Выделение и изучение основных биологических свойств бактериофагов escherichia coli о157 и их применение в диагностике микробиология
На правах рукописи
Молофеева Надежда Ивановна
ВЫДЕЛЕНИЕ И ИЗУЧЕНИЕ ОСНОВНЫХ БИОЛОГИЧЕСКИХ СВОЙСТВ БАКТЕРИОФАГОВ ESCHERICHIA COLI О157 И ИХ ПРИМЕНЕНИЕ В ДИАГНОСТИКЕ
- микробиология
03.00.23 биотехнология
АВТОРЕФЕРАТ
диссертации на соискание ученой степени
кандидата биологических наук
Саратов - 2004
Работа выполнена на кафедре микробиологии, вирусологии, эпизоотологии и ветеринарно-санитарной экспертизы Ульяновской государственной сельскохозяйственной академии
Научные руководители: доктор биологических наук, профессор
Васильев Дмитрий Аркадьевич
кандидат ветеринарных наук, доцент
Золотухин Сергей Николаевич
Официальные оппоненты: доктор биологических наук
профессор Игнатов Олег Владимирович
доктор ветеринарных наук
профессор Русалеев Владимир Сергеевич
Ведущая организация: Ульяновский государственный университет
Защита диссертации состоится «___»____________ 2004 года в _____ часов на заседании диссертационного совета Д 220.061.04 в Федеральном государственном образовательном учреждении высшего профессионального образования «Саратовский государственный аграрный университет им. Н.И.Вавилова» по адресу: 410005, г. Саратов, ул. Соколовая, 335.
С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке ФГОУ ВПО «Саратовский государственный аграрный университет им. Н.И.Вавилова» по адресу: 410005, г. Саратов, ул. Соколовая, 335.
Автореферат разослан «___»____________2004.
Ученый секретарь
диссертационного совета,
доктор биологических наук Л.В.Карпунина
Общая характеристика работы
Актуальность темы. Escherichia coli являются распространенными возбудителями инфекционных заболеваний желудочно-кишечного тракта у животных и человека (Покровский и др., 1989; Cantey, 1993;Тугаринов, Пирожков, Малахов, 2001).
В последнее время в научной литературе появилось большое число сообщений о заболеваниях людей, протекающих в тяжелой форме, вызванных Е.coli O157, которые образуют шигаподобный вероцитотоксин (Riley, Remis, Helgerson,1985; Покровский и др., 1989; Ратинер, Бондаренко, 1998). Вспышки этой инфекции зарегистрированы во многих странах Северной и Южной Америки, Австралии, Европы, Азии, Африки и в нашей стране. Эшерихии серогруппы О157 вызывают у молодняка животных диарею, геморрагический энтероколит и отечную болезнь у поросят (Тугаринов, Пирожков, Малахов, 2001). Так как основным резервуаром инфекции является крупный и мелкий рогатый скот, свиньи, реже лошади, олени, птица, то особенно опасны для людей пищевые продукты, полученные от этих животных (Armstrong, Hollingsworth, Morris, 1996; Easton, 1997), а также растительные продукты, выращенные на полях, куда мог вывозиться необеззараженный навоз от животных-носителей этой серогруппы эшерихий (Cielask et al., 1993). По данным J. Tuttle et al. (1999) в ноябре 1992 года - феврале 1993 года наблюдалась вспышка (более 700 случаев) на Западе США, вызванная E.coli О157:Н7, связанная с гамбургерами, приготавливаемыми в ресторанах. Исследования показали, что для заражения человека достаточна инфицирующая доза, не превышающая 700 бактерий.
Эффективность профилактических мероприятий во многом зависит от своевременной диагностики болезни у сельскохозяйственных животных, поэтому совершенствованию методов лабораторной диагностики вышеуказанной инфекции уделяется большое внимание. Современные методы иммунодиагностики (ИФА), предлагаемые для индикации этих бактерий, хотя и являются высокоспецифичными и чувствительными, но сложность методик, высокая стоимость оборудования и реактивов делает их пока недоступными для большинства лабораторий. В лабораторной практике для индикации микроорганизмов в патологическом материале и объектах внешней среды, а также для их быстрого типирования, предложены бактериофаги (Гольдфарб, 1961; Ганюшкин, 1988; Русалиев, 1990; Кольпикова, Бакулов, Котляров, 1990, 1992). Методы фагодиагностики просты в постановке, специфичны, не требуют больших затрат времени, материалов и общедоступны.
Цель исследования. Разработка параметров и технологических приёмов по индикации и идентификации E.coli О157 с помощью реакции нарастания титра фага (РНФ).
Задачи исследования. В связи с этим при выполнении работы решались следующие задачи:
1.Выделить и селекционировать бактериофаги, активные в отношении штаммов Е.coli O157.
2.Изучить основные биологические свойства (морфология негативных колоний, литическая активность и ее спектр, специфичность, температурная устойчивость, устойчивость к хлороформу) селекционированных изолятов.
3. Подобрать оптимальный набор выделенных фагов и сконструировать на их основе новый биопрепарат – диагностикум.
4. Разработать схему выделения и ускоренной идентификации бактерий E.coli О157 с использованием выделенных фагов.
5. Разработать схему ускоренной индикации бактерий E.coli О157 в объектах ветеринарного надзора с помощью РНФ и использованием созданного биопрепарата.
6. Разработать технологические параметры получения биопрепарата для фагодиагностики.
Научная новизна работы.
- Впервые были выделены бактериофаги активные в отношении штаммов E.coli О157.
- Изучены основные биологические свойства выделенных фагов. Доказана эффективность использования селекционированных бактериофагов для индикации и идентификации E.coli O157.
- Разработаны технологические параметры по получению диагностического биопрепарата фага и схема постановки РНФ.
Практическая значимость работы. Выделены и селекционированы специфичные бактериофаги, активные в отношении патогенных штаммов эшерихий серологической группы О157. Два выделенных и изученных штамма депонированы в лаборатории бактериальных инфекций ВГНКИ, признаны перспективными и рекомендованы для изготовления диагностического и лечебно-профилактического препарата. Разработана «Временная инструкция по изготовлению и контролю лабораторной серии индикаторных бактериофагов E.coli О157 Е-61 УГСХА и Е-67 УГСХА».
Для врачей бактериологов написаны «Методические рекомендации по ускоренной индикации методом реакции нарастания титра фага (РНФ) энтерогеморрагической кишечной палочки E.coli О157 в патологическом материале, пищевых продуктах, кормах и объектах внешней среды» и «Методические рекомендации по выделению и фаготипированию энтерогеморрагической кишечной палочки E.coli О157 из патологического материала, кормов, пищевых продуктов и объектов внешней среды с применением диагностических бактериофагов Е-61 УГСХА и Е-67 УГСХА», одобрены ученым советом и утверждены ректором академии 16.02.04 г.
Основные положения диссертационной работы, выносимые на защиту:
- Схема выделения бактериофагов E.coli O157.
- Биологические свойства выделенных бактериофагов E.coli O157.
- Сконструирование из отобранных фагов нового биопрепарата – диагностикума.
- Разработка схемы выделения и ускоренной идентификации бактерий E.coli О157 с использованием выделенных фагов.
- Разработка схемы ускоренной индикации бактерий E.coli О157 в объектах ветеринарного надзора с помощью РНФ и использованием созданного биопрепарата.
6. Разработка технологических параметров получения биопрепарата для фагодиагностики E.coli O157.
Работа выполнена в соответствии с комплексным планом научной работы кафедры микробиологии, вирусологии, эпизоотологии и ветеринарно-санитарной экспертизы Ульяновской государственной сельскохозяйственной академии.
Апробация работы. Результаты основных исследований, подтверждены актом комиссионных испытаний в ВГНКИМ (от 30.05.02.) и УГСХА (от 27.01.03.). Материалы диссертации доложены и обсуждены на научно-практических конференциях УГСХА (2000, 2001, 2002), семинарах Ульяновского областного управления ветеринарии (2001), на международной научно - практической конференции (Воронеж, 2002).
Публикации. По теме диссертации опубликовано 5 работ.
Структура и объем диссертации. Диссертация изложена на 166 страницах машинописного текста и включает: введение, обзор литературы, материалы и методы, результаты собственных исследований, обсуждение, выводы, практические предложения и список литературы (229 источников, в том числе 110 отечественных). Работа иллюстрирована 25 таблицами, 8 рисунками, 1 схемой и дополнена приложениями.
СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ
Материалы и методы исследования
Штаммы: В работе использованы как гомологичные - 6 штаммов E.coli серологической группы O157, так и гетерологичные - 67 штаммов E.coli, в том числе 12 штаммов получены из лаборатории ООИ центра санэпиднадзора Ульяновской обл, 56 штаммов E.coli выделены нами из хозяйств Московской, Ульяновской и Самарской областей. Помимо этого, при определении специфичности бактериофагов использовались 71 штамм бактерий других родов: Proteus, Citrobacter, Morganella, Klebsiella, Salmonella, Staphylococcus, Pseudomonas, Bacillus, полученные из музея кафедры. Они обладали типичными для данных культур биологическими свойствами. Объектами исследования явились фаги E.coli O157, выделенные нами из объектов внешней среды хозяйств Ульяновской и Самарской областей.
Питательные среды. Для бактериологического исследования использовали питетельные среды: мясо-пептонный бульон (МПБ) (НПО «Питательные среды», г. Махачкала), мясо-пептонный агар (МПА) (НПО «Питательные среды», г. Махачкала); среды: Симонса (НИИ питательных сред, г. Махачкала), Эндо (ГНЦ прикладной микробиологии, г. Оболенск), сорбитол E.coli О157:Н7 агар (ГНЦ прикладной микробиологии, г. Оболенск), Клиглера (НИИ питательных сред, г. Махачкала), Гисса с индикатором Андраде (глюкоза, лактоза, сахароза, маннит, арабиноза, рамноза, дульцит, раффиноза, ксилоза, адонит, инозит, салицин) (НПО «Питательные среды» г. Махачкала), Fluorocult E.coli О157:Н7 Agar (фирма Merck).
Набор эшерихиозных агглютинирующих серогрупповых О-коли сывороток (Армавирская биофабрика).
Приборы и оборудование. Термостаты ТС-80М-2; микроскопы МБИ-3, электронный микроскоп JEM-100В (Япония), микроскоп МИР-12т, лупа бинокулярная МБС-9, ультратермостаты УТ-15У4,2; вакуумный насос Mezmolnice (Чехословакия), бактериальные фильтры L-3 свечи Шамберлана, центрифуги лабораторные ОПн-8УХЛ4,2 и ЦЛС-3; аппарат ультрафиолетового облучателя крови «Изольда» с ртутной лампой ДРБ8-1; холодильники бытовые, колбы мерные, пипетки пастеровские, пипетки мерные на 1,0; 2,0; 5,0; 10 см3, флаконы ёмкостью 50, 100 см3, стёкла покровные, стёкла предметные, чашки Петри, пробирки, стандарты мутности на 0,5 и 1,0 млрд. микробных клеток.
Методы. В работе использовались методы приведенные в «Методических указаниях по бактериологической диагностике колибактериоза (эшерихиоза) животных», утвержденные Департаментов ветеринарии МСХ и П РФ 27.07.00 и в «Методических указаниях по методам выделения и идентификации энтерогеморрагической кишечной палочки E.coli O157:Н7», МУК 4.2.992-00 утвержденные Главным государственным санитарным врачом Российской Федерации 4.11.2000. Исследования фагов проводили общепринятыми методами: А.Адамс (1961), Д.М.Гольдфарб (1961), И.М. Габрилович (1973), А.П.Пономарева, О.Г.Андреевой и Т.Н.Артамоновой (2002).
Результаты исследований и их обсуждение
Поиск и селекции бактериофагов
Для выполнения цели диссертационных исследований необходимо было первоначально выделить и изучить искомый бактериофаг, поэтому первым этапом нашей работы была попытка выделить бактериофаги E.coli О157 из имеющихся у нас штаммов бактерий E.coli О157. Мы надеялись обнаружить лизогенные культуры, так как бактериофаги, выделенные из таких культур, обладают более выраженной специфичностью (Жугова, 1985).
Выделить бактериофаги из имеющихся у нас культур E.coli О157 мы пробовали различными методами. Все изученные нами штаммы исследовались как индикаторные и как «лизогенные».
В первой серии опытов на культуры, исследуемые как «лизогенные», воздействовали индуцирующим фактором, затем фильтровали через бактериальные свечи Шамберлана L-3 (Ревенко, 1978). В качестве индуцирующего фактора применяли воздействие на бактерии ультрафиолетовыми лучами, в течение 30 секунд при помощи прибора «Изольда» с ртутной лампой ДРБ8, 18,0%, мощности которой приходится на область 254 нм. Полученный фильтрат исследовали на наличие фага на имеющихся культурах E.coli О157 методом агаровых слоев. По данным наших исследований, можно сделать вывод, что культуры E.coli О157 штаммы РЛ. №904, №35150, №43895, №51659, XLI в опытах при воздействии на них ультрафиолетовыми лучами не проявили лизогенных свойств.
Во второй серии опытов использовали методику, предложенную С.Лурия, Д. Дарнелл (1970), для выделения бактериофагов энтеробактерий из культур E.coli О157 без воздействия на них индуцирующего фактора. Проведя эти исследования нам не удалось выделить бактериофаги E.coli О157 из имеющихся у нас штаммов бактерий E.coli О157.
Резюмируя полученные данные, можно утверждать, что мы не обнаружили явления лизогении у имеющихся штаммов бактерий.
Мы решили перейти к методу выделения бактериофагов E.coli О157 из объектов внешней среды (Адельсон, 1962). Для этого мы использовали сточные воды в свиноводческих хозяйствах и молочно-товарных фермах в различных хозяйствах Ульяновской и Самарской областей. При исследовании 26 образцов, удалось выявить из 4 образцов присутствие искомого фага по наличию на газоне индикаторной культуры E.coli О157, негативных колоний. Результаты представлены в таблице 1.
Таблица 1
Источники выделения бактериофагов E.coli О157
| № | Название фага | Лизис бактерий E.coli О157 | Из чего выделен | Место и год Выделения |
| 1. 2. 3. 4. 5. | Е –61 УГСХА Е –2 УГСХА Е -3 УГСХА Е-4 УГСХА Е –67 УГСХА | РЛ, 43895, 51659, XLI РЛ, 43895, 51659, XLI 904,43895, 51659, XLI 904, 43895, 51659, XLI РЛ, 904, 35150, 43895, 51659, XLI | Сточные воды МТФ Сточные воды МТФ Сточные воды СТФ Сточные воды СТФ Сточные воды МТФ | УЧХОЗ, 2000 УЧХОЗ, 2000 УЧХОЗ, 2001 УЧХОЗ, 2001 САМАРА, 2001 |
Для получения чистой линии фага проводили до пяти пассажей из изолированных негативных колоний по методике, описанной Dulbeio, Vogt (1954) и использованной И.М.Габриловичем (1992), С.Н. Золотухиным (1994).
В результате проведённых опытов нами были выделены и изолированы методом прогревания 5 штаммов фагов E.coli О157 Е-61 УГСХА, Е-2 УГСХА, Е-3 УГСХА, Е-4 УГСХА, Е-67 УГСХА. Фаг Е-4 УГСХА при хранении при температуре 2-40С в течение 3 месяцев потерял свою активность и в дальнейших исследованиях не использовали.
Характеристика фагов E.coli О157
Изучение биологических свойств фагов проводили по методам, предложенным А.С.Тихоненко (1968); Т.Г.Чинашвили (1968); И.М.Габрилович (1973); D.Reanney H.-W.Ackermann (1982). Исследовались следующие свойства фагов E.coli серологической группы О157: а) морфология негативных колоний; б) литическая активность; в) спектр литической активности; г) специфичность действия; д) температурная устойчивость; е) устойчивость к хлороформу; ж) литический фермент; з) электронная микроскопия.
а) Морфология негативных колоний
Морфология негативных колоний изучалась при посевах фагов методом агаровых слоёв по Грация на питательном агаре. Учёт производился через 18-20 часов инкубации при температуре 37°С. Негативные колонии, образуемые изученными бактериофагами, разделены нами на три типа по классификации Тихоненко (1968). Колонии типа «а» образуют округлые негативные колонии с ровными краями, от 1,5 до 2,5 мм в диаметре. У двух бактериофагов (Е-61 УГСХА и Е-2 УГСХА) отмечались негативные колонии типа «а». Один бактериофаг (Е-3 УГСХА) образовывал крупные, полупрозрачные негативные колонии с ровными краями, центр с вторичным ростом индикаторной культуры, от 2,5 до 3,0 в диаметре – тип «в». Тип «с» образовывал один бактериофаг (Е-67 УГСХА), прозрачные негативные колонии, округлые с ровными краями, от 0,5 до 1,0 мм в диаметре.
б) Литическая активность бактериофагов E.coli О157
Литическую активность селекционированных бактериофагов проводили по методу Аппельмана и Грация (Д.М.Гольдфарб, 1961). Определение активности фага Е-61 УГСХА по методу Аппельмана составила 10-7, фага Е-2 УГСХА составила 10-5, фага Е-3 УГСХА составила 10-6, фага Е-67 УГСХА составила 10-7. Результаты изучения литической активности выделенных фагов по Грация представлены в таблице 2 и титр составлял от 1,0х109 до 3,2х109 фаговых корпускул в 1 мл.
Таблица 2
Литическая активность бактериофагов E.coli О157 по Грация
| № | Фаги | Титр |
| 1. 2. 3. 4. | Е-61 УГСХА Е-2 УГСХА Е-3 УГСХА Е-67 УГСХА | 3,2х109 1,0 х109 2,0х109 1,5х109 |
в) Спектр литической активности бактериофагов E.coli О157
Спектр литической активности является характерной особенностью фага, и им пользуются для его идентификации (М.Адамс, 1961). Для изучения спектра литической активности четырех селекционированных фагов (Е–61 УГСХА, Е–2 УГСХА, Е–3 УГСХА, Е-67 УГСХА) мы использовали 6 референс штаммов E.coli О157 (шт. РЛ, №904, №35150, №43895, №51659 и XLI) и проводили его методом нанесения фага на газон бактериальной культуры (Ганюшкин, 1988). Результаты опыта представлены в таблице 3.
Таблица 3
Спектр литической активности эшерихиозных фагов по отношению
к штаммам бактерий E.coli О157.
| № | Фаги | Кол-во испытан. штаммов | Из них чувствит. к фагу | Лизируемые штаммы | % лизируемых штаммов |
| 1 2. 3. 4. | Е-61 УГСХА Е-2 УГСХА Е-3 УГСХА Е-67 УГСХА | 6 6 6 6 | 4 4 4 6 | РЛ,43895,51659,XLI РЛ,43895.51659,XLI 904,43895,51659,XLI РЛ,904, 35150.43895 51659, XLI | 66,6 66,6 66,6 100 |
Исследования показали, что наиболее широким спектром литической активности по отношению к изучаемым культурам обладает штамм фага Е–67 УГСХА, который лизировал все имеющиеся у нас штаммы E.coli О157, что составляет 100%.
г) Специфичность действия бактериофагов E.coli О157
Эта способность фагов определяется прежде всего сродством их к фаговым рецепторам лизируемых бактерий и используется в практике для дифференциации бактерий. Изучение специфичности четырех бактериофагов E.coli О157 (Е-61 УГСХА, Е-2 УГСХА, Е-3 УГСХА, Е-67 УГСХА) проводили по отношению к представителям полевых штаммов E.coli -67 штаммов, Proteus -36 штаммов, Citrobacter -12 штаммов, Morganella -6 штаммов, Klebssiella -4 штамма, Salmonella -6 штаммов, Staphylococcus -3 штамма, Pseudomonas aureginisa -2 штамма, Bacillus cereus -2 штамма. Установлено, что фаги не лизировали ни одну из испытуемых бактерий E.coli других серогрупп и неактивны к представителям бактерий других видов, поэтому можно сделать вывод о том, что селекционированные фаги являются специфичными по отношению к E.coli О157.
д) Температурная устойчивость бактериофагов E.coli О157
Степень устойчивости бактериофагов к инактивирующим температурным факторам имеет таксономическое значение. Исследования по изучению термочувствительности селекционированных бактериофагов были проведены по методикам, предложенным М.Адамс (1961); Д.М. Гольдфарб (1961); И.М.Габрилович (1973). Результаты исследования представлены в таблице 4.
Таблица 4
Температурная устойчивость бактериофагов E.coli О157
| Температура, °С | ФАГИ | |||
| Е-61 УГСХА | Е-2 УГСХА | Е-3 УГСХА | Е-67 УГСХА | |
| 60 –63 | 1,2х108 | 3,7х108 | 2,3х108 | 3х108 |
| 64 –66 | 3,2х108 | 4,5х108 | 1,2х108 | 1,8х108 |
| 67 –70 | 2,5х108 | 3,1х108 | 2,4х108 | 1,8х108 |
| 71 –73 | 1,4х108 | 1,3х108 | 2,3х108 | 1,4х108 |
| 74 –76 | 6,2х108 | 3,1х108 | 2,6х108 | 1,0х108 |
| 77 –80 | 5,3х108 | 1,7х108 | 2,6х108 | 3х108 |
| 81 –83 | 1,5х106 | 1,2х106 | 3,4х106 | 4,1х106 |
| 84 –85 | 3,1х102 | 1х101 | 8х101 | 2,5х102 |
| 86 –88 | 4±1,2 | - | 1±0,1 | 1,5х101 |
| 88-90 | - | - | - | - |
| Контроль фага | 4х108 | 5х108 | 1х108 | 1х108 |
| Контроль культуры | Рост бактерий | Рост бактерий | Рост бактерий | Рост бактерий |
Полученные данные свидетельствуют о выраженной устойчивости фагов к воздействию температуры в 800 С.
е) Устойчивость выделенных бактериофагов к воздействию хлороформа
Обычно бактериофаги устойчивее к хлороформу, чем клетки микроорганизмов, поэтому данный химический агент является хорошим средством для освобождения фаголизата от жизнеспособных бактерий. Определение чувствительности бактериофагов и бактерий проводили путем обработки фаговой суспензии и бульонной культуры эшерихий хлороформом в соотношении 1:10 при постоянном встряхивании. Обработка бактерий E.coli О157 индикаторных штаммов РЛ, №904, №51659 в течение 17 минут хлороформом приводила к их полной инактивации. Бактериофаги проявили выраженную устойчивость к воздействию хлороформа. При его воздействии на фаголизаты в течение 40 минут существенного уменьшения активных фаговых корпускул в 1 мл не наблюдалось.
ж) Изучение наличия литического фермента
Литические ферменты бактериофагов играют существенную роль в процессе фаговой инфекции. Литический фермент проявляется на плотной питательной среде вокруг негативных колоний, обработанных хлороформом. Отмечено, что характер ореолов имеет таксономическое значение для ряда бактериофагов (Габрилович, 1973; Жугова, 1985; Васильев, Померанцев, 2001). Определение свободного литического фермента определяли по методике описанной Д.М. Гольдфарбом и В.А.Зуевым (1963). По показателям образования литического фермента бактериофаги E.coli О157 мы распределили в 2 группы. В 1 - отнесли фаг Е-61 УГСХА и Е-2 УГСХА, по характеру проявления свободного литического фермента они однотипны и образуют вокруг негативных колоний ореолы крупных размеров от 5 до 7 мм, а фаг Е-3 УГСХА и Е-67 УГСХА образуют ореолы мелких размеров от 2,6 до 3,3 мм.
з) Электронная микроскопия
Для электронно-микроскопических исследований в качестве исследуемого материала использовали лизаты бульонных культур E. coli O157 с бактериофагами Е-61 УГСХА, Е-2 УГСХА, Е-3 УГСХА, Е-67 УГСХА.
Электронно-микроскопические исследования проводили по методике, предложенной А.П.Пономаревым, О.Г.Андреевой и Т.Н.Артамоновой (2002). Методика отработана для работы с вирусами животных и успешно применяется при подготовке
препаратов для электронной микроскопии. В результате проведенных исследований было установлено, что вирионы фага имеют структуры, состоящие из головки в форме растянутого многогранника с отростком. У основной массы вирионов чехол находится в растянутом состоянии, что характерно для интактных частиц. Чехол отростка на всем протяжении прямой и имеет цилиндрическую форму. Концевая структура отростка ограничивается базальной мембраной, от которой отходят короткие нити. Единичные вирионы имеют отросток в сокращенном состоянии, то есть чехол отростка укорачивается и расширяется. При этом просматривается внутренний стержень отростка. Вирусные частицы имеют следующие размеры: диаметр головки: 68 нм, высота – 106 нм и длина отростка – 135 нм. Отношение высоты головки к её диаметру равно 1,55, что позволяет заключить о растянутости многогранника частиц данного фага (рис.1).
Рис.1. Электронная микроскопия. Морфология бактериофага Е-67 УГСХА 102000
Таким образом, в соответствии с морфологическими параметрами изучаемые фаги согласно Международной классификации и номенклатуре вирусов относятся к семейству Myoviride (F.A. Murphy и др., 1995), а по классификации А.С.Тихоненко - к V морфологической группе: «Фаги с отростком сложного строения, чехол которого способен к сокращению» (Тихоненко,1968).
Разработка схемы ускоренной идентификации бактерий E.coli О157 с использованием бактериофагов
Используя строгую специфичность селекционированных нами бактериофагов по отношению к патогенным штаммам E.coli О157 мы разработали схему выделения и ускоренной идентификации этих микроорганизмов и сравнили ее со схемой бактериологического исследования патологического материала, изложенной в действующих «Методических указаниях по бактериологической диагностике колибактериоза (эшерихиоза) животных», утвержденные Департаментом ветеринарии МСХ и П РФ 27.07.00. Результаты исследований представлены на схеме 1.
Схема 1. Выделение и ускоренная идентификация E.coli О157 с помощью селекционированных нами бактериофагов (I)
в сравнении со схемой бактериологического исследования, изложенной
в "Методических указаниях по бактериологической диагностике
колибактериоза (эшерихиоза) животных (II)
I II
Результат
Итого: 48 часов (2 суток)
Итого: 120 часов (5 суток)
Результат исследований считали положительным, если на месте нанесения одного или трех штаммов фагов на газоне сплошного роста культуры образовывалась прозрачная зона лизиса с вторичным ростом фагорезистентных микроорганизмов или без него, а также рост негативных колоний фага. Отрицательным считали результат при отсутствии лизиса на газоне роста исследуемой культуры микроорганизмов и отсутствии лизиса в контроле. При положительном результате культуру относили к виду E.coli О157. В результате проведенных исследований из всех 12 проб фекалий были выделены исходные культуры эшерихий, принадлежащих к серогруппе О157, о чем свидетельствовали результаты изучения их ферментативных и антигенных свойств.
Предлагаемая нами схема позволяет выделить и идентифицировать E.coli О157 за 48 часов (2 суток), тогда как срок бактериологического исследования по схеме изложенной в «Методических указаниях по бактериологической диагностике колибактериоза (эшерихиоза) животных» составил 120 часов (5 суток) при большей затрате посуды и реактивов.
Разработка оптимальных условий постановки РНФ
При разработке оптимальных условий постановки РНФ необходимо прежде всего: а) иметь биопрепарат из штаммов бактериофагов, обладающих строгой специфичностью и наибольшим спектром литической активности; в) определить количественный показатель реакции, имеющий диагностическое значение; с) определить оптимальное время, обеспечивающее полноценное взаимодействие фага с бактериями. Нами было установлено, что спектр активности бактериофагов Е-61 УГСХА и Е-67 УГСХА равен 100%, они обладают высокой литической активностью по Аппельману 10-7 и по Грациа от 1,5х109 до 3,2х109, а также высокой температурной устойчивостью до 800 С и проявили 100 % устойчивость к воздействию хлороформа в течение 40 минут.
Определение количественного показателя реакции, имеющего
диагностическое значение
Для определения параметров постановки РНФ и разработки количественного показателя реакции, имеющего диагностическое значение, проводили по методу, предложенному В.Д.Тимаковым и Д.М.Гольдфарбом (1962). Проведены эксперименты с использованием МПБ контаминированного 18 часовыми референс культурами E.coli О157 штаммом РЛ (для фага Е-61 УГСХА) и штаммом №51659 (для фага Е-67 УГСХА) от 101 до 105 м.к./мл. В качестве контроля использован интактный МПБ.
Учет результатов проводили через 12-16 часов инкубирования. С этой целью подсчитывали число негативных колоний фага, выросших на плотной питательной среде в опытной пробе и в контроле (контроль титра фага). Оценку РНФ проводили согласно таблицы 5. В случае наличия в исследуемом материале свободного фага число корпускул фага на чашке подсчитывали и вычитали из числа корпускул индикаторного фага в опытных чашках. Разницу сравнивали с контролем. При высоком титре свободного фага (сплошной лизис индикаторной культуры) реакция не учитывалась. РНФ, оцененная как сомнительная, не имела диагностического значения.
Таблица 5
Показатели увеличения титра фага в РНФ.
| Увеличение количества частиц бактериофага в опытной пробе по отношению к его контролю | Оценка результатов |
| Увеличение до 2,5 раз Увеличение до 5 раз Увеличение в 5 и более раз | Отрицательная Сомнительная Положительная |
По результатам проведенных опытов установлено, что количество фаговых частиц более чем в 5 раз превышает количество фаговых частиц в контрольных пробах при контаминации МПБ E.coli О157 в концентрации 103 м.к/мл.
Установление оптимального времени, обеспечивающего наиболее полноценное взаимодействие фага с бактериями
Для решения указанной задачи необходимо было провести эксперименты на тест- объекте по выявлению наиболее эффективного временного показателя взаимодействия фага и индикаторной культуры при сохранении остальных параметров (температурный режим, концентрация бактериальной культуры и фаговых корпускул в 1 мл) постановки РНФ. В качестве тест-объекта использовали МПБ, контаминированный E.coli О157, оптимальное время экспозиции выбирали из шести следующих параметров:
- в предварительном подращивании исследуемого материала в течение 5, 16, 24 часов при температуре 37° С, после добавления фагов смесь выдерживали в течение 5 часов при температуре 37°С;
- в увеличении времени контакта исследуемого материала с фагом до 10, 16 и 24 часов при температуре 37 С.
Для изучения чувствительности РНФ в зависимости от времени подращивания МПБ, контаминировали E.coli О157 в концентрации от 101 до 1х105 м.к./мл и инкубировали в термостате при температуре 370 С в течение 5, 16, 24 часов. Результаты исследования представлены в таблице 6.
Таблица 6
Чуствительность РНФ в зависимости от времени подращивания
исследуемого материала, контаминированного бактериями E.coli О157
| Фаги | №п | Варианты исследований | Минимальное количество эшерихий, обнаруживаемое с помощью | Время, затраченное на проведение исследований (в часах) | ||
| Длительность подращивания исследуемого материала | РНФ | бак. метод | РНФ | бак. метод | ||
| часы | МПБ | МПБ | МПБ | МПБ | ||
| Е-61 УГСХА | 1 | 5 | 103 | 104 | 22 | 96 |
| 2 | 16 | 102 | н.о | 32 | н.о | |
| 3 | 24 | 102 | н.о | 40 | н.о | |
| У-67 УГСХА | 1 | 5 | 103 | 104 | 22 | 96 |
| 2 | 16 | 102 | н.о | 32 | н.о | |
| 3 | 24 | 102 | н.о | 40 | н.о | |
Установлено, что при подращивании материала в течение 5-ти часов позволяет обнаружить эшерихии с помощью РНФ в концентрации 103 м.к./мл. При подращивании исследуемого материала в течение 16 часов чувствительность реакции повышается и позволяет обнаружить бактерии в количестве 102 м.к/мл. На проведение исследования затрачивается 32 часа. Бактериологическим методом это же количество эшерихий обнаружить не удавалось. При подращивании исследуемого материала в течение 24 часов чувствительность реакции не увеличивается, также позволяет обнаружить бактерии в количестве 102 м.к/мл. На проведение этого варианта реакции необходимо 40 часов.
Во втором варианте опыта МПБ, контаминированный E.coli О157 штаммами РЛ и №51659 от 101 до 1х105 м.к./мл не подращивали, а увеличивали время контакта материла с фагом до 10, 16, 24 часов. Результаты представлены в таблице 7.
Таблица 7
Чуствительность РНФ в зависимости от времени инкубирования
исследуемого материала с фагами
| Фаги | №п | Варианты исследований | Минимальное количество эшерихий, обнаруживаемое с помощью | Время, затраченное на проведение исследований (в часах) | ||
| Длительность подращивания исследуемого материала | РНФ | бак. метод | РНФ | бак. Метод | ||
| часы | МПБ | МПБ | МПБ | МПБ | ||
| Е-61 УГСХА | 1 | 10 | 103 | 104 | 22 | 96 |
| 2 | 16 | 102 | н.о | 32 | н.о | |
| 3 | 24 | 102 | н.о | 40 | н.о | |
| Е-67 УГСХА | 1 | 10 | 103 | 104 | 22 | 96 |
| 2 | 16 | 102 | н.о | 32 | н.о | |
| 3 | 24 | 102 | н.о | 40 | н.о | |
Примечание: н.о. – не обнаружено.
По результатам изучения чувствительности РНФ в зависимости от времени инкубирования исследуемого материала с фагом установлено, что увеличение времени до 10-ти часов позволяет обнаружить эшерихии с помощью РНФ в концентрации 103 м.к./мл. При инкубировании исследуемого материала с фагом в течение 16 часов чувствительность реакции повышается, что позволяет обнаружить бактерии в количестве 102 м.к/мл. На проведение исследования затрачивается 32 часа. Бактериологическим методом это же количество эшерихий обнаружить не удавалось. При инкубировании с фагом исследуемого материала в течение 24 часов чувствительность реакции не увеличивается и позволяет обнаружить бактерии в количестве 102 м.к/мл. На проведение этого варианта реакции необходимо 40 часов. Бактериологическим методом E.coli О157 удавалось обнаружить в концентрации 104 м.к./мл на проведение данного метода затрачивается 96 часов.
На основании наших данных, считаем, что наиболее эффективными являются режимы РНФ при 5 часовой экспозиции исследуемого материала с фагом, когда удается провести индикацию бактерий в количестве 103 в миллилитре исследуемого субстрата, на исследование которого затрачивается 16-18 часов, поэтому данный режим используем в дальнейших исследованиях, хотя наиболее эффективным по чувствительности является инкубирование исследуемого материала с фагом в течение 16 часов на которое затрачивается до 32 часов.
Разработка схемы постановки РНФ с предлагаемым диагностическим набором бактериофагов с образцами объектов внешней среды (водопроводная вода, комбикорм, фекалии)
В последние годы исследователи уделяют большое внимание проблеме обнаружения патогенных микроорганизмов в объектах внешней среды: в воде, кормах и фекалиях. Эти субстраты, подвергающиеся постоянному загрязнению выделениями больных животных и людей, в эпизоотологическом и эпидемиологическом отношениях заслуживают особого внимания. По мнению ряда исследователей E.coli О157 не только длительное время сохраняют свою жизнеспособность в объектах внешней среды, но и способны размножаться в них.
Поэтому разработка и внедрение в практику более простых и надежных методов обнаружения данного возбудителя в объектах внешней среды не теряют своей актуальности.
Для определения возможности использования РНФ для обнаружения E.coli О157 в объектах внешней среды исследовали образцы воды, комбикорма и фекалий.
Пробы водопроводной воды в объеме 10 мл вносили в колбы и контаминировали E.coli О157 штамм РЛ и №51659 в концентрации 105; 104; 103; 102; 101 м.к./мл, заливали МПБ из расчета 10 мл бульона на 1 мл воды. Для контроля использовали колбу с пробой воды, не контаминированной бактериями E.coli О157. Исследования проводили по методу, предложенному В.Д.Тимаковым и Д.М.Гольдфарбом (1962). Учет результатов проводили согласно показателям таблицы 5. По результатам проведенных опытов установлено, что увеличение титра фагов Е-61 УГСХА и Е-67 УГСХА более чем в 5 раз произошло уже при концентрации 103 микробных клеток эшерихий в 1 мл водопроводной воды.
Комбикорм массой 5-10 г растирали в стерильной фарфоровой ступке, контаминировали E.coli О157 штамм РЛ или №51659 в концентрации 105 ; 104 ; 103 ; 102 ; 101 м.к./мл и вносили в стерильные колбы объемом 100 мл, заливали МПБ из расчета 10 мл бульона на 1 г. Брали колбу с пробой комбикорма не контаминированного бактериями E.coli О157. Дальнейшие исследования проводили пометоду, предложенному В.Д.Тимаковым и Д.М.Гольдфарбом (1962). Учет результатов проводили согласно показателям таблицы 5. По результатам проведенных опытов установлено, что увеличение титра фагов Е-61 УГСХА и Е-67 УГСХА более чем в 5 раза произошло уже при концентрации 103 микробных клеток эшерихий в 1 г комбикорма.
Фекалии массой 5-10 г растирали в стерильной фарфоровой ступке, контаминировали их E.coli О157 в концентрации от 105 ; 104 ; 103 ; 102 ; 101 м.к. и заливали МПБ из расчета 10 мл бульона на 1 г. Брали колбу с пробой фекалий не контаминированной бактериями E.coli О157. Исследования проводили по вышеуказанному методу. Учет результатов проводили согласно показателям таблицы 5. По результатам проведенных опытов установлено, что увеличение титра фагов Е-61 УГСХА и Е-67 УГСХА более чем в 5 раза произошло уже при концентрации 103 микробных клеток эшерихий в 1 г фекалий.
Нами установлено, что увеличение титра фагов Е-61 УГСХА и Е-67 УГСХА более чем в 5 раза произошло уже при концентрации 103 микробных клеток эшерихий в 1 мл взвеси водопроводной воды, комбикорма и фекалий.
Разработка схемы постановки РНФ с предлагаемым диагностическим набором бактериофагов с образцами мяса
Согласно литературным данным, заражение людей E.coli О157 происходит чаще всего при употреблении пищевых продуктов, в том числе мясных, которые не подверглись достаточной термической обработке, поэтому разработка методов вышеуказанных микроорганизмов в мясе и в других продуктах питания имеет актуальное значение (Bitzan et al, 1993).
Кусочки свинины массой 5-10 г растирали в стерильной фарфоровой ступке, контаминировали E.coli О157 штаммами РЛ и №51659 в концентрации 105 104 ; 103 ; 102 ; 101 м.к./г и вносили в колбы объемом 100 мл, заливали МПБ из расчета 10 мл бульона на 1 г. Для контроля использовали пробу мяса, не контаминированного бактериями E.coli О157. Дальнейшие исследования проводили по методу, предложенному В.Д.Тимаковым и Д.М.Гольдфарбом (1962). Учет результатов проводили согласно показателям таблицы 5.
По результатам проведенных опытов установлено, что увеличение титра фагов Е-61 УГСХА и Е-67 УГСХА более чем в 5 раза произошло уже при концентрации 103 микробных клеток эшерихий в 1 г мяса.
Основываясь на полученных данных, можно отметить, что РНФ является высокочувствительным методом индикации, позволяющим обнаружить E.coli О157 даже в тех биосубстратах, которые содержат обильную сопутствующую разнообразную микрофлору и выделение культуры в чистом виде очень затруднено.
ВЫВОДЫ
- Из объектов внешней среды было выделено 5 расс фагов активных по отношению к эшерихиям серогруппы О157.
- Четыре селекционированных штамма фагов Е-61 УГСХА, Е-67 УГСХА, Е-2 УГСХА, Е-3 УГСХА имели титр 10-5–10-7 по Аппельману и 1,0х109 - 3,2х109 по Грациа, обладали выраженной специфичностью к штаммам E.coli О157 (не лизировали E.coli гетерологичных серогрупп, представителей родов Proteus, Citrobacter, Morganella, Salmonella, Klebsiella, Staphylococus, Pseudomonas, Bacillus), сохраняли литическую активность в течение 12 месяцев, были устойчивы к нагреванию до 800 С в течение 30 минут и действию 10% раствора хлороформа в течение 40 минут наблюдения.
- Выделенные фаги Е-61 УГСХА, Е-67 УГСХА, Е-2 УГСХА, Е-3 УГСХА в соответствии с морфологическими параметрами согласно Международной классификации и номенклатуре вирусов относятся к семейству Myoviride, а по классификации А.С.Тихоненко – к V морфологической группе: «Фаги с отростком сложного строения, чехол которого способен к сокращению».
- Два фага Е-61 УГСХА и Е-67 УГСХА имели совместный спектр литической активности по отношению к изученным штаммам эшерихий серогруппы О157 равный 100% и были предложены для конструирования диагностического набора.
5. Разработана схема выделения и ускоренной идентификации бактерий E.coli О157 с использованием выделенных фагов.
6. Разработана схема ускоренной индикации E.coli О157 в объектах ветеринарного надзора с помощью РНФ с использованием созданного биопрепарата.
7. Разработаны технологические параметры изготовления и контроля набора бактериофагов для индикации E.coli О157 и диагностики эшерихиоза.
ПРАКТИЧЕСКИЕ ПРЕДЛОЖЕНИЯ
1. Предложены 2 штамма эшерихиозных бактериофагов Е-61 УГСХА и Е-67 УГСХА активных по отношению к бактериям E.coli О157, обладающие строгой специфичностью, широким диапазоном литической активности. Фаги депонированы в ВГНКИ ветеринарных препаратов (справка о депонировании фага Е-61 УГСХА – Phagum Esherichia coli 0157 Е-61 УГСХА – ДЕП от 29.05.2002г и фага Е-67 УГСХА – Phagum Esherichia coli 0157 Е-67 УГСХА – ДЕП от 29.05.2002г) и признаны перспективными для конструирования диагностических и лечебно-профилактических препаратов.
2. Идентификацию E.coli О157 предлагаем проводить с помощью набора диагностических колифагов, согласно «Методическим рекомендациям по выделению и фаготипированию энтерогеморрагической кишечной палочки E.coli О157 из патологического материала, пищевых продуктов и объектов внешней среды с применением диагностических бактериофагов Е-61 УГСХА и Е-67 УГСХА», утвержденные ученым советом и ректором УГСХА 16.02.2004.
3. Индикацию Е.соli О157 в объектах ветеринарного надзора предлагаем проводить с помощью РНФ с применением набора индикаторных бактериофагов Е-61 УГСХА и Е-67 УГСХА согласно “Методическим рекомендациям по ускоренной индикации, методом РНФ энтерогеморрагической кишечной палочки Е.соli О157 в патологическом материале, пищевых продуктах, кормах и объектах внешней среды“, утвержденные ученым советом и ректором УГСХА 16.02.2004.
4. Изготовление и контроль диагностического набора бактериофагов необходимо проводить согласно “Временной инструкции по изготовлению и контролю лабораторной серии эшерихиозных бактериофагов E.coli О157, Е-61 УГСХА и Е-67 УГСХА», утвержденной ученым советом и ректором УГСХА 16.02.2004.
Список работ, опубликованных по теме диссертации
1.Золотухин С.Н., Молофеева Н.А.,Васильев Д.А., Каврук Л.С. (ВНИИВС). Изучение чувствительности Escherichia coli О157 к колифагам. // Вестник УГСХА, - 2001. - С. 59-62.
2.Золотухин С.Н., Молофеева Н.И., Васильев Д.А. Разработка оптимального метода выделения диагностического препарата. // Вестник УГСХА, - 2002. - С. 32-35.
3. Золотухин С.Н., Молофеева Н.И., Бульканова Е.А., Васильев Д.А. Чувствительность к антибиотикам патогенных и непатогенных штаммов эшерихий, выделенных из объектов внешней среды и патологического материала при желудочно-кишечных заболеваниях молодняка животных. // Материалы международной научно-практической конференции. Воронеж, - 2002. - С.276-277.
4.Золотухин С.Н., Молофеева Н.И., Васильев Д.А. Изучение некоторых биологических свойств выделенных бактериофагов Escherichia coli. // Вестник УГСХА, - 2002.- С. 36-38.
5.Золотухин С.Н., Молофеева Н.И., Васильев Д.А. Влияние некоторых факторов внешней среды на бактериофаги E.coli О157 и штаммы клеток хозяев. // Материалы научно-производственной конференции. - 2003. - С. 219-222.
