Полиморфизм фрагментов днк, фланкированных инвертированными повторами микросателлитов, в исследованиях пород овец, крупного рогатого скота, лошадей

На правах рукописи

ФЕОФИЛОВ Антон Владимирович

ПОЛИМОРФИЗМ ФРАГМЕНТОВ ДНК, ФЛАНКИРОВАННЫХ ИНВЕРТИРОВАННЫМИ ПОВТОРАМИ МИКРОСАТЕЛЛИТОВ, В ИССЛЕДОВАНИЯХ ПОРОД ОВЕЦ, КРУПНОГО РОГАТОГО СКОТА, ЛОШАДЕЙ

03.02.07. – Генетика

АВТОРЕФЕРАТ

диссертации на соискание ученой степени

кандидата биологических наук

Дубровицы – 2012

Работа выполнена в Центре нанобиотехнологий ФГБОУ ВПО «Российского государственного аграрного университета – МСХА имени К.А. Тимирязева».

Научный руководитель: Глазко Валерий Иванович, доктор сельско-хозяйственных наук, профессор, академик РАСХН (иностранный член)

Официальные оппоненты: Калашникова Любовь Александровна, доктор биологических наук, профессор, заведующая лабораторией ДНК-технологий ФГБНУ Всероссийский научно-исследовательский институт племенного дела

Кленовицкий Павел Михайлович, доктор биологических наук, профессор, главный научный сотрудник лаборатории репродуктивной криобиологии ГНУ Всероссийский научно-исследовательский институт животноводства Россельхозакадемии

Ведущая организация: ГНУ Всероссийский научно-исследовательский институт коневодства Россельхозакадемии

Защита диссертации состоится « 9 » октября 2012 г. в 10-00 часов на заседании совета по защите докторских и кандидатских диссертаций Д 006.013.03 при Государственном научном учреждении Всероссийский научно-исследовательский институт животноводства Российской академии сельскохозяйственных наук.

Адрес института: 142132. Московская область. Подольский район, п. Дубровицы, ГНУ ВИЖ Россельхозакадемии; тел./факс (4967) 65-11-01. www.vij.ru.

С диссертацией можно ознакомиться в научной библиотеке ГНУ ВИЖ Россельхозакадемии.

Автореферат разослан « » сентября 2012 г.

Ученый секретарь

диссертационного совета

Д 006.013.03 И.В. Гусев

1. ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность темы. Успешность решения задач общей и частной популяционной генетики многих видов, в том числе и сельскохозяйственных, зависит от изученности особенностей полиморфизма различных элементов генома (Харченко, Глазко 2006; Эрнст, 2008; Калашникова, 2010). В последнее время для этих целей широко используются микросателлитные маркеры (Зиновьева, Гладырь, 2009, 2011; Багиров и др., 2009), которые позволили по-новому взглянуть на организацию генома как целого (Зайцев, Храброва, 2011). Достижения в этой области способствовали появлению методов геномного сканирования, т.е. одновременного анализа от десятков до нескольких сотен генетических локусов (Nosil et al., 2009). Хотя к настоящему времени геномы ряда сельскохозяйственных видов полностью секвенированы, и для картирования главных генов количественных признаков широко используются оценки разнообразия по сотням тысяч однонуклеотидных замен (Single Nucleotide Polymorphism – SNP) («геномная селекция», Weller, Ron, 2011), эффективность применения таких методов в селекционных программах (GEBV) не очень высока. К тому же она варьирует в зависимости от породной принадлежности (Flori et al., 2009) и эколого-географических условий разведения животных (Hammami et al., 2009).

Альтернативным направлением геномного сканирования может быть использование оценок полиморфизма длин фрагментов ДНК, фланкированных короткими инвертированными повторами; поскольку они широко представлены в геномах, такой подход позволяет охарактеризовать геном как целое. Применение микросателлитных последовательностей в качестве праймеров в ПЦР для геномного сканирования получило название ISSR-PCR (Inter-Simple Sequence Repeat). Эти маркеры нашли широкое применение в популяционно-генетических исследованиях различных объектов (Глазко, 2009; Зиновьева и др., 2011). Однако, поскольку геномное распределение микросателлитов существенно отличается у разных таксонов (Santana et al., 2009), а возможные причины таких отличий до сих пор недостаточно изучены, перед использованием ISSR-PCR для геномного сканирования необходимо исследовать полиморфизм спектров получаемых фрагментов ДНК в зависимости от корового мотива микросателлита, а также видовой и породной принадлежности животных, эколого-географических условий их воспроизводства. В связи с этим в настоящей работе выполнен сравнительный анализ полиморфизма ISSR-PCR маркеров, полученных с использованием в качестве праймеров различных микросателлитных мотивов, у ряда видов сельскохозяйственных животных.

Цель и задачи исследований. Целью настоящего исследования являлась разработка и оптимизация методов использования ISSR-PCR маркеров для выявления и контроля генетического разнообразия генофондов некоторых видов и пород сельскохозяйственных животных.

Для этого были поставлены следующие конкретные задачи:

1. Провести сравнительный анализ спектров продуктов амплификации, получаемых с использованием в качестве праймеров участков различных микросателлитов, у крупного рогатого скота, овец, лошадей, а также некоторых представителей диких видов семейства Bovidae;
2. Оценить информативность спектров фрагментов ДНК, получаемых при использовании различных праймеров для геномного сканирования доместицированных видов Bovidae, а также домашней лошади;
3. Дать характеристику исследованных групп животных по доле полиморфных локусов, полиморфному информационному содержанию спектров продуктов амплификации ISSR-PCR маркеров в зависимости от нуклеотидной последовательности микросателлитов, используемых в качестве праймеров;
4. Выявить получаемые в результате ISSR-PCR генетические локусы, участвующие в межвидовой и внутривидовой (межпородной) генетической дифференциации;
5. Оценить возможные источники отличий в распределении ISSR-PCR маркеров путем анализа особенностей их локализации в секвенированных последовательностях геномной ДНК с использованием международной базы данных GenBank;
6. Изучить последовательности ампликонов, демонстрирующих разнообразие на внутривидовом уровне, с целью выявления возможных причин наблюдаемых различий.

Научная новизна. В работе впервые выполнен сравнительный анализ спектров фрагментов ДНК, получаемых методом ISSR-PCR анализа, для представителей доместицированных и диких видов копытных. Рассмотрены особенности генетической дифференциации крупного рогатого скота, овец, лошадей по полиморфизму «анонимных» фрагментов ДНК, фланкированных инвертированными повторами участков микросателлитных локусов. Впервые у исследованных групп животных изучены особенности спектров получаемых фрагментов ДНК в зависимости от нуклеотидной последовательности флангов. Получены данные о видовой и породной специфичности, консервативности и изменчивости отдельных фрагментов ДНК, присутствующих в ISSR-PCR спектрах, о возможной связи наблюдаемого полиморфизма со спецификой локализации микросателлитов в различных частях генома. Путем секвенирования показано, что источником появления отдельных фрагментов ДНК в ISSR-PCR спектрах может быть рекомбинация между участками эндогенных ретровирусов. Один из таких фрагментов у лошадей оказался ассоциированным с присутствием хромосомы Y.

Практическая значимость. Подобраны наиболее информативные полилокусные сочетания ISSR-PCR маркеров, позволяющие проследить родственные отношения между группами животных, разработать видовые, внутривидовые, породные и внутрипородные «генофондные стандарты» – совокупности ДНК фрагментов разной длины в ISSR-PCR спектрах, присутствие/отсутствие которых отличает одну группу животных от другой. Полученные результаты дают возможность предложить генетически обоснованные программы сохранения биоразнообразия редких и исчезающих видов и пород, контролировать динамику генофондов сельскохозяйственных животных в условиях искусственного и естественного отборов. Обнаруженный фрагмент ДНК в геноме лошади, ассоциированный с присутствием хромосомы Y, может быть использован для пренатальной диагностики пола эмбриона методом ПЦР-анализа.

Положения, выносимые на защиту:

1. Результаты геномного сканирования при генотипировании нескольких десятков фрагментов ДНК, фланкированных инвертированными повторами микросателлитов (ISSR-PCR маркеры) отражают популяционно-генетические взаимоотношения между группами животных на межвидовом, внутривидовом (породном) и внутрипородном уровнях.

2. Участки генома, фланкированные инвертированными повторами микросателлитов, позволяют создавать тест-системы, устанавливающие принадлежность животного к конкретной (видовой, породной, по признаку пола) группе.

3. Полиморфизм ISSR-PCR маркеров может быть тесно связан с перемещениями и рекомбинацией мобильных генетических элементов.

Апробация работы. Материалы диссертации были представлены: на Международных конференциях студентов, аспирантов и молодых ученых «Ломоносов-2009», «Ломоносов-2010», «Ломоносов-2011», Москва; на Международных московских конференциях по вычислительной молекулярной биологии (MCCMB’09, MCCMB’11); на Международной научно-практической конференции, посвященной 60-летию зоотехнической науки Беларуси, Жодино, 2009; на Национальной научной конференции по генетике, Болгария, 2009; на 7-ой и 8-ой Международной конференции по биоинформатике регуляции и структуры генома и системной биологии (BGRS’10 и BGRS’12), Новосибирск; на Международной научной конференции «24-е генетические дни», Брно, 2010; на IX Съезде Териологического общества при РАН, Москва, 2011; на VI Московском международном конгрессе «Биотехнология», 2011; на конкурсе молодых ученых на лучший инновационный проект по вопросам биотехнологии, Подольск, ВИЖ, 2012.

Публикация результатов исследования. Основные результаты работы опубликованы в 21 научной статье, в том числе 9 из них в журналах, рекомендованных ВАК России.

Структура и объем работы. Диссертационная работа изложена на 148 страницах и включает введение, главы «Обзор литературы», «Материалы и методы», «Результаты исследований и их обсуждение», заключение, выводы, предложения производству, список литературы. Материалы диссертации иллюстрированы 31 таблицей, 19 рисунками. Список литературы включает 167 публикаций, в том числе 108 иностранных.

2. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ

Объекты исследования. В работе были проанализированы образцы ДНК, выделенной из крови крупного рогатого скота: серой украинской породы (34 головы (гол.), Украина, 45 гол., респ. Алтай), красной эстонской породы (23 гол., Псковская обл.), черно-пестрой голштинизированной породы (23 гол., хозяйство РГАУ-МСХА) и якутской породы (11 гол., респ. Саха); овец: эдильбаевской породы (бирликского внутрипородного типа – 50 гол., суюндукского – 50 гол., Волгоградская обл.), романовской породы (209 гол., разводимых в хозяйствах Ярославской и Ивановской областей), кулундинской породы (70 гол., респ. Алтай); лошадей: алтайской породы (96 гол., респ. Алтай), рысистых пород (48 гол., Московская обл.). Также были исследованы популяции монгольских местных пород (крупный рогатый скот – 14 гол., овцы – 32 гол., яки – 14 гол., козы – 22 гол.), разводимых на территории Южного Гоби, и группы этих же видов животных, обитающие в биосферном заповеднике Хубсугул.

Схема исследования представлена на рис. 1.

Рис 1. Схема исследований

Выделение ДНК. Экстракцию геномной ДНК из лейкоцитов крови проводили с использованием набора реагентов «ДНК-экстран» («Синтол», Россия) в соответствии с рекомендациями производителя. В ряде случаев был использован метод выделения ДНК с использованием фенол-хлороформной экстракции (Маниатис и др., 1984).

ISSR-PCR анализ. Для проведения ISSR-PCR анализа применяли методику, разработанную Зеткевичем и др. с некоторыми модификациями (Zietkiewicz et al. 1994). В качестве праймеров использовали последовательности (AG)9C, (GA)9C, (GAG)9C, (CTC)9C, (AGC)6G, (ACC)6G («Синтол», Россия). Один ампликон спектра рассматривали как один локус ДНК. Полиморфизм такого локуса оценивали по наличию-отсутствию ампликона соответствующей длины в спектрах. Программа амплификации включала в себя первичную денатурацию (t = 94°С, 2 мин.); 30 циклов денатурации (t = 94°С, 30 с.), отжига праймера (t = 55°С, 30 с.), элонгации цепи (t = 72°С, 2 мин.); а также финальную элонгацию (t = 72°С, 10 мин.), ПЦР проводили на амплификаторе «Терцик» («ДНК-технологии», Россия).

Разделение продуктов амплификации. Электрофорез продуктов амплификации проводили с использованием 1,5% агарозного геля в 1х ТВЕ-буфере (89 мМ трис, 89 мМ борная кислота, 2 мМ ЭДТА) с добавлением бромистого этидия до конечной концентрации 0,5 мкг/мл со следующими параметрами: сила тока составляла 50 мА, напряжение 100 В, время 1,5 часа.

Визуализация результатов электрофореза. Гели фотографировали в ультрафиолете, = 312 нм (трансиллюминатор УВТ-1, «Биоком», Россия).

Обработка полученных результатов. Для каждого спектра строили матрицу, отражающую присутствие/отсутствие в нем конкретных ампликонов. Расчеты частот доминантных/рецессивных аллелей в выборке выполняли с помощью Microsoft Excel; популяционно-генетические расчеты производили в программе TFPGA (Miller, 1997).

Расчет индекса PIC (polymorphism information contents). Индекс PIC характеризует уровень гетерозиготности локусов – продуктов амплификации, исходя из представлений о том, что по каждому локусу исследованная группа животных находится в состоянии, соответствующем равновесию Харди-Вайнберга. Для индивидуальных локусов значения индекса рассчитывали по формуле, предложенной Botstein и др. для диаллельных локусов (Botstein et al., 1980), для которых PIC=2f(1-f), где f – частота одного из двух аллелей. Ее вычисляли исходя из доли носителей рецессивных гомозигот по формуле, где R – количество носителей рецессивных гомозигот, N – количество исследованных животных.

Поиск гомологии. Поиск гомологичных последовательностей в GenBank осуществлялся с помощью алгоритмов семейства BLASTn (http://blast.ncbi.nlm.nih.gov), в базах данных повторяющихся последовательностей – с помощью программ Censor (www.girinst.org/censor/) и RepeatMasker (www.repeatmasker.org/).

Выделение ДНК из геля. Ампликоны спектра выделяли из геля с помощью набора для элюции ДНК из агарозных гелей («Изоген», Россия) в соответствии с рекомендациями производителя.

Клонирование, селекция колоний, выделение плазмидной ДНК. Некоторые ампликоны выделили из геля и амплифицировали с использованием праймера 5’-CAGCTGCAG(AG)8C-3’, содержащего на 5’-конце сайт рестрикции для PstI. ПЦР-продукт клонировали в плазмиде pUC19 по PstI, которую размножали затем в клетках E. coli штамма JM109. Клонирование, селекцию колоний и выделение плазмидной ДНК выполняли в соответствии со стандартной процедурой (Маниатис и др., 1984).

Секвенирование ДНК проводилось с помощью набора реактивов ABI PRISM® BigDye™ Terminator v. 3.1 с последующим анализом продуктов реакции на автоматическом секвенаторе ДНК ABI PRISM 3730 Applied Biosystems на базе Межинститутского Центра коллективного пользования «ГЕНОМ» ИМБ РАН. Секвенирование осуществляли с использованием праймеров к фагу М13: F(-40) – 5’-GTTTTCCCAGTCACGAC-3’, R(-40) – 5’-CAGGAAACAGCTATGAC-3’. Результаты секвенирования анализировали с помощью компьютерной программы BioEdit v. 7.0.5.

3. РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЙ

3.1. Изучение межвидовой дифференциации методом ISSR-анализа

На первом этапе, с целью получить наиболее насыщенные спектры продуктов ISSR-PCR с высокой воспроизводимостью, была выполнена оптимизация условий геномного сканирования. Тестируемые праймеры содержали последовательности ди- и тринуклеотидных микросателлитных мотивов с добавлением якорного нуклеотида на 3’-конце. В реакционной смеси варьировали концентрацию магния, Taq ДНК полимеразы, количество ДНК-матрицы, в программе амплификации варьировали температуру отжига праймера, количество циклов и длительность этапов отжига праймера и элонгации цепи. Оптимальные для всех исследованных видов условия приведены в разделе «Материалы и методы». Спектры, получаемые с использованием ди- и тринуклеотидных микросателлитных мотивов в качестве праймеров, оказались в равной степени насыщены ампликонами, хотя предполагалось, что спектры динуклеотидных праймеров должны быть более сложными.

Для изучения межвидовой дифференциации была поставлена дополнительная задача: протестировать образцы геномной ДНК видов млекопитающих и птиц, представленных на фореграмме (рис. 2). Тестирование по каждому из использованных праймеров позволяло надежно отличать один вид от другого по присутствию уникальных ампликонов. В качестве примера на рис. 2 приведены спектры ампликонов, получаемые с использованием праймера (AG)9C.

Рис. 2. Спектры ампликонов, получаемые при использовании праймера (AG)9C в ISSR-PCR. M – маркер молекулярных масс (длины фрагментов ДНК указаны слева), 1– каборга, 2 – лань, 3 – северный олень, 4 – снежный баран, 5 – овцебык,
6 – лошадь, 7 – овца, 8 – крупный рогатый скот, 9 – як, 10 – зубр, 11 – лось, 12 – косуля, 13 – дрофа.

На основании совокупности данных спектров четырех ISSR-PCR праймеров были рассчитаны величины генетических дистанций (Nei, 1972) и построена дендрограмма (рис. 3).

Рис. 3. Дендрограмма межвидовых взаимоотношений между представителями видов, принадлежащих различным классам животных, построенная на основании генетических расстояний, рассчитанных по ISSR-PCR маркерам.

Оказалось, что дендрограмма адекватно отражает существующие представления о филогенетических взаимоотношениях между классами и видами. Из этого следует, что полиморфизм «анонимных» фрагментов ДНК, фланкированных инвертированными повторами разных микросателлитов (суммарно 186 локусов) объективно отражает генетическую дифференциацию между разными группами животных.

3.2. Особенности генетической дифференциации на внутривидовом (межпородном) уровне

3.2.1. Породы крупного рогатого скота и яки

Использование ISSR-PCR маркеров позволило получить у пород крупного рогатого скота спектры продуктов амплификации (ампликонов), характеристики которых представлены в табл. 1.

Таблица 1

Характеристики спектров ампликонов, полученных в ISSR-PCR у пород крупного рогатого скота

Праймер	Порода	Количе-ство ампли-конов в спектре	Границы длин локусов спектра, п.н.	Количество полиморфных ампликонов	Доля полиморфных ампликонов в спектре, %	РІС
(AG)9С	серая украинская	11	1200-220	5	45	0,175
	черно-пестрая	9	1050-280	4	44	0,171
	красная эстонская	11	1250-480	5	45	0,154
(GA)9C	серая украинская	10	1500-240	0	0	0
	черно-пестрая	6	600-210	3	50	0,221
	красная эстонская	12	1100-300	3	25	0,105
(GAG)6C	серая украинская	17	3000-280	8	47	0,233
	черно-пестрая	16	1050-280	6	38	0,133
	красная эстонская	21	1300-360	9	43	0,170
(CTC)6C	серая украинская	16	3100-310	15	94	0,300
	черно-пестрая	14	1350-310	7	50	0,210
(AGC)6G	серая украинская	16	2600-380	4	25	0,162
(ACC)6G	серая украинская	32	3250-320	31	97	0,280

Обнаружено, что каждый используемый праймер в ISSR-PCR методе приводил к формированию специфичных спектров продуктов амплификации, причем их полиморфизм не был прямо связан с количеством выявляемых локусов. У серой украинской породы спектр праймера (ACC)6G оказался существенно более полиморфным у быков по сравнению с коровами. Выявлены выраженные отличия между спектрами праймеров (GAG)6C и (CTC)6C. Эти последовательности принадлежат к так называемым пурин/пиримидиновым трекам, способным формировать триплексные структуры, предположительно, принимающим участие в регуляции генной экспрессии. При почти одинаковом количестве ампликонов в спектрах доля полиморфных локусов была существенно выше у последнего, а по структуре спектров в случае (GAG)6C преобладали “легкие” (до 1000 п.н.) ампликоны, в то время как для (CTC)6C были характерны “тяжелые” (от 1550 до 3250 п.н.) фрагменты ДНК. Полученные величины PIC для этих спектров качественно совпадали с результатами оценки доли полиморфных локусов: наибольшие значения PIC обнаруживаются в спектрах праймеров (ACC)6G и (CTC)6C по сравнению со спектрами, полученными при использовании других праймеров.

У представителей черно-пестрой голштинизированной породы выявлено от 6 до 16 ампликонов, при этом доля полиморфных локусов была примерно одинаковой. Максимальное число ампликонов наблюдали в спектре праймера (GAG)6C, минимальное – при использовании праймера (GA)9C, при этом значения индекса PIC для них были наименьшим (0,133) и наибольшим (0,221) соответственно. То есть, несмотря на небольшое количество локусов, выявляемых праймером (GA)9C, их полиморфизм имеет большее информационное содержание.

У животных красной эстонской породы спектры праймера (GA)9С оказались наименее полиморфными – значение индекса PIC было наименьшим среди всех исследованных групп крупного рогатого скота. В спектрах, полученных с использованием праймера (AG)9С, присутствовали ампликоны длиной в 710, 690 и 560 п.н., до этого не наблюдавшиеся нами в спектрах этого праймера у других пород крупного рогатого скота. В совокупности, были выявлены ампликоны, характерные для каждой породы, например, локус 370 п.н. для красной эстонской породы и локус 410 п.н. для черно-пестрой (рис. 4) в спектре праймера (AG)9С.

Для сопоставления со спектрами ISSR-PCR маркеров у близкородственных видов рода Bos нами были дополнительно проанализированы образцы геномной ДНК яков (19 гол., респ. Саха). Выявлены общие и отличающиеся между группами продукты амплификации. Так, например, в спектрах праймера (GAG)6C фрагмент длиной в 650 п.н. присутствовал у 12 из 19 исследованных яков, у половины представителей черно-пестрой породы и у большинства представителей красной эстонской породы. Фрагмент длиной 480 п.н. отсутствовал у черно-пестрой породы, но наблюдался у якутской породы и у 79% яков. Фрагмент длиной 400 п.н. был выявлен примерно у половины животных черно-пестрой породы, у всех животных якутской породы, у 91% животных красной эстонской породы и у 74% яков. Фрагменты длин в 280 и 380 п.н. наблюдали только у коров якутской и черно-пестрой породы соответственно.

Полученные данные свидетельствуют о том, что оценки полиморфизма ISSR-PCR маркеров позволяют выявлять совокупность фрагментов ДНК, фланкированных инвертированными повторами разных микросателлитных локусов, сочетание которых отличает одну породу крупного рогатого скота от другой, а также от яков.

3.2.2. Генетическая дифференциация пород овец по ISSR-PCR маркерам

Нами выполнен анализ образцов геномной ДНК овец эдильбаевской породы, полученные характеристики ISSR-PCR спектров представлены в таблице 2. Обращает на себя внимание высокий полиморфизм в спектрах праймера (CTC)6C, а также небольшое общее количество и сравнительно малая длина ампликонов в спектрах праймера (GA)9C. Между спектрами праймеров (GAG)6C и (CTC)6C у исследованных овец, так же как и у крупного рогатого скота, обнаруживались выраженные отличия по доле полиморфных локусов и диапазонам длин ампликонов (табл.2).

Таблица 2

Характеристики спектров ампликонов, полученных в ISSR-PCR у пород овец

Праймер	Количество ампликонов в спектре	Границы длин локусов спектра, п.н.	Количество полиморфных ампликонов	Доля полиморфных ампликонов в спектре, %	PIC
Эдильбаевская
(AG)9C	10	1200-280	7	70	0,274
(GA)9C	5	600-200	4	80	0,297
(GAG)6C	8	850-400	3	38	0,231
(CTC)6C	17	1700-280	17	100	0,399
Романовская
(AG)9C	26	1270-225	18	69	0,314
(GA)9C	9	640-215	7	78	0,356

Среди продуктов амплификации, полученных в спектрах праймеров (AG)9C и (GA)9C, у животных романовской породы наиболее надежно выявлялись 13 и 8 ампликонов соответственно. В спектрах праймера (AG)9C c высокой частотой присутствовали фрагменты ДНК длин 1000 и 600 п.н. Уровень средней гетерозиготности по продуктам спектра праймера (AG)9C у романовских овец из разных хозяйств варьировал от 0,265 до 0,373 при среднем значении 0,314, в то время как в спектрах праймера (GA)9C он практически не отличался: 0,355-0,359. Обращает на себя внимание сходство доли полиморфных локусов и границ длин ампликонов у эдильбаевской и романовской пород (табл. 2).

Несколько отличался от эдильбаевской спектр продуктов амплификации по праймеру (GA)9C у кулундинской овцы. Спектр праймера (GA)9C этой породы был относительно больше обогащен длинными фрагментами ДНК, по сравнению с эдильбаевской овцой: размер ампликонов находился в пределах 2500-300 п.н. Суммарно выявлено 6 продуктов амплификации. В спектрах праймера (AG)9C, наблюдалось 11 ампликонов длинами от 600 до 2500 п.н.

Для сравнения нами были также проанализированы представители близкородственного дикого вида – снежного барана (6 гол., респ. Саха). В результате в спектрах праймера (AG)9C выявлены ампликоны, присутствие которых отличалось у домашней овцы и снежного барана. Так, специфичным для кулундинской породы овец оказался ампликон длиной в 2500 п.н. Ампликоны длиной в 2200 и 900 п.н. выявлены только у снежного барана. Продукты амплификации размером 1700, 1000 и 600 п.н. были общими для обоих видов. Фрагмент длиной 600 п.н. был обнаружен нами как постоянно присутствовавший у кулундинской овцы и снежного барана. В спектрах праймера (GA)9C из 7 ампликонов в интервале 2000-500 п.н. фрагменты длиной 1600 и 1700 п.н. выявлены только у кулундинской породы, а длиной 1400 и 500 п.н. – только у снежного барана.

Выполненные сравнения генетических структур пород овец и близкородственного дикого вида – снежного барана – свидетельствуют о том, что полилокусные спектры ISSR-PCR маркеров имеют выраженную видовую и породную специфичность, их полиморфизм зависит от используемого в качестве праймера фрагмента микросателлитного локуса и позволяет выявлять не только специфические особенности полиморфизма различных геномных участков, но и консервативные по длине фрагменты ДНК, фланкированные инвертированными повторами одних и тех же микросателлитов, в геномах близкородственных видов.

3.2.3. Полилокусные спектры ISSR-PCR маркеров у пород лошадей

Выполнен сравнительный анализ генетических структур по полилокусным спектрам продуктов амплификации ISSR-PCR маркеров пород лошадей, отличающихся по направлению их использования. Местная алтайская порода была представлена животными двух хозяйств, из СПК «Энчи» (48 гол.) и СПК «Чингиз» (48 гол.). Лошади спортивных рысистых пород включали группы животных американских (7 гол.), русских (6 гол.), орловских (4 гол.) рысаков и помесей русских и американских рысаков (31 гол.). Результаты выполненных исследований представлены в табл. 3.

У исследованных лошадей отмечается сходный диапазон длин фрагментов ДНК, фланкированных инвертированными повторами разных микросателлитных локусов (табл. 3), в отличие от пород крупного рогатого скота и овец (табл. 1, 2). В спектрах ISSR-PCR маркеров у животных алтайской породы были обнаружены ампликоны, присутствующие с более высокой частотой у лошадей одного хозяйства по сравнению с другим: 320 и 380 п.н. в спектрах маркера (AG)9C; 1280, 1180 и 920 п.н. в спектрах маркера (GAG)6C; 980 п.н. в спектрах маркера (CTC)6C, однако значения PIC оказались близкими у лошадей обоих хозяйств.

Таблица 3

Характеристики спектров ISSR-PCR маркеров у пород лошадей

Праймер	Порода	Количество ампликонов в спектре	Границы длин локусов спектра, п.н.	Количество полиморфных ампликонов	Доля полиморфных ампликонов в спектре, %	РІС
(AG)9С	алтайская	13	1250-320	10	77	0,325
	рысистые	9	1200-320	7	78	0,251
(GA)9C	алтайская	9	1000-370	7	78	0,318
	рысистые	8	1000-360	7	88	0,352
(GAG)6C	алтайская	13	1280-360	12	92	0,366
	рысистые	11	1400-180	8	73	0,296
(CTC)6C	алтайская	13	1500-440	11	85	0,349
	рысистые	7	1100-350	3	43	0,156

У лошадей рысистых пород спектры ампликонов, полученные при использовании в качестве праймеров участков тринуклеотидных микросателлитов, в целом, оказались менее полиморфными по сравнению со спектрами динуклеотидных праймеров (табл. 3). Интересно отметить, что у жеребцов уровень полиморфизма спектров праймера (AG)9C был существенно ниже, чем у кобыл: у первых полиморфными оказались только два локуса (длиной в 320 и 380 п.н.). Между жеребцами и кобылами наблюдались различия в локусах 750 и 620 п.н. спектров праймера (GA)9C: частоты присутствия в спектрах фрагментов ДНК с такой длиной у жеребцов равнялись 0,087 для обоих локусов, в то время как у кобыл они встречались с частотой в 0,592 и 0,512 соответственно.

При сравнении спектров ампликонов лошадей алтайской породы со спектрами представителей трех рысистых пород наибольшее сходство между всеми исследованными группами лошадей выявлено по спектрам праймера (GA)9C. Обнаружено 8 общих локусов (фрагментов ДНК) у разных пород и помесей. Различие наблюдалось лишь по фрагменту ДНК длиной в 740 п.н., представленном в спектрах ампликонов только у лошадей алтайской породы. Наибольшее различие между породами выявлено в спектрах праймера (GAG)6C: у рысистых пород отсутствовали четыре локуса (длиной в 1180, 920, 780, и 430 п.н.), а у лошадей алтайской породы не были найдены ампликоны длиной в 300, 250 и 180 п.н. Количество ампликонов в спектрах, получаемых с использованием праймера (CTC)6C, у лошадей рысистых пород оказалось существенно меньшим по сравнению с алтайской породой: 6 общих локусов, из которых по четырем полиморфизм отсутствовал. По-видимому, наблюдаемые отличия могут быть обусловлены линейным разведением и относительно меньшим генетическим разнообразием используемых жеребцов при разведении рысаков по сравнению с местной алтайской породой.

Значения индекса PIC лошадей алтайской породы, а также американских, русских и орловских рысаков и их помесей представлены в табл. 4. Оказалось, что уровень гетерозиготности по спектрам всех четырех праймеров сходен у обеих групп алтайских лошадей и заметно выше, чем у группы рысистых пород. Интересно отметить сходство по значениям PIC спектров ампликонов спектров разных праймеров у лошадей алтайской породы. По сравнению с этими лошадьми, значение индекса у рысистых пород ниже, особенно в спектрах праймера (CTC)6C.

Таблица 4

Полиморфное информационное содержание (PIC) спектров продуктов амплификации у исследованных групп рысаков и лошадей алтайской породы

Праймеры	Рысаки					Алтайская порода n=96
	Амери-канский n=7	Русский n=6	Орловский n=4	Помеси n=31	По всем животным n=48
(AG)9C	0,111	0,180	0,248	0,229	0,251	0,325
(GA)9C	0,272	0,239	0,125	0,343	0,352	0,318
(GAG)6C	0,270	0,204	0,203	0,252	0,296	0,366
(CTC)6C	0,120	0,161	0,059	0,156	0,156	0,349
В среднем	0,193	0,196	0,159	0,245	0,264	0,340

В целом, алтайская порода лошадей отличалась от рысаков более высоким уровнем гетерозиготности и, соответственно, меньшей генофондной консолидированностью, что, по-видимому, может быть обусловлено меньшей интенсивностью искусственного отбора по сравнению со спортивными рысистыми породами. Обнаружено, что у лошадей рысистых пород основной вклад в значения PIC вносят ампликоны ISSR-PCR спектров (GA)9C и (GAG)6C (табл. 4). У помесных рысаков уровень PIC был заметно выше (0,245), чем у родительских пород (0,159-0,196; табл.4). При суммарном расчете PIC у рысаков значения индекса рассчитывали по спектрам всех праймеров отдельно. Поскольку по полиморфизму некоторых ампликонов группы рысаков отличались друг от друга, суммарные значения PIC, как правило, были больше, чем по отдельным группам.

По ISSR-PCR маркерам нами рассчитаны генетические дистанции по М. Нею и построены дендрограммы взаимоотношений указанных групп лошадей (рис. 5). Кластеризация групп лошадей, принадлежащих к разным породам и помесям, наглядно свидетельствует о том, что такое полилокусное генотипирование (суммарно по 48 локусам) по ISSR-PCR маркерам с высокой точностью соответствует истории происхождения групп исследованных животных. По-видимому, даже при таких сложных скрещиваниях и генофондных пересечениях в истории формирования групп исследованных животных (русские рысаки исходно выведены из помесей орловских и американских рысаков), использование совокупности полилокусных спектров ISSR-маркеров позволяет реконструировать генофондные взаимоотношения даже между малочисленными группами животных.

Рис. 5. Дендрограмма генетических взаимоотношений групп лошадей алтайской и рысистых пород, построенная на основании генетических расстояний, рассчитанных по суммарному полилокусному генотипированию ISSR-PCR маркеров.

В этой связи далее мы рассмотрели возможности использования полилокусных ISSR-PCR маркеров для оценки внутрипородных особенностей генетической дифференциации сельскохозяйственных видов животных.

3.2.4. Генетические структуры внутрипородных типов эдильбаевской
породы овец

Таблица 5

Распределение частот встречаемости некоторых ампликонов у внутрипородных типов овец эдильбаевской породы

Длины ампликонов, п.н.	Внутрипородный тип
	бирликский (n=50)		суюндукский (n=50)
	+	—	+	—
Спектр праймера (AG)9C
780	1	0	0,776		0,224
280	0,250	0,750	0,329		0,671
Спектр праймера (GA)9C
400	0,134	0,866	0,082		0,918
290	0,315	0,685	0,452		0,548
200	0,681	0,319	1		0

Примечание. Знаком «+» обозначено присутствие ампликона, «—» его отсутствие. Цифрами в ячейках таблицы указаны частоты присутствия/отсутствия ампликонов разной длины (левая колонка) у исследованных внутрипородных типов эдильбаевской породы овец.

С использованием ISSR-PCR маркеров выполнен сравнительный анализ генетических структур двух внутрипородных типов эдильбаевской породы овец – бирликского и суюндукского.

В спектрах ампликонов выявлена генетическая дифференциация между этими типами по частотам встречаемости фрагментов различных длин: 780 п.н. в спектре праймера (AG)9C, и 200 и 290 п.н. в спектре праймера (GA)9C (табл. 5). Интересно отметить, что ампликон размером в 900 п.н., выявленный у животных обоих внутрипородных типов, ранее обнаруживался только у снежного барана и не наблюдался в генофондах ни у одной из пород овец, описанных нами по ISSR-PCR маркерам.

Полученные данные свидетельствуют о том, что полилокусное генотипирование по ISSR-PCR маркерам позволяет выявить дифференциацию между двумя типами внутри одной породы. Основной вклад в такую дифференциацию могут вносить особенности происхождения животных (эффекты основателей), как это наглядно обнаруживалось при оценках генетической дифференциации пород и помесей рысаков (рис. 5), и может быть обусловлено влиянием разных факторов отбора.

Для того, чтобы оценить возможности использования полилокусного генотипирования ISSR-PCR маркеров для выявления действия факторов экологического стресса, далее выполнено сравнение генетических структур групп животных, воспроизводящихся в условиях зоны «рискованного животноводства» (Южное Гоби с сухим, резко континентальным климатом, большими сезонными и суточными колебаниями температуры воздуха, дефицитом кормовых ресурсов) и природном заповеднике Хубсугул (Монголия, озеро Хубсугул с участками хвойной тайги).

3.3. Генетическая дифференциация животных, воспроизводящихся в разных эколого-географических условиях

Выполнен сравнительный анализ генетических структур групп животных монгольских местных пород 4-х видов, воспроизводящихся в условиях зоны рискованного животноводства Южного Гоби и в условиях биосферного заповедника Хубсугул, с использованием ISSR-PCR маркеров (табл.6).

Таблица 6

Параметры спектров продуктов амплификации исследованных групп животных, полученных при использовании праймера (AG)9C

Диапазон длин локусов, п.н.	Яки		Крупный рогатый скот		Овцы		Козы
	Гоби	Хубсугул	Гоби	Хубсугул	Гоби	Хубсугул	Гоби	Хубсугул
2500 – 1200	1	0	1	2	2	1	0	2
	3	2	3	3	2	3	3	4
1200 – 600	1	1	2	2	1	2	0	0
	4	4	6	5	6	5	6	5
600 – 180	2	4	2	5	10	4	2	3
	9	10	9	8	14	8	9	10
PIC	0,039	0,040	0,035	0,067	0,118	0,071	0,018	0,038

Примечание. Верхнее число указывает количество полиморфных фрагментов, нижнее – общее количество фрагментов

В спектрах продуктов амплификации праймера (AG)9C у исследованных групп яков, крупного рогатого скота, овец и коз суммарно выявлено 38 локусов (табл. 6). Обращает на себя внимание небольшое количество полиморфных локусов в целом, а также большая доля «легких» ампликонов у всех исследованных видов.

На дендрограмме, построенной по генетическим расстояниям М. Нея, рассчитанным по ISSR-PCR маркерам (рис.6), яки образуют общий кластер с крупным рогатым скотом, другой относительно автономный кластер образуют группы овец и коз. Это соответствует межвидовым эволюционным взаимоотношениям и согласуется с принадлежностью яков и крупного рогатого скота к одному роду Bos (быки), домашней овцы (род Ovis) и домашней козы (род Capra) – к общему подсемейству Caprinae.

Рис. 6. Дендрограмма генетических взаимоотношений между группами животных, воспроизводящихся в зоне рискованного животноводства (Южное Гоби) и биосферном заповеднике Хубсугул.

Для дополнительной оценки внутрипородной дифференциации под влиянием разных эколого-географических условий нами выполнен (Т.Т. Глазко с соавт., 2012) сравнительный анализ этих же групп животных с использованием микроядерного теста (подсчет частот встречаемости эритроцитов с микроядрами в мазках периферической крови). Оказалось, что у всех видов в группах животных в зоне рискованного животноводства (Южное Гоби), этот показатель статистически достоверно (P<0,05) ниже, чем у животных того же вида, воспроизводящихся в более благоприятных условиях. Результаты микроядерного теста свидетельствуют о том, что исследованные группы животных дифференцируются не только по ISSR-PCR маркерам, но и по частотам цитогенетических аномалий – показателям геномной нестабильности. Можно ожидать, что в условиях зоны рискованного животноводства (Южного Гоби) воспроизводится только часть исходного генофонда, носители которого отличаются относительно повышенной стабильностью генетического аппарата.

3.4. Оценка возможных источников полиморфизма ISSR-PCR маркеров

Выполненные нами исследования свидетельствуют о высоком полиморфизме ISSR-PCR маркеров и зависимости получаемых спектров фрагментов ДНК от нуклеотидной последовательности микросателлита, используемой в качестве праймера. Наиболее наглядно отличия обнаруживались у крупного рогатого скота и овец по спектрам ампликонов праймеров (AG)9C и (GA)9C (табл. 1, 2). В целях выяснения возможных источников наблюдаемых отличий нами выполнен поиск гомологии к прямым и инвертированным повторам каждого праймера на основе секвенированных последовательностей геномов крупного рогатого скота, овец, представленных в GenBank, с использованием компьютерной программы BLASTn (100% совпадений). Для (AG)9 выявлено 22 участка гомологии, в основном в группе генов II класса комплекса гистосовместимости, для пары (GA)9-(TC)9 участков гомологии не обнаружено. Большинство совпадений для праймера (AG)9C локализовалось в генах иммунной системы. По литературным данным известно, что GA микросателлиты являются мишенью связывания белков фолдинга хроматина (GAF, CTCF), что может приводить в итоге к относительно повышенному консерватизму таких последовательностей. То есть, отличия в спектрах ISSR-PCR маркеров могут быть обусловлены особенностями геномной локализации микросателлитов, используемых в качестве праймеров.

В целях выяснения нуклеотидных последовательностей, фланкированных инвертированным повтором (AG)9C, нами выполнено выделение, клонирование и секвенирование фрагментов ДНК, содержавшихся в отдельном сегменте агарозного геля, в котором выполнялось электрофоретическое разделение ампликонов спектра (AG)9C генома домашней лошади. Среди секвенированных фрагментов ДНК, выделенных из этого сегмента, присутствовал участок, длиной в 416 нуклеотидов. Далее были подобраны лидирующий и терминирующий праймеры, включавшие фланговую последовательность (АG)9C, 6 и 8 нуклеотидов из прилегающих к инвертированным флангам секвенированного фрагмента лошади соответственно. В полимеразной цепной реакции с использованием этих праймеров обнаруживался только один продукт амплификации и только у жеребцов (рис.7), что позволило нам прийти к заключению о его локализации в хромосоме Y.

Поскольку в GenBank содержится информация о первичной последовательности ДНК только кобылы, в нем не удалось найти гомологичных участков к секвенированному нами фрагменту длиной в 416 п.н. Однако этот фрагмент содержит последовательность длиной около 250 нуклеотидов, которая (в отличие от целого фрагмента) в геноме домашней лошади встречается с высокой частотой, причем в каждой хромосоме количество участков гомологии к ней статистически достоверно коррелирует (r=0,93; P<0,001) с ее длиной.

Высокая частота встречаемости в хромосомах домашней лошади позволяет полагать локализацию фрагмента длиной в 250 п.н. в составе диспергированного повтора. Для его выявления в секвенированном фрагменте ДНК длиной в 416 п.н. с помощью программ Censor и RepeatMasker выполнен поиск повторов. В результате обнаружены три участка с высокой гомологией к фрагментам различных мобильных генетических элементов: один к фрагменту ДНК транспозона Danio rerio (Bao, Jurka, 2008), второй к консенсусу длинного терминального повтора ретровирус-подобного элемента млекопитающих, ERV3 (MLT1G2, Smit, 1993). Третий фрагмент со степенью дивергенции в 4~11% совпадал с лидирующим участком эндогенного ретровируса ERV1 лошади (Jurka, 2008).

Полученные данные свидетельствуют о том, что один из механизмов возникновения видоспецифичных фрагментов ДНК, фланкированных инвертированными повторами микросателлитов, может быть связан с геномным расселением мобильных генетических элементов. Разнообразие по геномной локализации микросателлитных локусов, их возможные ассоциации с мобильными генетическими элементами могут быть источниками отличий в полиморфизмах спектров продуктов амплификации ISSR-PCR маркеров, получаемых с использованием в качестве праймеров микросателлитов с разными коровыми мотивами и «якорями».

3.5. Заключение

Выполнено геномное сканирование пород и внутрипородных групп сельскохозяйственных животных (крупный рогатый скот, овцы, лошади) с использованием ISSR-PCR (в среднем около 40 локусов на группу животных). Выявлена видовая и породная специфичность присутствия, а также консервативности и полиморфизма отдельных участков ДНК определенной длины, фланкированных инвертированными повторами микросателлитов. Дендрограммы, построенные по генетическим расстояниям М. Нея, рассчитанным суммарно по всем выявленным ISSR-PCR маркерам, соответствовали генетической дифференциации между исследованными группами животных, поскольку совпадали с известной историей расхождения видов, формирования пород, помесей. При сравнительном анализе спектров ISSR-PCR маркеров обнаружены отличия в сложности спектров (количестве продуктов амплификации) и их полиморфизме. Такие отличия в спектрах, в частности, праймеров (AG)9C и (GA)9C у крупного рогатого скота и овец, могут быть обусловлены особенностями геномной локализации микросателлитов: присутствием AG повторов в высокополиморфных генах иммунной системы, GA последовательностей – в консенсусах ДНК-связывающих белков. Выраженных отличий между спектрами праймеров, основанных на динуклеотидных микросателлитных мотивах, и основанных на тринуклеотидных мотивах не выявлено. Результаты секвенирования свидетельствуют о том, что одним из механизмов формирования полиморфных ISSR-PCR маркеров могут быть процессы рекомбинаций между мобильными генетическими элементами и ассоциированными с ними микросателлитами.

4. ВЫВОДЫ

1. Сравнительный анализ геномной ДНК ряда пород крупного рогатого скота, овец и лошадей по полилокусным спектрам ISSR-PCR маркеров с использованием в качестве праймеров фрагментов микросателлитных локусов (AG)9C, (GA)9C, (GAG)6C, (СТС)6С свидетельствует о видо- и породоспецифичных особенностях сочетаний фрагментов ДНК разной длины, фланкированных инвертированными повторами микросателлитов.
2. Доли полиморфных локусов, индекс полиморфного информационного содержания (PIC) спектров ISSR-PCR маркеров зависят от нуклеотидной последовательности микросателлита, используемого в качестве праймера, а не от длины его элементарного повтора. Так, у исследованных групп животных отличия в показателях полиморфизма спектров ампликонов праймеров (GA)9C, и (AG)9C, (СТС)6С и (GAG)6C были не меньше, чем в общем между спектрами ди- и тринуклеотидных праймеров.
3. Доля полиморфных локусов и значения PIC по спектрам всех праймеров были близкими у всех исследованных животных: у пород крупного рогатого скота от 0 до 97% и от 0 до 0,300 соответственно; у пород овец от 69% до 100% и от 0,071 до 0,399 соответственно; у пород лошадей от 43% до 92% и от 0,059 до 0,366 соответственно. В то же время, наблюдались видовые отличия вклада в полиморфизм спектров ISSR-PCR, полученных с разными праймерами. Так, у крупного рогатого скота и овец одним из наиболее полиморфных был спектр праймера (CTC)6C, наименее – праймера (GA)9C; у лошадей наиболее полиморфными были спектры праймера (GAG)6C.
4. Выявлены ампликоны и их сочетания, присутствие которых типично для одной исследованной группы животных, представляющих определенную породу (крупного рогатого скота, овец, лошадей), и отличает их генофонды от животных других пород (например, фрагмент ДНК длиной в 370 п.н. у красной эстонской породы, фрагмент длиной в 410 п.н. у черно-пестрой в спектрах ампликонов праймера (AG)9С). Обнаруженное нами соответствие взаимоотношений между генофондами пород, оцененное на основании дендрогамм, известной истории происхождения пород, позволяет проводить поиск молекулярно-генетических маркеров «генофондного стандарта» исследованных пород с использованием полученных нами данных.
5. Сравнительный анализ ISSR-PCR маркеров у овец свидетельствует о возможности их использования для выявления генофондной дифференциации не только пород, но и внутрипородных типов, таких как бирликский и суюндукский внутрипородные типы эдильбаевской овцы.
6. Кластеризация групп трех пород рысаков и двух групп лошадей алтайской породы на дендрограммах полностью совпала с историей их формирования, что свидетельствует об эффективности использования полученных нами полилокусных спектров ISSR-PCR маркеров для реконструкции происхождения в различных по численности группах животных.
7. Результаты поиска последовательностей, гомологичных к праймерам (GA)9C, и (AG)9C, в секвенированных последовательностях геномов крупного рогатого скота и овец свидетельствуют о том, что различия в полиморфизме в спектрах ампликонов этих праймеров частично обусловлены их локализацией в определенных геномных районах: праймера (AG)9C в интронах генов II класса главного комплекса гистосовместимости, а (GA)9С – в участках связывания белков, ответственных за упаковку хроматина (GAF, CTCF).
8. Секвенирование фрагментов ДНК из спектра продуктов амплификации лошади с использованием праймера (AG)9C позволило обнаружить ДНК фрагмент длиной в 416 п.н., участок которого длиной около 250 п.н. в большом количестве включений присутствует во всех секвенированных последовательностях хромосом лошади. Число локализаций гомологичных фрагментов коррелировало с длиной хромосом лошади (r=0,93, P<0,001). Этот фрагмент имел высокую степень гомологии с лидирующим участком эндогенного ретровируса ERV1 лошади. Подбор праймеров по флангам секвенированного продукта длиной в 416 п.н. с последующей его амплификацией указывает на его локализацию в хромосоме Y исследованных лошадей. Полученные данные свидетельствуют о том, что одним из механизмов формирования полиморфных ISSR-PCR маркеров являются рекомбинации между мобильными генетическими элементами.

Предложения производству

Научным учреждениям при использовании ISSR-PCR в целях геномного сканирования рекомендуется проводить предварительное изучение параметров получаемых спектров продуктов амплификации геномной ДНК. При анализе генофондов крупного рогатого скота и овец рекомендуется использовать в качестве праймеров последовательности (CTC)6C и (AG)9C; генетической структуры лошадей – последовательность (GAG)6C.

Научным учреждениям, принимающим участие в племенной работе, предлагается использовать метод ISSR-PCR наравне с другими методами полилокусного генотипирования ввиду представленных в данной работе возможностей адекватно оценивать генетическую дифференциацию даже небольших групп животных, связанную как с особенностями их происхождения, так и влиянием факторов окружающей среды.

Список работ, опубликованных по материалам диссертации

Статьи в журналах, рекомендованных ВАК Российской Федерации.

1. Глазко, В.И. Распределение фрагментов ДНК, фланкированных инвертированными повторами ди- и тринуклеотидных микросателлитов, в геномах серого украинского скота / В.И. Глазко, Ю.А. Столповский, А.В. Феофилов, Н.В. Кол // Известия Тимирязевской сельскохозяйственной академии. – 2009. – №1. – С.155-162.
2. Феофилов, А.В. Структурно-функциональная организация и полиморфизм AG, GA повторов (ISSR-PCR) в геноме крупного рогатого скота / А.В. Феофилов, В.И. Глазко // Известия Тимирязевской сельскохозяйственной академии. – 2010. – №4. – С.104-108.
3. Ельсукова, И.А. Генетическая дифференциация суюндукского и бирликского внутрипородных типов эдильбаевской породы овец / И.А. Ельсукова,
   А.В. Феофилов, Ю.А. Юлдашбаев, В.И. Глазко // Известия Тимирязевской сельскохозяйственной академии. – 2010. – № 6. – С. 84-89.
4. Глазко, В.И. Структурно-функциональные особенности микросателли-тов в геномах крупного рогатого скота и овец / В.И. Глазко, А.В. Феофилов, Ю.А. Столповский, Т.Т. Глазко // Доклады Российской академии сельскохозяйственных наук. – 2011. – № 1. – С. 41-44.
5. Феофилов, А.В. Дифференциация генофондов пород лошадей мясного и спортивного направлений / А.В. Феофилов, Н.В. Бардуков, В.И. Глазко // Генетика. – 2011. – Т. 47. – № 9. – С. 1230-1235.
6. Глазко, В.И. Видоспецифичные ISSR-PCR маркеры и пути их формирования / В.И. Глазко, А.В. Феофилов, Н.В. Бардуков, Т.Т. Глазко // Известия Тимирязевской сельскохозяйственной академии. – 2012. – № 1. – С. 118-125.
7. Глазко, Т.Т. Внутрипородная генетическая дифференциация местных пород монгольского крупного и мелкого рогатого скота в разных эколого-географических условиях разведения / Т.Т. Глазко, Е.Е. Астафьева, А.В. Феофилов и др. // Доклады Российской академии сельскохозяйственных наук. – 2012. – № 2. – С. 36-39.
8. Glazko, V.I. Polymorphism of ISSR and IRAP Markers in Genomes of Musk-Oxen (Ovibos Moschatus) and Horse (Equus Caballus) of Altaic Breed / V.I. Glazko, N.V. Bardukov, A.V. Pheophilov et al. // Izvestiya of Timiryazev Academy. – 2012. – Special Issue – P. 16-26.
9. Глазко, В.И. Информационная оценка полиморфизма по ISSR и IRAP-маркерам у различных видов животных, находящихся под действием искус-ственного и естественного отбора / В.И. Глазко, Т.П. Сипко, А.В. Феофилов и др. // Информационные и телекоммуникационные технологии. – 2012. – №16. – С. 100-108.

Статьи в других изданиях.

10. Феофилов, А.В. Полиморфизм "анонимных" фрагментов ДНК и позиционирование инвертированных повторов в секвенированных последовательностях генома овцы / А.В. Феофилов // материалы докл. XVI Междунар. конф. студентов, аспирантов и молодых ученых «Ломоносов» / Отв. ред. И.А. Алешковский, П.Н. Костылев, А.И. Андреев.]. – М.: МАКС Пресс, 2009. – [Адрес ресурса в сети интернет: http://lomonosov-msu.ru/archive/Lomonosov_2009/]. – Секция «Биоинженерия и биоинформатика». Подсекция «биоинформатика». – C. 27.
11. Pheophilov, A.V. Polymorphism of ISSR-PCR markers and positioning of reverse repeats of microsatellites in sequences of Bovidae family / A.V. Pheophilov, V.I. Glazko // Proceedings of the International Moscow Conference on Computational Molecular Biology, 2009. – Moscow. – P. 292-293.
12. Феофилов, А.В. Полиморфизм ISSR-PCR-маркеров и позиционирование инвертированных повторов в геномах овец и крупного рогатого скота / А.В. Феофилов, В.И. Глазко // Стратегия развития зоотехнической науки: тез. докл. междунар. науч.-практической конф., посвящ. 60-летию зоотехнической науки Беларуси (22-23 октября 2009 г.). – Науч.-практический центр Нац. Акад. Наук Беларуси по животноводству, 2009. Жодино. – С. 160-161.
13. Феофилов, А.В. Закономерности полиморфизма ISSR-PCR маркеров в геномах крупного рогатого скота и овец / А.В. Феофилов // Материалы Междунар. молодежного науч. форума «ЛОМОНОСОВ-2010». / Отв. ред. И.А. Алешковский, П.Н. Костылев, А.И. Андреев, А.В. Андриянов. [Электронный ресурс] – М.: МАКС Пресс, 2010. [Адрес ресурса в сети интернет: http://lomonosov-msu.ru/archive/Lomonosov_2010/]. – Секция «Биоинженерия и биоинформатика». Подсекция «Биоинформатика».
14. Pheophilov, A.V. Polymorphism of Invert Microsatellite Repeats (ISSR-PCR) and Their Relation with the Mechanisms of Gene Transcription Regulation / A.V. Pheophilov, V.I. Glazko // Proceedings of the Seventh International Conference on Bioinformatics of Genome Regulation and Structure \ Systems Biology, 2010. – Novosibirsk. – P. 225.
15. Pheophilov, A.V. Inverted repeats and their role in nuclear mechanisms / A.V. Pheophilov, V.I. Glazko // Book of Abstract of the XXIVth Genetic Days 2010. – Mendel University in Brno. – 2010. – P. 8.
16. Бардуков, Н.В. Подбор ДНК маркеров для оценки генетической структуры группы лошадей рысистых пород / Н.В. Бардуков, Г.К. Коновалова, А.В. Феофилов, В.И. Глазко // Териофауна России и сопредельных территорий. Между-народное совещание (IX Съезд Териологического общества при РАН, Москва, 1-4 февраля 2011 г.). – М.: Товарищество научных изданий КМК. – 2011. – С. 41
17. Феофилов, А.В. Генетическая структура эдильбаевской овцы и снежного барана по ISSR-PCR маркерам / А.В. Феофилов, И.А. Ельсукова, Ю.А. Юлдашбаев и др. // Териофауна России и сопредельных территорий. Международное совещание (IX Съезд Териологического общества при РАН, Москва, 1-4 февраля 2011 г.). – М.: Товарищество научных изданий КМК. – 2011. – С. 499.
18. Феофилов, А.В. Использование ISSR-PCR маркеров для выяснения особенностей генофондов некоторых сельскохозяйственных и диких видов животных / А.В. Феофилов // Материалы VI Московского междунар. конгресса, ч. 1 (Москва, 21-25 марта, 2011 г.). – М.: ЗАО «Экспо-биохим-технологии», РХТУ имени Д.И. Менделеева. – 2011. – С. 431-432.
19. Феофилов, А.В. Генотипирование пород крупного рогатого скота и овец с помощью ISSR-PCR / А.В. Феофилов // Материалы Международного молодежного научного форума «ЛОМОНОСОВ-2011» Секция «Биология» / Отв. ред. А.И. Андреев, А.В. Андриянов, Е.А. Антипов, М.В. Чистякова. [Электронный ресурс] – М.: МАКС Пресс. – 2011. – С. 99.
20. Pheophilov, A.V. Inverted Repeats in Surveyed and Sequenced Cattle and Sheep / A.V. Pheophilov // Proceedings of the International Moscow Conference on Computational Molecular Biology, 2011. – Moscow. – P. 283-284.
21. Pheophilov, A.V. Recombination of Mobile Genetic Elements as Possible Source of New ISSR-PCR Markers / A.V. Pheophilov, V.I. Glazko // The Eighth International Conference on Bioinformatics of Genome Regulation and Structure \ Systems Biology: Abstracts, 2012. – Novosibirsk. – P. 240.