Фосфатаза ppz1p и эффективность нонсенс-супрессии у дрожжей saccharomyces cerevisiae
САНКТ-ПЕТЕРБУРГСКИЙ ГОСУДАРСТВЕННЫЙ УНИВЕРСИТЕТ
На правах рукописи
Иванов Максим Сергеевич
ФОСФАТАЗА PPZ1P И ЭФФЕКТИВНОСТЬ НОНСЕНС-СУПРЕССИИ
У ДРОЖЖЕЙ SACCHAROMYCES CEREVISIAE
Специальность 03.00.15- генетика
АВТОРЕФЕРАТ
диссертации на соискание ученой степени
кандидата биологических наук
Санкт-Петербург
2009
Работа выполнена в лаборатории физиологической генетики кафедры генетики и селекции Санкт-Петербургского государственного университета.
Научный руководитель: профессор, доктор биологических наук
Людмила Николаевна Миронова
Официальные оппоненты: профессор, доктор биологических наук
Михаил Давидович Тер-Аванесян
кандидат биологических наук
Ольга Всеволодовна Невзглядова
Ведущее учреждение: Всероссийский научно-исследовательский
институт сельскохозяйственной
микробиологии РАСХН
Защита диссертации состоится "___" _______ 2009 г. в ___ часов на заседании совета Д.212.232.12 по защите докторских и кандидатских диссертаций при Санкт-Петербургском государственном университете по адресу: 199034, Санкт-Петербург, Университетская наб. 7/9, биолого-почвенный факультет, кафедра генетики и селекции, аудитория 1.
С диссертацией можно ознакомиться в центральной научной библиотеке им. М. Горького Санкт-Петербургского Государственного университета
Автореферат разослан "___" ______ 2009 г.
Ученый секретарь
Диссертационного совета Д.212.232.12
кандидат биологических наук Л. А. Мамон
ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ
Актуальность темы. Считывание триплетов мРНК аппаратом белкового синтеза в соответствии с генетическим кодом – основополагающее свойство живой клетки, обеспечивающее ее стабильное функционирование. Как и другие матричные процессы, трансляция характеризуется некоторым уровнем неточного считывания, в результате которого может происходить переосмысление значащих триплетов, считывание стоп-кодонов как значащих, сдвиг рамки считывания. В соответствии с принципом поливариантности матричных процессов, способность к прочтению одного и того же триплета более чем одним способом является неотъемлемым свойством белок-синтезирующей системы клетки (Инге-Вечтомов, 1969).
Наиболее простой моделью для изучения генетического контроля точности трансляции является изучение супрессии нонсенс-мутаций, приводящих к появлению преждевременного стоп-кодона в открытой рамке считывания. Такие изменения в точности трансляции могут быть обнаружены на фенотипическом уровне, так как считывание стоп-кодонов как значащих восстанавливает синтез полноразмерного белка, прерванный нонсенс-мутацией. Увеличение или уменьшение эффективности нонсенс-супрессии у дрожжей-сахаромицетов может быть вызвано факторами как генетической, так и эпигенетической природы. Большинство мутаций, влияющих на эффективность нонсенс-супрессии, изолированы в генах, кодирующих тРНК, рРНК, белки рибосомы, факторы элонгации и терминации трансляции (см. Valente a. Kinzy, 2003). Хорошо изученным примером эпигенетического фактора, приводящего к усилению нонсенс-супрессии, является дрожжевой прион [PSI+] - продукт прионного превращения фактора терминации eRF3 (Sup35p) (Cox, 1965; Wickner et al., 1995).
Многие белки, прямо или косвенно участвующие в трансляции, являются фосфобелками, и их функциональная активность регулируется специфическими киназами и фосфатазами. Для некоторых из этих белков показано, что уровень их фосфорилированности оказывает влияние на процесс трансляции. Например, фосфорилирование -субъединицы фактора инициации трансляции IF-2 киназой Gcn2p снижает эффективность инициации трансляции в ответ на некоторые стрессовые условия (Hinnebusch, 1993). Фосфорилирование белков Р0, Р1 и Р2, входящих в состав "стебля" рибосомы, оказывает влияние на трансляцию некоторых мРНК (Zambrano et al., 1997). Фосфорилирование белка Upf2p оказывает влияние на функционирование системы нонсенс-зависимой деградации мРНК (Wang et al., 2006). Таким образом, изменение уровня экспрессии определенных киназ и фосфатаз может влиять на работу аппарата трансляции.
Действительно, показано, что в генетический контроль трансляции у дрожжей вовлечены гомологичные фосфатазы Ppz1p и Ppq1p. Делеция гена PPQ1 приводит к аллосупрессии, а сверхэкспрессия - к антисупрессии на фоне различных нонсенс-супрессорных факторов (Vincent et al., 1994). Делеция гена PPZ1 приводит к увеличению частоты считывания стоп-кодонов как значащих в 3-4 раза (de Nadal et al., 2001). Роль фосфатазы PPZ1 в регуляции эффективности нонсенс-супрессии была также подтверждена в нашей лаборатории в ходе исследования антисупрессорного прионоподобного детерминанта [ISP+]. Было показано, что изменение уровня экспрессии гена PPZ1 (а также гена HAL3, кодирующего негативную регуляторную субъединицу Ppz1p) влияет на проявление детерминанта [ISP+] (Aksenova et al., 2007). Кроме того, было показано, что сверхэкспрессия и делеция генов HAL3 и PPZ1 влияют на эффективность нонсенс-супрессии и в [isp-] штаммах. Эти данные подтверждают участие белкового комплекса Hal3/Ppz1p в контроле считывания стоп-кодонов.
Однако механизмы влияния этой и других фосфатаз на считывание стоп-кодонов в настоящее время практически не изучены. В частности, неизвестны белки-мишени фосфатазной активности Ppz1p и Ppq1p, участвующие в трансляции.
В связи с этим целью исследования явилось изучение связи между фосфатазой Ppz1p и эффективностью нонсенс-супрессии у дрожжей Saccharomyces cerevisiae.
В ходе работы решались следующие задачи: (1) изучение влияния фосфатазы Ppz1p на проявление нонсенс-супрессорных мутаций в генах sup35 и sup45; (2) изучение влияния фосфатазы Ppz1p и ее регуляторной субъединицы Hal3p на проявление фактора [PSI+]; (3) выяснение роли гомологичной фосфатазы Ppz2p в генетическом контроле считывания стоп-кодонов; (4) поиск белков-мишеней фосфатазы Ppz1p, опосредующих влияние этой фосфатазы на считывание стоп-кодонов.
Научная новизна исследования. Получены дополнительные данные, проливающие свет на механизмы влияния фосфатазы Ppz1p на эффективность нонсенс-супрессии у дрожжей-сахаромицетов. Показана зависимость проявления некоторых нонсенс-супрессорных мутаций в генах sup35 и sup45, а также дрожжевого приона [PSI+] от уровня экспрессии гена PPZ1. Также мы показали, что проявление фактора [PSI+] зависит и от уровня экспрессии гена PPZ2, кодирующего фосфатазу Ppz2p. При этом влияние гена HAL3 на проявление фактора [PSI+] обусловлено ингибированием фосфатазной активности как Ppz1p, так и Ppz2p. Получены данные, свидетельствующие о том, что дефосфорилирование фактора элонгации EF1B (Tef5p) фосфатазой Ppz1p играет минорную роль в проявлении антисупрессорного эффекта сверхэкспрессии PPZ1. В соответствии с этими данными высказана гипотеза о том, что влияние Ppz1p на эффективность нонсенс-супрессии опосредовано дефосфорилированием как минимум двух фосфобелков, участвующих в трансляции - EF1B и какого-то другого белка, в настоящее время остающегося неизвестным. В связи с этим были проверены предположения о возможной роли ряда фосфобелков, связанных с трансляцией, в проявлении антисупрессорного эффекта сверхэкспрессии PPZ1: (1) фактора терминации eRF1 (Sup45p); (2) белков Upf1p и Upf2p, участвующих в нонсенс-зависимой деградации мРНК; (3) белка Sla1p; и (4) шаперонов Ssb1p и Ssb2p. Показано, что эти белки не являются мишенами фосфатазной активности Ppz1p. Тем не менее, показано, что двойная делеция генов SSB1 и SSB2 блокирует аллосупрессорный эффект сверхэкспрессии мутантной аллели ppz1-R451L, кодирующей каталитически неактивный белок Ppz1p. На основании этих данных высказано предположение о том, что фосфатаза Ppz1p может оказывать влияние на функционирование аппарата трансляции за счет взаимодействия с шаперонами Ssb1p и Ssb2p, причем это взаимодействие на связано с фосфатазной активностью Ppz1p.
Практическая ценность. В настоящее время известно значительное количество наследственных заболеваний человека, обусловленных нарушениями в работе трансляционного аппарата клетки (синдром Уолкотта-Раллисона, лейкоэнцефалопатия, хроническая миелоидная лейкемия и др.) (см. Calkhoven et al., 2002). Кроме того, показано, что дерегуляция экспрессии факторов инициации трансляции играет важную роль в процессе онкотрансформации клетки (см. Stoneley a. Willis, 2003). Поэтому изучение механизмов регуляции точности трансляции может способствовать разработке методов лечения этих заболеваний, связанных с нарушениями трансляции.
Апробация работы. Результаты работы были представлены на 3-ей Международной конференции молодых ученых (Одесса, Украина 2007), на конференции EuroPhosphatases 2007 (Авейро, Португалия 2007), на 12-ом Международном конгрессе по дрожжам (Киев, Украина 2008) и на конференции по трансляционному контролю (Колд Спринг Харбор, США 2008).
Публикации. По теме диссертации опубликовано 6 работ.
Структура и объем работы. Работа изложена на 152 страницах и состоит из следующих разделов: введение, обзор литературы, материалы и методы, результаты и обсуждение, заключение, выводы, список литературы (210 наименований). Работа содержит 7 таблиц и 30 рисунков.
МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ
Штаммы. Генотипы штаммов дрожжей, использованных в работе, приведены в таблице 1.
Таблица 1. Штаммы, использованные в работе
| Название | Генотип | Происхождение |
| 1А-Д1628 | MAT ade1-14 his3 lys2 ura3-52 trp1-289 leu2-3,112 SUP45::HIS3 [pRS316-SUP45] | Moskalenko et al., 2003 |
| 21А-Д863 | MAT ade 1-14 his7-1 lys2-90 ura3-52 trp1-289 leu2-3,112 SUP35::TRP1 [pFL38S] | Задорский и др., 2003 |
| 5V-H19 | MAT ade 1-14 his7-1 lys2-90 ura3-52 trp1-289 leu2-3,112 SUP35::TRP1 [pFL38S] | Ter-Avanesyan et al., 1994 |
| 22V-H63 | MATa ade2-1 kar1 lys1 his3 ura3 leu2 cyhR SUQ5 SUP35::TRP1 [pRS316-SUP35] | Shkundina et al., 2006 |
Плазмиды. Плазмиды pRS315-TEF5 и pRS315-TEF5-S86A получены при клонировании ПЦР-продуктов, содержащих аллель дикого типа TEF5 либо мутантную аллель tef5-T622C, в вектор pRS315 по сайту рестрикции BamHI. Центромерные плазмиды, несущие мутантные аллели sup45 и sup35, описаны ранее (Moskalenko et al., 2003; Москаленко и др., 2004; Volkov et al., 2002; Chabelskaya et al., 2004). Использованные мутации sup35 и sup45 приведены в таблице 2. Также в работе использовали мультикопийную плазмиду YEplac195 (Gietz a. Sugino, 1988) и ее производные YEplac195-HAL3, YEplac195-PPZ1 и YEplac195-PPZ1-R451L (Clotet et al., 1996). Центромерные плазмиды pDB902 и pDB858, несущие мутантные аллели sup45-S421/432A и sup45-S421/432D, а также исходный вектор pDB800 описаны ранее (Kallmeyer et al., 2006). Для получения делеций генов использовали плазмиды pFA6 (Wach et al., 1994) и pAG32 (Goldstein a. McCusker, 1999).
Таблица 2. Мутации sup45 и sup35, использованные в работе
| sup45-101 | 796GT (UAA) | Moskalenko et al., 2003 |
| sup45-103 | 62TC (21LeuSer) | Москаленко и др., 2004 |
| sup45-104 | 848TA (UAA) | Moskalenko et al., 2003 |
| sup45-105 | 1153GT (UAA) | Moskalenko et al., 2003 |
| sup45-107 | 950TG (UGA) | Moskalenko et al., 2003 |
| sup45-111 | 193CT (65ArgCys) | Москаленко и др., 2004 |
| sup45-115 | 206CT (70SerPhe) | Москаленко и др., 2004 |
| sup45-116 | 185GC (62ArgThr) | Москаленко и др., 2004 |
| sup35-10 | 1083GA (363AspAsn) | Volkov et al., 2002 |
| sup35-25 | 1113CT (378ThrIle) | Volkov et al., 2002 |
| sup35-203 | 214CT (UAG) | Chabelskaya et al., 2004 |
| sup35-218 | 541GT (UAA) | Chabelskaya et al., 2004 |
| sup35-240 | 166CT (UAA) | Chabelskaya et al., 2004 |
| sup35-244 | 586GT (UAG) | Chabelskaya et al., 2004 |
| sup35-260 | 724CT (UAG) | Chabelskaya et al., 2004 |
Методы. Использовали стандартные методы генетики дрожжей (Захаров и др., 1984; Sherman et al., 1986) и стандартные среды: YAPD, полную синтетическую среду SMM, а также селективные среды, не содержащие отдельных компонентов среды SMM. Кроме того, использовали среды на основе YAPD, содержащие гигромицин Б (HygB) либо генетицин (G418), а также среду на основе SMM, содержащую 5-фтороротовую кислоту.
Качественную оценку эффективности нонсенс-супрессии осуществляли визуально по росту штаммов на средах SMM-Ade (в случае супрессии ade1-14 и ade2-1), SMM-His (his7-1) и SMM-Trp (trp1-289). Для этого производили упорядоченный посев суспензии дрожжевых клеток (в серии последовательных разведений в 3 раза) на соответствующую селективную среду (см. Hampsey, 1997). Использование последовательных разведений повышало разрешающую способность метода и позволяло регистрировать даже незначительные отличия в эффективности нонсенс-супрессии.
ПЦР, рестрикционный анализ, выделение геномной и плазмидной ДНК, трансформацию дрожжей и E.coli, гель-электрофорез ДНК, иммуноблоттинг проводили в соответствии со стандартными методиками (Sambrook et al., 1989; Kaiser et al., 1994; Gietz et al., 1992; Inoue et al., 1990). Электрофорез белков в полиакриламидном геле (SDS-PAGE) осуществляли по модифицированной методике (Kushnirov et al., 2006). Получение мутантной аллели tef5-T622C проводили методом Overlap Extension PCR (Pont-Kingdon, 2003). Делеции генов TEF5, SUP45, SLA1, SSB1, SSB2, UPF1, UPF2, HAL3, PPZ1 и PPZ2 были получены с помощью сайт-направленного мутагенеза с использованием олигонуклеотидов (Wach et al., 1994; Goldstein a. McCusker, 1999).
РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ
1. Сверхпродукция Ppz1p влияет на проявление некоторых мутаций в генах sup35 и sup45, а также дрожжевого приона [PSI+].
Мутации в генах SUP35 и SUP45, кодирующих факторы терминации трансляции eRF3 и eRF1, соответственно, приводят к нарушению точности трансляции; в их присутствии повышается уровень считывания стоп-кодонов как значащих. Эпигенетический фактор [PSI+] представляет собой продукт прионного превращения Sup35p; в его присутствии уменьшается доля мономеров Sup35p, участвующих в терминации трансляции, что также приводит к увеличению эффективности нонсенс-супрессии.
Ранее влияние сверхэкспрессии гена PPZ1 на уровень нонсенс-супрессии было показано в штамме, несущем нонсенс-мутацию sup35-25, а также криптическую мутацию sup45-400 (Aksenova et al., 2007). Поэтому было необходимо выяснить, являются ли эффекты PPZ1 специфичными по отношению к этим мутациям, или они могут проявляться и на фоне других нонсенс-супрессорных факторов.
В первую очередь мы проанализировали влияние сверхэкспрессии PPZ1 на проявление 8-ми различных мутаций в гене SUP45 в отсутствие мутаций sup35. Использованные мутантные аллели sup45 различаются по молекулярной природе (среди них есть как миссенс-, так и нонсенс-мутации) (см. таблицу 2), а также по эффективности нонсенс-супрессии (рисунок 1).
У штамма 1А-Д1628, несущего делецию хромосомной копии гена SUP45 и плазмиду с геном SUP45, методом плазмидного шафлинга заменяли эту компенсирующую плазмиду на плазмиды, содержащие мутантные аллели sup45. Далее этих трансформантов дополнительно трансформировали плазмидами YEplac195-PPZ1 и YEplac195-PPZ1-R451L, несущими аллель дикого типа PPZ1 и мутантную аллель ppz1-R451L, а также контрольной плазмидой YEplac195. Мутация ppz1-R451L полностью блокирует каталитическую активность Ppz1p (de Nadal et al., 2001).
| Рисунок 1. Производные штамма 1А-Д1628, несущие различные мутации sup45 на плазмиде, различаются по эффективности нонсенс-супрессии. Символом wt обозначена аллель дикого типа SUP45, номерами 101 - 116 обозначены мутации sup45-101 - sup45-116. На этом и последующих рисунках символом SMM обозначена синтетическая питательная среда, обеспечивающая рост используемого штамма и поддержание плазмид, SMM-Ade - среда на основе SMM, не содержащая аденина, SMM-Trp - не содержащая триптофана. |
Мы обнаружили, что сверхэкспрессия PPZ1 ослабляет супрессорный эффект пяти из восьми проанализированных мутаций (sup45-101, -104, -111, -115 и -116). В то же время сверхэкспрессия ppz1-R451L усиливает супрессорный эффект этих пяти мутаций. В то же время сверхэкспрессия PPZ1 и ppz1-R451L существенно (по крайней мере, в пределах разрешающей способности метода) не изменяет проявление трех других мутаций (sup45-103, -105 и -107) (рисунок 2). Таким образом, проявление мутаций sup45 может зависеть от уровня экспрессии фосфатазы Ppz1p.
| Рисунок 2. Антисупрессорный эффект PPZ1 и аллосупрессорный эфффект ppz1-R451L проявляются на фоне sup45-116 (А), но не на фоне sup45-105 (Б). На этом и последующих рисунках символом обозначен контрольный вектор YEplac195, PPZ1 - плазмида YEplac195-PPZ1, ppz1-R451L - плазмида YEplac195-PPZ1-R451L. |
Далее мы проанализировали влияние сверхэкспрессии гена PPZ1 на проявление пяти нонсенс-мутаций, а также двух миссенс-мутаций в гене sup35 (см. таблицу 2). Экспрессия всех использованных мутантных аллелей sup35 приводит к выраженной нонсенс-супрессии (Chabelskaya et al., 2004). Как и в предыдущем эксперименте, у штаммов, содержащих делецию хромосомной копии гена SUP35 и плазмиду, компенсирующую летальный эффект делеции, методом плазмидного шафлинга заменяли компенсирующие плазмиды на плазмиды, несущие мутантные аллели sup35. Далее полученные штаммы дополнительно трансформировали мультикопийными плазмидами, несущими аллели гена PPZ1. Мы обнаружили, что сверхэкспрессия PPZ1 и ppz1-R451L не влияет на проявление всех пяти нонсенс-мутаций sup35, а также обеих миссенс-мутаций sup35-10 и sup35-25 (данные не представлены).
Вместе с тем, необходимо отметить, что ранее антисупрессорный эффект сверхэкспрессии PPZ1 был показан в штамме, несущем одну из проанализированных мутаций - sup35-25 (Aksenova et al., 2007). Однако, этот штамм содержал криптическую мутацию sup45-400. Поэтому можно предположить, что для проявления эффектов PPZ1 на фоне мутаций sup35 могут быть необходимы мутации sup45. С другой стороны, проявление эффектов PPZ1 может зависеть от эффективности нонсенс-супрессии, обуславливаемой мутациями sup35.
Для проверки этих предположений мы проанализировали проявление сверхэкспрессии PPZ1 и ppz1-R451L в штамме 21А-Д863 на фоне "укороченных" аллелей sup35-10С и sup35-25С, кодирующих только С-терминальный домен Sup35p. Ранее было показано, что эти аллели характеризуются как минимум в два раза меньшей эффективностью нонсенс-супрессии по сравнению с полноразмерными аллелями sup35-10 и sup35-25 (Volkov et al., 2007). Мы обнаружили, что антисупрессорный эффект PPZ1 и аллосупрессорный эффект ppz1-R451L, действительно, наблюдаются на фоне "укороченных" аллелей sup35-10C и sup35-25C (рисунок 3). Таким образом, эффекты сверхпродукции Ppz1p могут проявляться на фоне мутантных аллелей sup35 в отсутствии дополнительных мутаций sup45. При этом проявление эффектов PPZ1 зависит от уровня нонсенс-супрессии, обусловленной мутантными аллелями sup35.
| Рисунок 3. Антисупрессорный эффект PPZ1 и аллосупрессорный эффект ppz1-R451L наблюдаются на фоне "укороченной" мутантной аллели sup35-25C. Символом SMM-His обозначена среда на основе SMM, не содержащая гистидина, SMM-Lys - не содержащая лизина. |
Являются ли мутации sup35 и sup45 необходимым условием для проявления эффектов сверхпродукции Ppz1p, или же эти эффекты могут проявляться при снижении эффективности терминации трансляции, обусловленной другими причинами? Для ответа на этот вопрос мы проверили возможный эффект сверхэкспрессии PPZ1 и ppz1-R451L в штамме 5V-H19 [PSI+], не содержащем мутаций sup35 и sup45. Антисупрессорный эффект PPZ1 и аллосупрессорный эффект мутантной аллели ppz1-R451L проявляются на фоне нонсенс-супрессии, обусловленной фактором [PSI+] (рисунок 4). Таким образом, проявление эффектов PPZ1 может наблюдаться и в отсутствии мутаций sup35 или sup45. Это говорит о том, что эффекты PPZ1 проявляются на фоне нонсенс-супрессии, которая может быть обусловлена факторами различной природы.
| Рисунок 4. Сверхэкспрессия PPZ1 приводит к антисупрессии, а сверхэкспрессия ppz1-R451L - к аллосупрессии по отношению к фактору [PSI+] в штамме 5V-H19. |
Изменение фенотипического проявления фактора [PSI+] при сверхэкспрессии PPZ1 может быть связано с зависимостью прионного превращения Sup35p от фосфатазной активности Ppz1p. Для проверки этого предположения мы проанализировали количество Sup35р, находящегося в мономерной фракции, по сравнению с количеством тотального белка Sup35p в штаммах [PSI+] на фоне сверхэкспрессии PPZ1 и ppz1-R451L. Мы обнаружили, что распределение Sup35p между полимерной и мономерной фракциями не изменяется при сверхэкспрессии аллелей гена PPZ1 (данные не представлены). Таким образом, сверхпродукция Ppz1p не влияет на прионное превращение белка Sup35p. Эти данные косвенно свидетельствуют об отсутствии непосредственного взаимодействия между фосфатазой Ppz1p и фактором терминации eRF3.
2. Сверхэкспрессия и делеция HAL3 влияют на проявление фактора [PSI+].
На предыдущем этапе работы мы показали, что сверхпродукция Ppz1p влияет на проявление некоторых мутаций sup35 и sup45, а также фактора [PSI+]. Известно, что белок Hal3p является негативной регуляторной субъединицей фосфатазы Ppz1p (de Nadal et al., 1998). В таком случае следует ожидать, что изменение уровня экспрессии HAL3 может влиять на уровень нонсенс-супрессии за счет изменения фосфатазной активности Ppz1p. Для проверки этого предположения мы проанализировали эффекты делеции и сверхэкспрессии гена HAL3 в штамме 5V-H19 [PSI+]. Мы показали, что делеция HAL3 приводит к антисупрессии, а сверхэкспрессия HAL3 - наоборот, к аллосупрессии по отношению к фактору [PSI+] (рисунок 5). Таким образом, проявление фактора [PSI+] зависит от уровня экспрессии гена HAL3.
| Рисунок 5. Делеция HAL3 (А) приводит к антисупрессии, а сверхэкспрессия HAL3 (Б) - к аллосупрессии в штамме 5V-H19 [PSI+]. Символом wt обозначен исходный штамм 5V-H19 [PSI+], hal3 - штамм 5V-H19-hal3 [PSI+], HAL3 - плазмида YEplac195-HAL3. |
3. Сверхэкспрессия HAL3 проявляется на фоне делеции PPZ1, но не двойной делеции PPZ1 и PPZ2.
Поскольку Hal3p является негативным регулятором Ppz1p (de Nadal et al., 2001), то можно предположить, что аллосупрессорный эффект сверхэкспрессии HAL3 обусловлен снижением фосфатазной активности Ppz1p. В таком случае следует ожидать, что проявление сверхэкспрессии HAL3 будет блокировано в штамме, несущем делецию PPZ1. Для проверки этого предположения мы получили делецию гена PPZ1 в штамме 5V-H19 [PSI+]. Как и следовало ожидать, эффект делеции PPZ1 противоположен эффекту сверхэкспрессии этого гена, т.е. он проявлятся как аллосупрессия по отношению к [PSI+] (рисунок 6). Далее штамм 5V-H19-ppz1 [PSI+] трансформировали мультикопийной плазмидой YEplac195-HAL3, несущей гена HAL3. Как оказалось, аллосупрессорный эффект сверхпродукции Hal3p проявляется на фоне делеции гена PPZ1 (рисунок 7). Следовательно, влияние HAL3 на эффективность нонсенс-супрессии не может быть объяснено только ингибированием Ppz1p. Скорее всего, в этом процессе участвуют и другие белки, связанные с трансляцией.
Наиболее вероятным кандидатом на роль такого белка является фосфатаза Ppz2p. Показано, что Hal3p и Ppz2p взаимодействуют in vivo (Tarassov et al., 2008). Кроме того, Ppz1p и Ppz2p высокогомологичны, поэтому можно предположить, что Hal3p является общей регуляторной субъединицей как Ppz1p, так и Ppz2p. В таком случае аллосупрессорный эффект сверхэкспрессии HAL3 должен быть блокирован на фоне двойной делеции PPZ1 и PPZ2, но не на фоне одиночной делеции PPZ2.
Для проверки этого предположения мы получили делецию PPZ2, а также двойную делецию PPZ1 и PPZ2 в штамме 5V-H19 [PSI+]. Мы показали, что делеция PPZ2 приводит к аллосупрессии по отношению к [PSI+]; таким образом, фосфатаза Ppz2p также участвует в контроле эффективности нонсенс-супрессии (см. рисунок 6).
| Рисунок 6. Делеция генов PPZ1 и PPZ2 приводит к аллосупрессии по отношению к фактору [PSI+]. Символом wt обозначен исходный штамм 5V-H19 [PSI+], символами ppz1, ppz2 и ppz1/2 - его производные, несущие делеции PPZ1, PPZ2 и двойную делецию этих генов, соответственно. |
Далее штаммы с этими делециями трансформировали плазмидой YEplac195-HAL3. Мы обнаружили, что аллосупрессорный эффект сверхэкспрессии HAL3 проявляется на фоне делеции PPZ2; в то же время этот эффект полностью блокирован на фоне двойной делеции PPZ1 и PPZ2 (см. рисунок 7).
| Рисунок 7. Аллосупрессорный эффект сверхэкспрессии HAL3 проявляется на фоне одиночных делеций PPZ1 и PPZ2, но не на фоне двойной делеции этих генов. |
Таким образом, Hal3p является негативной регуляторной субъединицей и для Ppz1p, и для Ppz2p; влияние HAL3 на эффективность нонсенс-супрессии обусловлено ингибированием каталитической активности обеих этих фосфатаз.
4. Роль фактора элонгации EF1B в проявлении эффектов Ppz1p.
Антисупрессорный эффект сверхэкспрессии PPZ1 связан с усилением фосфатазной активности Ppz1p, поскольку антисупрессия не наблюдается при сверхэкспрессии мутантной аллели ppz1-R451L, кодирующей каталитически неактивный Ppz1p. Очевидно, таким образом, что Ppz1p дефосфорилирует какой-то фофобелок, связанный с трансляцией. Этот белок в настоящее время неизвестен. A priori наиболее вероятным кандидатом на роль такого белка является фактор элонгации трансляции EF1B. В гене TEF5, кодирующем EF1B, изолирован ряд мутаций, приводящих к антисупрессии (Carr-Schmid et al., 1999). Кроме того, показано, что EF1B является мишенью фосфатазной активности Ppz1p и дефосфорилируется по остатку серина в положении 86. Мутация tef5-T622C, приводящая к замене серина на аланин, полностью блокирует фосфорилирование EF1B in vivo (de Nadal et al., 2001). Если EF1В действительно опосредует антисупрессорный эффект сверхэкспрессии PPZ1, то этот эффект должен быть блокирован в штамме [PSI+], несущем эту мутантную аллель.
Для проверки этого предположения мы получили делецию гена TEF5 в штамме 5V-H19 [PSI+], содержащем центромерную плазмиду с мутантной аллелью tef5-T622C. В качестве контроля использовали изогенный штамм, экспрессирующий аллель дикого типа TEF5 с плазмиды. Фенотип этих штаммов свидетельствует о том, что tef5-T622C приводит к слабовыраженной антисупрессии по отношению к фактору [PSI+] (рисунок 8). Следовательно, уровень фосфорилированности EF1B по остатку Ser86 действительно влияет на эффективность нонсенс-супрессии, причем дефосфорилированное состояние EF1B ведет к антисупрессии. Эти данные подтверждают предположение о том, что антисупрессорный эффект сверхэкспрессии PPZ1, по крайней мере частично, опосредован дефосфорилированием EF1B.
| Рисунок 8. Мутация tef5-T622C приводит к антисупрессии на фоне [PSI+]. Символом TEF5wt обозначен исходный штамм 5V-H19 [PSI+], tef5-T622C - штамм 5V-H19-tef5 [PSI+], несущий плазмиду с аллелью tef5-T622C. |
Далее штамм, экспрессирующий мутантную аллель tef5-T622C, трансформировали плазмидами, несущими аллели PPZ1 и ppz1-R451L. Фенотип трансформантов свидетельствует о том, что антисупрессорный эффект PPZ1 и аллосупрессорный эффект ppz1-R451L проявляются на фоне tef5-T622C (рисунок 9). Это говорит о том, что EF1B является не единственной мишенью, опосредующей связь Ppz1p с трансляцией. По-видимому, проявление сверхпродукции Ppz1p также зависит от какого-то другого фосфобелка, связанного с трансляцией.
| Рисунок 9. Эффекты PPZ1 и ppz1-R451L по отношению к фактору [PSI+] проявляются на фоне мутации tef5-T622C. |
5. Поиск других белков-мишеней Ppz1p.
Мы показали, что EF1B играет минорную роль в проявлении эффекта сверхэкспрессии PPZ1. Поэтому мы рассмотрели ряд других фосфобелков, связанных с трансляцией, в качестве возможных мишеней Ppz1p. В их числе:
1. Фактор терминации трансляции eRF1 (Sup45p) - играет ключевую роль в считывании стоп-кодонов. Он фосфорилируется in vivo по Ser421 и Ser432 (Kallmeyer et al., 2006); фосфатаза, дефосфорилирующая Sup45p, в настоящее время неизвестна. Роль фосфорилирования Sup45p в клетке также не изучена.
2. Белки Upf1p (Nam7p) и Upf2p (Nmd2p) - необходимы для работы системы нонсенс-зависимой деградации мРНК (NMD). Кроме того, эти белки взаимодействуют in vivo с факторами терминации трансляции eRF1 и eRF3 (Czaplinski et al., 1998; Wang et al., 2001). Таким образом, эти белки тесно связаны с аппаратом трансляции и могут оказывать влияние на эффективность нонсенс-супрессии за счет как контроля активности системы NMD, так и регуляции считывания стоп-кодонов как значащих. Также известно, что Upf1p и Upf2p являются фосфобелками, причем фосфорилирование Upf2p необходимо для работы системы NMD (Wang et al., 2006). Фосфатаза, контролирующая уровень фосфорилированности Upf2p, в настоящее время неизвестна.
3. Фосфобелок Sla1p - взаимодействует in vivo как с Ppz1p (Venturi et al., 2000), так и с фактором терминации eRF3 (Bailleul et al., 1999). Делеция SLA1 приводит к повышению чувствительности к некоторым ингибиторам трансляции (Bailleul et al., 1999).
Для проверки возможной роли перечисленных фосфобелков в проявлении эффектов Ppz1p мы проанализировали проявление сверхэкспрессии PPZ1 и ppz1-R451L в производных штамма 5V-H19 на фоне:
а) Мутантной аллели sup45-S421/432A в штамме [PSI+], приводящей к заменам фосфорилируемых остатков серина в положениях 421 и 432 на аланин и вследствие этого кодирующей Sup45p, находящийся в конститутивно дефосфорилированном состоянии;
б) Одиночных делеций UPF1 и UPF2, а также двойной делеции этих генов в штаммах [psi-];
в) Делеции SLA1 в штамме [PSI+].
Во всех этих экспериментах мы наблюдали проявление антисупрессорного эффекта PPZ1 и аллосупрессорного эффекта ppz1-R451L (данные не представлены). Таким образом, белки Sup45p, Upf1/2p и Sla1p не участвуют в проявлении эффектов сверхпродукции Ppz1p (или их роль несущественна). Кроме того, проведенные эксперименты позволили также сделать следующие выводы:
1) Экспрессия мутантной аллели sup45-S421/432A не приводит к видимому изменению уровня нонсенс-супрессии в штамме [PSI+];
2) Эффекты сверхпродукции Ppz1p не связаны с изменением эффективности нонсенс-зависимой деградации мРНК;
3) Делеция гена SLA1 приводит к аллосупрессии по отношению к фактору [PSI+].
6. Роль Ssb1p и Ssb2p в проявлении аллосупрессорного эффекта ppz1-R451L.
Шапероны Ssb1p и Ssb2p также могут рассматриваться в качестве кандидатов на роль белков, участвующих в проявлении эффектов сверхпродукции Ppz1p. Гены SSB1 и SSB2 идентичны на 99%, поэтому Ssb1p и Ssb2p выполняют в клетке одни и те же функции. В отношении Ssb1p было показано, что он взаимодействует in vivo как с Ppz1p (Arino, 2002), так и с фактором терминации eRF3 (Allen et al., 2005). Кроме того, уровень экспрессии Ssb1p влияет на эффективность нонсенс-супрессии (Rakwalska a. Rospert, 2004; Hatin et al., 2007).
Мы получили одиночные делеции SSB1 и SSB2, а также двойную делецию этих генов в штамме 5V-H19 [PSI+]. Двойная делеция SSB1 и SSB2 приводит к аллосупрессии по отношению к [PSI+], в то время как одиночные делеции не оказывают видимого влияния на фенотип штамма; эти данные свидетельствуют о перекрывании функций белков Ssb1p и Ssb2p в регуляции эффективности нонсенс-супрессии. Далее штаммы с делециями трансформировали плазмидами, несущими аллели гена PPZ1. Антисупрессорный эффект сверхэкспрессии PPZ1 проявляется во всех проанализированных штаммах (рисунок 10). Следовательно, Ssb1p и Ssb2p не принимают участия в проявлении сверхэкспрессии аллели дикого типа PPZ1.
Тем не менее, аллосупрессорный эффект сверхэкспрессии ppz1-R451L проявляется на фоне одиночных делеций SSB1 или SSB2, но не на фоне двойной делеции этих генов. Таким образом, для проявления мутантной аллели ppz1-R451L необходимо наличие хотя бы одного из белков Ssb.
Эти данные позволяют предположить, что антисупрессорный эффект аллели дикого типа PPZ1 и аллосупрессорный эффект мутантной аллели ppz1-R451L обусловлены различными механизмами. Механизм, обеспечивающий проявление мутантной аллели ppz1-R451L, зависит от экспрессии генов SSB1 и SSB2, в то время как проявление аллели дикого типа PPZ1 Ssb-независимо.
![Аллосупрессорный эффект ppz1-R451L по отношению к [PSI+]-9](/images1/349603/allosupressorniy-effekt-ppz1-r451l.png)
| Рисунок 10. Аллосупрессорный эффект ppz1-R451L по отношению к [PSI+] проявляется в исходном штамме 5V-H19 (обозначен как SSB1/2wt), но не в штамме 5V-H19-ssb1/2 (обозначен как ssb1/2). |
Ssb-зависимый аллосупрессорный эффект мутантной аллели ppz1-R451L может быть объяснен следующим образом:
Мы показали, что двойная делеция SSB1 и SSB2 в штамме [PSI+] приводит к увеличению эффективности нонсенс-супрессии. Иными словами, уменьшение количества молекул Ssb1p и Ssb2p, взаимодействующих с компонентами аппарата трансляции, имеет нонсенс-супрессорный эффект. По-видимому, при сверхпродукции каталитически неактивной формы Ppz1p возрастает доля молекул Ssb1p и Ssb2p, взаимодействующих in vivo с Ppz1p, что приводит к снижению пула молекул этих шаперонов, взаимодействующих с рибосомой и с факторами терминации трансляции и, следовательно, к нонсенс-супрессии (рисунок 11).
| Рисунок 11. Влияние Ppz1p на эффективность нонсенс-супрессии может быть обусловлено двумя различными механизмами. |
В таком случае, при сверхэкспрессии аллели дикого типа PPZ1 можно предположить, что аллосупрессорный эффект, обусловленный взаимодействием между Ppz1p и белками Ssb, маскируется более сильным антисупрессорным эффектом, обусловленным увеличением фосфатазной активности Ppz1p (см. рисунок 11). Эта фосфатаза дефосфорилирует как минимум два белка: фактор элонгации EF1B, а также какой-то другой белок, в настоящее время остающийся неизвестным.
ВЫВОДЫ
1) Эффективность нонсенс-супрессии, обусловленной мутациями в генах SUP35 и SUP45, а также дрожжевым прионом [PSI+], зависит от активности фосфатазы Ppz1p;
2) Сверхпродукция каталитически активной формы Ppz1p обладает антисупрессорным эффектом, а сверхпродукция мутантного белка, лишенного фосфатазной активности, проявляет аллосупрессорный эффект;
3) Показано, что родственная Ppz1p фосфатаза Ppz2p также вовлечена в детерминацию эффективности нонсенс-супрессии; при этом ее активность регулируется общей с Ppz1 регуляторной субъединицей Hal3p;
4) Модификация фенотипического проявления фактора [PSI+] в зависимости от активности Ppz1p не связана с влиянием этой фосфатазы на прионное превращение белка Sup35p;
5) Уровень фосфорилированности фактора элонгации трансляции EF1B влияет на фенотипическое проявление фактора [PSI+] (хотя и в незначительной степени), но не влияет на проявление эффектов сверхпродукции нормальной и мутантной формы фосфатазы Ppz1p;
6) Эффективность нонсенс-супрессии в штамме [PSI+] не зависит от уровня фосфорилированности фактора терминации eRF1;
7) Влияние фосфатазы Ppz1p на эффективность нонсенс-супрессии не связано с активностью компонентов системы нонсенс-зависимой деградации мРНК;
8) Делеция гена SLA1 характеризуется аллосупрессорным эффектом по отношению к фактору [PSI+], но не влияет на проявление эффектов сверхпродукции нормальной и каталитически неактивной форм Рpz1p;
9) Аллосупрессорный эффект каталитически неактивной формы Ppz1p по отношению к фактору [PSI+] может быть объяснен ее взаимодействием с шаперонами Ssb1p и Ssb2p.
СПИСОК РАБОТ, ОПУБЛИКОВАННЫХ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ
1) Рогоза Т.М., Викторовская О.В., Родионова С.А., Иванов М.С., Волков К.В., Миронова Л.Н. Поиск генов, влияющих на поддержание антисупрессорного прионоподобного детерминанта [ISP+] у дрожжей, с помощью инсерционной библиотеки генов // Молекулярная биология. 2009. Т. 43. № 3. С. 1-8.
2) Иванов М.С., Аксенова А.Ю., Бурдаева Я.В., Радченко Э.А., Миронова Л.Н. Сверхэкспрессия гена PPZ1 дрожжей Saccharomyces cerevisiae влияет на эффективность нонсенс-супрессии // Генетика. 2008. Т. 44. № 2. С. 177-184.
3) Rogoza T., Goginashvili A., Ivanov M., Mironova L. Nonsense Suppression Efficiency is Yeasts Depends on the Level of SFP1 Expression. CSHL Meeting on Translational Control (Cold Spring Harbor, USA, September 3-7, 2008) - Book of Abstracts, P. 277.
4) Ivanov M.S., Radchenko E.A., Mironova L.N. Phosphatase Ppz1p influences the efficiency of nonsense suppression by pathways distinct from the dephosphorylation of the elongation factor EF1B in yeast Saccharomyces cerevisiae. 12th International Congress on Yeasts (Kyiv, Ukraine, August 11-15, 2008) - Book of Abstracts, P. 145.
5) Ivanov M.S., Aksenova A.Yu., Radchenko E.A. and Mironova L.N. The level of Ser/Thr phosphatase Ppz1p influences the manifestation of certain mutations in SUP35 and SUP45 genes as well as [PSI+] prion in Saccharomyces cerevisiae. EuroPhosphatases 2007 "Protein Phosphatases in Health and Disease" (Aveiro, Portugal, July 24-28, 2007) - Book of Abstracts, P. 183.
6) Ivanov M.S., Aksenova A.Yu., Mironova L.N. Influence of Ser/Thr phosphatase Ppz1p on manifestation and propagation of [PSI+] prion in Saccharomyces cerevisiae // III International Young Scientists Conference (Odesa, Ukraine, May 15-18, 2007) – Book of Abstracts, P. 192.
