Дифтерийный диализатный антиген и некоторые аспекты противодифтерийного иммунитета у детей с аллергическими заболеваниями

На правах рукописи

ЛАБУШКИНА

Анна Владимировна

ДИФТЕРИЙНЫЙ ДИАЛИЗАТНЫЙ АНТИГЕН И

НЕКОТОРЫЕ АСПЕКТЫ ПРОТИВОДИФТЕРИЙНОГО ИММУНИТЕТА У ДЕТЕЙ С АЛЛЕРГИЧЕСКИМИ

ЗАБОЛЕВАНИЯМИ

03.02.03 – микробиология

АВТОРЕФЕРАТ

диссертации на соискание ученой степени

кандидата медицинских наук

Москва – 2010

Работа выполнена в Государственном образовательном учреждении высшего профессионального образования «Ростовский государственный медицинский университет Федерального агентства по здравоохранению и социальному развитию»

Научные руководители: доктор медицинских наук, доцент

Галина Георгиевна Харсеева;

доктор медицинских наук, профессор,

Заслуженный врач РФ

Алексей Алексеевич Сависько.

Официальные оппоненты:

доктор медицинских наук,

профессор Евгений Петрович Пашков

доктор медицинских наук,

профессор Сергей Дмитриевич Митрохин

Ведущая организация: ГОУ ВПО Российский государственный медицинский университет им. Н. И. Пирогова.

Защита диссертации состоится «22» июня 2010 г. в 1400 часов на заседании Диссертационного совета Д. 208.040.08 в ГОУ ВПО Московской медицинской академии им. И. М. Сеченова: 117998, Москва, Трубецкая ул., 8, строение 2

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке ГОУ ВПО Московской медицинской академии им. И. М. Сеченова (117998, Москва, Нахимовский проспект, 49)

Автореферат разослан «___» мая 2010 г.

Ученый секретарь

Диссертационного совета Д. 208.040.08

доктор медицинских наук, профессор Андрей Юрьевич Миронов

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность исследования

В настоящее время благодаря проводимой вакцинопрофилактике заболеваемость дифтерией в России регистрируют на спорадическом уровне (Маркина С.С. с соавт., 2006; Онищенко Г.Г., 2007). Тем не менее, в популяции продолжают циркулировать штаммы Corynebacterium diphtheriaе, характеризующиеся гетерогенностью генетической структуры (Борисова И.Э., 2009; Комбарова С.Ю. с соавт., 2009). Основная роль в защите от дифтерии принадлежит антитоксическому иммунитету (Турьянов М.Х. с соавт., 1996; Костюкова Н.Н., 1999; Иванова В.В. С соавт, 2000). Однако, вакцинация населения противодифтерийными препаратами, содержащими дифтерийный анатоксин, снижает тяжесть клинического течения болезни, но не предохраняет от развития легких форм дифтерии и бактерионосительства (Маркина С.С. с соавт. 2005; Костюкова Н.Н., 2001), поддерживающего скрытое течение эпидемического процесса (Иванова В.В. с соавт, 2000).

Учитывая, что для дифтерии характерен воздушно-капельный путь передачи и первым барьером на пути С.diphtheriae является слизистая верхних дыхательных путей, особое значение в защите от инфекции имеет местный иммунитет (Карамов Э.В., 2008; Vancikova Z., 2002). У населения не сформирована колонизационная резистентность слизистых оболочек к возбудителю с измененной генетической структурой и скрытыми токсигенными свойствами (Костюкова Н.Н., 1999; Комбарова С.Ю., 2007; Борисова И.Э., 2009), что может явиться причиной нового эпидемического подъема дифтерии (Маркина С.С. с соавт., 2005).

В сложившейся ситуации группу риска составляют дети с хронической патологией, и, в частности, аллергическими заболеваниями (Костинов М.П., 1996, 2003; Hurwitz E., 2000; Mari A., 2004), у которых нарушается календарь прививок и значительно удлиняются сроки проведения плановой ревакцинации (Харит С.М., 2003; Костинов М.П. с соавт., 2008; Магаршак О.О., 2008; Destefano F. et.al., 2002). У детей с аллергическими заболеваниями наблюдают дефект местной защиты, связанный с нарушением синтеза sIgA (Долгих В.Т., 2007). Известно, что sIgA действует как агглютинатор микроорганизмов и нейтрализатор токсинов, ингибируя связывание бактерий с поверхностью слизистых оболочек (Wines B.D. et. al., 2006; Woof J. M., Kerr M.A., 2006). В связи с этим важную роль в реализации местной защиты против дифтерии играет антибактериальный компонент иммунитета, способствующий связыванию бактериальных клеток и элиминации их из организма. Имеющиеся в литературе данные о состоянии местного противодифтерийного иммунитета крайне малочисленны, поэтому актуальным является поиск новых информативных тестов для его определения.

Таким образом, при оценке состояния противодифтерийного иммунитета необходимо учитывать уровень напряженности антитоксического и антибактериального, как местного, так и системного компонентов иммунных реакций. Эти данные в совокупности могут дать более полное представление о защищенности против дифтерийной инфекции и позволят выделить группы риска развития дифтерии.

Цель исследования: изучение механизмов формирования противодифтерийного системного и местного антитоксического и антибактериального иммунитета у детей с аллергическими заболеваниями, привитых противодифтерийными препаратами.

Задачи исследования. Для достижения указанной цели исследования были поставлены следующие задачи:

1. Охарактеризовать свойства дифтерийного диализатного антигена (ДДА), выделенного из токсигенных и нетоксигенных штаммов C.diphtheriae, циркулировавших в межэпидемический период в г. Ростове-на-Дону и Ростовской области.
2. Разработать иммуноферментную тест-систему для определения противодифтерийного антибактериального sIgA в слюне на основе ДДА, выделенного из штаммов C.diphtheriae gravis tox+, циркулировавших в межэпидемический период в г. Ростове-на-Дону и Ростовской области.
3. Провести анализ напряженности противодифтерийного антибактериального местного и системного иммунитета у детей с аллергическими заболеваниями в зависимости от вакцинации и возраста.
4. Оценить противодифтерийный антитоксический системный и местный иммунитет у детей с аллергическими заболеваниями в зависимости от вакцинации и возраста.
5. Определить контингент повышенного риска развития дифтерии среди детей с аллергическими заболеваниями на основании определения уровня напряженности противодифтерийного иммунитета и показателей аллергических и аутоиммунных реакций.

Научная новизна полученных результатов

В результате проведенных исследований впервые:

• проведен сравнительный анализ показателей местного и системного противодифтерийного антибактериального иммунитета у детей с аллергическими заболеваниями и здоровых детей с использованием иммуноферментной тест-системы на основе ДДА, выделенного их штаммов C.diphtheriae gravis tox+, циркулировавших в межэпидемический период в г. Ростове-на-Дону и Ростовской области;
• разработан «Способ определения показания к проведению профилактической прививки против дифтерии» (заявка на изобретение № 200914108, приоритет от 6.11.2009г.);
• определены группы риска развития дифтерии среди детей с аллергическими заболеваниями на основании определения уровня напряженности местного и системного антибактериального и антитоксического иммунитета и показателей аллергических реакций.

Практическая значимость исследований

В результате проведенных исследований предложен способ определения показания к вакцинации детей с аллергическими заболеваниями на основании определения уровня напряженности местного и системного противодифтерийного антитоксического и антибактериального иммунитета с использованием разработанной иммуноферментной тест-системы для определения противодифтерийного антибактериального sIgA на основе ДДА, выделенного из штаммов C.diphtheriae gravis tox+, циркулировавших в межэпидемический период в г. Ростове-на-Дону и Ростовской области.

Выполнение работы осуществлялось в соответствии с комплексно-целевой программой РостГМУ «Научно-организационные основы профилактики, диагностики и лечения важнейших заболеваний женщины, матери и ребёнка».

Основные положения диссертации, выносимые на защиту

1. Иммуноферментная тест-система на основе ДДА, выделенного из штаммов C.diphtheriae gravis tox+, циркулировавших в межэпидемический период на территории г. Ростова-на-Дону и Ростовской области, может быть использована для определения противодифтерийного антибактериального sIgA.
2. Пониженное содержание противодифтерийного sIgA в слюне у детей с аллергическими заболеваниями свидетельствует о меньшей устойчивости их организма в адгезии C.diphtheriae по сравнению со здоровыми.
3. Местный противодифтерийный антитоксический иммунитет у детей с аллергическими заболеваниями и здоровых характеризуется низким содержанием антитоксического sIgA и не зависит от вакцинации и возраста обследованных.
4. Местный противодифтерийный антибактериальный и антитоксический иммунитет у детей с аллергическими заболеваниями, привитых противодифтерийными препаратами, характеризуется формирующимся к 10-15 годам превалированием гуморальных иммунных реакций, сопровождающихся более выраженной, чем у здоровых продукцией IgE.
5. Вакцинация АКДС- и АДС-М-препаратами детей с аллергическими заболеваниями на фоне гипосенсибилизирующей терапии не приводит к формированию повышеных аллергических и аутоиммунных реакций.

Внедрение результатов исследования

Результаты исследования внедрены в работу муниципального лечебно-профилактического учреждения здравоохранения «Консультативно-диагностический центр» г. Ростова-на-Дону и используются при чтении лекций и проведении лабораторных занятий со студентами, интернами, курсантами ФПК и ППС на кафедре микробиологии и вирусологии №2 и кафедре поликлинической педиатрии ГОУ ВПО «Ростовский государственный медицинский университет Федерального агенстсва по здравоохранению и социальному развитию».

Апробация диссертации

Основные положения диссертации доложены и обсуждены на 60-ой, 61-ой, 62-ой Итоговых научных конференциях молодых ученых с международным участием РостГМУ (г. Ростов-на-Дону, 2006, 2007, 2008); IX межгосударственной научно-практической конференции государств - участников СНГ «Современные технологии в реализации глобальной стратегии борьбы с инфекционными болезнями на территории государств-участников содружества независимых государств» (г. Волгоград, 2008 г.); 63-й Итоговой научной конференции молодых ученых с международным участием РостГМУ (г. Ростов-на-Дону, 2009 г.г.); VIII межвузовской конференции с международным участием «Обмен веществ при адаптации и повреждении» (г. Ростов-на-Дону, 2009); научно-практической конференции «Актуальные вопросы инфекционной патологии», посвященной 100-летию Ростовского НИИ микробиологии и паразитологии (г. Ростов-на-Дону, 2009г.); V Научной сессии Ростовского государственного медицинского университета, посвященной 95-летию высшего медицинского образования на Дону и 80-летию РостГМУ (г. Ростов-на-Дону, 2010 г.).

Структура и объем работы

Работа состоит из введения, аналитического обзора литературы (глава 1), характеристики материалов и методов исследования (глава 2), результатов собственных исследований (главы 3-5), обсуждения результатов, выводов, практических рекомендаций и списка литературы. Диссертация изложена на 146 страницах компьютерного текста, включает 22 таблицы, иллюстрирована 7 рисунками. Список литературы включает 326 источников, из них 235 отечественных и 91 иностранных.

СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ

Материалы и методы исследования

Микробные штаммы. Методы культивирования и характеристики. При проведении исследований использовали штаммы С.diphtheriae gravis tox+, и С.diphtheriae gravis tox-, циркулировавшие в г. Ростове-на-Дону и Ростовской области в межэпидемический период (2006г.), любезно предоставленные нам лабораторией бактериологических методов исследования ФГУЗ «Центр гигиены и эпидемиологии в Ростовской области»; штамм C.diphtheriae gravis tox+, BH, серотип 2, полученный из коллекции ГИСК им.Л.А.Тарасевича.

Культуральные, ферментативные, антигенные и токсигенные свойства культур С.diphtheriae определяли в соответствии с рекомендациями, изложенными в руководстве по лабораторной диагностике дифтерии «Дифтерия», г.Копенгаген (1994) и «Лабораторная диагностика дифтерийной инфекции», г. Москва (1995, 1998).

Токсинообразование дифтерийных микробов определяли с помощью теста Элека. Для тестирования гена ДТ использовали ПЦР со специфическими праймерами, комплементарными двум участкам гена ДТ, последовательность которого была опубликована M.Kaczorek et al. (1985) с помощью программы Vector NTI: прямой ТСАТТGАGGАGТАGGТСССGАТТGG-for Dt и обратный GССАСGТТТТССАСGGGТТТС-rev Dt. Праймеры были синтезированы в НПО «Литех» (г.Москва). Данные, полученные при проведении ПЦР, сопоставляли с результатами теста Элека.

Антииммуноглобулиновую активность исследовали по способу Бухарина О.В. с соавт. (патент РФ № 2236465, Бюл.№26 от 20.09.2004г.).

Адгезивную активность микроорганизмов исследовали с помощью метода полуколичественного титрования гемагглютинирующей активности дифтерийных культур (Костюкова Н. Н., 1991).

Методы получения дифтерийных антигенных препаратов. Для получения ДДА были использованы штаммы: C.diphtheriae gravis tox+, BH, серотип 2, полученный из коллекции ГИСК им.Л.А.Тарасевича; C.diphtheriae gravis tox+ и C.diphtheriae gravis tox-, циркулировавшие в Ростове-на-Дону и Ростовской области в межэпидемический период (2006г.) и полученные из ФГУЗ «Центр гигиены и эпидемиологии в Ростовской области». ДДА готовили, используя указания Е.П.Москаленко с соавт. (патент РФ № 2188666 от 10.09.2002г.).

Сыворотки, использованные при проведении исследований. Для изучения свойств ДДА, полученного из токсигенных и нетоксигенных штаммов C.diphtheriae, а также для разработки иммуноферментной тест-системы на основе ДДА использовали сыворотку крови больных с бактериологически подтвержденным диагнозом «дифтерия», взятую на 7-14 сутки от начала заболевания (20 чел.) и больных ангинами (20 чел.).

Методы изучения свойств дифтерийных антигенов. Содержание белка во всех лиофилизированных препаратах ДДА определяли по методу O.H.Lowry (1951). Активность ДДА определяли с помощью твердофазного ИФА, диск-электрофореза и иммуноблоттинга.

Объем и характеристика групп обследованных. С целью изучения показателей противодифтерийного иммунитета были обследованы дети с аллергическими заболеваниями (бронхиальная астма, астматический бронхит, поллиноз и др.) 1-15 лет (353 чел.). Из них 152 чел. непривитых и 201 чел. привитых АКДС и АДС-М-препаратами. Группу сравнения составили дети такого же возраста, принадлежащие к I-II группам здоровья (160 чел.), не имевшие в анамнезе за последние 3-6 мес. указаний на перенесенные заболевания, которые были привиты АКДС- и АДС-М-препаратами в соответствии с календарем профилактических прививок.

Методы изучения иммунологических показателей макроорганизма

1.РПГА. РПГА для определения антитоксических противодифтерийных и противостолбнячных антител проводили с использованием тест-системы «Микроанализ – дифтерия, столбняк» НПК «Микроанализ», г. Москва.

2.ИФА. ИФА для определения противодифтерийных антибактериальных и антитоксических антител в сыворотке крови пациентов осуществляли с использованием ДДА и ДА для сорбции планшет и конъюгата, представляющего собой кроличьи антитела против IgM, IgG, IgA человека, меченные пероксидазой хрена. Учет реакции осуществляли с помощью мультискана фирмы « Labsystem» при длине волны 450 нм. Расчет количества специфических IgM, IgG, IgA проводили с помощью калибровочной кривой и выражали в мкг/мл.

ИФА для определения противодифтерийного антибактериального и антитоксического sIgA в слюне пациентов осуществляли по описанной выше методике с использованием ДДА и ДА для сорбции планшет и конъюгата, представляющего собой кроличьи антитела против секреторных IgA человека, меченные пероксидазой хрена.

Определение общего IgE и специфических IgE к ДА и СА проводили с использованием иммуноферментной тест-системы производства фирмы «Вектор-Бест» (г. Новосибирск) согласно прилагаемой инструкции.

Для определения специфических IgE к ДА и СА планшеты фирмы «Dynatech» сорбировали ДА и СА. Далее постановку ИФА осуществляли по общепринятой методике с использованием конъюгата против IgЕ человека. Положительными считали образцы сыворотки, оптическая плотность которых превышала таковую в контроле на 0,1 ОЕ.

Цитокиновый профиль в сыворотке крови и слюне пациентов (ИЛ-4, -ИФН) определяли с помощью иммуноферментной тест-системы фирмы «Вектор-Бест» (г. Новосибирск).

Определение антител к ДНК одноцепочечной проводили с помощью тест-системы для ИФА производства фирмы «Вектор-Бест» (г. Новосибирск).

3.Тест дегрануляции базофилов (ТДБ). Осуществляли по методике J.Benveniste et al. (1981). В качестве аллергенов использовали коммерческие вакцинные препараты: АКДС-вакцину, АДС- и АДС-М – анатоксины, дифтерийный (ДА) и столбнячный (СА) анатоксины. Оптимальной дозой для постановки ТДБ после предварительного титрования считали 25 мкл цельных вакцинных препаратов, для ДА и СА – 10 Lf (ЕС).

Статистические методы. Статистическую обработку полученных данных осуществляли с помощью персонального компьютера IBM РC/XT и статистического пакета «Statistica 6.0» для Windows XP с использованием параметрических и непараметрических методов статистики.

Результаты собственных исследований

Известно, что антибактериальные антитела вырабатываются к поверхностным антигенам С.diphtheriae (Езепчук Ю. В. С соавт., 1974; Костюкова Н. Н. с соавт., 1997). Поэтому для характеристики показателей противодифтерийного иммунитета был получен ДДА, не содержащий дифтерийный токсин и представляющий собой липополисахаридо-полипептидный комплекс, в состав которого входят, в основном, элементы поверхностных структур и пептидогликана клеточных стенок C.diphtheriae (Харсеева Г.Г., 2006).

Для получения ДДА были использованы штаммы: C.diphtheriae gravis tox+, BH, серотип 2, полученный из коллекции ГИСК им.Л.А.Тарасевича; C.diphtheriae gravis tox+ и C.diphtheriae gravis tox-, циркулировавшие в Ростове-на-Дону и Ростовской области в межэпидемический период (2006г.), полученные из ФГУЗ «Центр гигиены и эпидемиологии в Ростовской области».

Штаммы C.diphtheriae gravis tox+ и C.diphtheriae gravis tox+, BH, серотип 2 были положительны в тесте Элека и ПЦР, имели высокую гемагглютинирующую (1:16-1:32) и антииммуноглобулиновую активность в отношении IgG (65,6±9,9%), относительно IgM и IgА значения антииммуноглобулиновой активности были ниже (20,4±7,7% и 20,1±6,7% соответственно). Штаммы C.diphtheriae gravis tox-, отрицательные в тесте Элека и ПЦР, имели низкую геммагглютинирующую (1:2) и антииимуноглобулиновую активность относительно IgA (8,4%) и высокую антииимуноглобулиновую активность в отношении IgG и IgM (90,0% и 37,5% соответственно).

Результаты электрофореза показали, что в ДДА, выделенном из токсигенных штаммов С.diphtheriae, были обнаружены протективные антигены (м.м. 30-70 кДа), разделенные на две фазы. Большая часть антигенных компонентов имела молекулярную массу 60-70 кДа, значительно меньшее количество – 30-36 кДа. Протективная часть антигена наиболее четко была выявлена с сывороткой крови больных дифтерией в ДДА, выделенном из штаммов C.diphtheriae gravis tox+, циркулировавших на территории г. Ростова-на-Дону и Ростовской области, по сравнению с музейным штаммом C.diphtheriae gravis tox+, ВН, серотип 2. В то же время, в ДДА, выделенном из штаммов С.diphtheriae gravis tox-, протективные антигены не обнаружили.

Результаты ИФА на основе ДДА (рис.1, 2) показали, что в сыворотке крови больных дифтерий, ангинами и детей с отягощенным аллергологическим анамнезом были обнаружены антитела к ДДА, выделенному из токсигенных штаммов коринебактерий дифтерии (ОП=0,222-0,578 в разведении 1:100), тогда как к ДДА, выделенному из нетоксигенных штаммов C.diphtheriae, антитела не выявляли (ОП=0,049-0,053). Следовательно, результаты электрофореза и ИФА совпадали и свидетельствовали о том, что ДДА, выделенный из штаммов С.diphtheriae tox+, циркулировавших в г. Ростове-на-Дону и Ростовской области в межэпидемический период, содержит в своем составе протективные антигены возбудителя дифтерии, которые отсутствуют в ДДА, выделенном из штаммов C.diphtheriae tox-.

Установленный факт может быть объяснен различиями антигенной структуры поверхностных детерминант токсигенных и нетоксигенных штаммов C. diphtheriae, что согласуется с данными других авторов (Езепчук Ю. В. С соавт., 1974; Костюкова Н. Н. с соавт., 1970 Шмелёва Е. А., 1981). Поэтому для изучения противодифтерийного антибактериального иммунитета целесообразно использовать тест-систему для ИФА на основе ДДА, полученного из токсигенных штаммов коринебактерий дифтерии.

Антибактериальный противодифтерийный иммунитет способствует формированию местной защиты на слизистых оболочках верхних дыхательных путей. Важнейшим показателем интенсивности мукозного иммунитета является специфический sIgA, который способен связывать микроорганизмы, находящиеся как на поверхности, так и внутри эпителиальных клеток, предотвращая адгезию возбудителя (Wines B. D. et. al., 2006; J. M Woof, M. A. Kerr, 2006).

Известно (Гущин И.С., 2009; Prioult G. et. al., 2005), что у детей с аллергическими заболеваниями в результате недостаточности местной защиты, в первую очередь sIgA, наблюдается увеличение проницаемости слизистых оболочек для антигенов (аллергенов) и выработка IgE к ним. В предварительном исследовании (Табл. 1) было установлено, что у детей с отягощенным аллерголоческим анамнезом средний уровень общего sIgA в слюне составил 396,8±11,3 мг/л и не отличался от аналогичного показателя у здоровых детей – 402,7±15,8 мг/л. У всех обследованных содержание sIgA не изменялось в зависимости от возраста и соответствовало значениям возрастной нормы. Полученные данные свидетельствовали о том, что снижения местных барьерных функций слизистых оболочек верхних дыхательных путей у детей с аллергическими заболеваниями на момент обследования обнаружено не было.

Рис.1 Содержание антител к ДДА, полученному из токсигенных штаммов C.diphtheriae gravis, у детей с различными заболеваниями

По оси абсцисс – разведения сыворотки.

По оси ординат – величина экстинкции при длине волны 450 нм

Рис.2 Содержание антител к ДДА, полученному из нетоксигенных штаммов C.diphtheriae gravis, у детей с различными заболеваниями

По оси абсцисс – разведения сыворотки

По оси ординат – величина экстинкции при длине волны 450 нм

Таблица 1

Содержание sIgA в слюне детей, привитых противодифтерийными

препаратами

Воз-раст	Коли-чество обследо-ванных		sIgA (мг/л)		Антитоксический sIgA (мкг/л)		Антибактериальный sIgA (мкг/л)
	I	II	I	II	I	II	I	II
1-5 лет	14	41	396,1± 17,8	393,5± 15,1	0,7± 0,4*	4,4± 0,6	29,1± 2,9*	50,1± 3,8
6-9 лет	22	41	404,0± 15,8	403,2± 18,2	2,0± 0,5**	5,5± 0,9	48,0± 4,8***	62,5± 4,2
10-15 лет	14	49	386,3± 27,6	410,1± 17,3	1,5± 0,5	2,7± 0,5	114,7± 11,6	87,7± 8,2
1-15 лет	50	131	396,8± 11,3	402,7± 15,8	1,5± 0,3*	4,1± 0,4	61,4± 8,4	68,0± 3,8

Примечание:

I - дети с аллергическими заболеваниями в анамнезе, II – здоровые дети

* - достоверность отличий показателей в группе детей с аллергическими заболеваниями по сравнению со здоровыми (p0,001)

** - достоверность отличий показателей в группе детей с аллергическими заболеваниями по сравнению со здоровыми (p0,005)

*** - достоверность отличий показателей в группе детей с аллергическими заболеваниями по сравнению со здоровыми (p0,05)

При изучении уровня противодифтерийного антибактериального sIgA в слюне у детей с аллергическими заболеваниями было установлено, что в возрасте 1-5 и 6-9 лет его уровень (29,1±2,9 мкг/л и 48,0±4,8 мкг/л соответственно) был достоверно (р0,001, р0,05) ниже, чем у здоровых детей того же возраста (50,1±3,8 мкг/л и 62,5±4,2 мкг/л соответственно). Учитывая важную роль sIgA в колонизационной резистентности, препятствующей проникновению в организм бактериальных антигенов, полученные результаты свидетельствовали о меньшей устойчивости к адгезии С. diphtheriae организма детей с аллергическими заболеваниями по сравнению со здоровыми.

С возрастом у обследованных обеих групп наблюдали постепенное нарастание уровня противодифтерийного антибактериального sIgA в слюне и к 10-15 годам различия в его содержании нивелировались. Возможно, это было связано с более высокой частотой их контакта с циркулирующим в популяции возбудителем дифтерии при поступлении в школьные учреждения. Выявленный с возрастом рост противодифтерийного антибактериального sIgA у детей явился свидетельством усиления специфической защиты слизистых оболочек, приводящей к увеличению вероятности связывания коринебактерий дифтерии и их элиминации из организма.

При изучении противодифтерийного антибактериального системного иммунитета у детей с аллергическими заболеваниями (Табл. 2) было обнаружено, что уровень антибактериальных противодифтерийных антитол не зависел от прививочного анамнеза. Так при сравнении содержания антибактериального IgG у привитых (92,1±3,0 мкг/мл) и непривитых (106,0±5,0 мкг/мл) детей достоверных различий выявить не удалось.

Таблица 2

Содержание противодифтерийных антибактериальных антител в сыворотке крови у привитых и не привитых детей с аллергическими заболеваниями

Прививочный анамнез	Кол-во обследованных (чел.)	Содержание противодифтерийных антибактериальных антител, мкг/мл
		IgG		IgM		IgA
		мкг/мл	не имеют антител (%±m)	мкг/мл	не имеют антител (%±m)	мкг/мл	не имеют антител (%±m)
Привитые	152	92,1±3,0	2 1,3±0,9	33,1±1,1	- 0	23,0±1,1	7 4,6±1,7
Не привитые	151	106,0±5,0	3 2,0±1,1	23,1±0,9	1 0,7±0,7	24,4±1,3	5 3,3±1,5

У детей с аллергическими заболеваниями содержание противодифтерийных антибактериальных антител в сыворотке крови увеличивалось в зависимости от возраста (Табл. 3). Наименьший уровень антибактериального IgG был обнаружен у детей 1 года (34,3±3,6 мкг/мл), причем 11,6±4,9% детей вообще не имели IgG. В дальнейшем, с расширением контактов детей при поступлении в дошкольные и школьные учреждения, содержание антибактериального IgG у них увеличивалось. Так, уровень антибактериального IgG возрос к 2-3 годам (р0,001) и составил 77,7±4,4 мкг/мл, повысился к 4-5 годам (р0,01), достиг максимальных значений к 6-9 годам (130,0±4,6 мкг/мл) и не изменялся у детей 10-15 лет.

Что касается содержания антибактериальных IgM и IgA, то их количество было минимальным у детей 1 года (14,5±1,1 мкг/мл и 13,7±1,6 мкг/мл соответственно), достоверно (р0,001) увеличивалось к 2-3 годам (26,5±1,5 мкг/мл и 24,7±1,8 мкг/мл соответственно) и в дальнейшем не претерпевало изменений.

Таблица 3

Содержание противодифтерийных антибактериальных антител в сыворотке крови у детей с аллергическими заболеваниями в зависимости от возраста, M±m

Возраст	Кол-во обследованных (чел.)	Содержание противодифтерийных антибактериальных антител, мкг/мл
		IgG		IgM		IgA
		мкг/мл	не имеют антител (%±m)	мкг/мл	не имеют антител (%±m)	мкг/мл	не имеют антител (%±m)
1	43	34,3± 3,5*	5 11,6±4,9	14,5± 1,1*	1 2,3±2,3	13,7± 1,6*	6 14,0±5,3
2-3	75	77,7± 4,4**	- 0	26,5± 1,5	- 0	24,7± 1,8	3 4,0±2,3
4-5	43	98,0± 4,8***	- 0	29,5± 1,5	- 0	23,4± 2,1	1 2,3±2,3
6-9	84	130,0± 4,6	- 0	32,4± 1,3	- 0	29,0± 1,7	- 0
10-15	58	129,0± 5,7	- 0	32,9± 1,7	- 0	22,5± 1,6	2 3,4±2,4
1-15	303	98,9± 2,9	5 1,7±0,7	28,1± 0,8	1 0,3±0,3	23,7± 0,8	12 4,0±1,1

Примечание:

* – различие между группами 1 и 2-3 года (p<0,0

** – различие между группами 2-3 и 4-5 лет (p<0,01)

*** - различие между группами 4-5 и 6-9 лет (p<0,01)

Рассматривая противодифтерийный антибактериальный местный и системный иммунитет у детей с аллергическими заболеваниями в целом, обнаружили коррелятивную связь (r=0,4; р0,05) между уровнем антибактериального IgA в крови и антибактериального sIgA в слюне у обследованных до 9 лет. У детей старшего возраста (10-15 лет) наблюдали более выраженное увеличение содержания sIgA в слюне, чем IgA в сыворотке крови, что свидетельствовало о превалировании антибактериального местного иммунитета по сравнению с системным.

Антибактериальный противодифтерийный иммунитет препятствует процессу персистенции возбудителя, но основным фактором невосприимчивости населения к дифтерии является антитоксический иммунитет, который формируется в результате проводимой вакцинации (Костюкова Н. Н., 1999).

При проведении вакцинопрофилактики у детей с аллергическими заболеваниями АКДС- и АДС-М-препаратами на фоне гипосенсибилизирующей терапии поствакцинальный период протекал, в основном, бессимптомно или наблюдали формирование слабых местных и общих реакций, не выходивших за пределы нормы. Обострения основного заболевания после прививки не диагностировали.

При рассмотрении местного антитоксического иммунитета (Табл. 1) обнаружили, что содержание антитоксического sIgA у всех обследованных на фоне проводимой вакцинации АКДС- и АДС-М-препаратами было значительно ниже, чем антибактериального sIgA и колебалось в пределах от 0,7 до 5,5 мкг/мл. Причем среднее содержание антитоксического sIgA у детей с аллергическими заболеваниями (1,5±0,3 мкг/мл) было ниже (р0,001), чем у здоровых обследованных (4,1±0,4 мкг/мл).

При изучении возрастной динамики содержания антитоксического sIgA были обнаружены те же закономерности, что и антибактериального sIgA. Так, в слюне у пациентов с аллергической патологией ранних возрастов (до 9 лет) уровень антитоксического sIgA был ниже, чем у детей группы сравнения аналогичного возраста, а к 10-15 годам эти отличия не обнаруживали. Полученные данные согласуются с результатами проведенных ранее исследований (Харсеева Г. Г. с соавт., 2009), показавших, что контингент повышенного риска развития дифтерии по уровню антитоксина в крови составляют дети ранних возрастов (3-6 лет). Этот факт может быть связан с развитием у них четвертого критического периода, характеризующегося высокой частотой развития атопических, паразитарных и иммунокомплексных заболеваний.

Результаты изучения местного антитоксического иммунитета показали, что вакцинация как здоровых детей, так и имеющих отягощенный аллергологический анамнез, способствует продукции у них лишь незначительного уровня противодифтерийного антитоксического sIgA. Возможно, этот факт обусловлен физиологической целесообразностью, так как возбудитель, попадая на слизистые оболочки верхних дыхательных путей, только после преодоления местных барьеров и адаптации выделяет токсин, проникающий в кровяное русло. И, следовательно, антитоксиновая защита эффективна лишь при реализации реакций системного иммунитета.

При изучении системного противодифтерийного антитоксического иммунитета (Табл. 4) после проведения полного курса вакцинации и ревакцинации АКДС- и АДС-М-препаратами никаких отличий у детей с аллергическими заболеваниями и здоровых ни по числу серопозитивных, ни по величине СГТ обнаружено не было, что согласуется с данными (Бучкова Т. Н., 1999; Харит С. М. с соавт., 2001). Следует отметить, что при анализе напряженности местного и системного антитоксического иммунитета как у детей с аллергическими заболеваниями, так и здоровых, коррелятивной связи обнаружить не удалось.

Таблица 4

Содержание противодифтерийных антитоксических антител в сыворотке крови детей с аллергическими заболеваниями в различные сроки после вакцинации АКДС- и АДС-М-препаратами

Сведения о вакцинации	Сроки после прививки	Всего обследованных	Кол-во серопозитивных (%±m)	СГТ
1.V1АКДС V2АКДС V3АКДС	1,5-11 мес.	27	26 96,3±3,6	1:66,4 (1:45,7-1:95,5)
	1-5 лет	34	26 76,5±7,3	1:50,5 (1:33,1-1:75,9)
2.V1АКДС V2АКДС V3АКДС R1АКДС	1,5-11 мес.	20	16 80,0±8,9	1:133,5 (1:177,6-1:234,4)
	1-5 лет	29	26 89,7±5,6	1:116,3 (1:74,1-1:186,2)
3.V1АКДС V2АКДС V3АКДС R1АКДС R2АДС-М	1,5-11 мес.	21	21 100%	1:517,9 (1:263,0-1:1000,0)
	1-5 лет	21	16 90,5±6,4%	1:225.1 (1:131,8-1:380,2)
4. непривитые	-	151	22 14,6±2,9	1:12,6 (1:11,0-1:14,4)
5. здоровые дети	1,5-11 мес.	61	58 95,1±2,8%	1:467,7 (1:331,1-1:660,7)
	1-5 лет	99	94 94,9±2,2%	1:199,5 (1:158,5-1:251,2)

Известно, что в составе секрета слюнных желез присутствуют цитокины, продуцируемые не только клетками иммунной системы, но и эпителиальными клетками. Для изучения взаимосвязи между Th1/Th2 – направленностью иммунного ответа, продукцией IgE и уровнем специфических противодифтерийных антител был проведен анализ содержания в слюне регуляторных цитокинов – ИФН- и ИЛ-4 у детей с аллергическими заболеваниями и здоровых детей.

В результате определения ИФН- в слюне (Табл. 5) были установлены близкие его значения у детей обеих обследованных групп в возрасте до 9 лет. Только у детей с аллергическими заболеваниями 10-15 лет уровень данного цитокина в слюне (25,5±5,7 пкг/мл) был ниже (р0,05), чем у здоровых обследованных (53,3±7,6 пкг/мл). Иные результаты были получены при определении в слюне ИЛ-4: у детей с аллергической патологией уровень данного цитокина уже с 6 лет превышал аналогичный показатель у здоровых детей. Пониженный уровень ИФН- в слюне детей 10-15 лет с отягощенным аллергологическим анамнезом меняет соотношение регуляторных цитокинов в пользу ИЛ-4, что свидетельствует о превалировании у них Th2 – направленности иммунного ответа.

Таблица 5

Содержание IgE и цитокинов в слюне детей, привитых противодифтерийными препаратами

Возраст	Количество обследованных		IgЕ (МЕ/мл)		ИФН- (пкг/мл)		ИЛ-4 (пкг/мл)
	I	II	I	II	I	II	I	II
1-5 лет	14	41	0,4±0,2	0,3± 0,1	40,5± 14,0	54,4±7,9	0,03± 0,02	1,0± 0,7
6-9 лет	22	41	1,0± 0,2***	0,4± 0,1	40,1± 19,4	34,9±3,0	0,5± 0,2***	0,1± 0,1
10-15 лет	14	49	0,7± 0,2**	0,2± 0,1	25,5± 5,1***	53,3±7,6	2,9± 1,6**	0,3± 0,2
1-15 лет	50	131	0,8± 0,1*	0,3± 0,1	36,1± 9,6	47,9±3,9	1,0± 0,5	0,5± 0,2

Примечание:

I - дети с аллергическими заболеваниями в анамнезе, II – здоровые дети

* - достоверность отличий показателей в группе детей с аллергическими заболеваниями по сравнению со здоровыми (p0,001)

** - достоверность отличий показателей в группе детей с аллергическими заболеваниями по сравнению со здоровыми (p0,005)

*** - достоверность отличий показателей в группе детей с аллергическими заболеваниями по сравнению со здоровыми (p0,05)

Выраженная гуморальная направленность иммунного ответа, зафиксированная на основании динамики содержания ИФН- и ИЛ-4 в слюне, была выявлена у детей с аллергическими заболеваниями только в возрасте 10-15 лет. В то же время, у данного контингента обследованных уже с 6 лет были обнаружены достоверно более высокие значения IgE в слюне по сравнению с аналогичным показателем у здоровых детей. Известно, что у лиц с атопией выявлена отрицательная корреляционная зависимость между синтезов sIgA и IgE в слизистых оболочках (Долгих В.Т., 2007). Поэтому можно предположить, что пониженное содержание в слюне противодифтерийного антибактериального и антитоксического sIgA приводит к повышению продукции IgE и является причиной повышенной проницаемости слизистой к возбудителю дифтерии.

При обследовании детей с аллергическими заболеваниями был проведен анализ содержания в сыворотке крови цитокинов – ИФН- и ИЛ-4. Результаты показали, что у детей 1-5 лет уровень ИЛ-4 был достоверно выше (2,2±1,4 пкг/мл), чем у детей старших возрастов (6-15 лет), но соответствовал верхней границе нормальных значений (0-2 пкг/мл). Содержание ИФН- в сыворотке крови у детей в зависимости от возраста не изменялось и оставалось в пределах 3,2-3,8 пкг/мл, что соответствовало норме (0-10 пкг/мл).

При исследовании показателей аллергических реакций в крови у детей с аллергическими заболеваниями (Табл. 6), привитых противодифтерийными препаратами, было установлено, что повышенный уровень общего IgE обнаруживали независимо от вводимого препарата и длительности поствакцинального периода. Количество лиц с уровнем общего IgE, превышающего возрастную норму, составило среди детей с аллергическими заболеваниями 31,0-48,1% обследованных, среди здоровых - 30,0±10,3% обследованных и не отличалось от аналогичного показателя у непривитых детей с аллергической патологией в анамнезе (41,7±4,0% обследованных). Высокий уровень общего IgE у здоровых детей при отсутствии клинической формы заболевания свидетельствовал о скрытой сенсибилизации обследованных к каким-либо аллергенам и мог быть обусловлен иными причинами, помимо введения вакцин. Поэтому целесообразным явилось определение специфического IgE к компонентам вакцин - ДА и СА. Уровень специфической сенсибилизации к ДА и СА был выше у детей с аллергической патологией в анамнезе, чем у здоровых и непривитых детей с той же патологией. Причем, специфический IgE к ДА обнаруживали чаще, чем к СА.

Таблица 6

Содержание общего и специфического IgE, антител к ДНК одночепочечной у детей с аллергическими заболеваниями в различные сроки после вакцинации

Сведения о вакцинации	Сроки после прививки	Всего обследованных	IgE		ДА-IgE (%±m)	СА-IgE (%±m)	Антитела к ДНК одноцепочечной
			M±m (МЕ/мл)	Кол-во лиц с уровнем выше нормы (%±m)
							M±m (ЕД/мл)	Кол-во лиц с уровнем выше нормы (%±m)
1.V1АКДС V2АКДС V3АКДС	1,5-11 мес.	27	87,6±40,5	13 48,1±9,6	6 22,2±8,0	5 18,5±7,5	35,7±2,9	18 66,7±9,1
	1-5 лет	34	182,0±50,3	16 47,1±8,6	3 8,8±4,9	2 5,9±4,0	37,8±4,1	18 52,9±8,6
2.V1АКДС V2АКДС V3АКДС R1АКДС	1,5-11 мес.	20	84,4±36,7	7 35,0±10,7	1 5,0±4,9	- 0	32,8±4,0	13 65,0±10,7
	1-5 лет	29	136,0±44,1	9 31,0±8,6	- 0	- 0	38,0±4,6	15 51,7±9,3
3.V1АКДС V2АКДС V3АКДС R1АКДС R2АДС-М	1,5-11 мес.	21	102,0±36,3	7 33,3±10,3	5 23,8±9,3	1 4,8±4,7	45,5±5,7	13 61,9±10,6
	1-5 лет	21	146,0±53,4	6 28,6±9,9	5 23,8±9,3	- 0	33,6±4,9	9 42,9±10,8
4. не привитые	-	151	121,0±17,6	63 41,7±4,0	5 3,3±1,5	3 2,0±1,1	33,5±1,9	27 54,0±7,0
5.здоровые	1,5-2 мес.	20	33,3±4,9	6 30,0±10,3	3 15,0±7,9	- 0	23,6±2,5	1 10,0± 9,5

Учитывая, что вакцины могут вызывать в организме привитых аллергические реакции как немедленного, так и замедленного или смешанного типов (Медуницин Н.В., 2004; Dannemann A. et. al, 1996), специфическую сенсибилизацию к противодифтерийным препаратам и их компонентам определяли в ТДБ, позволяющем выявлять анафилактический и клеточный тип реакций (Benveniste J., 1981).

Положительные результаты ТДБ с ДА и СА у детей с аллергическими заболеваниями наблюдали с одинаковой частотой в отличие от специфического IgE, определяемого в ИФА, что могло быть связано с несколько различными механизмами обнаружения гиперчувствительности, определяемой данными методами. Причем, наиболее высокий процент сенсибилизации к вакцинам и их дифтерийному и столбнячному компонентам обнаружили у обследованных, получивших три дозы АКДС-вакцины. У здоровых детей специфической сенсибилизации к вакцинам в ТДБ обнаружено не было.

Учитывая общность патогенетических механизмов развития аллергических и аутоиммунных процессов (Долгих В.Т., 2007), представляло интерес изучить у детей с аллергическими заболеваниями уровень антител к ДНК одноцепочечной (денатурированной) в ответ на вакцинацию.

Повышенное содержание антител к ДНК одноцепочечной в сыворотке крови детей с аллергическими заболеваниями наблюдали у 42,9-66,7% обследованных независимо от сроков после вакцинации, вида и кратности вводимого препарата. Уровень антител к ДНК одноцепочечной варьировал в пределах от 33,6 до 45,5 ЕД/мл. Полученные данные не отличались от аналогичного показателя у не привитых детей с аллергической патологией. В то же время у здоровых детей, привитых согласно календарю прививок, антитела к ДНК одноцепочечной определяли достоверно (р0,01) реже (у 10,0±9,5% обследованных). Следовательно, повышенное содержание антител к ДНК у детей с аллергическими заболеваниями не зависело от проводимой вакцинации противодифтерийными препаратами.

Выводы

1. ДДА, полученный из токсигенных штаммов С.diphtheriae, циркулировавших в г. Ростове-на-Дону и Ростовской области в межэпидемический период, содержит в своем составе протективные антигены возбудителя дифтерии, которые отсутствуют в ДДА, выделенном из нетоксигенных штаммов возбудителя.
2. Иммуноферментная тест-система на основе ДДА, выделенного из штаммов C.diphtheriae gravis tox+, циркулировавших в межэпидемический период в г. Ростове-на-Дону и Ростовской области чувствительна и специфична, позволяет определять противодифтерийный антибактериальный sIgA в слюне с достаточной степенью воспроизводимости.
3. Уровень противодифтерийного антибактериального системного и местного иммунитета у детей с аллергическими заболеваниями не связан с проводимой вакцинацией противодифтерийными препаратами, а обусловлен естественной циркуляцией возбудителя.
4. Пониженное содержание в слюне детей с аллергическими заболеваниями противодифтерийного антибактериального и антитоксического sIgA свидетельствует о меньшей устойчивости к адгезии С. diphtheriae организма детей с аллергическими заболеваниями по сравнению со здоровыми.
5. Вакцинация детей с аллергическими заболеваниями противодифтерийными препаратами, проводимая на фоне гипосенсибилизирующей терапии, эффективна и не вызывает формирования побочных реакций и осложнений.
6. Группу риска развития дифтерии составляют дети с аллергическими заболеваниями до 6 лет, имеющие пониженный уровень антибактериального и антитоксического противодифтерийного иммунитета по сравнению со здоровыми.

Практические рекомендации

1. Для выявления контингента детей, составляющих группу повышенного риска развития дифтерии в г. Ростове-на-Дону и Ростовской области представляется целесообразным определение напряженности местного и системного противодифтерийного антибактериального иммунитета с использованием ИФА на основе ДДА, выделенного из циркулирующих в данном регионе штаммов C.diphtheriae tox+.
2. Детям с аллергической патологией рекомендуется проводить вакцинацию противодифтерийными препаратами на фоне гипосенсибилизирующей терапии, что препятствует формированию у них аллергических и аутоиммунных реакций.

Список работ, опубликованных по теме диссертации

1. Лабушкина А.В., Фисько В.А. Эффективность вакцинации АКДС-вакциной детей с аллергическими заболеваниями // 60-я итоговая научная конференция молодых ученых. – Ростов-на-Дону: РостГМУ. – 2006. – С.40
2. Лозенко Е.А., Лабушкина А.В. Использование тест-системы для ИФА на основе дифтерийного диализатного антигена// 61-я итоговая научная конференция молодых ученых. – Ростов-на-Дону: РостГМУ. – 2008. – С.37
3. Донская М.А., Лабушкина А.В. Формирование иммунопатологических реакций у детей с аллергическими заболеваниями после прививки АКДС-вакциной//61-я итоговая научная конференция молодых ученых. – Ростов-на-Дону:РостГМУ. – 2008. – С.34
4. Лабушкина А.В., Алёшина М.А. Изучение формирования антибактериального противодифтерийного иммунитета у детей с аллергическими заболеваниями, вакцинированных АКДС- и АДС-М-препаратами//62-я итоговая научная конференция молодых ученых. – Ростов-на-Дону: РостГМУ. – 2008. – С.29
5. Лабушкина А.В., Харсеева Г.Г., Москаленко Е.П., Алексеева Л.П. Разработка иммуноферментной тест-системы для определения антибактериальных противодифтерийных антител//Материалы IX межгосударственной научно-практической конференции государств - участников СНГ «Современные технологии в реализации глобальной стратегии борьбы с инфекционными болезнями на территории государств-участников содружества независимых государств». – Волгоград: ФГУЗ «Центр гигиены и эпидемиологии в Волгоградской области». – 2008. – С.102-103
6. Тырина С.Н., Лабушкина А.В. Состояние иммунитета к дифтерии и столбняку у детей с аллергическими заболеваниями//63-я итоговая научная конференция молодых ученых с международным участием. – Ростов-на-Дону: РостГМУ. – 2009. – С.32
7. Текутьева Е.С., Лабушкина А.В. Формирование иммунопатологических реакций у детей с аллергическими заболеваниями, привитых АКДС- и АДС-М-препаратами//63-я итоговая научная конференция молодых ученых с международным участием. – Ростов-на-Дону: РостГМУ. – 2009. – С.33
8. Лабушкина А.В., Харсеева Г.Г. Мукозный противодифтерийный иммунитет у детей // Материалы VIII межвузовской конференции с международным участием «Обмен веществ при адаптации и повреждении». Ростов-на-Дону:РостГМУ. – 2009. – С.63-65
9. Лабушкина А.В., Харсеева Г.Г., Москаленко Е.П. Противодифтерийный иммунитет у детей с аллергическими заболеваниями //Вестник Российского университета дружбы народов. - 2009. - №4. – С.144-148.
10. Харсеева Г.Г., Лабушкина А.В., Москаленко Е.П., Бабаянц А.А. Вакцинация против дифтерии и столбняка детей с аллергическими заболеваниями //Эпидемиология и вакцинопрофилактика - 2010 - №1. – С. 63-66.
11. Лабушкина А.В., Харсеева Г.Г., Квасов А.Р. Иммуноферментный метод определения противодифтерийных антибактериальных антител в слюне// Клин.лаб.диагностика. – 2010. - №2. – С. 32-35