Оптимальные тест-системы для количественного определения и детекции мутаций вируса гепатита в
На правах рукописи
Пичковская Виктория Анатольевна
Оптимальные тест-системы для количественного определения и детекции мутаций вируса гепатита В
03.00.04 – «Биохимия»
| Автореферат диссертации |
| на соискание ученой степени |
| кандидата медицинских наук |
Москва-2004
Работа выполнена в Государственном некоммерческом учреждении «Гематологический научный центр Российской Академии медицинских наук».
| Научный руководитель: | кандидат биологических наук А.Б. Судариков |
| Официальные оппоненты: | доктор медицинских наук, профессор Е.А. Лукина |
| доктор биологических наук, профессор М.И.Михайлов |
Ведущая организация: Научно-исследовательский институт физико-химической медицины МЗ РФ.
Защита состоится « » 2004 г., в часов на заседании диссертационного совета Д 001.042.02 в Гематологическом научном центре РАМН (125167, г.Москва, Новозыковский пр-д, д. 4а).
С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Гематологического научного центра РАМН.
Автореферат разослан « » 2004 г.
| Ученый секретарь диссертационного совета кандидат биологических наук | В.Д. Реук |
Общая характеристика работы.
Актуальность темы диссертации.
Вирусный гепатит В на протяжении нескольких десятилетий занимает одно из первых мест в инфекционной патологии человека. Поэтому возбудитель данного заболевания – ДНК-содержащий гепатотропный вирус гепатита В стал предметом пристального внимания и всестороннего изучения. В настоящее время показано, что в репликации данного вируса присутствует стадия обратной транскрипции РНК-прегенома. Обратная транскриптаза, осуществляющая этот процесс, лишена 3’5’ корректирующей функции, что определяет вариабельность вирусного генома. В сочетании с высокой репликативной активностью вируса гепатита В это приводит к повышению вероятности ошибки считывания РНК-матрицы и появлению мутантных штаммов. В свою очередь, мутации вирусного генома могут изменять профиль серологических маркеров, приводить к снижению эффективности стандартных схем противовирусной терапии и т.д. Отсюда возникла необходимость в комплексной диагностике вирусного гепатита В, включающей количественную оценку вируса в крови больного и анализ мутаций вирусного генома. С этой целью сегодня применяются различные методы генодиагностики, в частности метод полимеразной цепной реакции (ПЦР).
Наиболее распространенным методом количественной оценки вируса гепатита В является конкурентная ПЦР, основанная на коамплификации ДНК патогена и количественно охарактеризованного внутреннего стандарта. Создание подобного внутреннего стандарта составляет определенную сложность, что ограничивает применение количественных тест-систем, основанных на методе конкурентной ПЦР, в клинической диагностике.
В ПЦР-диагностике мутаций генома вируса гепатита В приоритетным направлением является детекция клинически значимых YMDD- и precore-мутаций, ассоциирующихся со снижением/отсутствием эффективности противовирусной терапии нуклеозидными аналогами или препаратами интерферона. Кроме того, precore-мутация определяет отсутствие основного маркера активной репликации вируса – HBe-антигена. YMDD- и precore- мутации вызваны однонуклеотидными заменами в ДНК вируса гепатита В. Поэтому для их выявления применяются методы, предназначенные для детекции SNPs (single nucleotide polymorphisms). В большинстве случаев с этой целью используют методы прямого секвенирования и определения длин рестрикционных фрагментов. Но данные методики обладают рядом недостатков: они технически сложны в исполнении и с их помощью довольно трудно оценить долю мутантных вирусных штаммов в общей вирусной популяции. Тем не менее, такая информация необходима для выработки эффективной тактики лечения больных вирусным гепатитом В.
Вышеизложенное определило цели и задачи данной работы.
Цель работы.
Создать оптимальные диагностические тест-системы для количественного определения и детекции мутаций вируса гепатита В.
Основные задачи исследования.
- Разработать методически простую технологию конструирования внутреннего стандарта для количественного определения ДНК патогенов методом конкурентной ПЦР на примере вируса гепатита В.
- Разработать диагностическую тест-систему для количественного определения ДНК вируса гепатита В методом конкурентной ПЦР, в которой будет использоваться полученный внутренний стандарт.
- Найти оптимальный метод для выявления дикого и YMDD/precore-мутантных штаммов вируса гепатита В, позволяющий оценивать долю мутантных штаммов в общей вирусной популяции.
- Апробировать разработанные тест-системы для количественного определения и детекции мутаций вируса гепатита В на сыворотках больных вирусным гепатитом В.
Научная новизна работы.
Впервые предлагается универсальный и методически простой способ конструирования внутреннего стандарта для одностадийной конкурентной ПЦР, позволяющей определять концентрацию ДНК патогенов. Доказывается, что метод аллель-специфической ПЦР для выявления мутаций в вирусном геноме применим в диапазоне концентраций ДНК от 104 до 107 геном/мл. Причем проведение аллель-специфической ПЦР в указанных концентрационных пределах позволяет оценивать долю мутантных штаммов в общей вирусной популяции.
Практическое значение работы.
Разработанная технология конструирования внутреннего стандарта для конкурентной ПЦР позволяет снизить себестоимость количественного ПЦР-анализа. Данная технология применена при создании тест-системы для определения концентрации ДНК вируса гепатита В в биологических жидкостях, основанной на методе конкурентной ПЦР. Предложенные в данной работе методики используются для оценки концентрации и выявления клинически значимых YMDD- и precore-мутаций ДНК в сыворотках больных вирусным гепатитом В, что позволяет контролировать эффективность проводимой противовирусной терапии.
Апробация работы.
Материалы диссертации доложены на конгрессе «Человек и лекарство» (2001 г, Москва), I Всероссийском съезде гематологов (2002 г, Москва), научно-практическом симпозиуме “Технологии генодиагностики в практическом здравоохранении”, проводимом в рамках международной научно-практической конференции “Геномика, протеомика и биоинформатика для медицины” (2002 г, Москва).
Публикации.
По материалам диссертации опубликовано 5 работ, в том числе получен патент на изобретение № 2194761, Государственный реестр изобретений РФ.
Объем и структура диссертации.
Диссертация изложена на 86 страницах, состоит из Введения, Обзора литературы, описания Материалов и методов, изложения Результатов и их Обсуждения, Выводов и Списка цитируемой литературы. Работа содержит 21 рисунок и 2 таблицы. Список цитируемой литературы включает 117 наименований. Работа выполнена на базе лаборатории молекулярной гематологии ГНЦ РАМН (зав. - к.б.н. Судариков А.Б.) За помощь и поддержку в проведении работы выражаем искреннюю благодарность в.н.с. лаборатории молекулярной гематологии ГНЦ РАМН к.б.н. Февралевой И.С., зав отд. патологии печени клиники нефрологии, внутренних и профессиональных заболеваний им. Е.М. Тареева д.м.н. проф. Крель П.Е., ст.н.с. ЦНИИ Эпидемиологии МЗ РФ к.б.н. Гущину А.В.
Материалы и методы исследования.
Сыворотки.
В исследовании использовали сыворотки больных вирусным гепатитом В, проходящих лечение в Гематологическом научном центре РАМН по поводу гемобластозов. Сыворотки, заведомо содержащие вирус гепатита В с YMDD-мутацией (по данным прямого определения нуклеотидной последовательности) были любезно предоставлены к.б.н. А.Е. Гущиным (ЦНИИ Эпидемиологии МЗ РФ).
Олигонуклеотиды.
Для выявления ДНК вируса гепатита В использовали 5’-CTTCGCTTCACCGCTGC-3’-прямой и 3’-CAGTTGCTGGCTGGAACTCCG-5’-обратный праймеры, фланкирующие участок 1458-1578 нуклеотидной последовательности (н.п.) ДНК вируса гепатита В.
Для выявления YMDD-мутации использовали праймеры, фланкирующие участок 720-998 н.п. ДНК вируса гепатита В. Причем прямые аллель-специфические праймеры (отличающиеся последним нуклеотидом на 3’-конце) ymdGs, ymdAs, ymdVs, ymdIs были подобраны к позиции 743 н.п. так, чтобы выявить возможные замены нуклеотидов в триплете ATG – локусе YMDD-мутации (т.е. выяляется триплет GTG в случае YVDD-варианта мутации и триплет ATT в случае YIDD-варианта мутации):
| ymdGs: | 5’-TGACAAACCGAAAGTCAATATAC-3’ | -выявляют: YMDD-вариант (дикий штамм) |
| ymdAs: | 5’-TGACAAACCGAAAGTCAATAT-3’ | |
| ymdVs: | 5’-TGACAAACCGAAAGTCAATAC-3’ | - YVDD-вариант (штамм с мутацией) |
| ymdIs: | 5’-TGACAAACCGAAAGTCAATATAA-3’ | - YIDD-вариант (штамм с мутацией) |
Общий обратный праймер ymdCOMas - 5’GATTGGAAAGTATGTCAACG3’
Для выявления precore-мутации использовались праймеры, фланкирующие участок 1880-2084 н.п. ДНК вируса гепатита В. Прямые аллель-специфические праймеры precWCs и precMTs были подобраны к позиции 1896 н.п. так, чтобы выявить возможные замены нуклеотидов в триплете ТТG – локусе precore-мутации G1896A:
| precWCs | 5’-ACGGAACCCACCGAAAC-3’ | -выявляет дикий штамм |
| precMTs | 5’-ACGGAACCCACCGAAAT-3’ | -штамм с мутацией G1896A |
Общий обратный праймер precCOMas 5’-GCAAAGAATTGCTTGCCTGA-3’.
Все представленные выше праймеры были синтезированы фирмой «Синтол», Россия.
Подготовка образцов сывороток.
Исследуемую сыворотку разводили в соотношении 1:1 в буфере для выделения ДНК (изотонический раствор NaCl, содержащий 0,05% NP40 и 20% DMSO). Смесь прогревали в течение 10 минут при 950 С, центрифугировали, супернатант отбирали и использовали в полимеразной цепной реакции.
Полимеразная цепная реакция (ПЦР).
Для выявления ДНК вируса гепатита В готовили реакционную смесь объемом 25 мкл следующего состава: 5 мкл полученного супернатанта; по 0,1 пмоль прямого и обратного праймера (фланкирующих участок 1458-1578 н.п. ДНК вируса гепатита В); смесь для ПЦР (10 мM Tris-HCl, pH 8.3, 50 мM KСl, 2,5 мM MgCl2, 4% формамид, дезоксирибонуклеотидтрифосфаты по 0,2 мМ каждого («Бион», Россия), 1 единица Taq-ДНК полимеразы («Синтол», Россия); деионизованная вода). Для получения внутреннего стандарта в качестве матрицы использовали 100 нг ДНК, выделенной из мононуклеарных клеток человека. Реакцию амплификации проводили в программируемом термостате Perkin-Elmer Cetus. Температурный режим ПЦР:
для выявления ДНК вируса гепатита В: 35 циклов при 94°С – 15 сек., 56°С – 15 сек., 72°С – 15 сек. с последующим инкубированием при 72°С в течение 10 мин.;
для получения внутреннего стандарта: 5 циклов при 94°С – 15 сек., 37°С – 15 сек., 72°С – 15 сек., затем 30 циклов при 94°С – 15 сек., 56°С – 15 сек., 72°С – 15 сек. с последующим инкубированием при 72°С в течение 10 мин.
При выявлении YMDD и precore-мутаций для каждого исследуемого образца готовили 6 реакционных проб объемом 25 мкл каждая, содержащие по 5 мкл супернатанта; 1 мкМ одного из аллель-специфических праймеров; по 1 мкМ обратных праймеров и смесь для ПЦР (см. выше). Реакцию амплификации проводили в программируемом термостате Perkin-Elmer Cetus в следующих условиях: 35 циклов при 94°С – 15 сек., 54°С – 15 сек., 72°С – 15 сек. с последующим инкубированием при 72°С в течение 10 мин.
Продукты реакции анализировали методом электрофореза в 2% агарозном геле.
Клонирование внутреннего стандарта.
Выбранный в качестве внутреннего стандарта для конкурентной ПЦР, выявляющей ДНК вируса гепатита В, амплификационный ДНК-фрагмент был лигирован в плазмидный вектор pGem-T Easy (Promega) и клонирован в клетках E. coli (штамм ТВ1). Селекция клонов с лигированным фрагментом проводилась на среде LB + 2% агар + x-GAL + IPTG + ампициллин (в вектор встроен ген устойчивости к ампициллину). Белые колонии проверяли на наличие вставки методом ПЦР. Секвенирование полученной плазмидной ДНК проводилось в институте молекулярной биологии им. Энгельгарта. Все манипуляции по очистке ДНК-амплификата, его лигированию в плазмидный вектор, клонированию и выделению плазмидной ДНК со вставкой осуществляли по стандартным методикам, описанным в Current Protocols in Molecular Biology (on CD) и инструкции, прилагаемой к коммерческому набору «pGem®-T Easy Vector. System 1» (Promega).
Концентрация плазмидной ДНК с внутренним стандартом определялась спектрофотометрическим методом.
Конкурентная ПЦР.
Для количественного определения ДНК вируса гепатита В брали сыворотку крови положительную по ДНК данного вируса в качественном ПЦР-анализе (см. п. «ПЦР для выявления ДНК вируса гепатита В»). Готовили серию десятикратных разведений вектора, содержащего внутренний стандарт в концентрации от 103 до 1010 геном/мл, в буфере для выделения ДНК. Пробы для количественного ПЦР были приготовлены по следующему протоколу: к 2,5 мкл сыворотки добаляли по 2,5 мкл каждого из соответствующих приготовленных разведений. Затем пробы прогревали при 95°С в течение 10 мин, после чего в каждую добавляли по 20 мкл смеси для ПЦР и праймеры, фланкирующие участок 1458-1578 н.п. ДНК вируса гепатита В, и проводили амплификацию (см. п. «ПЦР для выявления ДНК вируса гепатита В»). Продукты реакции анализировали методом электрофореза в 2% агарозном геле.
Содержание работы.
Обзор информации о методах генодиагностики вирусного гепатита В показал, что в настоящее время существует необходимость в создании методически простых диагностических тест-систем для количественной оценки и идентификации клинически значимых мутаций ДНК вируса гепатита В, с помощью которых можно контролировать эффективность проводимой противовирусной терапии и корректировать тактику лечения в случае выявления мутантных штаммов вируса.
Большинство существующих методов количественной оценки вируса в крови или сыворотке реализуют принцип конкурентной ПЦР, основанной на коамплификации выявляемой ДНК и внутреннего стандарта. Внутренний стандарт представляет собой фрагмент ДНК, имеющий длину, отличную от длины выбранного для амплификации участка выявляемой ДНК, но общие с ним районы, связывающие праймеры в ПЦР. Такой внутренний стандарт в ПЦР выполняет две основные функции. Во-первых, позволяет избегать получения ложноотрицательных результатов реакции. Во-вторых, позволяет определять концентрацию выявляемой ДНК, т.к. при внесении в пробу он конкурирует с выявляемой ДНК за связывание с праймерами и амплификацию, и равные количества ПЦР-продуктов амплифицируются в том случае, если начальные концентрации выявляемой ДНК и внутреннего стандарта равны. Поскольку в пробу вносится известное количество внутреннего стандарта, то можно оценить количество выявляемой ДНК.
Одна из задач, поставленных нами в данной работе, состояла в том, чтобы разработать наименее трудоемкую технологию конструирования внутреннего стандарта для конкурентной ПЦР. В ходе ее решения руководствовались тем, что при температуре, существенно меньшей, чем оптимальная температура отжига праймеров в ПЦР, специфичность взаимодействия "праймер-матрица" снижается. В этих условиях в ПЦР с произвольной ДНК и праймерами к определенному участку выявляемой ДНК нарабатывается множество неспецифических амплификационных фрагментов, т.к. для инициации процесса ДНК-полимеризации достаточно комплементарности нескольких оснований в последовательности ДНК-матрицы и нескольких нуклеотидов, прилегающих к 3’-концу используемых праймеров. Далее в ходе реакции при оптимальной температуре отжига праймеров нарабатываются ДНК-фрагменты, имеющие последовательности, комплементарные использованным праймерам и, следовательно, коамплифицирующиеся с выявляемой ДНК. Следует отметить, что данная методика применима для получения внутреннего стандарта только для одностадийной ПЦР, когда не требуется наличия специфических участков внутри амплификационного фрагмента, использующегося в качестве внутреннего стандарта. Предложенная нами технология запатентована в Российском агенстве по патентам и товарным знакам (патент на изобретение № 2194761, Государственный реестр изобретений РФ).
Методику, представленную выше, применили при создании внутреннего стандарта, амплифицирующегося с праймерами для выявления ДНК вируса гепатита В. В качестве исходной матрицы была взята ДНК, выделенная из мононуклеарных клеток человека. Матрицу проамплифицировали с праймерами, фланкирующими один из участков нуклеотидной последовательности ДНК вируса гепатита В. Причем условия амплификации были следующими: в первых 5 циклах реакции температура отжига была на 19°С ниже температуры, оптимальной для данной пары праймеров, а в последующих 30 циклах отжиг осуществлялся при оптимальной температуре (см. п. «ПЦР для получения внутреннего стандарта»). В результате получили смесь фрагментов ДНК различной длины, имеющих фланкирующие последовательности, комплементарные праймерам, выявляющим ДНК вируса гепатита В, каждый из которых может служить внутренним стандартом в конкурентной ПЦР для выявления данного патогена (Рис. 1).
Рис. 1. Внутренний стандарт для конкурентной ПЦР, выявляющей ДНК вируса гепатита В.
Дорожки: 1 – амплификация ДНК мононуклеаров с праймерами, выявляющими ДНК вируса гепатита В; 2 – отрицательный контроль (амплификация без ДНК мононуклеарных клеток и вируса гепатита В); 3 – амплификация ДНК вируса гепатита В; 4 – маркер молекулярного веса (1kb Ladder, Promega).
Далее выбрали фрагмент длиной 500 п.н., последовательность которого определили прямым секвенированием. Последовательность фрагмента представлена на Рис. 2.
Рис. 2. Нуклеотидная последовательность фрагмента ДНК, выбранного в качестве внутреннего стандарта.
Заглавными буквами обозначены участки связывания с праймерами, выявляющими ДНК вируса гепатита В.
В базе данных GenBank провели сравнительный анализ полученной последовательности, в ходе которого было установлено, что это участок ДНК E.coli с фланкирующими последовательностями, комплементарными соответствующим праймерам для выявления ДНК вируса гепатита В. Причина того, что данный фрагмент является участком ДНК E.coli, а не принадлежит участку ДНК, использовавшейся в качестве матрицы в ПЦР, возможно, объясняется следующим образом. В реакции амплификации использовался препарат рекомбинантой ДНК-полимеразы Taq, при получении которого применялись клетки E.coli, трансформированные плазмидным вектором, в состав которого был введен ген ДНК-полимеразы Taq. Поэтому в растворе мог содержаться геномный материал клеток-продуцентов данного фермента, т.е. ДНК клеток E.coli. Однако, как видно на электрофореграмме, представленной на Рис. 1, при сравнении ПЦР-продуктов на дорожках 1 и 2, кроме фрагментов, принадлежащих ДНК E.coli, в смеси все же присутствуют фрагменты ДНК мононуклеарных клеток. Отсюда следует, что при получении внутреннего стандарта для конкурентной ПЦР предложенным нами методом можно использовать несколько ДНК-матриц.
После определения нуклеотидной последовательности фрагмента ДНК, выбранного в качестве внутреннего стандарта, и обнаружения в его составе участков, комплементарных праймерам для выявления ДНК вируса гепатита В, для получения необходимого количества внутреннего стандарта данный фрагмент лигировали в плазмиду и клонировали в клетках E. coli. Соответствующая плазмида выделена из E. coli, очищена и растворена в воде, и после подсчета количества копий плазмидной ДНК в миллилитре водного раствора такой раствор использовался в качестве внутреннего стандарта для конкурентной ПЦР, выявляющей ДНК вируса гепатита В. Эффективность коамплификации внутреннего стандарта и ДНК вируса гепатита В проверялась в конкурентной ПЦР с плазмидной ДНК, содержащей участок 1458-1578 н.п. ДНК вируса гепатита В. Результаты опыта представлены на Рис. 3.
Рис. 3. Эффективность коамплификации внутреннего стандарта и ДНК вируса гепатита В.
Дорожки: 1-5 – плазмидная ДНК, содержащая участок 1458-1578 н.п. ДНК вируса гепатита В (106 (а) и 107 (б) геном/мл), 120 п.н. + внутренний стандарт (108104 геном/мл), 500 п.н.
После определения эффективности коамплификации внутренний стандарт использовался в конкурентной ПЦР для количественного определения ДНК вируса гепатита В в сыворотке крови. Для этого готовили последовательные разведения раствора, содержащего внутренний стандарт в известной концентрации, в которые добавляли один и тот же объем исследуемой сыворотки крови. С этой смесью проводили ПЦР. В реакции, согласно принципу конкурентной ПЦР, равные количества продуктов должны были амплифицироваться в том случае, если начальные концентрации внутреннего стандарта и выявляемой ДНК равны. Поэтому при визуализации ПЦР-продуктов в агарозном геле выявляли пробу, в которой ампликон, соответствующий внутреннему стандарту в определенной концентрации, и ампликон, соответствующий ДНК вируса гепатита В, имеют сопоставимую интенсивность флуоресценции в УФ-лучах. Так в случае, показанном на Рис. 4, концентрация ДНК вируса гепатита В составила 108 геном-эквивалент/мл.
Рис. 4. Определение количества ДНК вируса гепатита В в конкурентной ПЦР.
Дорожки: 1 – сыворотка, содержащая ДНК вируса гепатита В, 120 п.н.; 2 - 6 - сыворотка с ДНК вируса гепатита В, 120 п.н. + внутренний стандарт (109105 геном/мл), 500 п.н.; 7 - маркер молекулярного веса (1kb Ladder, Promega).
Таким образом, на базе полученного внутреннего стандарта создали in house тест-систему для количественного определения ДНК вируса гепатита В в биологических жидкостях.
Кроме количественного определения ДНК вируса гепатита В, как уже упоминалось ранее, в ходе лечения возникает необходимость выявления мутационных изменений в вирусном геноме, в частности выявления клинически значимых YMDD- и precore- мутаций. Эти мутации вызваны однонуклеотидными заменами в ДНК вируса гепатита В, поэтому для их выявления применяются методы, предназначенные для детекции SNPs (single nucleotide polymorphisms). Анализ литературных данных показал, что кроме прямого секвенирования и определения длин рестрикционных фрагментов для детекции однонуклеотидных замен можно использовать более простой метод аллель-специфической ПЦР.
Принцип данного метода состоит в том, что в ПЦР фермент ДНК-полимераза Taq осуществляет процесс элонгации ДНК только в случае строгой комплементарности 3’-конца праймера соответствующему участку ДНК-матрицы. Таким образом, замена нуклеотида в ДНК-матрице может быть обнаружена по отсутствию амплификации с праймером, 3’-конец которого приходится точно на место мутации. Однако амплификация может быть осуществлена с измененным праймером, 3’-конец которого комплементарен мутантному нуклеотиду.
Исходя из этого были подобраны праймеры, способные выявлять дикий тип вируса и все возможные замены нуклеотидов ДНК вируса гепатита В в случае YMDD-мутации и precore-мутации G1896А (см. п. «Олигонуклеотиды»). С праймерами и ДНК вируса гепатита В проводили аллель-специфическую ПЦР, результаты которой представлены на Рис. 5 и Рис. 6. В данном опыте использовались сыворотки, заведомо содержащие вирус гепатита В с YMDD- и precore-мутацией (по данным прямого определения нуклеотидной последовательности).
Рис. 5. Результаты аллель-специфической ПЦР по выявлению дикого и YMDD-мутантных штаммов вируса гепатита В.
Длина амплификата 278 п.н.
Дорожки: 1-4 - результат амплификации с аллель- - специфическими праймерами ymdGs, ymdAs, ymdVs, ymdIs,соответственно; 5 – маркер молекулярного веса (500; 278 и 120 п.н.)
Так, на электрофореграмме, представленной на Рис. 5, видно, что в случае а) при использовании всех четырех пар праймеров ПЦР-продукты образуются только в образцах, содержащих ymdAs и ymdGs, которые выявляют дикий тип вируса, в то время как в случае б) срабатывают праймеры ymdAs и ymdIs, выявляющие мутантный штамм вируса (YIDD-вариант).
Рис. 6. Результаты аллель-специфической ПЦР по выявлению дикого и precore-мутантных штаммов вируса гепатита В.
Длина амплификата 204 п.н.
Дорожки: 1, 2 – Результат амплификации с аллель- - специфическими precWCs и precMTs праймерами,соответственно; 5 – маркер молекулярного веса.
На электрофореграмме Рис. 6 видно, что в случае а) ПЦР-продукты регистрируются в образце, содержащем precWCs-праймер, выявляющий дикий штамм вируса, а в случае б) – регистрируются в образце, где присутствует праймер precMTs, выявляющий мутантный штамм вируса G1896A.
В ходе экспериментов по выявлению YMDD- и precore-мутантных штаммов вируса гепатита В методом аллель-специфической ПЦР было установлено, что для получения адекватных результатов, концентрация вируса в исследуемом образце не должна превышать 107 геном/мл. Если концентрация вируса в сыворотке превышает 107 геном/мл, то при проведении ПЦР с аллель-специфическими праймерами образуются ПЦР-продукты, соответствующие как дикому, так и всем мутантным штаммам вируса (Рис. 7 б). При разведении таких сывороток до концентрации 107 геном/мл и менее определяли в этих образцах наличие только дикого или сочетание дикого и одной из мутантных форм вируса (Рис. 7 а).
Рис. 7. Результаты аллель-специфической ПЦР по выявлению дикого и YMDD-мутантных штаммов вируса гепатита В в сыворотках с разной концентрацией ДНК.
а) – концентрация ДНК вируса гепатита В 107 геном-эквивалент/мл; б) – концентрация ДНК вируса гепатита В 109 геном-эквивалент/мл.
Длина амплификата 278 п.н.
Дорожки: 1-4 - результат амплификации с аллель- - специфическими праймерами ymdGs, ymdAs, ymdVs, ymdIs,соответственно.
Данная ситуация может быть вызвана появлением неспецифических ПЦР-продуктов в реакции с высокой концентрацией ДНК-матрицы. Так, в работах, посвященных исследованию кинетических характеристик аллель-специфической ПЦР, было показано, что в реакции амплификации возможно связывание аллель-специфических праймеров с некомплементарным нуклеотидом матрицы (например G:A, A:A, T:T и т.д.) и элонгация цепей ДНК. Однако количество ПЦР-продуктов в этом случае будет значительно меньше, чем при связывании праймеров с комплементарным нуклеотидом матрицы. Отсюда следует, что при увеличении концентрации ДНК-матрицы соответственно возрастет количество ПЦР-продуктов, образующихся при правильном и ошибочном отжиге аллель-специфических праймеров. Поэтому для установления концентрационных пределов для матрицы в аллель-специфической ПЦР был проведен следующий эксперимент. В сыворотку, не содержащую ДНК вируса гепатита В, добавляли амплификационный фрагмент, полученный в ПЦР с ymdMs-праймером и ДНК дикого штамма вируса (имеющий в своем составе последовательность ATG, что соответствует дикому штамму вируса) в концентрации от 103 до 109 копий ДНК. Затем с сывороткой, содержащей амплификационный фрагмент в соответствующей концентрации, и аллель-специфическими праймерами ymdAs, ymdGs, ymdIs и ymdVs, проводили ПЦР. Результаты представлены на Рис. 8.
Рис. 8 Определение пределов чувствительности аллель-специфической ПЦР для выявления дикого и мутантных штаммов вируса.
Длина амплификата 278 п.н.
Дорожки: 1 – маркер молекулярного веса (500/278; 200; 134 п.н); 2 – 5 – результат амплификации с аллель- - специфическими праймерами ymdGs, ymdAs, ymdVs, ymdIs,соответственно.
Поскольку в качестве матрицы в ПЦР использовался амплификационный фрагмент, соответствующий дикому штамму вируса, то продукты аллель-специфической ПЦР должны были регистрироваться только в пробах, где присутствовали праймеры ymdAs и ymdGs, выявляющие данный штамм.
Однако, как видно на электрофореграммах, представленных на Рис. 8, если начальная концентрация ДНК была больше 107 копий, то регистрировались ПЦР-продукты в пробах, где присутствовали праймеры, выявляющие как дикий, так и мутантный штамм вируса. Таким образом, было показано, что предельная концентрация ДНК вируса в аллель-специфической ПЦР - 107 копий. На электрофореграммах также видно, что ПЦР-продукты регистрируются в пробах, где начальная концентрация ДНК составляла от 104 копий, следовательно, нижний предел чувствительности метода – 104 копий ДНК.
Так было доказано, что в случае сыворотки с высокой вирусной нагрузкой (более 107 геном/мл) обнаружение ПЦР-продуктов, соответствующих наличию вирусов всех форм, связано с появлением неспецифических ПЦР-продуктов.
Но существует еще одна причина такой ситуации. По данным литературы известно, что мутантные штаммы вируса в минорных количествах почти всегда присутствуют в вирусной популяции. Значит проведение аллель-специфической ПЦР с образцами, концентрация ДНК вируса в которых более 107 геном/мл, может выявлять эти штаммы в количестве 0,1 % и менее от общей вирусной популяции. Отсюда следует, что разведение сыворотки до концентрации вирусной ДНК 107 геном/мл и менее позволяет отсечь вклад минорных количеств мутантных штаммов и неспецифических реакций. Так, если в нативной сыворотке концентрация мутантных штаммов вируса составляет 0,1% и менее относительно дикого штамма, то при ее разведении до указанной концентрации после проведения ПЦР не будет зарегистрировано наличия ПЦР-продуктов, соответствующих мутантным штаммам, т.к. их количество находится за пределами чувствительности метода. В этом случае можем говорить о том, что в крови больного преимущественно содержится вирус дикого типа. Если же при разведении в образце ДНК до концентрации 107 геном/мл после ПЦР регистрируются оба (дикий и мутантный) штаммы вируса, то в исследуемом образце концентрация вирусов, несущих YMDD- или precore-мутацию была не менее 104 геном/мл, следовательно, концентрации дикого и мутантного штаммов в такой сыворотке различаются не более, чем в 1000 раз, и в крови одновременно присутствуют две формы вируса. Наличие ПЦР-продуктов, соответствующих только мутантным штаммам вируса свидетельствует о том, что в крови больного количество вируса с мутацией на три порядка превышает немутантную форму. Таким образом, было установлено, что методом аллель-специфической ПЦР можно определять соотношение мутантного и дикого штаммов в сыворотке крови.
Следует отметить, что метод аллель-специфической ПЦР ранее не применялся для оценки доли мутантных штаммов в общей вирусной популяции. Между тем нами установлено, что проведение аллель-специфической ПЦР в концентрационных пределах от 104 до 107 геном/мл поможет ответить на вопрос, с каким штаммом, диким или мутантным, на данном этапе заболевания связан процесс повреждения печени, а это, в свою очередь, немаловажно для выбора оптимальной тактики лечения.
Представленные выше методики в дальнейшем использовались для оценки концентрации и выявления клинически значимых YMDD- и precore-мутаций ДНК вируса в сыворотках больных вирусным гепатитом В с патологией системы крови. В ходе работы был создан банк сывороток, в который вошли 32 HBsAg-положительные и содержащие ДНК вируса гепатита В сыворотки больных, получающих химиотерапию при лечении гемобластозов. При исследовании данных сывороток использовали следующий алгоритм. Вначале методом конкурентной ПЦР определяли концентрацию вирусной ДНК. Если концентрация ДНК в сыворотках превышала 107 геном-эквивалент/мл, то перед постановкой аллель-специфической ПЦР их разводили до указанной концентрации. Затем проводили аллель-специфическую ПЦР для выявления YMDD- и precore G1896A - мутантных штаммов вируса гепатита В. В результате было показано, что концентрация ДНК вируса гепатита В в этих сыворотках составила от 107 до 1010 геном-эквивалент/мл, при разведении сывороток до концентрации ДНК 107 геном-эквивалент/мл и менее регистрировались ПЦР-продукты, соответствующие только диким штаммам вируса.
Заключение.
В ходе данного исследования был разработан методически простой способ конструирования внутреннего стандарта для одностадийной конкурентной ПЦР. Предложенная нами технология получения внутреннего стандарта запатентована в Российском агенстве по патентам и товарным знакам (патент на изобретение № 2194761, Государственный реестр изобретений РФ). Она была применена при создании диагностической тест-системы, основанной на методе конкурентной ПЦР, для количественного определения ДНК вируса гепатита В в биологических жидкостях. Для выявления клинически значимых мутаций в ДНК вируса гепатита В использовали аллель-специфическую ПЦР. Было установлено, что данная методика применима в диапазоне концентраций ДНК от 104 до 107 геном/мл. Причем проведение аллель-специфической ПЦР в указанных концентрационных пределах позволяет оценивать долю мутантных штаммов в общей вирусной популяции. Обе методики (конкурентную и аллель-специфическую ПЦР) применили для оценки концентрации и выявления YMDD- и precore-мутантных штаммов вируса гепатита В в HBsAg-положительных и содержащих ДНК вируса сыворотках больных, проходящих лечение в Гематологическом научном центре РАМН по поводу гемобластозов. В результате в сыворотках этих больных выявили содержание ДНК вируса гепатита В в концентрации от 107 до 1010 геном-эквивалент/мл с превалированием дикого штамма.
Таким образом, в данной работе предлагается ряд методик, которые могут использоваться в клинической диагностике с целью контроля эффективности терапии вирусного гепатита В и коррекции протокола лечения в случае выявления мутаций в геноме вируса.
Выводы
- Разработана и запатентована новая технология создания внутреннего стандарта для количественного определения ДНК патогенов методом конкурентной ПЦР.
- Разработана диагностическая тест-система для количественного определения ДНК вируса гепатита В методом конкурентной ПЦР.
- Показано, что аллель-специфическая ПЦР для выявления вирусных мутаций применима в диапазоне концентраций от 104 до 107 геном-эквивалент/мл.
- Установлено, что с помощью аллель-специфической ПЦР можно оценить долю мутантных штаммов в общей популяции вируса гепатита В.
- Разработанные тест-системы для количественного определения и детекции мутаций вируса гепатита В апробированы на сыворотках больных вирусным гепатитом В.
Список публикаций по теме диссертации.
- Пичковская В.А. Февралева И.С., Судариков А.Б. Разработка тест-системы, основанной на методе полимеразной цепной реакции, для количественного определения ДНК вируса гепатита В в сыворотке крови. // Вестник РГМУ. - 2001. - № 2 (17). - С. 153.
- Пичковская В.А., Февралева И.С., Ибрагимова М.М., Соловьева Т.И., Крель П.Е., Судариков А.Б. Детекция YMDD-мутации в ДНК вируса гепатита В с помощью аллель-специфической полимеразной цепной реакции // Молекулярная генетика, вирусология и микробиология. – 2004. – № 1. – С. 27-29.
- Февралева И.С., Пичковская В.А., Судариков А.Б.. Новая технология конструирования внутреннего стандарта для количественной полимеразной цепной реакции. // Проблемы гематологии и переливания крови. – 2002. - № 1. - С. 89.
- Февралева И.С., Пичковская В.А., Судариков А.Б. Разработка экспресс-диагностикума для количественного определения ДНК гепатита В в сыворотке крови. Тез. докл. Научно-практический симпозиум "Технологии генодиагностики в практическом здравоохранении". М.: НПО «Литех», 2002 г. – С. 31-33.
- Февралева И.С., Пичковская В.А., Судариков А.Б. Способ конструирования внутреннего стандарта для количественного определения ДНК патогенов методом конкурентной полимеразной цепной реакции. Патент на изобретение № 2194761. М.: Государственный реестр изобретений РФ, 2002.
