских линий ржи на формирование количественных признаков у первичных октоплоидных тритикале. Фертильность колоса // Генетика. 2003. Т.39. №3. С.370-375.
- Тихенко Н.Д., Цветкова Н.В., Войлоков А.В. Генетический контроль эмбриональной летальности при скрещивании мягкой пшеницы с рожью // Генетика. 2005. Т.41. №8. С.877-884.
- Tikhenko N., Rutten T., Voylokov A., Houben A. Analysis of hybrid lethality in F1 wheat-rye hybrid embryos // Euphytica. 2008. 159: 367-375.
- Цветкова Н.В., Войлоков А. В., Тихенко Н. Д. Петергофская генетическая коллекция первичных октоплоидных тритикале: современное состояние и перспективы изучения // Вестн. С.-Петерб. Ун-та. Сер. 3. 2009. Вып. 4. С. 82-91.
- Войлоков А.В., Тихенко Н.Д. Генетика постзиготической репродуктивной изоляции у растений // Генетика. 2009. Т. 45 (6): 637- 650.
- Tikhenko N., N. Tsvetkova, A. Voylokov, O. Dobrovolskaya, K. Zaynali Nezhad, M. Rder & A. Brner. Embryo lethality in wheat x rye hybrids – mode of inheritance and the identification of a complementary gene in wheat// Euphytica. 2010. Vol. 176. P. 191–198.
- Tikhenko N., N. Tsvetkova, S. Priyatkina, A. Voylokov & A. Brner. Gene mutations in rye causing embryo lethality in hybrids with wheat – allelism test and chromosomal localization// Biol. Plant. ACCEPTED (2010).
в иностранных журналах и материалах международных конференций
- Voylokov A.V., Tikhenko N.D. Identification and localization of rye polymorphic genes specifically expressed in Triticale // The Proceedings of 4th International Triticale Symposium, July 26-31, Red Deer, Alberta, Canada, 1998. V.1. Р. 290-296.
- Voylokov A.V., Tikhenko N.D. Triticale as a model for study of genome interaction and genome evolution in allopolyploid plants // Proc. of the 5th International Triticale Symposium, Radzikow, Poland, 2002. V.1. Р. 63-69.
- Tikhenko N.D., Tsvetkova N.V., Tyryshkin L.G., Smirnov V.G., Voylokov A.V. Diseases resistance in primary octoploid Triticale created with use of inbred rye lines // Triticale Topics (Journal of the International Triticale Association). 2003. V.19. Р. 27-33.
- Тихенко Н.Д., Цветкова Н.В., Войлоков А.В. Первичные тритикале как модельный объект для изучения взаимодействия геномов у аллополиплоидных растений // Отдаленная гибридизация. Труды Международной конференции по отдаленной гибридизации. Москва, 2003. С. 275-279.
- Цветкова Н.В., Тихенко Н.Д., Тырышкин Л.Г., Смирнов В.Г., Войлоков А.В. Анализ устойчивости к грибным болезням первичных октоплоидных тритикале, полученных на основе автофертильных линий ржи // Отдаленная гибридизация. Труды Международной конференции по отдаленной гибридизации. Москва, 2003. С. 295-299.
- Tikhenko N., Tsvetkova N., Boerner A., Voylokov A. Genetic study of embryo lethality in wheat-rye hybrids // In: Internat Symp on Rye Breeding and Genetics, Gro-Lsewitz, Germany, Vortrge fr Pflanzenzchtung. 2007. 71: 253-256.
- Voylokov A., Smirnov V., Sosnikhina S., Mikhailova E., Tikhenko N., Priyatkina S., Tsvetkova N., Smirnov A., Lovtzus A. The study of rye genetics in St. Petersburg University // In: Internat Symp on Rye Breeding and Genetics, Gro-Lsewitz, Germany, Vortrge fr Pflanzenzchtung. 2007. 71:52-53.
- Drzewiecki J., Tikhenko N.D., Tsvetkova N.V. Wspdziaanie genomw pszenicy Chinese Spring i linii wsobnych yta w pszenycie na przykadzie ekspresji genw kodujcych prolaminy ziarniakw// Biul. IHAR, 2008, 249:85-99.
- Тихенко Н.Д. Изменчивость систем постзиготической репродуктивной изоляции у растений//Труды Международной конференции памяти Е.Н. Синской «Генетические ресурсы культурных растений. Проблемы эволюции и систематики культурных растений», 9 – 11 декабря, 2009г. Санкт-Петербург, С. 128-130.
другие основные публикации
- Тихенко Н.Д. Экспрессия геномов пшеницы и ржи в процессе цветения и опыления у тритикале// Сб. науч. тр. ЛСХИ. «Морфогенетические показатели продуктивности растений и использование их в селекционно-семеноводческой работе», Л., 1988. C.62-68.
- Тихенко Н.Д. Гетерогенность сорта АД 206 по высоте растений // Сб. науч. тр. ЛСХИ. «Морфогенетические показатели продуктивности растений и использование их в селекционно-семеноводческой работе». Л., 1990. C. 34-37.
- Цветкова Н.В., Тихенко Н.Д. Анализ зерновой продуктивности первичных октоплоидных тритикале // Роль научного обеспечения в реформировании АПК, Санкт-Петербург, 2000. С.96-97.
- Цветкова Н.В., Тихенко Н.Д. Использование генетической коллекции ржи для совершенствования методов селекции тритикале// Тр. БиНИИ СПБГУ, 2008, вып. 54, С.36-52.
