Свободно-радикальное окисление при гипокинезии в условиях экспериментального перитонита
На правах рукописи
ПОПОВ
Сергей Владимирович
Свободно-радикальное окисление при гипокинезии в условиях экспериментального перитонита
03.01.04 – Биохимия
Автореферат
диссертации на соискание ученой степени
кандидата медицинских наук
Челябинск - 2013
Работа выполнена в Государственном бюджетном образовательном учреждении высшего профессионального образования «Челябинская государственная медицинская академия» Министерства здравоохранения Российской Федерации
| Научный руководитель: | доктор биологических наук, профессор Цейликман Вадим Эдуардович |
| Официальные оппоненты: | заслуженный работник высшей школы РФ, доктор медицинских наук, профессор, профессор кафедры биохимии ГБОУ ВПО «Омская государственная медицинская академия» Минздрава России Высокогорский Валерий Евгеньевич |
| доктор медицинских наук, профессор, заведующая кафедрой биохимии ФГБОУ ВПО «Уральский государственный университет физической культуры» Минспорттуризма России Львовская Елена Ивановна |
Ведущая организация: ГБОУ ВПО «Российский национальный исследовательский медицинский университет имени Н.И. Пирогова» Минздрава России.
Защита состоится «____»_________2013г. в _____ часов на заседании диссертационного совета Д 208.117.02 при ГБОУ ВПО «Челябинская государственная медицинская академия» Министерства здравоохранения Российской Федерации (454092, г. Челябинск, ул. Воровского, 64).
С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Челябинской государственной медицинской академии
Автореферат разослан "____" ____________ 2013 г.
Ученый секретарь диссертационного совета,
доктор медицинских наук Н.В. Тишевская
ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ
Актуальность
Согласно современным представлениям при септическом перитоните часто происходит делокализация воспалительного очага, что сопровождается интоксикацией, развитием SIRS - синдрома и генерализацией воспалительного процесса (Weinert C., Meller W., 2007; Boer R. et al., 2008; Шальков Ю.Л., 2010). Проявления системного воспаления могут быть в значительной степени модифицированы хроническим стрессом (Handa et al., 2008).
Ранее было показано, что предварительные ежедневные эпизоды одночасового иммобилизационного стресса влияют на процессы свободно-радикального окисления, как в воспалительном очаге, так и во внутренних органах при септическом перитоните (Нусратов М.И., 2011). Однако использованная в этом исследовании экспериментальная модель стресса не воспроизводит состояние длительного ограничения двигательной активности. Можно предположить, что длительная гипокинезия оказывает значительное влияние на динамику системного воспаления. Поэтому клинические проявления системного воспаления у больных, длительное время находящихся на строгом постельном режиме (тяжелые травмы, патология центральной и периферической нервной системы, кома различной этиологии), зачастую модифицированы, что значительно затрудняет их своевременное выявление и лечение (Hunter J.D., Doddi M., 2010). Кроме того, развитие сепсиса, как осложнения перитонита, приводит к ограничению двигательной активности, что отражено в термине «гиподинамическая фаза сепсиса» (Yang S.L. et al., 1997).
Вместе с тем, изменение динамики системного воспалительного процесса в условиях хронического стресса во многом реализуется за счет влияния на процессы свободно-радикального окисления в воспалительном очаге и во внутренних органах (Zhu H., Li Y.R., 2012). Имеются данные о причастности процессов свободно-радикального окисления к развитию осложнений при воспалительной патологии (Zhang R. et al., 2002). Известно, что с усилением свободно-радикального окисления во внутренних органах связано развитие полиорганной недостаточности (Лейдерман И.Н., 1999).
К сожалению, остаётся не исследованным влияние предварительной гипокинезии на особенности свободно-радикального окисления в воспалительном очаге и во внутренних органах при экспериментальном септическом перитоните.
Цель работы:
Установить особенности модифицирующего влияния 30 - суточной гипокинезии на уровень липопероксидации и карбонилирования белков в очаге воспаления, органах системы крови, печени и головном мозге при экспериментальном перитоните.
Задачи исследования:
- Определить особенности свободно-радикального окисления, изменения клеточного состава и функциональной активности нейтрофилов в перитонеальных смывах животных, подвергнутых 30 - суточной гипокинезии и ложной операции.
- Определить особенности свободно-радикального окисления в органах системы крови, печени и головном мозге животных, подвергнутых 30 - суточной гипокинезии и ложной операции.
- Исследовать особенности свободно-радикального окисления, изменения клеточного состава и функциональной активности нейтрофилов в перитонеальных смывах при экспериментальном септическом перитоните.
- Изучить особенности свободно-радикального окисления, изменения клеточного состава и функциональной активности нейтрофилов в перитонеальных смывах при септическом перитоните, воспроизводимом на фоне 30 - суточной гипокинезии.
- Изучить состояние свободно-радикального окисления в головном мозге и печени в условиях септического перитонита, воспроизводимого на фоне 30 - суточной гипокинезии.
- Изучить состояние свободно-радикального окисления в органах системы крови в условиях септического перитонита, воспроизводимого на фоне 30 - суточной гипокинезии.
Научная новизна
Впервые установлено, что 30 - суточная гипокинезия сопровождается увеличением содержания гептанофильных продуктов ПОЛ при неизменном уровне окислительной модификации белков в перитонеальных смывах. Установлено, что хирургический стресс, осуществляемый на фоне 30 - суточной гипокинезии, приводит к приросту содержания продуктов ПОЛ не только в перитонеальных смывах, но и в тимусе, селезенке и печени. Установлено, что при септическом перитоните угнетение фагоцитарной активности нейтрофилов ассоциируется со снижением липопероксидации и усилением карбонилирования белков в перитонеальных смывах. Установлено, что предварительное воздействие 30 - суточной гипокинезии усугубляет окислительную деструкцию белков в перитонеальных смывах, вызванную септическим перитонитом. Обнаружено, что при септическом перитоните соотношение между липопероксидацией и окислением белков имеет органоспецифический характер: в тимусе усилилось ПОЛ при снижении ОМБ, в селезенке наоборот снижение ПОЛ и усиление ОМБ. В костном мозге усиление ПОЛ. Увеличение содержания карбонилированных белков в головном мозге сопряжено с увеличением активности церебральной МАО-Б. Септический перитонит на фоне гипокинезии сопровождается приростом содержания гептан-растворимых продуктов ПОЛ в головном мозге.
Теоретическая и практическая значимость
Полученные результаты уточняют свободно-радикальные механизмы развития воспалительных осложнений в условиях длительного ограничения двигательной активности. Материалы диссертации могут быть использованы для разработки новых путей фармакологической коррекции септического перитонита, предусматривающих использование антиоксидантов. Результаты работы внедрены в учебный процесс кафедры биохимии ГБОУ ВПО ЧелГМА Минздравсоцразвития России.
Положения, выносимые на защиту:
- Длительное ограничение двигательной активности приводит к усилению свободно-радикального окисления в брюшине и вызывает органо-специфичные изменения свободно-радикального окисления во внутренних органах.
- Предварительная гипокинезия усугубляет снижение липопероксидации и повышение карбонилирования белков в брюшине, вызванные септическим перитонитом, усиливая при этом нейтрофильную инфильтрацию воспалительного очага.
- Предварительная гипокинезия модифицирует соотношение между липопероксидацией и карбонилированием белков во внутренних органах при септическом перитоните.
Апробация работы
Основные положения работы изложены и представлены на 2nd European congress of Immunology «Immunity for life Immunology for health» (Berlin, 2009); Всероссийской конференции «Актуальные проблемы теоретической и прикладной биохимии», посвященной 80-летию со дня рождения профессора Р.И.Лифшица (Челябинск, 2009); на XXXVI International Congress of Physiological Sciences (IUPS2009) Function of Life: Elements and Integration (Kyoto, Japan, 2009).
Публикации
По теме диссертации опубликовано 8 печатных работ, из них 5 – в рецензируемых журналах по перечню ВАК Минобразования РФ (Уральской медицинской академической науки).
Структура и объем диссертации
Диссертация изложена на 130 страницах машинописного текста и состоит из введения, обзора литературы, описания материалов и методов, главы собственных исследований, обсуждения результатов, выводов. Библиографический указатель включает 220 источников: 102 – на русском языке и 118 – иностранных. Работа содержит 10 таблиц.
МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ
Моделирование изучаемых состояний
Исследование выполнено на 210 беспородных лабораторных крысах обоего пола. Животных содержали в стандартных пластмассовых клетках при комнатной температуре на стандартной диете.
Гипокинетический стресс моделировали путём помещения крыс в специальные клетки-пеналы, ограничивающие подвижность животных, при свободном доступе к пище и воде. Применялась 30-суточная модель гипокинетического стресса (Коваленко Е.А., Гуровский Н.Н., 1980; Фёдоров И.В., 1984; Тигранян Р.А., 1990; Миллер E., Рутковский М., Mrowicka M., Матушевский Т., 2007).
Для создания экспериментального перитонита нами использована модель лигирования и последующего однократного пунктирования слепой кишки – cecal ligation and perforation (CLP) (Wichterman K.A., 1980).
Биохимические методы
Содержание продуктов перекисного окисления липидов (ПОЛ) оценивали спектрофотометрически в липидном экстракте исследуемых тканей по методике Волчегорского И.А. и др. (1989). Содержание конечных продуктов перекисного окисления липидов, определение интенсивности аскорбат-индуцированного ПОЛ производили спектрофотометрическим методом по Львовской Е.И. с соавт. (1998). Окислительную модификацию белков оценивали по уровню образования динитрофенилгидразонов по методу Е.Е. Дубининой (1995). Активность моноаминоксидазы - Б в гомогенатах органов определяли спектрофотометрическим методом, используя в качестве субстрата солянокислый бензиламин (Волчегорский И.А., 1991).
Гематологические и иммунологические методы
Изучение периферической крови проводилось общепринятыми методами (Гольдберг Е.Д., Дыгай А.М., Шахов В.П., 1992). Лейкоцитарную формулу изучали в мазках, окрашенных по Романовскому-Гимза. Кариоциты костного мозга и лимфоидных органов (также как и лейкоциты крови) подсчитывали в камере Горяева после ресуспендирования в 0,1% растворе метиленового синего в 3% уксусной кислоте. Изучение способности нейтрофилов к захвату частиц проводили на модели поглощения частиц латекса (Лебедев К.А., Понякина И.Д., 1990) и контрольных штаммов микроорганизмов. Исследование внутриклеточного кислородзависимого метаболизма нейтрофилов осуществлялось при помощи НСТ-теста. НСТ-тест проводили в двух вариантах: спонтанном и индуцированном (Карпищенко А.И., 1998). Раздел работы по изучению внутриклеточного кислородзависимого метаболизма нейтрофилов выполнен совместно со старшим преподавателем кафедры микробиологии, вирусологии, иммунологии и клинической лабораторной диагностики ГБОУ ВПО ЧелГМА Минздравсоцразвития, к.м.н. Е.В. Плехановой.
Статистический анализ результатов
Для обработки результатов исследований использовали пакет прикладных программ “Statistica 6.0 for Windows”. Статистически значимые различия между несколькими группами определялись с помощью критерия Краскелла-Уолиса (Kruskal-Wallis). Для определения статистически значимых различий между двумя сравниваемыми группами использовали критерии Манна-Уитни (U). Различия считали значимыми при р0,05. Статистические взаимосвязи изучали при помощи непараметрического корреляционного анализа, выполняя расчёт коэффициентов корреляции рангов по Спирмену (Rs) и Кенделлу (rk).
РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ
Особенности свободно-радикального окисления в перитонеальных смывах и внутренних органах при 30 - суточной гипокинезии
После завершения 30 - суточной гипокинезии (ГК30) наблюдалось увеличение содержания гептан-растворимых кетодиенов и сопряжённых триенов, Шиффовых оснований, а также вторичных изопропанол-растворимых продуктов перекисного окисления липидов в перитонеальных смывах животных (таблица 1).
Таблица 1
Влияние 30 - суточной гипокинезии на свободно - радикальное окисление в перитонеальных смывах
| Показатель | Контроль (n=8) | ГК30 (n=12) |
| Диеновые конъюгаты гептановая фаза, е.о.и. | 0,685±0,14 | 0,735±0,19 |
| Кетодиены и сопряжённые триены гептановая фаза, е.о.и. | 0,111±0,01 | 0,127±0,02 P=0,017U |
| Шиффовы основания гептановая фаза, е.о.и. | 0,013±0,02 | 0,026±0,002 P=0,014U |
| Диеновые конъюгаты изопропанольная фаза, е.о.и. | 0,798±0,015 | 0,822±0,04 |
| Кетодиены и сопряжённые триены изопропанольная фаза, е.о.и. | 0,146±0,03 | 0,189±0,03 P=0,014U |
| Шиффовы основания изопропанольная фаза, е.о.и. | 0,039±0,02 | 0,082±0,022 |
| Окислительная модификация белка мкмоль/г белка | 0,805±0,023 | 0,668±0,034 |
Примечание: е.о.и. – единицы окислительного индекса (Е232/Е220-первичные, Е278/Е220-вторичные продукты, Е400/Е220 – конечные продукты, извлекаемые гептановой и изопропанольной фазами липидного экстракта). U - критерий Манна-Уитни.
После завершения ГК30 в вилочковой железе наблюдалось увеличение содержания гептан - растворимых диеновых конъюгатов (таблица 2).
Таблица 2
Влияние 30 - суточной гипокинезии на свободно - радикальное окисление во внутренних органах
| Показатель | Контроль (n=8) | ГК30 (n=12) |
| Диеновые конъюгаты гептановая фаза, е.о.и. Тимус | 0,908±0,07 | 0,979±0,068 P=0,015U |
| Диеновые конъюгаты изопропанольная фаза, е.о.и. Головной мозг | 0,896±0,08 | 0,882±0,1 P=0,022U |
| Окислительная модификация белка (индукция Fe2+ / Н2О2), мкмоль /г белка Селезёнка | 70,91±3,48 | 81,93±1,13 P=0,021U |
| Окислительная модификация белка (индукция Fe2+ / Н2О2), мкмоль /г белка Печень | 66,31±4,32 | 48,08±2,11 P=0,017U |
| Окислительная модификация белка мкмоль/г белка Костный мозг | 4,41±0,51 | 2,58±0,35 P=0,017U |
Примечание: е.о.и. – единицы окислительного индекса (Е232/Е220-первичные, Е278/Е220-вторичные продукты, Е400 / Е220 – конечные продукты, извлекаемые гептановой и изопропанольной фазами липидного экстракта). U - критерий Манна-Уитни.
Для головного мозга характерно снижение содержания изопропанол-растворимых диеновых конъюгатов. В селезёнке наблюдалось увеличение уровня Fe+2/H2O2 - индуцированного карбонилирования белков. Для печени, напротив, характерно снижение Fe+2/H2O2 - индуцированного карбонилирования белков. В костном мозге обнаружено снижение базального уровня карбонилирования белков. Таким образом, для ГК30 изменения уровня свободно-радикального окисления имеют органо-специфичный характер.
Установлено, что 30-суточная гипокинезия (ГК30) сопровождалась появлением нейтрофилов в перитонеальных смывах (количество нейтрофилов составило 3,4±0,01 х109/л, Р=0,033U). В цитологических препаратах контрольных животных не обнаружена эта разновидность лейкоцитарных клеток. При этом отмечено увеличение спонтанного (с 37,85±2,78 до 68,3±3,44%, P=0,017U) и индуцированного (с 39,42±1,37 до 55,2±2,97%, P=0,017U) НСТ - теста при одновременном снижении активности фагоцитоза (с 44,57±3,33 до 21,1±1,97%, P=0,017U).
Особенности свободно-радикального окисления в перитонеальных смывах и внутренних органах ложнооперированных животных
У ложнооперированных животных, как и при гипокинезии, в перитонеальных смывах зарегистрировано статистически значимое увеличение содержания гептан-растворимых диеновых конъюгатов, кетодиенов и сопряжённых триенов, а также Шиффовых оснований. При этом содержание изопропанол - растворимых продуктов ПОЛ не претерпело статистически значимых изменений (таблица 3).
В перитонеальных смывах ложнооперированных животных наблюдалось снижение базального уровня окислительной модификации белка при увеличении уровня окислительной модификации белка в ответ на индукцию Fe2+ / Н2О2.
Таким образом, ложная операция характеризовалась реципрокными отношениями между перекисным окислением липидов и карбонилированием белков в перитонеальных смывах.
Таблица 3
Влияние процедуры ложной операции на свободно-радикальное окисление в перитонеальных смывах
| Показатель | Контроль (n=8) | Ложная операция (n=12) |
| Диеновые конъюгаты гептановая фаза, е.о.и. | 0,685±0,09 | 0,765±0,02 Р=0,027U |
| Кетодиены и сопряжённые триены гептановая фаза, е.о.и. | 0,113±,0,004 | 0,154±0,01 Р=0,027U |
| Шиффовы основания гептановая фаза, е.о.и. | 0,013±0,006 | 0,0843±0,02 Р=0,027U |
| Диеновые конъюгаты изопропанольная фаза, е.о.и. | 0,798±0,059 | 0,777±0,015 |
| Кетодиены и сопряжённые триены изопропанольная фаза, е.о.и. | 0,148±0,03 | 0,141±0,03 |
| Шиффовы основания изопропанольная фаза, е.о.и. | 0,039±0,005 | 0,035±0,002 |
| Окислительная модификация белка мкмоль /г белка | 0,551±0,62 | 0,191±0,391 Р=0,034U |
| Окислительная модификация белка (индукция Fe2+ / Н2О2), мкмоль /г белка | 2,55±10,23 | 3,22±0,618 Р=0,034U |
Примечание: е.о.и. – единицы окислительного индекса (Е232/Е220-первичные, Е278/Е220-вторичные продукты, Е400 / Е220 – конечные продукты, извлекаемые гептановой и изопропанольной фазами липидного экстракта). U - критерий Манна-Уитни.
В большинстве исследованных органов ложнооперированных животных наблюдалось изменение значений различных показателей свободно-радикального окисления (таблица 4).
Таблица 4
Влияние процедуры ложной операции на свободно-радикальное окисление во внутренних органах животных
| Показатель | Контроль (n=8) | Ложная операция (n=12) |
| Диеновые конъюгаты гептановая фаза, е.о.и., Тимус | 0,900±0,08 | 1,005±0,08 Р=0,016U |
| Диеновые конъюгаты гептановая фаза, е.о.и., Костный мозг | 0,692±0,03 | 0,724±0,04 Р=0,023U |
| Диеновые конъюгаты изопропанольная фаза (индукция Fe2+ / аскорбат), е.о.и.,Костный мозг | 2,355±0,074 | 2,12±0,08 Р=0,023U |
| Диеновые конъюгаты гептановая фаза, е.о.и., Печень | 0,542±0,04 | 0,515±0,048 Р=0,016U |
| Кетодиены и сопряжённые триены гептановая фаза, е.о.и., Печень | 0,29±0,009 | 0,515±0,048 Р=0,016U |
| Шиффовы основания изопропанольная фаза, е.о.и,Печень | 0,079±0,005 | 0,033±0,002 Р=0,016U |
| Диеновые конъюгаты изопропанольная фаза (индукция Fe2+ / аскорбат), е.о.и., Печень | 1,119±0,101 | 0,716±0,096 Р=0,015U |
| Окислительная модификация белка мкМ/г белка, Тимус | 1,25±0,102 | 2,48±0,98 Р=0,016U |
| Окислительная модификация белка мкМ/г белка, Костный мозг | 3,96±3,47 | 11,35±0,976 Р=0,006U |
| Окислительная модификация белка мкМ/г белка, Селезенка | 3,81±0,533 | 2,34±0,352 Р=0,016 U |
| Окислительная модификация белка мкМ/г белка, Печень | 5,92±0,43 | 2,25±0,38 Р=0,016U |
| Окислительная модификация белка (индукция Fe2+ / Н2О2), мкМ/г белка, Печень | 18,81±2,95 | 9,41±3,03 Р=0,016U |
| Окислительная модификация белка мкМ/г белка, Головной мозг | 0,572±0,063 | 0,382±0,028 Р=0,037U |
Примечания: е.о.и. – единицы окислительного индекса (Е232/Е220-первичные, Е278/Е220-вторичные продукты, Е400 / Е220 – конечные продукты, извлекаемые гептановой и изопропанольной фазами липидного экстракта). U - критерий Манна-Уитни.
В селезёнке отмечено снижение содержания карбонилированных белков. В тимусе и в костном мозге наблюдалось увеличение содержания гептан-растворимых диеновых конъюгатов, а также карбонилированных белков. Таким образом, в этих органах развитие операционного стресса сопровождалось усилением свободно-радикального окисления.
Для печени характерно снижение содержания гептан-растворимых диеновых конъюгатов, а также кетодиенов и сопряжённых триенов, при одновременном снижении уровня изопропанол-растворимых Шиффовых оснований. Кроме того, в органе наблюдалось снижение содержания уровня Fe+2 / H2O2 - индуцированного карбонилирования белков.
В головном мозге ложнооперированных животных наблюдалось статистически значимое ограничение ОМБ по сравнению с контролем (таблица 4).
Полученные результаты свидетельствуют об органо-специфичных изменениях свободно-радикального окисления при ложной операции, что отражает особенности хирургического стресса. Поэтому активация ПОЛ в брюшине, а также в тимусе, костном мозге может быть связана со стрессорными гормонами. Усиление карбонилирования белков в тимусе и в костном мозге может быть связано с глюкокортикоид - зависимой активацией протеолиза.
У ложнооперированных животных, как и при гипокинезии, в перитонеальных смывах зарегистрировано появление нейтрофильных гранулоцитов (до 9,3±4,19 % от общего количества лейкоцитов, Р=0,014U). Уместно обратить внимание на положительную корреляционную зависимость между количеством нейтрофилов, инфильтрировавших брюшину, и уровнем гептан - растворимых Шиффовых оснований (Rs=0,576; P=0,034). Отмечено увеличение показателей спонтанного (с 37,85±2,78 до 63,75±3,29, Р=0,014U) и индуцированного (с 39,42±1,37 до 63,75±4,28, Р=0,014U) НСТ-теста при одновременном снижении активности фагоцитоза (с 44,57±3,33 до 29,12±3,16, Р=0,014U).
Особенности свободно-радикального окисления в перитонеальных смывах и во внутренних органах при ложной операции на фоне длительного ограничения двигательной активности
Установлено, что ложная операция на фоне 30 - суточной гипокинезии характеризовалась увеличением содержания молекулярных продуктов ПОЛ в перитонеальных смывах. Одновременно повышалась устойчивость к Fe+2/H2О2 - индуцированному карбонилированию белков (таблица 5).
Операционный стресс после ГК30 привёл к усилению липопероксидации при одновременном снижении карбонилирования белков в вилочковой железе (таблица 5).
Усиление ПОЛ в тимусе проявлялось в повышении содержания гептан-растворимых продуктов ПОЛ.
Таблица 5
Влияние предварительной гипокинезии на липопероксидацию и карбонилирование белков в перитонеальных смывах и внутренних органах при ложной операции
| Показатель | Ложная операция (n=8) | ГК30 + Ложная операция (n=8) |
| Диеновые конъюгаты изопропанольная фаза, е.о.и., Перитонеальные смывы | 0,777±0,072 | 0,826±0,084 Р=0,028U |
| Окислительная модификация белка (индукция Fe2+ / Н2О2), мкМ/г белка, Перитонеальные смывы | 2,25±0,201 | 1,66±0,12 Р=0,032U |
| Диеновые конъюгаты гептановая фаза, е.о.и., Тимус | 1,005±0,07 | 1,019±0,068 Р=0,017U |
| Диеновые конъюгаты изопропанольная фаза (индукция Fe2+ / аскорбат), е.о.и., Костный мозг | 2,12±0,007 | 2,34±0,004 Р=0,015U |
| Диеновые конъюгаты гептановая фаза, е.о.и., Селезенка | 0,588±0,058 | 0,657±0,058 Р=0,042U |
| Кетодиены и сопряжённые триены гептановая фаза, е.о.и. Селезенка | 0,012±0,009 | 0,015±0,005 Р=0,025U |
| Шиффовы основания гептановая фаза, е.о.и., Селезенка | 0,008±0,002 | 0,018±0,005 Р=0,016U |
| Диеновые конъюгаты гептановая фаза, е.о.и., Печень | 0,515±0,022 | 0,536±0,01 Р=0,017U |
| Кетодиены и сопряжённые триены гептановая фаза, е.о.и., Печень | 0,174±0,0041 | 0,22±0,03 Р=0,024U |
| Окислительная модификация белка мкМ/г белка, Тимус | 0,249±0,008 | 0,141±0,006 Р=0,018U |
| Окислительная модификация белка мкМ/г белка, Костный мозг | 1,13±0,11 | 2,3±0,05 Р=0,027U |
| Окислительная модификация белка мкМ/г белка, Селезенка | 1,922±0,321 | 2,268±0,98 Р=0,042U |
| Окислительная модификация белка (индукция Fe2+ / Н2О2), мкМ/г белка, Селезенка | 6,602±1,245 | 7,477±2,123 Р=0,045U |
| Окислительная модификация белка мкМ/г белка, Головной мозг | 0,215±0,04 | 0,208±0,05 Р=0,009U |
Примечания: е.о.и. – единицы окислительного индекса (Е232/Е220-первичные, Е278/Е220-вторичные продукты, Е400 / Е220 – конечные продукты, извлекаемые гептановой и изопропанольной фазами липидного экстракта). U - критерий Манна-Уитни.
Активация свободно-радикального окисления в селезёнке проявлялась в увеличении содержания всех категорий гептан-растворимых продуктов ПОЛ, а также повышения содержания карбонилированных белков. В костном мозге, в отличие от селезёнки, наблюдалось снижение карбонилирования белков.
В печени животных, подвергнутых ложной операции после ГК30 наблюдалось увеличение содержания неполярных продуктов ПОЛ. В головном мозге (таблица 5), отмечено снижение содержания карбонилированных белков на базальном уровне.
Таким образом, осуществляемый после завершения ГК30 операционный стресс характеризовался увеличением содержания гептан-растворимых продуктов ПОЛ во внутренних органах и органо - специфичным изменением уровня карбонилирования белков.
Ложная операция на фоне 30 - суточной гипокинезии характеризовалась уменьшением количества нейтрофилов в перитонеальных смывах (с 9,3±1,19% в группе «ложная операция» до 3,6±0,31% в группе «ГК30 + ложная операция», P=0,044U), при неизменной функциональной активности. Отмечено наличие положительной корреляционной зависимости между уровнем изопропанол - растворимых диеновых конъюгатов и количеством нейтрофилов в перитонеальных смывах (Rs=0,745; P=0,018).
Особенности свободно-радикального окисления в перитонеальных смывах и внутренних органах при CLP -перитоните
В перитонеальном экссудате животных с CLP - перитонитом наблюдалось снижение содержания гептан-растворимых продуктов ПОЛ при одновременном увеличении содержания изопропанол - растворимых диеновых конъюгатов, а также базального уровня окислительно модифицированных белков и уровня Fe+2/H2O2 индуцированного карбонилирования (таблица 6).
В исследованных внутренних органах специфично менялось соотношение между липопероксидацией и окислением белков (таблица 7).
Так, в вилочковой железе наблюдалось снижение содержания гептан - растворимых диеновых конъюгатов при одновременном увеличении содержания диеновых конъюгатов в изопропанольной фазе. В тимусе также снижался уровень карбонилированных белков.
Для селезёнки характерно увеличение содержания карбонилированных белков и гептан-растворимых Шиффовых оснований. Для костного мозга характерно снижение содержания гептан-растворимых Шиффовых оснований на фоне увеличения уровня Fe+2/аскорбат индуцированного ПОЛ. Таким образом, среди иммунных органов наиболее эффективной антиоксидантной защитой при CLP - перитоните обладает костный мозг.
Таблица 6
Содержание продуктов липопероксидации и карбонилирования белков в перитонеальных смывах при CLP – перитоните
| Показатель | Ложная операция (n=8) | Перитонит (n=12) |
| Диеновые конъюгаты гептановая фаза, е.о.и. | 0,765±0,04 | 0,691±0,09 P=0,014U |
| Кетодиены и сопряжённые триены гептановая фаза, е.о.и. | 0,154±0,01 | 0,113±0,02 P=0,027U |
| Шиффовы основания гептановая фаза, е.о.и. | 0,084±0,02 | 0,016±0,002 P=0,014U |
| Диеновые конъюгаты изопропанольная фаза, е.о.и. | 0,778±0,015 | 0,812±0,04 P=0,027U |
| Окислительная модификация белка мкМ/г белка | 0,584±0,023 | 0,999±0,054 P=0,044U |
| Окислительная модификация белка (индукция Fe2+ / Н2О2), мкМ/г белка | 7,17±0,201 | 7,37±0,201 P=0,022U |
Примечания: е.о.и. – единицы окислительного индекса (Е232/Е220-первичные, Е278/Е220-вторичные продукты, Е400 / Е220 – конечные продукты, извлекаемые гептановой и изопропанольной фазами липидного экстракта). U - критерий Манна-Уитни.
В печени по сравнению с ложнооперированными животными было обнаружено увеличение уровня Fe+2/аскорбат - индуцированного ПОЛ. Кроме того, в органе снижалось содержание изопропанол-растворимых диеновых конъюгатов и увеличилось содержание гептан-растворимых диеновых конъюгатов (таблица 7).
Одновременно снижалась активность печёночной МАО-Б с 3,92±0,48 нМ / мг белка / мин (n=9) до 1,42 ±0,21нМ / мг белка / мин (n=9;P=0,021U). В связи с этим интересно отметить положительную корреляционную связь между активностью МАО-Б и содержанием изопропанол - растворимых диеновых конъюгатов (Rs=0,714; P=0,023).
При экспериментальном перитоните по сравнению с ложнооперированными животными наблюдалось увеличение содержания карбонилированных белков в головном мозге в ответ на индукцию в системе Фэнтона. Кроме того, по сравнению с ложнооперированными животными снижалось содержание общего белка в органе. Это даёт основание предполагать, что усиленное карбонилирование белков является механизмом активации протеолитических процессов в органе. Усилению карбонилирования белков в органе сопутствовало увеличение активности церебральной МАО-Б. В связи с этим заслуживают внимания положительные корреляционные зависимости между содержанием карбонилированных белков и уровнем активности церебральной МАО-Б (Rs=0,639; P=0,025).
Таблица 7
Перекисное окисление липидов и окислительная модификация белков во внутренних органах при CLP - перитоните
| Показатель | Ложная операция (n=9) | Перитонит (n=9) |
| Диеновые конъюгаты гептановая фаза, е.о.и., Тимус | 0,900±0,07 | 0,975±0,101 Р=0,027U |
| Диеновые конъюгаты изопропанольная фаза, е.о.и., Тимус | 0,851±0,072 | 1,07±0,085 Р=0,028U |
| Шиффовы основания гептановая фаза, е.о.и., Селезенка | 0,08±0,004 | 0,025±0,007 Р=0,026 U |
| Шиффовы основания гептановая фаза, е.о.и., Костный мозг | 0,031±0,009 | 0,019±0,002 Р=0,017U |
| Диеновые конъюгаты изопропанольная фаза (индукция Fe2+ / аскорбат), е.о.и., Костный мозг | 0,956±0,087 | 1,98±0,11 Р=0,017U |
| Диеновые конъюгаты изопропанольная фаза, е.о.и., Головной мозг | 0,730±0,061 | 2,94±0,191 Р=0,02WW |
| Диеновые конъюгаты изопропанольная фаза (индукция Fe2+ / аскорбат),е.о.и., Головной мозг | 1,037±0,92 | 0,906±0,102 Р=0,027WW |
| Кетодиены и сопряжённые триены изопропанольная фаза (индукция Fe2+ / аскорбат),е.о.и., Головной мозг | 1,243±0,154 | 0,875±0,081 Р=0,017U |
| Диеновые конъюгаты изопропанольная фаза, е.о.и., Печень | 0,612±0,043 | 0,56±0,024 Р=0,026 U |
| Диеновые конъюгаты изопропанольная фаза (индукция Fe2+ / аскорбат),е.о.и., Печень | 1,588±0,12 | 1,96±0,098 Р=0,026 U |
| Кетодиены и сопряжённые триены изопропанольная фаза (индукция Fe2+ / аскорбат), е.о.и., Печень | 6,15±0,36 | 8,64±0,42 Р=0,026 U |
| Окислительная модификация белка мкМ/г белка, Тимус | 0,2496±0,098 | 0,1981±0,012 Р=0,027 WW |
| Окислительная модификация белка мкМ/г белка, Селезенка | 1,9±3,321 | 2,47±1,12 Р=0,017U |
| Окислительная модификация белка мкМ/г белка, Головной мозг | 0,157±0,014 | 0,345±0,029 Р=0,044U |
| Окислительная модификация белка (индукция Fe2+ / H2O2), мкМ/г белка, Головной мозг | 3,294±2,28 | 6,69±3,123 Р=0,044U |
Примечания: е.о.и. – единицы окислительного индекса (Е232/Е220-первичные, Е278/Е220-вторичные продукты, Е400 / Е220 – конечные продукты, извлекаемые гептановой и изопропанольной фазами липидного экстракта). U - критерий Манна-Уитни.
В перитонеальном экссудате животных с CLP - перитонитом наблюдалось увеличение содержания нейтрофилов до 38,6±9,31 %, P=0,014U (в сравнении с группой «ложная операция»). Прирост содержания нейтрофилов сопровождался снижением их фагоцитарного числа (с 0,96±0,15 до 0,651±0,04, P=0,038 U).
Влияние предварительной гипокинезии на свободно-радикальное окисление в перитонеальных смывах и во внутренних органах при септическом перитоните
CLP – перитонит, воспроизводимый после завершения ГК30, характеризовался относительным снижением содержания гептан-растворимых Шиффовых оснований и увеличением окислительной модификации белка в перитонеальных смывах (таблица 8).
Таблица 8
Свободнорадикальное окисление в перитонеальных смывах
при CLP – перитоните, воспроизводимом на фоне гипокинезии
| Показатель | 1 Ложная перация (n=8) | 2 Перитонит (n=12) | 3 ГК30 +Перитонит (n=12) |
| Шиффовы основания гептановая фаза, е.о.и. | 0,084±0,02 | 0,016±0,002 P1,2=0,014U | 0,008±0,0003 P2,3=0,024U |
| Окислительная модификация белка, мкМ/г белка | 0,147±0,023 | 0,491±0,034 P1,2=0,044U | 1,22±0,072 P2,3=0,044U |
Примечания: е.о.и. – единицы окислительного индекса (Е232/Е220-первичные, Е278/Е220-вторичные продукты, Е400 / Е220 – конечные продукты, извлекаемые гептановой и изопропанольной фазами липидного экстракта). U - критерий Манна-Уитни.
При этом снижается уровень липопероксидации в печени, что проявляется в более низком уровне гептан-растворимых диеновых конъюгатов. В костном мозге снижено содержание изопропанол-растворимых диеновых конъюгатов. Одновременно наблюдалось увеличение эффективности антиоксидантной защиты костного мозга. Так, в группе «ГК30+перитонит» отмечен более высокий уровень Fe+2/аскорбат - индуцированного ПОЛ, что свидетельствует об увеличении окисляемости ацильных радикалов в полярных липидных фракциях (таблица 9).
В головном мозге, напротив, в группе «ГК30+перитонит» повышено содержание вторичных гептан-растворимых продуктов ПОЛ. В тимусе повышено содержание как гептан-растворимых диеновых конъюгатов, так и изопропанол - растворимых кетодиенов и сопряжённых триенов. В селезёнке также повышено содержание гептан-растворимых диеновых конъюгатов (таблица 9).
Таблица 9
Показатели свободнорадикального окисления во внутренних органах при моделировании перитонита у стрессированных животных (M±m)
| Показатель | 1 Ложная операция (n=11) | 2 ГК30 + Ложная операция (n=32) | 3 Перитонит (n=23) | 4 ГК30+ Перитонит (n=11) |
| Головной мозг | ||||
| Кетодиены и сопряжённые триены гептановая фаза, е.о.и. | 0,012±0,04 | 0,010±0,01 | 0,012±0,02 | 0,018±0,05 Р3,4=0,006U |
| Диеновые конъюгаты изопропанольная фаза (индукция Fe2+ / аскорбат),е.о.и., | 1,23±0,15 | 1,15±0,33 | 1,15±0,05 | 1,39±0,07 Р3,4=0,006U |
| Печень | ||||
| Диеновые конъюгаты гептановая фаза, е.о.и. | 0,515±0,084 | 0,536±0,09 | 0,547±0,03 | 0,523±0,04 Р3,4=0,028U |
| Кетодиены и сопряжённые триены гептановая фаза, е.о.и. | 0,174 ±0,02 | 0,22±0,01 | 0,19±0,01 | 0,13±0,02 Р3,4=0,006U |
| Диеновые конъюгаты изопропанольная фаза (индукция Fe2+ / аскорбат),е.о.и., | 1,59±0,08 | 1,97±0,04 | 1,96±0,06 | 2,36±0,19 Р3,4=0,017U |
| Костный мозг | ||||
| Диеновые конъюгаты изопропанольная фаза е.о.и. | 0,48±0,06 | 0,47±0,1 | 0,51±0,03 | 0,45±0,09 Р3,4=0,0035 U |
| Диеновые конъюгаты изопропанольная фаза (индукция Fe2+ / аскорбат),е.о.и., | 2,12±0,34 | 2,34±0,56 | 2,38±0,09 | 1,98±0,04 Р3,4=0,01U |
| Селезёнка | ||||
| Диеновые конъюгаты гептановая фаза, е.о.и. | 0,588±0,15 | 0,657±0,2 | 0,567±0,07 | 0,670±0,03 Р3,4=0,01U |
| Тимус | ||||
| Диеновые конъюгаты гептановая фаза, е.о.и. | 1,005±0,024 | 1,01±0,018 Р1,2=0,01U | 0,975±0,071 | 0,988±0,08 Р3,4=0,01U |
Примечания: е.о.и. – единицы окислительного индекса (Е232/Е220-первичные, Е278/Е220-вторичные продукты, Е400 / Е220 – конечные продукты, извлекаемые гептановой и изопропанольной фазами липидного экстракта). U - критерий Манна-Уитни.
Предварительная гипокинезия существенно повлияла на клеточный состав воспалительного экссудата при CLP – перитоните (таблица 10).
Это проявлялось в увеличении количества нейтрофильных гранулоцитов при одновременном снижении количества лимфоцитов. Кроме того, гипокинетический стресс ограничивает снижение фагоцитарного числа, вызванное септическим перитонитом (таблица 10).
Таблица 10
Клеточный состав перитонеальных смывов при CLP - перитоните у стрессированных животных (M±m)
| Показатель | 1 Ложная операция (n=8) | 2 Перитонит (n=7) | 3 Гипокинезия+ Перитонит (n=10) |
| Лейкоциты (109/л) | 69,17±3,96 | 74,50±4,16 | 89,46±3,81 P2,3=0,016U |
| Нейтрофилы (%) | 9,3±4,19 | 38,6±9,31 P=0,014U | 62,7±2,87 P2,3=0,027U |
| Лимфоциты (%) | 83,25±6,25 | 47,2±5,01 P=0,014U | 36,8±4,431 P2,3=0,019U |
| Фагоцитарное число | 0,96±0,15 | 0,651±0,04 P=0,038 U | 0,894±0,005 P2,3=0,044 U |
Примечание к таблице: U - Критерий Манна – Уитни
Основным итогом выполненного исследования является обнаруженный факт усугубления воспалительного процесса в брюшной полости на фоне 30 - суточной гипокинезии. Таким образом, экспериментально показана возможность развития осложнений при перитоните в результате длительного ограничения двигательной активности, что необходимо учитывать в хирургической практике.
Прежде всего, это связано с провоспалительными эффектами ГК30 в брюшине. Их наличие может быть связано с гиперцитокинемией, характерной для гипокинезии (Сысаков Д.А., 2009). Вероятно, последствием гиперцитокинемии является формирование градиентов хемоаттрактантов.
При ГК30, также как и при экспериментальном перитоните, продукты свободнорадикального окисления обладают бактерицидным действием и вносят свой вклад в элиминацию инфекционных агентов при септическом перитоните (Skau T et al.,1986). Кроме того, они выступают в роли хемоаттрактантов для лейкоцитарных клеток (Маянский Д.Н.,1991). Гипокинезия оказывает аддитивное действие на перитонит-зависимое усиление окислительной модификации белков в воспалительном очаге. Вполне возможно, что это способствует реализации провоспалительных эффектов стресса применительно к экспериментальному перитониту.
ВЫВОДЫ
- У животных, подвергнутых 30 - суточной гипокинезии, как и у ложнооперированных животных, наблюдается увеличение содержания гептан-растворимых Шиффовых оснований в перитонеальных смывах, что ассоциируется с появлением в них нейтрофильных гранулоцитов.
- Осуществляемый после завершения ГК30, операционный стресс характеризуется увеличением содержания гептан-растворимых продуктов ПОЛ во внутренних органах и органо - специфичным изменением уровня карбонилирования белков.
- В перитонеальных смывах при септическом перитоните наблюдается усиление окислительной модификации белка, снижение содержания гептан-растворимых диеновых конъюгатов и увеличение количества нейтрофилов со сниженным фагоцитарным числом.
- Моделирование перитонита на фоне предварительной 30 – суточной привело к снижению уровня гептан-растворимых Шиффовых оснований, показателей НСТ - теста и уровня фагоцитарной активности нейтрофилов на фоне увеличения их количества в перитонеальных смывах.
- В печени и в головном мозге 30 - суточная гипокинезия с септическим перитонитом приводит к усилению Fe+2/аскорбат-индуцированного ПОЛ. При этом в печени снижается, а в головном мозге увеличивается содержание гептан-растворимых продуктов ПОЛ.
- Сочетание 30 - суточной гипокинезии с септическим перитонитом приводит к повышению содержания гептан-растворимых продуктов ПОЛ в тимусе и селезёнке и в снижении содержания изопропанол- растворимых диеновых конъюгатов в костном мозге.
Список опубликованных работ:
- Tseilikman, V.E. Stress-induced hepatitis and sensitivity to pro-inflammatory cytokines and glucocortikoids / V.E.Tseilikman, O.B. Tseilikman, M.I. Nusratov, S.V.Popov, D.A.Kozochkin // European journal of Immunology Supplement 1/09. Immunity for life Immunology for health Abstracts 2nd European congress of Immunology September 13-16, 2009 Berlin, Germany.
- Tseylikman, V.E. Endocrine-immune interaction under stress conditions on hypertensive and normotensive rats / V.E. Tseylikman, O. B. Tseyliman, D.A. Kozochkin, A.I. Sinitsky, S.V.Popov, E.S. Katashinsky, A.M. Mironov // The journal of Physiological Sciences Proceedings of the XXXVI International Congress of Physiological Sciences Function of Life: Elements and Integration July 27–August 1, 2009, Kyoto, Japan.
- Лаптева, И.А. Состояние свободнорадикального окисления в эритроцитах и во внутренних органах при гипокинетическом и иммобилизационном стрессе / И.А. Лаптева, А.Б. Горностаева, Д.А. Козочкин, Д.А. Романов, С.В. Попов // Актуальные проблемы теоретической и прикладной биохимии. Российская конференция, посвящённая 80-летию со дня рождения Р.И. Лифшица. Челябинск. – 2009. – С. 57.
- Цейликман, В.Э. Модифицирующее влияние хронического стресса на реакцию лейкоцитарного звена системы крови и процессы свободнорадикального окисления в воспалительном очаге при экспериментальном перитоните / В.Э. Цейликман, М.И. Нусратов, С.В. Попов, Е.В. Плеханова, Р.В. Деев // Вестник Уральской медицинской академической науки. Тематический выпуск по аллергологии и иммунологии. -2010- № 2/1 (29). – С.226-227.
- Плеханова, Е.В. Изменение функционального статуса нейтрофилов и количества нейтрофильных внеклеточных ловушек у крыс при стрессе и его сочетании с экспериментальным перитонитом / Е.В. Плеханова, В.Э. Цейликман, Д.А. Козочкин, С.В. Попов, А.И. Синицкий // Вестник Уральской медицинской академической науки Тематический выпуск по микробиологии, иммунологии, биотехнологии.- 2011.-№4/1 (38) С.145-146
- Плеханова, Е.В. Изменение функционального статуса нейтрофилов, количества нейтрофильных внеклеточных ловушек и уровня свободно-радикального окисления в воспалительном очаге при экспериментальном перитоните ./ Е.В. Плеханова, В.Э. Цейликман, М.И. Нусратов, Т.В. Соломатова, С.В.Попов // Вестник Уральской медицинской академической науки. - 2011.- № 2/1.- С. 61 – 62.
- Плеханова, Е.В. Изменения функционального статуса нейтрофилов при экспериментальном стрессе микробной и немикробной этиологии у животных / Е.В. Плеханова, Е.А.Мезенцева, И.Ю.Орнер, В.А.Маркова, А.И.Синицкий, С.В.Попов // Вестник Уральской медицинской академической науки.- 2012.- №2 (39).- С.112-113.
- Cтрельников, И.В. Влияние предварительной гипокинезии на глюкокортикоид-зависимые изменения поведенческой активности и свободно-радикального окисления в различных отделах головного мозга / И.В.Cтрельников, В.Э. Цейликман, Д.А. Козочкин С.В.Попов, А.Л. Цытович, Л.Ф. Чарная // Вестник Уральской медицинской академической науки. – 2012.- № 2.- С.113 – 114.
Список использованных сокращений:
ГК – гипокинезия
ГК30 – тридцатисуточная гипокинезия
ДК – диеновые конъюгаты
КДиСТ – кетодиеновые сопряженные с триеновыми
МАО-Б – моноаминоксидаза-Б
ОМБ – окислительная модификация белка
ПОЛ – перекисное окисление липидов
ШО – Шиффовы основания
U – критерий Манна-Уитни
WW – критерий Вальда-Вольфовица
Работа проведена в рамках ФЦП "Научные и научно-педагогические кадры инновационной России" на 2009 - 2013 годы, Соглашение №8275 от 23.10.2012 (НОЦ " Проблемы фундаментальной и клинической медицины ").
