Экспериментально-клиническое обоснование выбора стратегии профилактики гриппозной инфекции в период подготовки к пандемии
На правах рукописи
Миронов Александр Николаевич
Экспериментально-клиническое обоснование выбора
стратегии профилактики гриппозной инфекции
в период подготовки к пандемии
14.00.36 - Аллергология и иммунология
03.00.06 - Вирусология
АВТОРЕФЕРАТ
диссертации на соискание ученой степени
доктора медицинских наук
Москва - 2009
Работа выполнена на ФГУП «НПО «Микроген» МЗ РФ и
в НИИ вакцин и сывороток им. И.И. Мечникова РАМН
| Научные консультанты: | академик РАМН, профессор В.В. Зверев |
| доктор медицинских наук, профессор Н.А. Михайлова |
| Официальные оппоненты: | доктор медицинских наук, профессор Л.В. Ковальчук |
| доктор медицинских наук, профессор Б.В. Пинегин | |
| доктор медицинских наук С.Г. Маркушин |
| Ведущая организация: | НИИ гриппа СЗО РАМН |
Защита состоится «25» марта 2010 г. в «12» часов на заседании диссертационного совета Д 001.035.01 при НИИ вакцин и сывороток им. И.И. Мечникова РАМН по адресу: 105064, г. Москва, Малый Казенный пер., д.5а.
С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке НИИ вакцин и сывороток им. И.И. Мечникова РАМН.
Автореферат разослан «25» декабря 2009 г.
Ученый секретарь
диссертационного совета,
кандидат биологических наук И.В. Яковлева
ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ
Актуальность проблемы. Грипп – острая вирусная инфекция с воздушно-капельным путем передачи, характеризующаяся острым началом, лихорадкой, общей интоксикацией и поражением респираторного тракта. Эпидемии гриппа происходят ежегодно, поражая до 15 % населения Земного шара, значимо увеличивая смертность в группах повышенного риска, увеличивая затраты на медицинскую помощь и нанося серьезный экономический ущерб. По частоте и количеству случаев грипп и ОРВИ занимают первое место, составляя 95 % всех инфекционных заболеваний. В России ежегодно регистрируют от 27,3 до 41,2 млн. заболевших гриппом и другими ОРВИ [Литвинова О.М, 2001; Couch R.B., 1999; Palach A.M., 1991; Palache A.M., 1997].
Кроме ежегодных эпидемий вирус гриппа А может вызывать и пандемии. Пандемии всегда являлись событиями мирового значения. Они возникали в результате появления высококонтагиозного вируса гриппа, к которому большая часть населения не имела иммунитета, и, как следствие, практически глобальной восприимчивости людей к инфекции. Характерными особенностями пандемий являлись быстрота распространения гриппа по всем частям света, как правило, менее чем за год, и подверженность заболеванию более четверти всего населения. Помимо высокой смертности пандемии всегда отличались внезапностью возникновения вспышки заболевания, не позволяющей адекватно подготовиться к борьбе с инфекцией. В прошлом столетии отмечено три пандемии гриппа: «испанский грипп» в 1918 г., «азиатский грипп» в 1957 г. и «гонконгский грипп» в 1968 г. «Испанка» унесла от 40 до 50 миллионов человек во всем мире [Mills C.E, 2004; White L.F, 2008]. Ни сроки, ни последствия следующей пандемии невозможно предсказать определенно.
Из известных 15 подтипов вируса гриппа А подтип H5N1 обладает наиболее высоким пандемическим потенциалом: он быстро мутирует и вступает в рекомбинацию с вирусами, инфицирующими различные виды животных, в том числе млекопитающих [Cleaveland S, 2006; Vahlenkamp T.W, 2008; Chang S, 2007]. Первый подтвержденный случай заражения людей гриппом птиц произошел в Гонконге в 1997 г., когда H5N1 вызвал тяжелое респираторное заболевание у 18 человек, из которых 6 умерло, причем заболевание было вызвано вирусом, циркулирующим в тот момент в популяции местной домашней птицы [Wong S.S, 2006; Lewis D.B, 2006].
В настоящее время активно дискутируется вопрос о возможности распространения новой пандемии гриппа [Garca-Garca J, 2006; Thomas J.K, 2007; Kleinman A.M, 2008]. Опасность представляет не только широкое распространение подтипа H5N1 в популяции птиц, но также высокая летальность данного вируса для человека: из 433 случаев заболевания людей гриппом H5N1 262 закончились летальным исходом [WHO, 2009]. В случае с гриппом птиц Н5N1 была определена 3 фаза предупреждения пандемии гриппа.
13 апреля 2009 г. в Мексике был подтвержден первый случай заражения новым видом вируса, который получил название «свиной грипп». Позже, когда был идентифицирован штамм возбудителя (California/07/2009), болезнь получила название грипп H1N1. Появление и циркуляция данного вируса гриппа Н1N1 в популяции людей привела к объявлению 27.04.09 г. 6 фазы предупреждения о пандемии. Объявление этой фазы указывает на то, что началась глобальная пандемия. По данным ВОЗ на 15.06.2009 в мире случаи заражения вирусом гриппа H1N1 зафиксированы в 76 странах. Общее число заболевших составляет 35928 человек, из них смертью закончились 163 [Li G.-X, 2009; Bolotin S, 2009; et al].
Можно предполагать, что причина столь быстрого распространения вируса H1N1 в человеческой популяции является отсутствие иммунитета у человека и наличие в геноме данного вируса генов от вируса гриппа птиц и вируса гриппа человека [WER, 2009; Hurt A.C, 2009; MMWR, 2009].
В плане предупреждения возникшей угрозы здоровью людей вакцинация будет основным инструментом в борьбе с инфекцией. Следовательно, разработка эффективных вакцин против пандемического гриппа – вопрос первостепенной важности. Лабораторно-экспериментальные исследования, проведенные с субтипом Н5N1 показали, что существует реальная проблема разработки пандемических вакцин, связанная с тем, что отработанные и принятые повсеместно схемы применения (способ введения, кратность, интервал, доза) сезонных гриппозных вакцин не эффективны в случае «птичьего» или «свиного» гриппа [Desheva J.A, 2006; Howard M.K, 2008; MMWR, 2009; WHO, 2009].
Еще одной проблемой, связанной с появлением пандемического вируса гриппа, является недостаток производственных мощностей для обеспечения населения вакциной.
Новые технологии должны сыграть важную роль в разработке наилучшей вакцины против пандемического гриппа. Идеальная вакцина должна быть безопасной и высокоэффективной с точки зрения защиты во всех целевых группах, включая грудных детей и престарелых. Препарат должен содержать небольшое количество антигена вируса и храниться без охлаждения. И наконец, такая вакцина должна производиться в больших масштабах и недорого стоить [ВОЗ, 2005].
Стратегии производства эффективных вакцин, использующих меньшее содержание антигена, за счет включения в состав препарата адъюванта, могут привести к значительному увеличению производственного потенциала, но для этого необходимо проведение полномасштабных доклинических и клинических исследований, доказывающих безопасность и иммуногенность сконструированных препаратов.
Имея в виду изложенные аргументы, проведение целенаправленных фундаментальных и прикладных исследований по разработке и изучению свойств «макетных» пандемических вакцин против гриппа является актуальной проблемой.
Целью настоящей работы являлось экспериментально-клиническое обоснование выбора стратегии профилактики гриппозной инфекции в период подготовки к пандемии.
Задачи исследования:
1. Сконструировать живую и инактивированные потенциальные («макетные») препандемические гриппозные вакцины.
2. Изучить физико-химические и молекулярно-биологические свойства отечественных потенциальных («макетных») препандемических гриппозных вакцин.
3. Провести доклинические и клинические исследования живой гриппозной вакцины «Ультрагривак» и оценить их результаты.
4. Провести сравнительные доклинические и клинические исследования гриппозных инактивированных субъединичных вакцин «ОрниФлю» и «ВГИПС» и выбрать наиболее оптимальный вариант;
5. Провести доклинические и клинические исследования гриппозной инактивированной расщепленной виросомальной адсорбированной вакцины «АвиФлю» и оценить их результаты.
6. Разработать оптимальную стратегию вакцинации населения в период подготовки к пандемии.
Научная новизна. Впервые изучены свойства живой «Ультрагривак» и инактивированных субъединичной сорбированной «ОрниФлю» и расщепленной виросомальной сорбированной «АвиФлю» потенциальных («макетных») препандемических вакцин против гриппа.
В ходе проведенных исследований впервые:
- выбраны наиболее перспективные варианты потенциальных («макетных») препандемических вакцин против гриппа – живая «Ультрагривак», инактивированные адсорбированные - субъединичная «ОрниФлю» и расщепленная виросомальная «АвиФлю»;
- экспериментально обоснована необходимость применения двукратной схемы вакцинации с целью профилактики пандемического гриппа;
- в рамках доклинических исследований экспериментально доказана безопасность и иммунологическая эффективность живой «Ультрагривак» и инактивированных адсорбированных субъединичной «ОрниФлю» и расщепленной виросомальной «АвиФлю» потенциальных («макетных») препандемических гриппозных вакцин на лабораторных животных;
- в рамках клинических исследований экспериментально доказана низкая реактогенность, безопасность и иммуногенность живой «Ультрагривак» и инактивированных адсорбированных субъединичной «ОрниФлю» и расщепленной виросомальной «АвиФлю» потенциальных («макетных») препандемических гриппозных вакцин на добровольцах;
- разработаны и утверждены критерии реактогенности и иммуногенности живой «Ультрагривак» и инактивированной субъединичной адсорбированной «ОрниФлю» препандемических гриппозных вакцин.
- обоснованы схемы вакцинации населения РФ с целью специфической профилактики гриппа в случае возникновения пандемии: для живой вакцины «Ультрагривак» - интраназально двукратно с интервалом 10 сут в дозе не менее 7,5 lg ЭИД50; для инактивированной субъединичной адсорбированной вакцины «ОрниФлю» - внутримышечно двукратно с интервалом 28 сут в дозе 15 мкг НА.
Практическая значимость работы. Работа имеет большое народно-хозяйственное значение. В результате проведенной работы:
- доказана эффективность технологических подходов при конструировании безопасных и эффективных живой и инактивированных вакцин против пандемического гриппа;
- выбраны наиболее оптимальные конструкции вакцин для защиты населения РФ от пандемии гриппа - живая вакцина «Ультрагривак»; инактивированные адсорбированные субъединичная «ОрниФлю» и расщепленная виросомальная «АвиФлю»;
- по результатам исследований оформлены НТД, зарегистрированы и разрешены к применению в РФ живая интраназальная вакцина «Ультрагривак» (ЛСР-002340/09 от 25.03.2009) и инактивированная субъединичная адсорбированная вакцина «ОрниФлю» (ЛСР-001481/09 от 03.03.2009);
Результаты и выводы диссертации могут быть использованы при разработке средств профилактики и лечения инфекционных заболеваний, имеющих пандемический потенциал.
Внедрение результатов работы. По теме работы разработана НТД (ФСП, инструкция по применению, регламент производства) на живую гриппозную вакцину «Ультрагривак», гриппозные инактивированные адсорбированные субъединичную «ОрниФлю» и расщепленную виросомальную «АвиФлю».
В марте 2009 г. в РФ зарегистрированы и разрешены к применению две «макетные» пандемические гриппозные вакцины:
- инактивированная субъединичная адсорбированная «ОрниФлю» (ЛСР-001481/09 от 03.03.2009);
- живая «Ультрагривак» (ЛСР-002340/09 от 25.03.2009).
Апробация работы. Основные результаты диссертационной работы доложены на Всероссийской научно-практической конференции «Вакцинология 2006. Совершенствование иммунобиологических средств профилактики, диагностики и лечения инфекционных болезней» (Москва, 21-22 ноября 2006 г.), Международном семинаре-тренинге «Актуальные вопросы защиты населения от биологических угроз» (Москва, 17-19 октября 2007 г.), Шестой международной конференции «Клинические исследования лекарственных средств» (Москва, 12 октября 2007 г.), Всероссийской научной конференции «Теоретические основы эпидемиологии. Современные эпидемиологические и профилактические аспекты инфекционных и массовых неинфекционных заболеваний» (Санкт-Петербург, 17-18 апреля 2008 г.), Международной научно-практической конференции «Проблемы совершенствования межгосударственного взаимодействия в подготовке к пандемии гриппа» (Новосибирская обл., Кольцово, 9-10 октября 2008 г.), IV научно-практической конференции «Актуальные проблемы медицинской биотехнологии» (Краснодарский край (пос. Джемете), 9-12 сентября 2008 г.), Проблемной комиссии РАМН «Грипп и гриппоподобные инфекции, включая особо опасные. Фундаментальные и прикладные аспекты изучения. (Санкт-Петербург, 19 февраля 2009 г.), VII съезде аллергологов и иммунологов СНГ. II Всемирный форум по астме и респираторной аллергии (Санкт-Петербург, 26-28 апреля 2009 г.), Международной конференции «Актуальные проблемы в области развития и внедрения противогриппозных вакцин и вакцин против гриппа птиц» (г. Иркутск, 14-15 мая 2009 г.), Х международном конгрессе, посвященном 100-летию со дня рождения академика АМН А.Д.Адо «Современные проблемы аллергологии, иммунологии и иммунофармакологии», г. Казань, 20-23 мая 2009 г).
Публикации. По теме диссертации опубликовано 56 печатных работ, в том числе в 15 журналах, рекомендованных ВАК и в 41 тезисе докладов.
Структура и объем диссертации. Диссертация изложена на 482 страницах текста, включая 129 таблиц и 34 рисунка; состоит из введения, трех глав обзора литературы, пяти глав собственных исследований, заключения, выводов и списка литературы, который содержит 317 источников, из них 24 отечественных и 293 – иностранных.
Личный вклад автора. Тема и план диссертации, ее основные идеи и содержание разработаны автором на основании проведенных исследований. Проекты конструирования, планирование и проведение доклинических и клинических исследований препандемических гриппозных вакцин проведены при непосредственном участии автора. Автор принимал личное участие в заседаниях ВОЗ, Проблемной Комиссии и Комиссии по гриппозным вакцинным и диагностическим штаммам по вопросам, связанным к подготовке к пандемии гриппа. Во всех совместных исследованиях по теме диссертации, наряду с личным участием в их проведении, автору принадлежит участие в анализе полученных данных. Все материалы, использованные в диссертационной работе, проанализированы и обобщены лично автором.
МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ
Материалы:
Вакцинные штаммы
При конструировании «макетных» пандемических вакцин использованы два вакцинных штамма, рекомендованных ВОЗ, полученные методом обратной генетики и один штамм, разработанный в РФ, на основе апатогенного утиного штамма Н5, полученный методом классической рекомбинации (реассортации).
Штамм NIBRG-14(A/Vietnam/1194/2004 (H5N1), клайд 1, предоставлен Национальным институтом биологических стандартов и контроля (NIBSC), Великобритания. Штамм А/Indonesia/5/2005, клайд 2.1., получен из Института по контролю за заболеваниями (CDC), США.
Реассортанты NIBRG-14(A/Vietnam/1194/2004(H5N1) и А/Indonesia/5/2005 (H5N1) разработаны на основе штамма А/PR/8/34(Н1N1) и содержали модифицированные методами обратной генетики HA и NA. Соотношение генов в штаммах 6:2, история пассирования - клеточная культура VERO – 1 пассаж, РКЭ - 2 пассажа.
Методом классической рекомбинации, в ГУ НИИ экспериментальной медицины РАМН, подготовлен вакцинный штамм А/17/утка/Потсдам/86/92(Н5N2)[17/Н5], на основе апатогенного утиного штамма вируса А/утка/Потсдам/1402-6/86(Н5N2) и холодоадаптированного донора аттенуации А/Ленинград/134/17/57(H2N2). Соотношение генов в вакцинном штамме А/17/утка/Потсдам/86/92(Н5N2)[17/Н5] - 7:1, с историей пассирования - 7 пассажей в РКЭ в процессе реассортации.
Субстрат накопления
В качестве субстрата накопления вакцинных штаммов использованы 10 - суточные РКЭ.
Культуры клеток
Для определения биологической активности штаммов вирусов гриппа птиц в исследованиях использованы перевиваемые культуры клеток почек зеленых мартышек – Vero B, почек собаки – МDCK. В качестве ростовой среды и среды поддержания использовали полусинтетическую среду (ПС-4) на базе раствора Хенкса (раствор Эрла для культуры клеток Vero B), содержащую 7,5 и 2 % сыворотки крупного рогатого скота соответственно.
Адъюванты
В качестве адъювантов использованы: алюминия гидроксид («Brenntag Biosector», Дания), Полиоксидоний® - сополимер N-окиси 1,4 этиленпиперазина и (N-карбоксиэтил)-1,4-этиленпиперазиний бромида («Группа Компаний Петровакс», г. Москва), Глутоксим® – Бис-(гамма-L-глутамил)-L-цистеинил-бис-глицин динатриевая соль (ЗАО «ФАРМА ВАМ», г. Москва).
Исследуемые вакцины против гриппа птиц
На основе вакцинных штаммов приготовлены три типа инактивированных (цельновирионная, сплит (расщепленная) и субъединичная) и живая аттенуированная вакцины против гриппа птиц.
Инактивированная цельновирионная вакцина против гриппа птиц, на основе штамма NIBRG-14 (A/Vietnam/1194/2004 (H5N1), приготовлена по технологии получения Вакцины гриппозной инактивированной элюатно-центрифужной жидкой, зарегистрированной и разрешенной к применению в РФ.
Инактивированная субъединичная вакцина против гриппа птиц, на основе штамма NIBRG-14 (A/Vietnam/1194/2004 (H5N1), получена по технологии производства сезонной вакцины «Гриппол» (Вакцина гриппозная тривалентная полимер-субъединичная жидкая), зарегистрированной и используемой в РФ в рамках календаря профилактических прививок. В зависимости от входящих в состав препарата адъювантов сконструированы 2 вида субъединичных вакцин – «ОрниФлю» - вакцина сорбированная на алюминии гидроксиде и «ВГИПС» - вакцина в смеси с Полиоксидонием.
В основе технологии приготовления инактивированной сплит (расщепленной) вакцины против гриппа птиц «АвиФлю» использованы подходы, отработанные на новой сезонной инактивированной расщепленной вакцине «Грифор», зарегистрированной в 2008 г. в РФ. Инактивированная расщепленная вакцина против гриппа птиц, поэтапно, произведена на основе штаммов NIBRG-14(A/Vietnam/1194/2004(H5N1), А/Indonesia/5/2005(H5N1), А/17/утка/Потсдам/86/92(Н5N2)[17/Н5]. Принципиальное отличие конструкции данной вакцины заключалось в использовании адъюванта алюминия гидроксида и в пространственной структуре препарата в форме виросом.
«Ультрагривак» - живая аттенуированная вакцина против гриппа птиц, произведена по технологии сезонной гриппозной вакцины «Ультравак», успешно применяемой в РФ для предотвращения и снижения заболеваемости гриппом различных возрастных групп на протяжении более 30 лет. Вакцина приготовлена на основе вакцинного штамма А/17/утка/Потсдам/86/92(Н5N2)[17/Н5]. Для получения вакцинного штамма в процессе реассортации использованы два апатогенных штамма: А/утка/Потсдам/1402-6/86(Н5N2), не вызывающий заболевания и гибели уток и А/Ленинград/134/17/57(H2N2), универсальный холодоадаптированный донор аттенуации, используемый в приготовлении сезонной гриппозной вакцины.
Экспериментально-производственные серии живой и инактивированных вакцин против гриппа птиц произведены на филиалах ФГУП «НПО «Микроген» МЗ РФ в г. Иркутске «Иркутское предприятие по производству бактерийных препаратов» и г. Уфе «Иммунопрепарат».
Вирулентный штамм вируса гриппа птиц А/ H5N1
Для оценки протективных свойств полученных вакцин против гриппа птиц использован дикий вирулентный штамм вируса гриппа птиц А/курица/Курган/Россия/2/05 (H5N1).
Штаммы вируса гриппа птиц, используемые при оценке кросс-реактивности вакцин против гриппа птиц
При изучении кросс-реактивности «Ультрагривак» - вакцины живой аттенуированной использован штамм вируса гриппа птиц А/Chicken/Suzdalka/Nov-11/2005 (H5N1), выделенный в Новосибирской области в 2005 г. Кроме того, при исследовании сывороток крови привитых вакциной «Ультрагривак» использованы гетерологичные вакцинные штаммы NIBRG-14(A/Vietnam/1194/2004(H5N1), А/Indonesia/5/2005 (H5N1).
При оценке кросс-реактивности «АвиФлю» - вакцины инактивированной расщепленной применены гетерологичные вакцинные штаммы NIBRG-14(A/Vietnam/1194/2004(H5N1), А/Indonesia/5/2005 (H5N1) и А/17/утка/Потсдам/86/92(Н5N2)[17/Н5].
Лабораторные животные
Лабораторно-экспериментальные (доклинические) исследования проведены на белых беспородных половозрелых мышах обоего пола, массой 18-20 г, морских свинках обоего пола, массой 200-250 г, кроликах породы «Шиншилла» обоего пола, массой 2,5- 3 кг, курах породы белый Леггорн в возрасте 4-х недель, хорьках обоего пола в возрасте 4-х месяцев, обезьянах: яванских макаках, массой от 2,5 до 3,0 кг, павианах гамадрилах, массой от 2,3 до 2,7 кг, зеленых мартышках, массой 2,0 кг, макаках резусах, массой 2,4 кг.
Биоматериалы
Кровь и сыворотки крови, полученные от иммунизированных животных, изучали в рамках доклинических исследований.
Кровь и сыворотки крови, мочу и носоглоточные смывы привитых добровольцев изучаны в рамках клинических исследований. Получение и обработку клинических материалов производили согласно «Методическим указаниям по проведению контроля противогриппозных препаратов» от 16.11.84 или МУК 4.2.2136-06.
Методы:
Электронная микроскопия
Вакцины против гриппа птиц на различных технологических стадиях приготовления исследовали в электронном микроскопе JEM 100-CX (JEOL, Япония) при инструментальном увеличении 58000х, напряжении 80 кВольт и апертурной диафрагме 50 мкм. Фотографирование производили на фотопленку (Agfa Alliance Camera CE, Германия). Морфологический анализ изучаемых образцов проводили методом негативного контрастирования.
Метод электрофореза
Для определения чистоты, гомогенности и молекулярной массы антигенов инактивированных вакцин против гриппа птиц применяли метод электрофореза в 12 % полиакриламидном геле (ПААГ) с додецилсульфатом натрия (SDS) в нередуцирующих условиях с последующей окраской геля Кумасси ярко-голубым R-250. Испытание проводили на полуфабрикатах вакцин перед добавлением каких либо стабилизаторов, консервантов и других компонентов, входящих в состав лекарственной формы.
Доклинические исследования
Доклинические исследования проводили в соответствии с Федеральным законом о лекарственных средствах от 22 июня 1998 г. № 86-ФЗ, приказом Минздрава РФ от 19.06.2003 № 267 г. «Об утверждении правил лабораторной практики» и рекомендаций руководств.
На лабораторных животных проводили оценку безопасности вакцин против гриппа птиц по следующим критериям: острая токсичность, хроническая токсичность, влияние на гематологические показатели, местное и местно-раздражающие действие, гиперчувствительность немедленного типа, гиперчувствительность замедленного типа, генетическая стабильность.
Эффективность вакцин против гриппа птиц на лабораторных животных включала оценку иммуногенных свойств в ИФА, РТГА, РН и протективных свойств, после инфицирования вирулентным штаммом вируса гриппа птиц.
Клинические исследования
Клинические исследования проводили в соответствии с Федеральным законом о лекарственных средствах от 22 июня 1998 г. № 86-ФЗ, приказом Минздрава РФ от 19.06.2003 № 266 «Правила клинической практики в Российской Федерации», национальным стандартом Российской Федерации ГОСТ Р52379-2005 «Надлежащая клиническая практика» и утвержденными протоколами, на основании решений Федерального комитета по этике и разрешений Росздравнадзора, согласно Европейскими Предписаниями по GCP и Хельсинской Декларацией.
Критерии переносимости, реактогенности и безопасности включали оценку витальных симптомов (АД, ЧСС, t тела), нежелательных явлений (местные и системные реакции), согласно МУ 3.3.2.1758-03 «Методы определения показателей качества иммунобиологических препаратов для профилактики и диагностики гриппа» и лабораторных показателей (IgA, IgM, IgG, IgE, ОАК, ОАМ, б/х крови).
Иммуногенные свойства вакцин против гриппа птиц изучали в РТГА, РМН, ИФА, определяя уровень сероконверсии, уровень серопротекции, фактор сероконверсии, величину среднегеометрического титра антител. После вакцинации живой аттенуированной вакциной против гриппа птиц также проводили оценку секреторного IgA и специфического IgG.
Анализ гена гемагглютинина Н5 вируса гриппа методом ПЦР
Анализ гена гемагглютинина серотипа H5 в вируссодержащем материале проводили с использованием коммерческих наборов «АмплиСенс Influenza virus H5» - для выявления РНК вируса гриппа А и идентификации субтипа Н5N1 методом обратной транскрипции и полимеразной цепной реакции (ПЦР) с гибридизационно-флюоресцентной детекцией по «конечной точке».
Анализ нуклеотидных последовательностей генов PB1, PB2, PA, M, и NS
Вирусную РНК выделяли из вируссодержащей культуральной жидкости набором RNeasy Mini kit «Qiagen» (Valencia, CA). Реакцию обратной транскрипции проводили с праймером Uni-12, комплементарным 3`-концевой последовательности всех сегментов генома вируса гриппа с помощью ревертазы M-MulV «СибЭнзим» (Россия). Методом ПЦР с использованием специфичных праймеров на гены PB1, PB2, PA, NР, M, и NS вируса гриппа получены фрагменты ДНК генов. Постановку полимеразной реакции осуществляли на амплификаторе Dyad «BioRad».
Определение концентрации секреторного IgA в назальных смывах методом ИФА
Для исследования использовали набор реагентов для иммуноферментного определения концентрации секреторного иммуноглобулина класса А в биологических жидкостях («Вектор-Бест», Россия). Концентрацию sIgA в образцах определяли по калибровочному графику. Чувствительность анализа составляла 0,35 мг/л.
Определение активности цитотоксических Т-лимфоцитов (ЦТЛ), сенсибилизированных к вирусу гриппа
Идентификацию (предсказание) ЦТЛ-эпитопов в последовательностях белков вируса гриппа А (ВГА) для оценки ВГА-специфического ответа CD8+ T-лимфоцитов (TCD8+) в реакции ELISPOT ИФН-гамма проводили с помощью программы ProPred1 и оригинального программного обеспечения QMpredict. Шесть пептидов для ELISPOT ИФН-гамма анализа: GILGFVFTLTV, RMVLASTTAK, ELRSRYWAI, SRYWAIRTR, CTELKLSDY, KMNTQFEAV, были синтезированы стандартным твердофазным методом на тритильном полимере с использованием Nsc-аминокислот. Очистку пептидов обращено-фазовой ВЭЖХ проводили на колонке 15х250 мм с полимером PLRP (Polymer Laboratories Reverse Phase) 300A 15-20 мкм в градиенте ацетонитрила с 0,1% трифторуксусной кислотой (ТФУ). Для постановки ELISPOT ИФН-гамма использовали наборы Human IFN-gamma ELISPOT Set, Pierce Product # ELS002 и 96-луночные планшеты Millipore MultiScreenHTS-IP Filter Plates for ELISPOT, Millipore Product # MSIPS4W10.
Статистическая обработка данных
При анализе полученных результатов определяли средние величины и стандартное отклонение (M±). Оценку статистической достоверности различий проводили при помощи компьютерной программы Statistica (версия 6,0) с использованием теста t-распределения Стьюдента для выборок с нормальным распределением, или непараметрических критериев Уилкоксона-Манна-Уитни.
ОСНОВНЫЕ РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЙ
Конструирование и изучение физико-химических и молекулярно-биологических свойств «макетных» пандемических вакцин против гриппа
Позиция ВОЗ по вопросу использования вакцин с целью профилактики гриппозной инфекции сводится к тому, что наиболее надежными средствами защиты от вирусных инфекций являются вакцинные препараты, формирующие при иммунизации напряженный и длительный иммунитет.
Необходимость разработки новых подходов в конструировании и изучение свойств препандемических гриппозных вакцин связана с невозможностью применения классических подходов получения вакцинных штаммов, неэффективностью использования схем (кратность, интервал введения, дозы), используемых в настоящее время для специфической профилактики сезонного гриппа, а также необходимостью включения в состав инактивированных препаратов адъювантов, с целью повышения иммуногенных свойств вакцин и уменьшения дозы антигена, без потери эффективности.
Использование в технологии приготовления вакцин концентрирования и очистки вируса методами высокоскоростного центрифугирования, а также добавление детергента тетрадецилтри-метиламмония бромида (ТДТАБ) позволило получить высокоочищенные субъединичные препараты, с низкой реактогенностью и достаточной иммуногенностью. Используя отработанные технологические подходы на основе штамма NIBRG-14 (A/Vietnam/1194/2004), были сконструированы прототипы пандемической инактивированной субъединичной вакцины против гриппа птиц Н5N1 («ОрниФлю», «ВГИПС»). Методом электронной микроскопии выявлено, что основными морфологическими структурами полуфабриката вакцин были специфические объединения гемагглютининов (розетки), а также минивиросомы с размером от 22 до 50 нм (рис. 1). При проведении электрофореза в ПААГ показано, что очищенные вирионы вируса гриппа птиц Н5N1 содержали в составе как внутренние, так и наружные антигены. Проведение технологических операций приготовления субъединичной вакцины позволило получить высокоочищенный препарат, состоящий из поверхностного белка НАо и следовых количества NP (рис. 2).
  | Рисунок 1 – Полуфабрикат вакцины «ОрниФлю», субтип H5N1, штамм NIBRG -14(A/Vietnam/1194/2004) |
1 2
 | Рисунок 2 - Анализ полипептидного состава вакцины «ОрниФлю» 1. Препарат очищенных вирионов вируса гриппа птиц, штамм NIBRG-14 (A/Vietnam/1194/2004); 2. Полуфабрикат вакцины «ОрниФлю», штамм NIBRG-14 (A/Vietnam/1194/2004). |
В отличие от технологии приготовления инактивированных субъединичных вакцин «ОрниФлю» и «ВГИПС» при конструировании расщепленной виросомальной вакцины «АвиФлю» использовали более щадящий метод инактивации вирусов гриппа – ультрафиолетовое облучение, позволяющее сохранять в нативном состоянии структуру вирионов, новый детергент – бета октилгликозид, обеспечивающий возможность самосборки структур в форме виросом, моделирующих пространственную структуру вирионов вируса гриппа, а также современные методы концентрирования и очистки с использованием хромотографических установок.
При морфологическом исследовании полуфабриката расщепленной виросомальной вакцины выявлено наличие в материале большого количества виросом диаметром 100-180 нм, на поверхности которых неравномерно располагались гемагглютинины. В отличие от вирионов виросомы представляли собой слабо структурированные «пустые» частицы, состоявшие из оболочки и упомянутых выше гемагглютининов (рис. 3, 4). При изучении полипептидного состава инактивированной расщепленной виросомальной вакцины «АвиФлю», приготовленной на основе штаммов А/Indonesia/5/2005 (H5N1) и А/17/утка/Потсдам/86/92(Н5N2)[17/Н5] установлено, что препараты содержали поверхностный антиген вируса НАо и внутренние белки М1 и NP. Молекулярная масса полипептидов НАо отличалась в зависимости от штаммов, так для штамма А/Indonesia/5/2005 (H5N1) она составляла 75 кДА, а для штамма А/17/утка/Потсдам/86/92(Н5N2)[17/Н5] – 72 кДа (рис. 5).
| Рисунок 3 – Полуфабрикат вакцины «АвиФлю», субтип H5N1, штамм А/Indonesia/5/2005 (H5N1) | Рисунок 4 – Полуфабрикат вакцины «АвиФлю», субтип H5N2, штамм А/17/утка/Потсдам/86/92(Н5N2)[17/Н5] |
1 2
 | Рис. 5 - Анализ полипептидного состава вакцины «АвиФлю» 1. Полуфабрикат вакцины «АвиФлю», штамм А/Indonesia/5/2005 (H5N1). 2. Полуфабрикат вакцины «АвиФлю», штамм А/17/утка/Потсдам/86/92 (Н5N2)[17/Н5]. |
Для усиления иммуногенных свойств в конструкции «макетных» инактивированных субъединичной и расщепленной виросомальной вакцин использованы адъюванты – алюминия гидроксид (вакцины «ОрниФлю», «АвиФлю») и Полиоксидоний (вакцина «ВГИПС»).
На первом этапе исследований согласно регулирующим стандартам по проведению доклинических испытаний новых МИБП и в соответствии с согласованным с ФГУН ГИСК им. Л.А. Тарасевича (Протоколом исследования) оценена переносимость и безопасность сконструированных препаратов на двух видах лабораторных животных (белые беспородные мыши и морские свинки).
В результате проведенных исследований показано, что инактивированные цельновирионная несорбированная и сорбированная на алюминии гидроксиде препандемические вакцины, полученные на основе штамма NIBRG-14 (A/Vietnam/1194/2004 (H5N1), обладали токсическими свойствами, плохо переносились и вызывали у лабораторных животных изменения в поведении, снижение двигательной активности и аппетита, изменение шерстяного покрова. Кроме того, у животных, иммунизированных этими препаратами, при патоморфологическом и гистологическом изучении отмечали образования лимфогистиоцитарных инфильтратов в печени, и незначительную гиперплазию единичных лимфоидных фолликулов в ткани селезенки, что могло быть одним из проявлений реакции на вводимые препараты. При изучении местного действия инактивированной цельновирионной вакцины сорбированной на алюминии гидроксиде отмечали выраженную местную воспалительную реакцию в виде покраснения и отека. Менее выраженные местные реакции отмечались у лабораторных животных после введения инактивированной субъединичной вакцины в смеси с Полиоксидонием.
Применение сконструированных инактивированных субъединичных и расщепленной экспериментальных образцов препандемических вакцин против гриппа птиц в остром опыте при однократном внутрибрюшинном введение в дозах 0,65 мкг/кг и 2250 мкг/кг – для белых мышей и 0,65 мкг/кг и 181,7 мкг/кг – для морских свинок, не вызывало гибели животных, не приводило к снижению массы тела, образованию воспалительных экссудатов, выпотов, некробиотических изменений, что свидетельствовало об отсутствии клинических симптомов интоксикации. Ежедневное в течение 14 сут подкожное введение вакцин в суммарной дозе 181,7 мкг/кг - для морских свинок и 2250 мкг/кг – для белых мышей не вызывало гибели животных, не приводило к снижению массы тела, изменению поведения и самочувствия иммунизированных лабораторных животных, что явилось доказательством хорошей переносимости и безопасности разработанных вариантов вакцин.
После отработки ряда технологических деталей и результатов, полученных в рамках предварительных доклинических исследований, нами были сконструированы и изучены четыре прототипа вакцин против гриппа птиц Н5: «ОрниФлю» - инактивированная субъединичная сорбированная на алюминии гидроксиде; «ВГИПС» - инактивированная субъединичная в смеси с Полиоксидонием; «АвиФлю» - инактивированная расщепленная виросомальная сорбированная на алюминии гидроксиде; «Ультрагривак» - живая интраназальная.
Целью дальнейших исследований явилось: выбор оптимальной схемы иммунизации (кратности введения препарата) на белых мышах; выбор инфицирующей дозы вируса гриппа птиц (штамм А/курица/Курган/Россия/2/2005 (Н5N1)) для оценки протективных свойств; оценка иммуногенных (РТГА, РН, ИФА) и протективных свойств экспериментальных образцов живой и инактивированных вакцины против гриппа птиц на белых мышах.
В результате предварительных доклинических исследований «макетных» вакцин против гриппа птиц было показано, что для формирования иммунного ответа у лабораторных животных необходимо проводить не менее двух иммунизаций с интервалом 21-28 сут (для инактивированных) и 10 сут (для живой). Обязательным условием повышения иммуногенности сконструированных инактивированных вакцин явилось включение в состав адъювантов, наиболее перспективными, из которых, явились алюминия гидроксид и Полиоксидоний.
При сравнительной оценке иммуногенных и протективных свойств разработанных экспериментальных образцов инактивированных вакцин показано, что эффективность вакцин зависит от схемы иммунизации животных. Увеличение иммунизирующей дозы и кратности введения, как для живой, так и для инактивированных вакцин существенно повышала их иммуногенные и защитные свойства. Для инактивированных вакцин («ОрниФлю», «ВГИПС», «АвиФлю») наиболее оптимальной схемой иммунизации является двукратное (с интервалом 21-28 суток) введение вакцин в дозе 15 мкг НА. Такая тактика вакцинации приводит к индукции ИФ-АТ в титрах от 1:80 до 1:320, АГА – от 1:10 до 1:40 и ВНА – 1:20 и защищает от заражения вирулентным штаммом (27 ЛД50) от 50 до 80 % белых мышей. Наиболее эффективными являлись инактивированные субъединичная и расщепленная виросомальная вакцины, сорбированные на гидроокиси алюминия (71 и 80 %). Субъединичная вакцина в смеси с Полиоксидонием оказывал менее выраженный защитный эффект (50 %).
При двукратном интраназальном введении живой вакцины «Ультрагривак» с интервалом в 10 суток в дозе 106,4 ЭИД50 вакцина вызывала индукцию ИФ-АТ в титре 1:1280, АГА – 1:180, ВНА – 1:40, и обеспечивала защиту белых мышей от интраназального заражения вирулентным вирусом гриппа птиц в дозе 27 ЛД50 в 87 %, что соответствует требованиям к медицинским средствам защиты (ОТТ 8.1.112-98). Однократная иммунизация в аналогичных условиях обеспечивала защиту только 57 % животных. В контрольных группах, зараженных той же дозой вирулентного возбудителя, погибло 100 % особей, что подтверждает правильность обоснованной ранее инфицирующей дозы вирулентного штамма (табл. 1)
Таблица 1 - Оценка иммуногенных и протективных свойств вакцин
против гриппа птиц на белых мышах
| № п/п | Вакцина | Иммуни-зация | Средняя величина титров антител после иммунизации в серологических реакциях | Доля выживших животных после инфицирования, % | ||
| ИФА | РН | РТГА | ||||
| 1. | «АвиФлю» | 1 | 1:40 | <1:10 | <1:10 | 33 |
| 2 | 1:160 | 1:33 | 1:40 | 71 | ||
| 2. | «ОрниФлю» | 1 | 1:80 | 1:10 | <1:10 | 40 |
| 2 | 1:320 | 1:20 | 1:10 | 80 | ||
| 3. | «ВГИПС» | 1 | <1:40 | <1:10 | <1:10 | 20 |
| 2 | 1:80 | 1:20 | 1:20 | 50 | ||
| 4. | «Ультрагривак» | 1 | 1:320 | 1:14 | 1:40 | 57 |
| 2 | 1:1280 | 1:40 | 1:180 | 87 | ||
| 5. | Контроль | 1,2 | <1:10 | <1:10 | <1:10 | 0 |
В рамках лабораторно-экспериментальных исследований изучены физико-химические и иммунобиологические свойства и выбраны наиболее перспективные вакцинные кандидаты: живая интраназальная («Ультрагривак») и инактивированные субъединичные («ОрниФлю», «ВГИПС»), расщепленная виросомальная («АвиФлю»).
Доклиническое и клиническое изучение живой гриппозной вакцины «Ультрагривак»
В Российской Федерации в отделе вирусологии ГУ НИИЭМ РАМН был получен штамм А/17/утка/Потсдам/86/92(H5N2)[17/Н5] для живой вакцины путем реассортации донора аттенуации А/Ленинград/17/57(H2N2) и штамма А/утка/Потсдам/86, а затем наработаны экспериментальные серии «макетной» вакцины на Иркутском предприятии ФГУП «НПО «Микроген» МЗ РФ.
В рамках доклинических исследований показано, что реассортантный штамм А/17/утка/Потсдам/86/92(Н5N2) сохраняет молекулярную структуру НА и является антигенно-идентичным родительскому птичьему вирусу; он не патогенен для кур; проявляет аттенуирующий фенотип при интраназальном введении мышам, активно репродуцируясь в ВДП при сниженной репродукции вируса в легких; вызывает образование системных и локальных антител не только к гомологичному вирусу, но и к высокопатогенным вирусам подтипа H5N1; при однократном введении создает высокий уровень резистентности к инфекции высокопатогенным вирусом подтипа A(H5N1). «Ультрагривак» - вакцина гриппозная живая, лиофилизат для приготовления раствора для интраназального введения, является иммунологически эффективным препаратом, вызывая выработку ИФ-АТ в титре 1:320 при однократном и 1:1280 при двукратном (с интервалом 10 сут) введении в дозе 10 6,4 ЭИД50 белым мышам массой 14-16 г, вируснейтрализующих антител в титре 1:40 при двукратном введении и гемагглютинирующих антител при однократном введении в титре 1:40, при двукратном – 1:80 и обеспечивает 100 % защиту от заражения 8 ЛД50 и 87 % защиту от 27 ЛД50 вирулентного штамма вируса гриппа птиц А/курица/Курган/Россия/2/2005 (Н5N1) (табл. 2).
Оценивая влияние иммунизации живой вакциной против гриппа птиц на иммунный статус обезьян, необходимо отметить, что вакцинация обеспечивает появление специфических титров АТ, определяемых в реакциях ИФА, РН и РТГА. Однократная вакцинация не обеспечивала формирование напряженного иммунитета у животных. Вторая иммунизация приводила к приросту титров антител, что указывает на обоснованность использования двукратной схемы иммунизации. Результаты клинического обследования добровольцев и проведенные лабораторно-инструментальные исследования свидетельствовали об отсутствии отклонений в самочувствии и в результатах анализов после иммунизации добровольцев вакциной «Ультрагривак» в сравнении с фоновыми значениями.
Таблица 2 - Результаты оценки антигенных и протективных свойств вакцины «Ультрагривак» на белых мышах
| Схема введе ния вакцины | Титр в ИФА | Титр в РН | Титр в РТГА | Зара жаю щая доза, ЛД50 | Количество погибших животных на …сутки после заражения | Продолжитель ность жизни живот ных (х±), сут. | Доля выживших, про цент | ||||||||||||||
| до инфи циро вания | после инфи циро вания | крат ность превы шения, раз | до инфицирования | после инфицирования | до ин фи цирова ния | после инфи циро вания | крат ность пре-вышения, раз | ||||||||||||||
| 5 | 6 | 7 | 8 | 9 | 10 | 11 | 12 | 13 | 14 | ||||||||||||
| Одно кратное | 1: 320 | 1:2560 | 8 | <1:10 | 1:160 | 1:40 | 1:320 | 8 | 8 | 0 | 0 | 1 | 3 | 2 | 0 | 0 | 0 | 0 | 0 | 8,2±0,8 | 60 (9/15) |
| 1:2560 | 8 | 1:160 | 1:160 | 4 | 27 | 1 | 1* | 2 | 3 | 0 | 0 | 0 | 0 | 0 | 0 | 7,2±1,2 | 57 (8/14) | ||||
| Дву кратное | 1:1280 | 1:1280 | 1 | 1:40 | 1:80 | 1:80 | 1:160 | 2 | 8 | 0 | 0 | 0 | 0 | 0 | 0 | 0 | 0 | 0 | 0 | - | 100 (15/15) |
| 1:1280 | 1 | 1:80 | 1:160 | 2 | 27 | 0 | 0 | 1 | 1 | 0 | 0 | 0 | 0 | 0 | 0 | 7,5±0,7 | 87 (13/15) | ||||
| Контроль (неиммунизированные) | 8 | 0 | 0 | 1 | 1 | 8 | - | - | - | - | - | 8,7±0,7 | 0 | ||||||||
| 27 | 0 | 0 | 1 | 6 | 3 | - | - | - | - | - | 8,2±0,6 | 0 | |||||||||
| Примечание 1. - 1*- у погибшего животного вирус гриппа H5N1 из легких не выделили, при вскрытии отсутствовал характерный признак поражения легких – «красное опеченение». 2. 4-кратное и более превышение титра в ИФА после заражения свидетельствует о перенесенной инфекции животных. | |||||||||||||||||||||
Рисунок 6 – Местные реакции на введение вакцины «Ультрагривак»
Местные реакции после первой вакцинации на 4, 5 дни были представлены катаральными явлениями в носоглотке, имели слабовыраженный транзиторный характер и исчезали на 6 день (рис.6). Местные реакции средней и сильной степени выраженности, а также системные реакции у привитых добровольцев отсутствовали. Результаты клинического и биохимического анализа крови и общего анализа мочи в процессе вакцинации не претерпели существенных изменений относительно нормальных значений. Реизоляты проявляли ts и ca фенотип, сохраняли изменения в генах внутренних и неструктурных белков, а также характерные для донора аттенуации биологические свойства, что свидетельствует о генетической стабильности вакцины «Ультрагривак» (табл. 3).
Таблица 3 – Оценка генетической стабильности вакцины «Ультрагривак»
| Интервал между введением | Вакцинация | Основные мутации в генах внутренних и неструктурных белков реизолятов, характерные для [17/H5] | |||||
| РВ2-1459 | PB1-819 | PA-107 | PA-1045 | М-969 | NS-798 | ||
| 10 сут | V1 | T | T | C | T | A | A |
| V2 | T | T | C | T | A | A | |
| 21 сут | V1 | T | T | C | T | A | A |
| V2 | T | T | C | T | A | A | |
Изучение локального иммунного ответа в носовых секретах волонтеров, привитых вакциной «Ультрагривак» показало, что достоверные приросты концентрации sIgA-антител в ИФА отмечены более чем в 2 раза, по сравнению с исходными значениями, после двукратного введения препарата, независимо от интервала введения 10 или 21 сут (рис. 7).
Рисунок 7 – Оценка местного иммунитета на введение вакцины «Ультрагривак»
При оценке в РМН сывороток крови привитых добровольцев после двукратной вакцинации процент лиц с титром антител 1:20 составил более 70 %, с титром антител 1:40 – более 50 %, при этом кратность прироста СГТ антител - 5 (рис. 8).
Рисунок 8 – Оценка иммуногенных свойств вакцины «Ультрагривак»
С целью оценки реактогенности, безопасности, местного, клеточного и гуморального иммунного ответа, выбора оптимальной схемы (интраназальная двукратная с интервалами 10 и 21 сут) вакцинации, а также возможности усиления иммуногенности препарата за счет увеличения дозы с 6,9 lg ЭИД50/0,5 мл до не менее 7,5 lg ЭИД50/0,5 мл на двух клинических базах с участием 200 добровольцев в возрасте от 18 до 60 лет была проведена II фаза клинических исследований вакцины «Ультрагривак».
Показано, что препарат вне зависимости от интервала введения 10 или 21 сут обладает хорошей переносимостью, безопасностью и низкой реактогенностью. Местные реакции были представлены катаральными явлениями в носоглотке, носили слабовыраженный транзиторный характер и исчезали через 1-2 суток (рис. 6). Уровни сывороточных иммуноглобулинов классов A, М, G и. Е, у всех добровольцев в течение периода исследования сохранялись в пределах нормальных значений. Получены положительные данные о выделяемости вируса из носовых ходов привитых, что свидетельствует о хорошей приживаемости вакцины. Для выделения вакцинного вируса потребовалось 2-3 пассажа на чувствительных культурах клеток, что говорит о крайне незначительном содержании вируса в мазках из полости носа привитых и может свидетельствовать о безопасности вакцины для окружающих (рис. 9).
Рисунок 9 – Оценка безопасности вакцины «Ультрагривак» для окружающих
Генетическая стабильность реизолятов вакцинного вируса продемонстрирована молекулярно-биологическими методами, что является существенной гарантией безопасности применения применяемого вакцинного штамма на людях. Полученные данные показывают, что вакцина «Ультрагривак» способна обеспечить иммунный ответ не только в отношении гомологичного вакцинного штамма А/17/утка/Потсдам/86/92 Н5N2 [17/Н5], и в отношении других штаммов вируса гриппа птиц А (H5N1): А/Vietnam/1194/2004 и A/Indonesia/5/2005, т.е. обладает высокой кросс-реактивностью (рис. 10). В результате проведенных клинических исследований установлено, что живая гриппозная вакцина «Ультрагривак
Рисунок 10 – Оценка кросс-реактивности вакцины «Ультрагривак»
ареактогенна, безвредна для вакцинируемых, безопасна для окружающих, индуцирует развитие местного, клеточного и гуморального иммунитета, что позволило зарегистрировать препарат в Российской Федерации с целью защиты населения в случае возникновения пандемии гриппа. Учитывая назначение вакцины «Ультрагривак» для специфической профилактики пандемического гриппа преимущество имеет схема введения препарата с интервалом 10 сут, что позволит сократить время для обеспечения полноценной защиты людей от инфекции.
Доклиническое и клиническое изучение инактивированных гриппозных вакцин «ОрниФлю», «ВГИПС» и «АвиФлю»
С целью оценки безопасности и эффективности полученных вакцинных кандидатов были проведены доклинические исследования на лабораторных животных. В результате проведенных исследований показано, что вакцины «ОрниФлю» и «ВГИПС» нетоксичны в остром и хроническом эксперименте, хорошо переносились животными, не обладали выраженными местными и местно-раздражающими действиями, не вызывали негативного влияния на патоморфологические, гистологические и гематологические показатели. Незначительные изменения изучаемых показателей более выражены были при использовании вакцины «ВГИПС». При изучении антигенных и протективных свойств показано, что для индукции иммунитета и получения эффективной защиты животных от патогенного вируса гриппа птиц необходимо проводить не менее двух иммунизаций. Наиболее оптимальной схемой иммунизации животных является внутримышечная двукратная с интервалом 28 сут в дозе 15 мкг НА, позволяющая инициировать выработку ИФ-АТ в титрах от 1:80 до 1:320, АГА – от 1:10 до 1:40 и ВНА – 1:20 и защищать от гибели от 50 до 80 % лабораторных животных, инфицированных вирулентным штаммом вируса птичьего гриппа А/курица/Курган/Россия/2/2005 (Н5N1) (табл. 4).
В рамках I фазы сравнительных клинических исследований на ограниченном контингенте добровольцев (241 доброволец в возрасте от 18 до 50 лет) с целью оценки реактогенности, безопасности и иммуногенности при использовании трех дозировок препаратов (15, 30 и 45 мкг НА) после одно- и двукратного введения были изучены инактивированные субъединичные сорбированная на алюминии гидроксиде «ОрниФлю» и в смеси с Полиоксидонием «ВГИПС» вакцины против гриппа птиц.
Оба типа вакцин отличались хорошей переносимостью, безопасностью и низкой реактогенностью. Серьезных побочных реакций на введение вакцинных препаратов отмечено не было ни в одном случае. В большинстве случаев местные реакции слабой и средней степени выраженности наблюдались как у привитых вакциной «ОрниФлю», так и вакциной «ВГИПС» и были представлены болью в месте введения вакцин (рис. 11, 12).
Уровень иммуногенности, индуцированный вакциной «ОрниФлю», содержащей 15 мкг НА соответствовал уровню иммуногенности индуцированному вакциной «ВГИПС», содержащей 45 мкг НА (рис. 13), а также по данным литературы показателям иммуногенности индуцированных препаратом субъединичной вакцины без адъюванта, содержащей 90 мкг НА и препаратом адсорбированной субъединичной вакцины, содержащей 30 мкг НА.
Исходя из концепции создания вакцинных препаратов, предпочтение отдается вакцине, которая при минимальном количестве антигена индуцирует достаточный уровень специфического иммунного ответа у привитых добровольцев и не оказывает неблагоприятного влияния на здоровье вакцинируемых.
Таблица 4 – Антигенные и протективные свойства инактивированных субъединичных вакцин «ОрниФлю» и «ВГИПС»
| Крат ность введения вакцины | Препарат | Иммуни зирую щая доза, мкг НА | Величина титра антител в | Количество погибших животных на …сутки после заражения | Продолжительность жизни животных (х±), сут. | Доля выживших, процент | |||||||||||
| ИФА | РН | РТГА | 5 | 6 | 7 | 8 | 9 | 10 | 11 | 12 | 13 | 14 | |||||
| Одно-кратное | «ВГИПС» | 1,0 | <1:40 | <1:10 | <1:10 | 0 | 0 | 4 | 4 | 1 | 2 | 0 | 0 | 0 | 0 | 8,1±1,1 | 15,4 (2/13) |
| 15,0 | <1:40 | <1:10 | <1:10 | 0 | 0 | 6 | 5 | 0 | 1 | 0 | 0 | 0 | 0 | 7,7±0,9 | 20,0 (3/15) | ||
| «ОрниФлю» | 1,0 | <1:40 | <1:10 | <1:10 | 0 | 0 | 9 | 5 | 0 | 0 | 0 | 0 | 0 | 0 | 7,4±0,5 | 6,7 (1/15) | |
| 15,0 | <1:80 | <1:10 | <1:10 | 0 | 0 | 7 | 2 | 0 | 0 | 0 | 0 | 0 | 0 | 7,2±0,4 | 40,0 (6/15) | ||
| Двукрат-ное | «ВГИПС» | 1,0 | 1:40 | 1:10 | 1:10 | 0 | 0 | 3 | 7 | 0 | 0 | 0 | 0 | 0 | 0 | 7,7±0,5 | 28,6 (4/14) |
| 15,0 | 1:80 | 1:20 | 1:20 | 0 | 0 | 4 | 2 | 1 | 0 | 0 | 0 | 0 | 0 | 7,6±0,8 | 50,0 (7/14) | ||
| «ОрниФлю» | 1,0 | 1:40 | <1:10 | <1:10 | 0 | 0 | 6 | 7 | 1 | 0 | 0 | 0 | 0 | 0 | 7,6±0,6 | 6,7 (1/15) | |
| 15,0 | 1:320 | 1:20 | 1:10 | 0 | 0 | 3 | 0 | 0 | 0 | 0 | 0 | 0 | 0 | 7,0±0,0 | 80,0 (12/15) | ||
| Контроль (неиммунизированные) | 0 | 0 | 1 | 6 | 3 | 0 | 0 | 0 | 0 | 0 | 8,2±0,6 | 0 | |||||
| Примечание – заражающая доза 25 ЛД50 | |||||||||||||||||
Рисунок 11 – Оценка местных реакций на введение вакцин «ОрниФлю» и «ВГИПС»
Рисунок 12 – Оценка системных реакций на введение вакцин «ОрниФлю» и «ВГИПС»
Рисунок 13 – Оценка иммуногенных свойств вакцин «ОрниФлю» и «ВГИПС»
Этим требованиям соответствует вакцина «ОрниФлю» с содержанием в одной прививочной дозе 15 мкг НА и 0,5 мг алюминия гидроксида, что дало основание рекомендовать ее для проведения II фазы клинического исследования.
В контролируемом проспективном рандомизированном многоцентровом двойном слепом исследовании приняли участие 360 добровольцев в возрасте от 18 до 60 лет. В рамках проведенной I фазы исследований отмечено существенное влияние содержания алюминия гидрооксида на показатели иммуногенной активности вакцины «ОрниФлю». Принципиальным отличием данного препарата от конструкции вакцины «ОрниФлю» использованной в рамках проведения I фазы клинического исследования являлось повышении концентрации алюминия гидроксида в составе препарата с 0,23 мг до 0,5 мг. В рамках II фазы исследовали вакцину «ОрниФлю» с антигенной нагрузкой 15 и 30 мкг НА.
Вакцина «ОрниФлю» характеризовалась хорошей переносимостью, безопасностью и низкой реактогенностью вне зависимости от использованной дозы. Побочных реакций сильной степени выраженности и серьезных нежелательных явлений на введение вакцины отмечено не было ни в одном случае. Местные реакции были слабой степени выраженности и наблюдались в группах лиц, привитых как вакциной «ОрниФлю», с антигенной нагрузкой НА 15 мкг/доза так и с антигенной нагрузкой НА 30 мкг/доза. Достоверных различий по частоте возникновения местных реакций между этими группами выявлено не было. Системные реакции также в основном были слабой степени выраженности. Температурная реакция средней степени выраженности в большинстве случаев наблюдалась в группе лиц, привитых вакциной «ОрниФлю», с антигенной нагрузкой НА 30 мкг/доза (рис. 14). Результаты клинического и биохимического анализа крови и общего анализа мочи в процессе вакцинации исследуемыми препаратами не претерпевали существенных изменений относительно нормальных значений.
Рисунок 14 – Оценка местных и системных реакций на введение вакцины «ОрниФлю»
Учитывая отсутствие рекомендаций ВОЗ, СРМР, СНМР и ФГУН ГИСК им. Л.А. Тарасевича Роспотребнадзора к оценке свойств подобного рода вакцин, полученные результаты клинических исследований позволили разработать требования к иммуногенности вакцин против гриппа птиц, которые были сформулированы и утверждены Комиссией по гриппозным вакцинным и диагностическим штаммам МЗСЦ РФ: 1) препандемические вакцины должны после второй вакцинации на 21-28 сут вызывать прирост гомологичных антител в сыворотке крови в 4 и более раз не менее чем у 50 % добровольцев (сероконверсия); 2) повышение средних геометрических титров антител на 21-28 день после второй вакцинации по сравнению с исходным уровнем, выражается в кратности увеличения и должно составлять величину более 2,5 (фактор сероконверсии).
Рисунок 15 – Оценка иммуногенных свойств вакцины «ОрниФлю»
Этим требованиям соответствует вакцина «ОрниФлю» инактивированная субъединичная с содержанием в одной прививочной дозе 15 мкг НА и 0,5 мг алюминия гидроксида, являющаяся первым препаратом для специфической профилактики гриппа птиц, рекомендованным к регистрации в РФ (рис. 15).
С целью повышения безопасности, иммуногенности и эффективности гриппозных вакцин с 2006 по 2008 г. ФГУП «НПО «Микроген» оценивало возможность разработки новой технологии приготовления препарата. В результате проведенных НИОКР разработана сезонная и макетная пандемическая инактивированные расщепленные виросомальные вакцины.
При проведении доклинических исследований инактивированной расщепленной виросомальной сорбированной на алюминии гидроксиде вакцины «АвиФлю» показано, что препарат нетоксичен, не обладает выраженным местным и местно-раздражающим действием, не оказывает неблагоприятного воздействия на системы и органы лабораторных животных, что свидетельствует о ее безопасности.
Проведение двукратной иммунизации позволило индуцировать выработку антител, определяемых в ИФА, РТГА и РМН, а также защитить от гибели до 71,4 % инфицированных вирулентным штаммов вируса гриппа птиц в дозе 25 ЛД50 лабораторных животных. Кроме того было показано, что вакцина «АвиФлю» с антигенной нагрузкой в 5 раз меньше, создала лучший иммунитет чем вакцина «ВГИПС», что свидетельствует о правильности конструктивных подходов в создании препарата нового поколения для защиты от пандемического гриппа (табл. 5).
В открытом сравнительном контролируемом проспективном рандомизированном исследовании приняли участие 65 здоровых волонтеров (мужчины и женщины) в возрасте 18–50 лет с целью изучения реактогенности, безопасности, иммуногенности и кросс-реактивных свойств вакцины «АвиФлю». Клиническое исследование вакцины «АвиФлю» показало, что введение исследуемых серий препарата не сопровождалось развитием негативных явлений в поствакцинальном периоде, а возникшие
Таблица 5 – Антигенные и протективные свойства инактивированной расщепленной виросомальной вакцины «АвиФлю»
| Кратность введения вакцины | Иммуни зирую щая доза, мкг НА | Величина титра антител в | Количество погибших животных на …сутки после заражения | Продолжительность жизни животных (х±), сут. | Доля выживших, процент | |||||||||||
| ИФА | РН | РТГА | 5 | 6 | 7 | 8 | 9 | 10 | 11 | 12 | 13 | 14 | ||||
| Однократное | 0,2 | 1:40 | <1:10 | <1:10 | 1 | 0 | 5 | 4 | 0 | 0 | 0 | 0 | 0 | 0 | 7,2±0,9 | 28,6 (4/14) |
| 3,0 | 1:40 | <1:10 | <1:10 | 0 | 0 | 8 | 2 | 0 | 0 | 0 | 0 | 0 | 0 | 7,2±0,4 | 33,3 (5/15) | |
| Двукратное | 0,2 | 1:40 | <1:10 | 1:10 | 0 | 1 | 2 | 5 | 1 | 0 | 0 | 0 | 0 | 0 | 7,7±0,9 | 35,7 (5/14) |
| 3,0 | 1:160 | 1:20 | 1:40 | 0 | 0 | 1 | 2 | 1 | 0 | 0 | 0 | 0 | 0 | 8,0±0,8 | 71,4 (10/14) | |
| Контроль (неиммунизированные) | 0 | 0 | 1 | 6 | 3 | 0 | 0 | 0 | 0 | 0 | 8,2±0,6 | 0 | ||||
| Примечание – заражающая доза 25 ЛД50 | ||||||||||||||||
слабовыраженные общие и местные реакции были кратковременными и не вызывали ухудшения в состоянии здоровья привитых. В подавляющем большинстве случаев все реакции носили слабовыраженный характер и развивались в первые сутки после вакцинации (рис. 16, 17).
Рисунок 16 – Оценка местных реакций на введение вакцины «АвиФлю»
Рисунок 17 – Оценка системных реакций на введение вакцины «АвиФлю»
Уровень сероконверсии и серопротекции при двукратной вакцинации с интервалом в 28 сут достигал 100 % вне зависимости от введенной дозы и штамма препарата (рис. 18, 19).
Рисунок 18 – Уровень сероконверсии на введение вакцины «АвиФлю»
Рисунок 19 – Уровень серопротекции на введение вакцины «АвиФлю»
При исследовании сывороток крови привитых вакциной «АвиФлю» с гетерологичными штаммами NIBRG-14 (A/Vietnam/1194/2004) (H5N1), A/17/утка/Потсдам/86/92 (Н5N2), A/Indonesia/05/2005 (H5N1) доказана высокая кросс-реактивности препарата (рис. 20).
Рисунок 20 – Оценка кросс-реактивности вакцины «АвиФлю»
Представленные результаты свидетельствуют о том, что впервые в мировой практике нам удалось создать «макетную» пандемическую вакцину с двумя адъювантами (виросомы-алюминия гидроксид), которая обладает низкой реактогенностью и высокой иммуногенностью, что может явиться стратегически правильным посылом в области разработки новых вакцинных препаратов.
Стратегия вакцинации населения с целью профилактики гриппозной инфекции в период подготовки к пандемии
Широкое распространение вируса гриппа А/(Н1N1)sw1 вызывает серьезные опасения органов здравоохранения всех стран мира. Несмотря на принимаемые правительствами стран противоэпидемические меры и развертывание работ по созданию средств и способов защиты от возбудителя, заметных успехов в борьбе с гриппом А/(Н1N1)sw1пока не достигнуто.
Необходимо учитывать, что в настоящее время к вирусу гриппа А/(Н1N1)sw1 у основной массы населения мира антитела отсутствуют, как и в случае с гриппом А/Н5, и, по-видимому, использование подходов (схем - кратности, интервалов, доз) отработанных на модели макетных вакцин А/Н5, в разработке пандемических вакцин А/(Н1N1)sw1 может явиться реально действующей мерой, которая позволит защитить население РФ от надвигающейся новой пандемии гриппа.
Доклинические и клинические исследования «макетных» пандемических вакцин на основе серотипа А/Н5 были проведены на ведущих лабораторных и клинических базах РФ. В результате исследований были отработаны схемы (кратность, интервал, дозы) применения, доказана безвредность для окружающих, безопасность, иммуногенность и эффективность вакцин (в тестах при оценке протективных свойств на лабораторных животных). Кроме того, что принципиально важно, доказана высокая кросс-реактивность «макетных» пандемических вакцин как в отношении штаммов А/Н5 циркулирующих на территории РФ, так и в отношении штаммов выделенных на других континентах мира.
Полученные результаты позволили в марте 2009 г. зарегистрировать две принципиально отличные друг от друга конструкции пандемических вакцин:
- инактивированная субъединичная сорбированная на алюминии гидроксиде вакцина «ОрниФлю» (ЛСР-001481/09 от 03.03.2009) с содержанием 15 мкг НА в дозе;
- живая интраназальная вакцина «Ультрагривак» (ЛСР-002340/09 от 25.03.2009) с активностью не менее 7,5 lg EID50 в дозе. В настоящее время данные вакцины официально разрешено использовать у людей в возрасте от 18 до 60 лет.
С целью повышения безопасности, иммуногенности и эффективности гриппозных вакцин с 2006 по 2008 г. была оценена возможность разработки новой технологии приготовления препарата. В результате проведенных НИОКР разработана «макетная» пандемическая инактивированная расщепленная виросомальная вакцина «АвиФлю». В результате доклинических и клинических исследований показана безопасность, иммуногенность и высокая эффективность разработанных конструкций.
Одной из основных проблем в настоящее время остается возможность увеличения производственных мощностей с целью обеспечения населения пандемической вакциной против гриппа. В случае возникновения пандемии дефицит вакцины может вызвать кризис здравоохранения. Для успешной реализации национальной программы защиты населения от пандемического гриппа необходимо расширить мощности по производству, увеличить объемы вакцинации населения сезонными вакцинами, при появлении пандемического гриппозного штамма использовать стратегию иммунопрофилактики, отработанную в рамках проведенных доклинических и клинических исследований «макетных» пандемических вакцин «ОрниФлю», «АвиФлю» и «Ультрагривак».
ВЫВОДЫ
1. Выбраны наиболее перспективные вакцинные кандидаты для специфической профилактики гриппа в случае пандемии – живая гриппозная вакцина «Ультрагривак», инактивированные субъединичная адсорбированная вакцина «ОрниФлю», расщепленная виросомальная адсорбированная вакцина «АвиФлю» и изучены их физико-химические и иммунобиологические свойства.
2. При применении выбранных вакцин для получения эффективной защиты от патогенного вируса гриппа птиц экспериментально обоснована необходимость проведения двукратной вакцинации.
3. Гриппозная живая вакцина «Ультрагривак», полученная на основе холодоадаптированного реассортантного штамма, генетически стабильна, апатогенна и безопасна для лабораторных животных, вызывает образование системных и локальных антител не только к гомологичному вирусу, но и к дрейфовым вариантам вируса гриппа птиц Н5N1.
4. Экспериментально доказана безопасность, иммуногенность и эффективность интраназальной двукратной с интервалом 10 сут в дозе не менее 7,5 lg ЭИД50 вакцинации живой гриппозной вакциной «Ультрагривак» с целью специфической профилактики высокопатогенного гриппа птиц.
5. Использование разработанных технологий позволяет получить варианты безопасных, иммуногенных препаратов, которые после двукратной иммунизации защищают от гибели до 80 % лабораторных животных, инфицированных высокопатогенным штаммом вируса гриппа птиц.
6. Внутримышечная двукратная с интервалом 28 сут иммунизация инактивированной субъединичной адсорбированной вакциной «ОрниФлю» в дозе 15 мкг НА не оказывает неблагоприятного влияние на здоровье вакцинированных и индуцирует образование вируснейтрализующих и гемагглютинирующих антител, что указывает на безопасность, иммуногенность и эффективность данного препарата.
7. Показана перспективность конструирования виросомальных вакцин на основе подходов, отработанных на инактивированной расщепленной виросомальной адсорбированной вакцине «АвиФлю», при использовании двойного адъюванта «виросомы-алюминия гидроксид».
8. Теоретически и экспериментально обоснованы подходы для производства безопасных и эффективных «макетных» пандемических вакцин для профилактики гриппа.
СПИСОК ОСНОВНЫХ РАБОТ, ОПУБЛИКОВАННЫХ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ
1. Зверев В.В. Результаты сравнительного клинического исследования вакцин против вируса гриппа птиц. / Катлинский А.В., Костинов М.П., Жирова С.Н., Ерофеева М.К., Стукова М.А., Коровкин С.А., Мельников С.Я., Семченко А.В., Миронов А.Н. //Журнал микробиологии эпидемиологии и иммунобиологии.- 2007.- №3. - С. 10-16.
2. Онищенко Г.Г. Тетравакцина – новый принципиальный подход к предотвращению пандемии гриппа. / Зверев В.В., Катлинский А.В., Семченко А.В., Коровкин С.А., Мельников С.Я., Миронов А.Н. // Журнал микробиологии эпидемиологии и иммунобиологии. -2007. - №4. - С. 15-19.
3. Зверев В.В. Профилактическая эффективность новой отечественной гриппозной инактивированной вакцины Грифор®. / Михайлова Н.А., Ерофеева М.К., Фельдблюм И.В., Чуйкова К.И., Миронов А.Н., Мельников С.Я., Дылдина Н.В. //Инфекционные болезни. -2008. - №3. – Т. 6. – С. 78-82.
4. Киселев О.И. Результаты клинического исследования реактогенности, безопасности и иммуногенности вакцины Грифор® на пожилом контингенте (от 60 лет и старше). / Коровкин С.А., Миронов А.Н., Мельников С.Я., Дылдина Н.В., Ерофеева М.К., Соминина А.А., Войцеховская Е.М., Стукова М.А. // Эпидемиология и вакцинопрофилактика. - 2008. - №4. – С. 36-39.
5. Мельников С.Я. Разработка и доклиническое исследование виросомальной расщепленной гриппозной вакцины нового поколения «Грифор®». /Зверев В.В., Коровкин С.А., Миронов А.Н., Дылдина Н.В., Михайлова Н.А., Файзулоев Е.Б., Лотте В.Д. // Журнал микробиологии эпидемиологии и иммунобиологии. – 2009. - №1. – С. 21-26.
6. Зверев В.В. Оценка реактогенности, безопасности и иммуногенности виросомальной расщепленной инактивированной гриппозной вакцины «Грифор®» в I фазе клинического исследования. / Коровкин С.А., Миронов А.Н., Мельников С.Я., Михайлова Н.А., Костинов М.П., Дылдина Н.В., Жирова С.Н. // Журнал микробиологии эпидемиологии и иммунобиологии. -2009. - №1. – С. 26-31.
7. Зверев В.В. Клиническое исследование новой инактивированной гриппозной вакцины «Грифор®». / Киселев О.И., Коровкин С.А., Миронов А.Н., Мельников С.Я., Михайлова Н.А., Костинов М.П., Ерофеева М.К., Соминина А.А., Дылдина Н.В., Жирова С.Н., Стукова М.А. // Журнал микробиологии эпидемиологии и иммунобиологии. – 2009. - №2. - С. 35-40.
8. Зверев В.В. Разработка и внедрение в практику здравоохранения РФ новой отечественной расщепленной виросомальной вакцины против гриппа. / Михайлова Н.А., Коровкин С.А., Миронов А.Н., Мельников С.Я., Ерофеева М.К., Дылдина Н.В., Никоноров И.Ю., Максакова В.Л. // Лечащий врач. - 2008. - №9. –С. 68-70.
9. Меркулов В.А. Использование обратной генетики для получения рекомбинантных штаммов вируса гриппа, пригодных в качестве живых аттенуированных вакцин./ Лебедев В.Н., Плеханова Т.М., Максимов В.А., Коровкин С.А., Миронов А.Н. // Журнал микробиологии эпидемиологии и иммунобиологии. – 2009. - №2. - С. 111-117.
10. Мазуркова Н.А. Результаты клинических испытаний реактогенности, безопасности и иммуногенности гриппозной аллантоисной интраназальной живой вакцины «Ультрагривак» (тип А/Н5N2). /Шишкина Л.Н., Сергеев А.Н., Терновой В.А., Туманов Ю.В., Булычев Л.Е., Петрищенко В.А., Скарнович М.О., Кабанов А.С., Рындюк Н.Н., Панченко С.Г., Алейников Р.П., Ильина Т.Н., Миронов А.Н., Мельников С.Я., Кузубов В.И., Коровкин С.А., Дроздов И.Г. // Вестник РАМН (в печати).
11. Шишкина Л.Н. Проведение 2-й фазы клинических испытаний иммуногенности и безопасности гриппозной аллантоисной интраназальной живой вакцины «Ультрагривак» при двукратной иммунизации. /Мазуркова Н.А., Сергеев А.Н., Терновой В.А., Туманов Ю.В., Булычев Л.Е., Петрищенко В.А., Скарнович М.О., Кабанов А.С., Рындюк Н.Н., Панченко С.Г., Алейников Р.П., Ильин Т.Н., Миронов А.Н., Мельников С.Я., Кузубов В.И., Коровкин С.А., Дроздов И.Г. //Сборник Института медицинской биотехнологии (Филиал «Вектора») «Достижения отечественной биотехнологии» (в печати).
12. Коровкин С.А. Изучение реактогенности, безопасности и иммуногенности гриппозной инактивированной вакцины «Грифор®» при иммунизации людей старше 60 лет. / Мельников С.Я., Миронов А.Н., Дылдина Н.В. // Журнал «Аллергология и иммунология». - Том 10. - № 2. - Апрель 2009. - С. 297.
13. Миронов А.Н. «Ультрагривак» - отечественная вакцина против гриппа птиц./ Коровкин С.А., Мельников С.Я., Дылдина Н.В. // Журнал «Аллергология и иммунология». - Том 10. - № 2. - Апрель 2009. - С. 298.
14. Миронов А.Н. Лабораторно-экспериментальное (доклиническое) исследование генно-инженерного Интерферона альфа-2b. / Коровкин С. А., Дылдина Н. В., Мельников С.Я. // Журнал «Аллергология и иммунология» - Том 10. - № 2. - Апрель 2009. - С. 299.
15. Коровкин С.А. «Авифлю» - новая отечественная вакцина против гриппа птиц. / Миронов А.Н., Мельников С.Я // Журнал «Аллергология и иммунология». - Том 10. - № 2. - Апрель 2009. - С. 298.
16. Миронов А.Н. «ОрниФлю» - гриппозная инактивированная субъединичная вакцина для профилактики гриппа птиц. / Коровкин С.А., Мельников С.Я., Дылдина Н.В. // Журнал «Аллергология и иммунология». - Том 10. - № 2. - Апрель 2009. - С. 298.
17. Катлинский А.В. Вакцина Ультрагривак – основное средство борьбы с возможной пандемией птичьего гриппа /Семченко А.В., Коровкин С.А., Миронов А.Н., Мельников С.Я. // Журнал «Эпидемиология и вакцинопрофилактика». - №2 (45). - Март-апрель 2009. - С.50-56.
18. Катлинский А.В. Клинические исследования вакцин против «птичьего» гриппа, разработанных ФГУП «НПО «Микроген». / Семченко А.В., Коровкин С.А., Мельников С.Я, Миронов А.Н. //Шестая международная конференция «Клинические исследования лекарственных средств». – Москва. - 12 октября 2007 г. - С.62.
19. Katlinsky A.V. Avian flu H5N1 vaccine. – ICCAID. / Korovkin S.A., Melnikov S.J., Mironov A.N., Krasilnikov I.V. // The Second International Congress of Central Asia Infectious Diseases. – Almaty-Kazakhstan. - 27-31 Мarch 2008. - Р. 75.
20. Дылдина Н.В. Изучение реактогенности, безопасности и иммуногенности новой инактивированной гриппозной вакцины «Грифор». / Мельников С.Я., Миронов А.Н., Коровкин С.А. // Всероссийская научная конференция «Теоретические основы эпидемиологии. Современные эпидемиологические и профилактические аспекты инфекционных и массовых неинфекционных заболеваний». – Санкт-Петербург. - 17-18 апреля 2008 г. - С.98.
21. Хамитов Р.А. Изучение безопасности и эффективности вакцины гриппозной интраназальной живой (типа (Н5N2), штамм А/утка/Потсдам/86/92/Н5N2 [17/Н5] на приматах. / Мельников С.А., Максимов В.А., Мельников С.Я., Миронов А.Н., Коровкин С.А. // Всероссийская научная конференция «Теоретические основы эпидемиологии. Современные эпидемиологические и профилактические аспекты инфекционных и массовых неинфекционных заболеваний». – Санкт-Петербург. - 17-18 апреля 2008 г. - С.100.
22. Мельников С.А. Клинические испытания живой вакцины против гриппа птиц «Орвакс» на ограниченной группе добровольцев. / Максимов В.А., Хамитов Р.А., Мельников С.Я., Миронов А.Н., Коровкин С.А., Черникова Н.К. // Всероссийская научная конференция «Теоретические основы эпидемиологии. Современные эпидемиологические и профилактические аспекты инфекционных и массовых неинфекционных заболеваний». – Санкт-Петербург. - 17-18 апреля 2008 г. - С.101-102.
23. Ерофеева М.К. Клинические исследования пандемических гриппозных вакцин в России. / Стукова М.А., Миронов А.Н., Максакова В.Л., Охапкина Е.А., Поздеев В.К., Позднякова М.Г., Кривицкая В.З., Войцеховская Е.М., Васильева А.А., Коровкин С.А., Соминина А.А., Киселев О.И. // Всероссийская научная конференция «Теоретические основы эпидемиологии. Современные эпидемиологические и профилактические аспекты инфекционных и массовых неинфекционных заболеваний». – Санкт-Петербург. - 17-18 апреля 2008 г. - С.106-107.
24. Катлинский А.В. Доклинические и клинические исследования живой препандемической вакцины против гриппа птиц. / Семченко А.В., Дроздов И.Г., Коровкин С.А., Миронов А.Н., Мельников С.Я., Дылдина Н.В., Руденко Л.Г., Мельников С.А., Черникова Н.К., Хамитова М.Ф., Сергеев А.Н., Шишкина Л.Н., Мазуркова Н.А., Кузубов В.И., Рындюк Н.Н., Голубев Д.А. //IХ Межгосударственная научно-практическая конференция «Современные технологии в реализации глобальной стратегии борьбы с инфекционными болезнями на территории государств – участников Содружества Независимых Государств». – Волгоград. - 30 сентября – 2 октября 2008 г. - С. 89-90.
25. Катлинский А.В. Сравнительное изучение реактогенности, безопасности и иммуногенности новой инактивированной гриппозной вакцины «Грифор». / Семченко А.В., Коровкин С.А., Миронов А.Н., Мельников С.Я., Дылдина Н.В. // IХ Межгосударственная научно-практическая конференция «Современные технологии в реализации глобальной стратегии борьбы с инфекционными болезнями на территории государств – участников Содружества Независимых Государств». – Волгоград. - 30 сентября – 2 октября 2008 г. - С. 92-93.
26. Катлинский А.В. Разработка препандемических вакцин против гриппа птиц в Российской федерации. / Семченко А.В., Коровкин С.А., Миронов А.Н., Мельников С.Я., Дылдина Н.В. // IХ Межгосударственная научно-практическая конференция «Современные технологии в реализации глобальной стратегии борьбы с инфекционными болезнями на территории государств – участников Содружества Независимых Государств». – Волгоград. - 30 сентября – 2 октября 2008 г.- С. 90-91.
27. Катлинский А.В. Разработка и внедрение в практику Здравоохранения РФ виросомальной расщепленной вакцины нового поколения «Грифор» для специфической профилактики гриппа. / Семченко А.В., Коровкин С.А., Миронов А.Н., Мельников С.Я., Дылдина Н.В. // Международная научно-практическая конференция «Проблемы совершенствования межгосударственного взаимодействия в подготовке к пандемии гриппа». – Новосибирская обл., Кольцово. - 9-10 октября 2008 г. - С. 83-84.
28. Зверев В.В. Конструирование и проведение исследований инактивированной расщепленной виросомальной препандемической вакцины против гриппа птиц. / Катлинский А.В., Киселев О.И., Семченко А.В., Коровкин С.А., Миронов А.Н., Мельников С.Я., Дылдина Н.В., Михайлова Н.А., Костинов М.П., Жирова С.Н., Соминина А.А., Алексеев В.В., Плеханова Н.Г., Мельников С.А., Черникова Н.К., Хамитова М.Ф. // Международная научно-практическая конференция «Проблемы совершенствования межгосударственного взаимодействия в подготовке к пандемии гриппа». – Новосибирская обл., Кольцово. - 9-10 октября 2008 г.. - С. 79-81.
29. Катлинский А.В. Клинические исследования и внедрение в практику здравоохранения РФ инактивированной препандемической вакцины против гриппа птиц. / Зверев В.В., Семченко А.В., Коровкин С.А., Миронов А.Н., Мельников С.Я., Дылдина Н.В., Киселев О.И., Ерофеева М.К., Стукова М.А., Соминина А.А., Михайлова Н.А., Костинов М.П., Жирова С.Н. // Международная научно-практическая конференция «Проблемы совершенствования межгосударственного взаимодействия в подготовке к пандемии гриппа». – Новосибирская обл., Кольцово. - 9-10 октября 2008 г. - С. 81-83.
30. Полушкина А.В. Специфическая профилактика гриппа отечественной инактивированной расщепленной вакциной «Грифор». / Фельдблюм И.В., Воробьева Н.Н., Коровкин С.А., Миронов А.Н., Дылдина Н.В. // Научно-практическая конференция молодых ученых «Создание и перспективы применения медицинских иммунобиологических препаратов», посвященная 110-летию филиала ФГУП «НПО «Микроген» «Пермское научно-производственное объединение «Биомед». - 18-19 июня 2008 г. - С. 37-39.
31. Позднякова М.Г. Оценка реактогенности, безопасности и иммуногенности вакцины Грифор® при однократной иммунизации взрослых от 18 до 60 лет. / Никоноров И.Ю., Максакова В.Л., Васильева А.А., Вакин В.С., Войцеховская Е.М., Охапкина Е.А., Дылдина Н.В., Миронов А.Н., Ерофеева М.К. // Научно-практическая конференция молодых ученых «Создание и перспективы применения медицинских иммунобиологических препаратов», посвященная 110-летию филиала ФГУП «НПО «Микроген» «Пермское научно-производственное объединение «Биомед» - 18-19 июня 2008 г. - С. 40-42.
32. Дылдина Н.В. Доклиническое изучение виросомальной гриппозной вакцины «Грифор®». / Миронов А.Н., Коровкин С.А. // Научно-практическая конференция молодых ученых «Создание и перспективы применения медицинских иммунобиологических препаратов», посвященная 110-летию филиала ФГУП «НПО «Микроген» «Пермское научно-производственное объединение «Биомед». - 18-19 июня 2008 г. - С. 39-40.
33. Дылдина Н.В. Клинические исследования реактогенности, безопасности и иммуногенности новой инактивированной виросомальной гриппозной вакцины «Грифор®». / Миронов А.Н., Коровкин С.А. // Научно-практическая конференция молодых ученых «Создание и перспективы применения медицинских иммунобиологических препаратов», посвященная 110-летию филиала ФГУП «НПО «Микроген» «Пермское научно-производственное объединение «Биомед». - 18-19 июня 2008 г. - С. 44-45.
34. Позднякова М.Г. Реактогенность, безопасность и иммуногенность гриппозной инактивированной вакцины Грифор® при иммунизации людей старше 60 лет. / Никоноров И.Ю, Васильева И.А,, Васильева А.А., Войцеховская Е.М., Максакова В.Л., Охапкина Е.А., Дылдина Н.В., Миронов А.Н., Ерофеева М.К. // Научно-практическая конференция молодых ученых «Создание и перспективы применения медицинских иммунобиологических препаратов», посвященная 110-летию филиала ФГУП «НПО «Микроген» «Пермское научно-производственное объединение «Биомед». - 18-19 июня 2008 г. - С. 42-44.
35. Коровкин С.А. Оценка иммуногенных и протективных свойств вакцин против гриппа птиц, разработанных ФГУП НПО «Микроген». / Максимов В.А., Миронов А.Н., Хамитов Р.А., Мельников С.Я., Мельников С.А. // VII Межгосударственная научно-практическая конференция «Чрезвычайные ситуации международного значения в общественном здравоохранении, решения Санкт-Петербургского саммита «Группы восьми» и санитарная охрана территорий государств-участников Содружества Независимых Государств». - Московская область, п. Оболенск. - 3-5 октября 2006 г. - С. 45.
36. Sominina A.A. Comparative investigations of microneutralization and hemagglutination inhibition tests in evaluation of immunogenicity of inactivated influenza H5 vaccine./ Krivitskaya V.Z., Mironov A.N., Voytsekhovskaya E.M., Vasilieva A.A., Tretjakova N.V., Kiselev O.I. // Third European Influenza Conference. - Vilamoura, Portugal. - 14-17 September 2008 - Р.101-102.
37. Ерофеева М.К. Гриппозные вакцины Н5N1: Клинические исследования в России. / Стукова М.Л., Максакова B.JI., Охапкина ЕЛ., Поздеев В.К., Позднякова М.Г., Кривицкая В.З., Войцеховская ЕМ., Васильева АЛ., Миронов А.Н., Коровкин СА., Соминина А.А., Киселев О.И. // Международная научно-практическая конференция, посвященная 50-летию Научно-исследовательского института проблем биологической безопасности НЦБ МОИ РК «Биотехнология в Казахстане: проблемы и перспективы инновационного развития». - Республика Казахстан, г. Алматы. - 19-21 мая 2008. - С. 453.
38. Коровкин С.А. «АвиФлю» - новая инактивированная виросомальная вакцина против гриппа птиц. / Миронов А.Н., Мельников С.Я. // Всероссийская научно-практическая конференция «Вакцинология 2008. Совершенствование иммунобиологических средств профилактики, диагностики и лечения инфекционных болезней». – Москва. - 11-12 ноября 2008. - С. 65-66.
39. Коровкин С.А. «Ультрагривак» - живая гриппозная вакцина против гриппа птиц./ Миронов А.Н., Мельников С.Я., Дылдина Н.В. // Всероссийская научно-практическая конференция «Вакцинология 2008. Совершенствование иммунобиологических средств профилактики, диагностики и лечения инфекционных болезней». – Москва. - 11-12 ноября 2008. - С. 66.
40. Миронов А.Н. Клинические исследования вакцины «ОрниФлю» для профилактики гриппа птиц. / Коровкин С.А., Мельников С.Я., Дылдина Н.В. // Всероссийская научно-практическая конференция «Вакцинология 2008. Совершенствование иммунобиологических средств профилактики, диагностики и лечения инфекционных болезней». – Москва. - 11-12 ноября 2008. - С. 81.
41. Коровкин С.А. Клиническое исследование инактивированной виросомальной вакцины против гриппа птиц. / Миронов А.Н., Мельников С.Я. // «Диагностика, лечение и профилактика опасных и особо опасных инфекционных заболеваний. Биотехнология». Материалы Всероссийской научной конференции, посвященной 80-летию со дня основания ФГУ «48 ЦНИИ Минобороны России». – Киров: ФГУ «48 ЦНИИ Минобороны России». - 2008. - Вып.1. – С. 80-82.
42. Миронов А.Н. Клиническое исследование инактивированной субъединичной вакцины против гриппа птиц. / Коровкин С.А., Мельников С.Я., Дылдина Н.В. // «Диагностика, лечение и профилактика опасных и особо опасных инфекционных заболеваний. Биотехнология». Материалы Всероссийской научной конференции, посвященной 80-летию со дня основания ФГУ «48 ЦНИИ Минобороны России». – Киров: ФГУ «48 ЦНИИ Минобороны России». - 2008. - Вып.1. – С. 93-94.
43. Коровкин С.А. Клиническое исследование живой гриппозной вакцины против гриппа птиц. / Миронов А.Н., Мельников С.Я., Дылдина Н.В. – «Диагностика, лечение и профилактика опасных и особо опасных инфекционных заболеваний. Биотехнология». Материалы Всероссийской научной конференции, посвященной 80-летию со дня основания ФГУ «48 ЦНИИ Минобороны России». – Киров: ФГУ «48 ЦНИИ Минобороны России». - 2008. - Вып.1. – С. 82-83.
44. Коровкин С.А. Профилактическая эффективность вакцины «Грифор». / Мельников С.Я., Миронов А.Н., Дылдина Н.В. // Х международный конгресс, посвященный 100-летию со дня рождения академика АМН А.Д.Адо «Современные проблемы аллергологии, иммунологии и иммунофармакологии». - г. Казань. - 20-23 мая 2009 г. - С. 8.
45. Мельников С.Я. Иммуногенность и безопасность вакцины «АвиФлю» - новой инактивированной виросомальной вакцины против гриппа птиц. / Коровкин С.А., Миронов А.Н. // Х международный конгресс, посвященный 100-летию со дня рождения академика АМН А.Д.Адо «Современные проблемы аллергологии, иммунологии и иммунофармакологии». - г. Казань. - 20-23 мая 2009 г. - С.10.
46. Миронов А.Н. Доклинические и клинические исследования вакцины «ОрниФлю» для профилактики гриппа птиц / Коровкин С.А., Мельников С.Я., Дылдина Н.В. // Х международный конгресс, посвященный 100-летию со дня рождения академика АМН А.Д.Адо «Современные проблемы аллергологии, иммунологии и иммунофармакологии». - г. Казань. - 20-23 мая 2009 г. - С.10-11.
47. Миронов А.Н. Иммуногенность и безопасность вакцины «Ультрагривак» - живой гриппозной вакцины против гриппа птиц / Коровкин С.А., Мельников С.Я., Дылдина Н.В. // Х международный конгресс, посвященный 100-летию со дня рождения академика АМН А.Д.Адо «Современные проблемы аллергологии, иммунологии и иммунофармакологии». - г. Казань. - 20-23 мая 2009 г. - С.12-13.
48. Миронов А.Н. Доклинические исследования генно-инженерного интерферона альфа-2. / Коровкин С.А., Дылдина Н.В., Мельников С.Я. // Х международный конгресс, посвященный 100-летию со дня рождения академика АМН А.Д.Адо «Современные проблемы аллергологии, иммунологии и иммунофармакологии». г. Казань. - 20-23 мая 2009 г. - С. 470.
49. Катлинский А.В. Результаты доклинических и клинических исследований вакцины против гриппа птиц «ОрниФлю» / Зверев В.В., Семченко А.В., Коровкин С.А., Миронов А.Н., Мельников С.Я., Дылдина Н.В., Киселев О.И., Ерофеева М.К., Стукова М.А., Соминина А.А., Михайлова Н.А., Костинов М.П., Жирова С.Н. // 7-я Российско-итальянская научно-практическая конференция «Актуальные вопросы социально-значимых вирусных инфекций». - г. Великий Новгород. - 14-16 мая 2009 г. - С. 65-66.
50. Катлинский А.В. Виросомальная расщепленная вакцина нового поколения «Грифор» для специфической профилактики гриппа. / Семченко А.В., Коровкин С.А., Миронов А.Н., Мельников С.Я., Дылдина Н.В. // 7-я Российско-итальянская научно-практическая конференция «Актуальные вопросы социально-значимых вирусных инфекций». - г. Великий Новгород. - 14-16 мая 2009 г. - С. 66-67.
51. Катлинский А.В. Разработка вакцин против гриппа птиц в Российской Федерации / Семченко А.В., Коровкин С.А., Миронов А.Н., Мельников С.Я., Дылдина Н.В. // 7-я Российско-итальянская научно-практическая конференция «Актуальные вопросы социально-значимых вирусных инфекций». - г. Великий Новгород. - 14-16 мая 2009 г. - С. 67-68.
52. Миронов А.Н. Результаты исследований живой гриппозной вакцины «Ультрагривак» для профилактики гриппа птиц. / Дылдина Н.В., Цаан А.А., Бушменков Д.С., Иванова О.Ю., Романова А.А., Коровкин А.С. // 7-я Российско-итальянская научно-практическая конференция «Актуальные вопросы социально-значимых вирусных инфекций». - г. Великий Новгород. - 14-16 мая 2009 г. - С. 95-96.
53. Мельников С.Я. Изучение иммуногенности и безопасности вакцины против гриппа птиц – «АвиФлю». / Коровкин С.А., Миронов А.Н. // 7-я Российско-итальянская научно-практическая конференция «Актуальные вопросы социально-значимых вирусных инфекций». - г. Великий Новгород. - 14-16 мая 2009 г. - С. 96-97.
54. Катлинский А.В. Виросомальная расщепленная вакцина нового поколения «Грифор®» для специфической профилактики гриппа. / Семченко А.В., Коровкин С.А., Миронов А.Н., Мельников С.Я., Дылдина Н.В. // Международная научно-практическая конференция (14–15 мая 2009 г., Новосибирск, Россия). – Новосибирск: Изд-во «ЦЭРИС». – 2009. - С. 247-248.
55. Катлинский А.В. Современное состояние разработки вакцин против гриппа птиц в Российской Федерации. / Семченко А.В., Зверев В.В., Михайлова Н.А., Коровкин С.А., Миронов А.Н., Мельников С.Я., Дылдина Н.В. // Международная научно-практическая конференция (14–15 мая 2009 г., Новосибирск, Россия). – Новосибирск: Изд-во «ЦЭРИС». – 2009. - С. 249-250.
56. Рындюк Н.Н. Клиническое исследование живой аллантоисной интраназальной гриппозной вакцины «Ультрагривак». / Алейников Р.П., Кузубов В.И., Мазуркова Н.А., Шишкина Л.Н., Сергеев А.Н., Миронов А.Н., Мельников С.Я., Коровкин С.А. Международная научно-практическая конференция (14–15 мая 2009 г., Новосибирск, Россия). – Новосибирск: Изд-во «ЦЭРИС». - 2009. - С. 261.
