Молочнокислые бактерии : индивидуальные особенности действия на патогенные ми к роорганизмы, макроорганизм и его микр о биоту

На правах рукописи

Ермоленко Елена Игоревна

молочнокислыЕ бактерии: индивидуальные особенности действия на патогенные микроорганизмы, макроорганизм и его микробиоту

АВТОРЕФЕРАТ

диссертации на соискание ученой степени

доктора медицинских наук

03.00.07 – микробиология

Санкт-Петербург

2009

Работа выполнена в Учреждении Российской Академии медицинских наук Научно-исследовательском институте экспериментальной медицины Северо-Западного отделения РАМН

Научный консультатнт:

доктор медицинских наук, профессор Суворов Александр Николаевич

Официальные оппоненты:

доктор медицинских наук, профессор Королюк Александр Михайлович

доктор медицинских наук, профессор Афиногенов Геннадий Евгеньевич

доктор медицинских наук, профессор Бойцов Алексей Геннадьевич

Ведущая организация:

Федеральное государственное учреждение науки «Санкт-Петербургский Научно-исследовательский институт эпидемиологии и микробиологии имени Пастера» Роспотребнадзора

Защита диссертации состоится «…»………………….2009 г. в « » часов на заседании

диссертационного совета ДМ 001.022.01 при НИИЭМ СЗО РАМН

по адресу: 197376, Санкт-Петербург, ул. Акад. Павлова, 12

С диссертацией можно ознакомиться в научной библиотеке НИИЭМ СЗО РАМН

Автореферат разослан «…..»………………….2009 г.

Ученый секретарь диссертационного совета

доктор медицинских наук Бурова Л.А.

ХаРАКТЕРИСТИКА работы

Актуальность исследования. Еще в начале XX века российский ученый И.И. Мечников впервые начал активно пропагандировать использование молочнокислых бактерий (lactic acid bacteria, LAB) в лечебно-профилактических целях. Он создал предпосылки для формирования нового научного направления, включающего изучение межмикробного антагонизма и оценку влияния LAB на организм хозяина, сформулировал основные постулаты для зарождающейся в наши дни научной дисциплины «пробиотической микробиологии» [Нынь И.В.и Королюк А.М., 2008]. Несмотря на длительное и достаточно успешное использование пробиотических пищевых продуктов и препаратов, их активное, но часто бесконтрольное применение в последние десятилетия привело к возникновению ряда серьезных проблем. Среди них можно указать: низкую эффективность действия некоторых препаратов, угнетение собственной микрофлоры хозяина, развитие инфекционной патологии при введении пробиотиков ослабленным больным [Lebenthal E., Lebenthal Y., 2003; Land M.H. et al., 2005]. Становится очевидным, что для увеличения эффективности лечебно-профилактического использования и предотвращения развития побочных эффектов LAB должны вводиться с учетом индивидуальных характеристик пациента и по назначению врача. Именно поэтому в настоящий момент как никогда остро встал вопрос о необходимости серьезных комплексных научных исследований особенностей действия молочнокислых бактерий на макроорганизм и его микробиоту.

К числу LAB относят два рода бактерий, явившихся предметом настоящего исследования,- Lactobacillus spp. и Enterococcus spp.. [Axelsson L., 2004; Salminen S. et al., 2004]. Эти микроорганизмы представляют особый научный и практический интерес, так как являются представителями нормальной микрофлоры человека и животных, широко распространены во внешней среде, входят в состав многих пробиотических препаратов и продуктов. Известно, что энтерококки и лактобациллы могут оказывать разностороннее влияние на биохимические, физиологические, нейрогуморальные и иммунные процессы в организмах человека и животных [Шендеров Б.А., 2005; Goldin B.R. and Gorbach S.L., 1984; Maldonado G. et al., 2007; Preter V. et al., 2007]. Эти бактерии участвуют в поддержании колонизационной резистентности и гомеостаза, нормализуют содержание в организме углеводов, желчных кислот, холестерина, осуществляют синтез витаминов и других биологически активных соединений [Gibson G.R. et al., 1995; Доронин А.Ф.и Шендеров Б.А., 2002]. Некоторые штаммы энтерококков и лактобацилл способны продуцировать в окружающую среду такие продукты, как перекись водорода, лизоцим, бактериоцины и бактериоциноподобные субстанции, конкурировать с патогенными микроорганизмами за пищевые субстраты и сайты прикрепления к клеткам [Reid G., 2004; Salminen S. et al., 2004]. Основным требованием, предъявляемым к пробиотическим штаммам LAB, является наличие выраженной антагонистической активности по отношению к патогенным микроорганизмам [Reid G., 2008]. Это позволяет использовать пробиотики для усиления или коррекции эффектов антибиотиков, а в ряде случаев - как их альтернативу. На основании большого числа клинических наблюдений можно полагать, что пробиотики практически незаменимы при терапии дисбиотических состояний, болезни Крона, язвенной болезни желудка и двенадцатиперстной кишки [Ткаченко Е.И. и Успенский Ю.П., 2006]. Кроме того, LAB активно используются при терапии сахарного диабета, аллергических заболеваний [Prescott S. and Bjrkstn B., 2009], ишемической болезни сердца, коррекции нарушений липидного и минерального обменов [Гриневич В.Б. и др., 2004]. Наряду с пероральным введением молочнокислых бактерий целесообразно их местное использование при вагинитах, тонзиллитах и стоматитах [Reid G. et al., 2004; Elmer G.W., 2001; Maldonado G. et al., 2007].

Несмотря на несомненные успехи, достигнутые при изучении LAB, многое до сих пор остается неясным. Неизвестно, как молочнокислые бактерии, входя в состав микробиоты человека и животных, влияют на патогенные микроорганизмы и представителей нормальной микрофлоры, какое действие они оказывают на отдельные ткани состояние отдельных систем и макроорганизм в целом. Обнаружены существенные различия в спектрах антибактериального действия различных штаммов молочнокислых бактерий, а также в их способности влиять на систему иммунитета и метаболические процессы, происходящие в организме человека и животных. Возможность соматической патологии пациента и особенности собственной микрофлоры хозяина делают необходимым индивидуальный подбор пробиотиков. Отсутствие стандартных методов исследования пробиотиков затрудняет сравнительный анализ различных штаммов молочнокислых бактерий и их паспортизацию. В связи с этим разработка методологии сравнительного исследования пробиотических культур, а также изучение особенностей их действия в системах in vitro и in vivo, являются актуальной проблемой современной микробиологии.

Целью настоящей работы является изучение особенностей влияния молочнокислых бактерий на микробиоту и макроорганизм, а также разработка стратегии максимально эффективного использования пробиотических штаммов LAB для профилактики и лечения заболеваний человека и животных, вызванных стрептококками и другими патогенными микроорганизмами.

Задачи исследования

1. Разработать комплекс методических подходов для исследования влияния LAB на

патогенные микроорганизмы, нормальную микрофлору и макроорганизм.

2. Провести сравнительное исследование антагонистической активности культур LAB в отношении различных грамотрицательных и грамположительных бактерий, микоплазм, грибов родов Candida и Cryptococcus, а также вирусов простого герпеса.

3. Исследовать геномы LAB, обладающих антагонистической активностью в отношении патогенных бактерий и грибов, на наличие известных генов бактериоциногенности.

4. Изучить влияние антимикробных пептидов, продуцируемых LAB, а также искусственно синтезированных аналогов бактериоцинов на рост и морфофизиологические особенности патогенных микроорганизмов.

5. Провести анализ экспрессии генов бактериоциногенности LAB и исследовать влияние специфических пептидных индукторов на антибактериальную активность молочнокислых бактерий.

6. Исследовать в модельных условиях воздействие штаммов LAB и аутопробиотических энтерококков на клинические симптомы, метаболические процессы, иммунитет и микробиоту кишечника лабораторных животных при дисбиозе, вызванном приемом антибиотиков, а также при терапии урогенитальных инфекций.

Научная новизна

Предложен комплекс методов (микробиологических, биохимических, генетических, иммунологических, гистологических, электронно-микроскопических) для разностороннего изучения воздействия LAB на макроорганизм и заселяющую его микрофлору.

Проведено сравнительное исследование лактобацилл и энтерококков, выделенных из различных источников. Благодаря введению нового количественного показателя удалось охарактеризовать степень антагонистической активности различных штаммов энтерококков и лактобацилл в отношении широкого круга индикаторных микроорганизмов (грамотрицательных и грамположительных бактерий, микоплазм, а также грибов рода Candida и Cryptococcus). Впервые выявлена способность метаболитов лактобацилл и энтерококков угнетать рост микоплазм и репродукцию вирусов простого герпеса в системе in vitro.

Разработаны новые модели экспериментального дисбиоза и бактериального вагинита. При их использовании впервые установлены особенности влияния различных культур LAB на клинические симптомы, микробиоту, показатели иммунитета, тонкие морфологические изменения в тканях животных.

Впервые исследована степень влияния пробиотических штаммов, в частности, молочнокислых бактерий, на метаболические процессы, происходящие в разных отделах желудочно-кишечного тракта.

Впервые на биологической модели доказана эффективность использования индигенных (аутопробиотических) энтерококков для коррекции дисбиозов у животных.

Впервые выявлено действие искусственно синтезированного энтероцина В и его аналога на грамотрицательные бактерии, проявляющееся в ингибировании роста E. coli и повреждении их цитоплазматических мембран.

Выявлены штаммовые особенности действия метаболитов энтерококков и лактобацилл на морфологию S. pyogenes.

Теоретическая значимость работы

Теоретическое значение работы заключается в том, что диссертантом предложен новый подход для исследования влияния LAB на организм млекопитающих и их микрофлору. В результате удалось значительно дополнить имеющиеся представления об особенностях распространения молочнокислых бактерий в организме и возможности колонизации ими слизистых оболочек урогенитального и желудочно-кишечного трактов.

Установлено, что воздействие пробиотиков на организм сопровождается существенными сдвигами, как в сторону стимуляции, так и в сторону ингибирования реакций иммунной системы, а также пристеночного и просветного пищеварения на разных уровнях желудочно-кишечного тракта. Характер влияния вводимых пробиотических культур зависит от их индивидуальных особенностей, а также от наличия или отсутствия инфекционной патологии. Эти данные имеют большое значение для понимания сложного комплекса взаимодействий макроорганизма и его микробиоты, а также выбора пробиотика в зависимости от клинического диагноза и этиологии заболевания.

Полученные результаты важны для развития медицинской, а также ветеринарной микробиологии, открывают перспективы широкого практического использования и дальнейшего изучения LAB.

Практическая значимость работы

Прикладными аспектами исследования являются разработанные на основе экспериментальных данных: 1) метод двухслойного агара с количественной и качественной оценкой антимикробной активности молочнокислых бактерий in vitro; 2) комплексный подход в исследования прямого и опосредованного антимикробного действия in vivo, с учетом влияния LAB на патогенные микроорганизмы, микробиоту хозяина, метаболизм и иммунную систему макроорганизма.

В ходе сравнительного исследования клинических изолятов из урогенитального тракта выбран и идентифицирован новый штамм LAB, L. fermentum Z, предложенный для использования в составе пробиотических препаратов или пищевых продуктов [Заявка на изобретение № 2008133794 от 15.08.08]. Его отличительной особенностью является избирательное действие в отношении патогенных микроорганизмов, отсутствие влияния на другие LAB, в частности E. faecium L3. При исследовании антимикробного эффекта эти молочнокислые бактерии выступают, как синергисты и могут быть рассмотрены в качестве компонентов нового симбиотического препарата.

Исследование влияния аутопробиотических энтерококков на организм животных при дисбиозе кишечника может рассматриваться как предварительный экспериментальный этап перед комплексным исследованием перспектив применения в клинической практике собственной микрофлоры.

Результаты исследований могут быть использованы при клиническом назначении пробиотиков с целью защиты и профилактики заболеваний инфекционной природы. Применение пробиотических препаратов для лечения и профилактики эндометритов у коров, обусловленных условно-патогенной микрофлорой, изложено в методических рекомендациях, утвержденных методическим советом ФГОУ ВПО «Санкт-Петербургская Государственная академия ветеринарной медицины».

Модифицированный метод двухслойного агара применяется в лаборатории молекулярной микробиологии НИИЭМ СЗО РАМН, на кафедре микробиологии, вирусологии и иммунологии Санкт-Петербургской государственной медицинской академии имени И.И. Мечникова для изучения микробного антагонизма, на кафедре эпизоотологии ФГОУ ВПО «Санкт-Петербургской государственной академии ветеринарной медицины».

Результаты диссертационного исследования используются при чтении лекций и проведения практических занятий по микробиологии на медицинском факультете Санкт-Петербургского Государственного университета.

Основные положения, выносимые на защиту

1. При назначении пробиотиков, в состав которых входят молочнокислые бактерии, целесообразно учитывать спектр их антимикробной активности, а также особенности их влияния на иммунную систему и метаболические процессы.
2. Предложенные модели экспериментальных дисбиозов и вагинитов, позволяют изучать особенности действия штаммов пробиотиков на макроорганизм и его микрофлору на фоне развития указанных патологических процессов.
3. Новый подход в оценке степени влияния пробиотических бактерий на метаболические процессы в разных отделах желудочно-кишечного тракта расширяет существующие научные представления о роли микробиоты в процессе пищеварения.
4. Модифицированный метод двухслойного агара позволяет проводить количественную оценку антагонистической активности LAB к широкому спектру микроорганизмов и выявлять возможные морфофункциональные изменения индикаторных культур.
5. Созданию симбиотических и комбинированных микробных препаратов должны предшествовать эксперименты, направленные на выявление степени антагонистической активности компонентов консорциумов по отношению друг к другу и к патогенным микроорганизмам при совместном и раздельном культивировании.

Структура и объем диссертации

Диссертационная работа изложена на 270 страницах и включает: введение, обзор литературы материалы и методы, результаты исследований и их обсуждение, заключение, выводы, список цитируемой литературы и приложение. Текст диссертации иллюстрирован 77 рисунками и 50 таблицами. Список литературы включает 379 источников, из них 132 отечественных и 247 зарубежных.

Основная часть работы выполнена в отделе молекулярной микробиологии (НИИЭМ СЗО РАМН). Антимикотическая активность LAB исследована автором на кафедре микробиологии, вирусологии и иммунологии Санкт-Петербургского Университета им. акад. И.П. Павлова. Электронная микроскопия и синтез пептидов проведены в Федеральном государственном унитарном предприятии "Государственный научно-исследовательский институт особо чистых биопрепаратов" Федерального медико-биологического агентства. (ФГУП ГНИИ ОЧБ ФМБА). Ветеринарные исследования проведены в животноводческих хозяйствах Ленинградской области (ЗАО « Предпортовый» и ЗАО ПЗ «Гражданский»).

Апробация работы

По теме диссертации опубликовано 66 научных работ, из них 23 статьи

(9 статей в журналах, рекомендованных ВАК РФ), 37 тезисов. Материалы диссертационной работы изложены также в отдельных главах трех книг и в 3 методических пособиях.

Диссертация апробирована на заседании отдела молекулярной микробиологии

НИИЭМ СЗО РАМН 8 июня 2009 года.

Результаты диссертационной работы были доложены на VI Российско-Итальянской научной конференции «Инфекционные болезни: диагностика, лечение, профилактика”, Санкт-Петербург, 2000 г; Всероссийской научной конференции, посвященной 103-летию основания кафедры инфекционных болезней Военно-медицинской академии, Санкт-Петербург, 2001 г; I Съезде микологов, Москва, 2002 г; научной конференции «Проблемы инфекции в клинической медицине» и VIII съезде Итало-Российского общества по инфекционным болезням, Санкт-Петербург, 2002 г; конференции «Пробиотические микроорганизмы – современное состояние вопроса и перспективы использования» Москва, 2002 г; первом всероссийском конгрессе по медицинской микологии, Москва 2003 г; VI Российском съезде врачей инфекционистов, Санкт-Петербург, 2003 г; 14th European Congress of Clinical Microbiology and Infectious Diseases Prague, Czech Republic, 2004; научно-практической конференции по медицинской микологии (7-е Кашкинские чтения), Санкт-Петербург, 2004 г; 1st International Conference on Environmental, Industrial and Applied Microbiology (BioMicroWorld-2005), Badajoz, Spain, 2005; Российской научно-практической конференции «Узловые вопросы борьбы с инфекцией», Санкт-Петербург, 2004 г; Международном научно-практическом конгрессе «Актуальные проблемы ветеринарной медицины», Санкт-Петербург, 2005 г; The XVI Lancefield International Symposium on Streptococci and Streptococcal Diseases, Palm Cove, Australia, 2005; 7-м Международном Славяно-Балтийском научном форуме Санкт-Петербург, 2005 г; Российской научно-практической конференции, посвященной 110-летию кафедры инфекционных болезней Военно-медицинской академии им. С.М.Кирова «Инфекционные болезни: проблемы здравоохранения и военной медицины», Санкт-Петербург, 2006 г; заседании общества эпидемиологов, микробиологов и паразитологов в НИИ им. Пастера, Санкт-Петербург, 2006 г; IX съезде всероссийского общества эпидемиологов, микробиологов и паразитологов, Москва, 2007 г; Международном конгрессе «Пробиотики, пребиотики, синбиотики и функциональные продукты питания. Фундаментальные и клинические аспекты», Санкт-Петербург, 2007 г; международном конгрессе «Пробиотики, пребиотики, синбиотики и функциональные продукты питания. Фундаментальные и клинические аспекты», Санкт-Петербург, 2007 г; 10-м Юбилейном Славяно-Балтийского научном форуме «Санкт-Петербург – Гастро-2008», Санкт-Петербург, 2008 г; VI Всероссийской конференции с международным участием, посвященной 50-летию открытия А.М. Уголевым мембранного пищеварения, Санкт-Петербург 2008 г; II Съезде физиологов СНГ «Физиология и здоровье человека», Кишинев, Молдова, 2008 г; The XVII Lancefield International Symposium on Streptococci and Streptococcal Diseases, Porto Heli, Greece, 2008; II Съезде физиологов СНГ «Физиология и здоровье человека», СПб. 2008 г; Международной конференции «Probiotics for the 3rd Millennium» High Tatras, Slovakia, 2008; втором Санкт-Петербургском международном ЭкоФоруме-«Окружающая среда и здоровье человека» Санкт-Петербург, 2008 г; 20th European Society of Clinical Microbiology and Infectious Diseases, 2009; Helsinki, Finland, 2009; 8th BIO FORUM BIO EXPO JAPAN, Tokyo, 2009.

Личный вклад диссертанта

Основная часть исследований выполнена лично автором. Выделение антимикробных пептидов выполнялось при консультации, д.б.н., профессора В.Н. Кокрякова (НИИЭМ СЗО РАМН). Пептиды по предоставленной аминокислотной последовательности синтезированы д.б.н. А.А.Колобовым (ФГУП ГНИИ ОЧБ ФМБА). Электронная микроскопия ультратонких срезов с поверхности двухслойного агара стрептококков и эшерихий выполнена д.б.н., профессором О.В. Рыбальченко (ФГУП ГНИИ ОЧБ ФМБА). Исследование биохимической активности проведены совместно с д.б.н. Л.В.Громовой (НИИ Физиологии им. И.П. Павлова). Гистологические исследования проведены д.б.н., П.В. Пигаревским (НИИЭМ СЗО РАМН). Культивирование ВПГ и определение выполнено совместно с к.б.н. В.А. Фураевой (НИИ гриппа Северо-Западного отделения РАМН). Лечение послеродового эндометрита у коров проведено совместно с к.в.н. И.В. Марцинковской (Государственная академия ветеринарной медицины) в животноводческих хозяйствах Ленинградской области.

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ

Характеристика штаммов антагонистов и индикаторных микроорганизмов

В качестве антагонистов использованы штаммы энтерококков и лактобацилл, выделенные из пробиотических препаратов, а также изолированные из урогенитального тракта и кишечника здоровых людей (Lactobacillus spp. 62, 64, 65 и E. faecium V1). Большая часть экспериментов проводилась с использованием 6 штаммов пробиотических молочнокислых бактерий: Enterococcus faecium L3 («Ламинолакт»), E. faecium L5, устойчивый к эритромицину дериват штамма L3, E. faecium SF68 («Бифиформ»), E. faecium М74 («Линекс»), Lactobacillus plantarum 8Р-А3 («Лактобактерин»), L. acidophilus Д № 75 и 76 («Витафлор»), L. aciophilus EP 317/402 («Наринэ») и L. fermentum Z (подана заявка на изобретение) в качестве антагонистов. В качестве контролей использовались пробиотические культуры E. coli M17 и Saccharomyces boulardii П№ 011277, входящие в состав препаратов «Бификол» и «Энтерол», соответственно.

В качестве индикаторных культур использовали: 30 штаммов стрептококков, по 10 штаммов из серогрупп A (СГА), В (СГВ), C (СГС) и G (СГG); Enterococcus spp. V1-V28, Staphylococcus aureus ATCC 25923, S. aureus 209, Sh1 и Sh 2 (устойчивый к метициллину), Escherichia coli АТСС 25922, E. coli 1-20, Pseudomonas aeruginosa ATCC 27853, Proteus mirabilis E, Klebsiella pneumoniae E, Listeria monocytogenes EGD, M. hominis 31.P ATСС15488, Candida albicans ATCC 855-653 и Cryptococcus neoformans E. Также в роли индикаторных бактерий выступали 7 штаммов молочнокислых бактерии: E. faecium L3, SF68, M74, L. acidophilus EP 317/402, L. plantarum 8Р-А3 и L. fermentum Z, использованные как антагонисты.

Для определения противовирусной активности супернатантов культур LAB, полученных из них пептидных экстрактов, а также синтетического энтероцина В и его аналога использовали штамм вируса простого герпеса 1 типа (ВПГ-1) «Ленинград».

Культуральные среды, условия роста и хранение культур микроорганизмов

Для культивирования микроорганизмов применяли жидкие и плотные питательные среды: THB (Todd-Hewitt Broth, «Difco», США), BHI (Brain Heart Infusion Broth, «Gibco Diagnostics», США), MРС1, МРС4 («НИЦФ», Россия), MRS и колумбийский агар («Himedia», Индия) с добавлением (до 10% объема) нормальной лошадиной сыворотки, среду Мюллера-Хинтона («НИЦФ», Россия) триптозный агар («FERAK», Германия). Все бактериальные штаммы инкубировали в аэробных условиях при 37оС. Первичное выделение лактобацилл из проб, взятых из организма людей и животных, осуществляли при той же температуре в микроаэрофильных условиях (в микроанаэростатах с использованием газогенерирующих пакетов для анаэробов «Becton Dickinson», США).

Методы исследования

Изучение морфологических, культуральных и биохимических свойств микроорганизмов, изолированных из объектов исследования, проводили по общепринятым методикам [Balows A., et al., 2005]. Исследование биохимических свойств энтерококков и лактобацилл осуществляли при помощи тест систем Lachema (Чехия), bioMerieux (Франция).

Анализ геномов энтерококков и лактобацилл в целях их видовой идентификации, а также выявления генов патогенности и генов, обеспечивающих продукцию бактериоцинов, выполняли при помощи полимеразной цепной реакции (ПЦР). Экспрессию генов бактериоцинов в штамме E. faecium L3, подтверждали, используя метод обратной транскрипции (ОТ-ПЦР).

Исследование антимикробной активности культур антагонистов проводили методами штриховых посевов (ГОСТ, 2004), двухслойного агара с определением предложенного нами показателя МИКА (минимального ингибирующего количества антагониста) и с оценкой характера роста индикаторных культур. Кроме того, для изучения антагонистической активности LAB определяли количества жизнеспособных индикаторных микроорганизмов при их выращивании в присутствии молочнокислых бактерий в жидкой питательной среде.

Антимикробную активность супернатантов, пептидных экстрактов, полученных из них фракций пептидов, а также искусственно синтезированных пептидов определяли с помощью метода радиальной диффузии [Lehrer R. I. et al., 1991], капельным и турбодиметрическим методами.

Противовирусную активность супернатантов LAB и пептидов исследовали, заражая вирусом простого герпеса первого типа (ВПГ-1) культуру клеток Vero, с последующей количественной оценкой цитопатического действия (ЦПД). Наличие репродукции вирусов устанавливали при помощи иммуно-флюоресцентного метода (с поликлональной сывороткой против ВПГ-1).

Концентрацию молочной кислоты в супернатантах LAB определяли энзиматическим калориметрическим методом с использованием тест системы «Лактат-Витал» («Витал Диагностикс», Санкт-Петербург, Россия).

Пептидный экстракт из супернатанта культуры E. faecium L3 получали путем преципитации 70% сульфатом аммония, с последующей фильтрацией через мембрану Amicon PM (10000 MW, США). Выделение и очистку низкомолекулярных катионных пептидных фракций культуры E. faecium L3 выполняли путем гельфильтрации.

Анализ молекулярной массы пептидов, входящих в состав фракций, проводили с использованием SDS электрофореза и при помощи масспектрометрического анализа.

Синтез пептидов осуществляли с использованием автоматического синтезатора пептидов Applied Biosystems 430-A (США).

Содержание иммуноглобулинов A, M и G в сыворотке крови крыс и коров, а также слизи из урогенитального тракта и кишечника крыс определяли методом осаждения сульфатом цинка [Холод В.М., и др. 1988].

Функциональную активность С3 компонента комплемента сыворотки крови крыс оценивали по результатам кинетической регистрации комплементзависимого гемолиза эритроцитов кролика в присутствии реагента RC3 [Jessen T.E. et al., 1983].

Экспрессию мРНК цитокинов (IL-1, IL-8, IL-10, IL-18) и TLR2 рецепторов в тканях слизистой кишечника и влагалища лабораторных животных определяли методом ОТ-ПЦР.

Эксперименты на крысах проводили, используя штамм E. faecium L5 (E. faecium L3, несущий ген устойчивости к эритромицину), L. fermentum Z и аутопробиотические штаммы, выделенные из фекалиев здоровых крыс.

Оценку острой и подострой токсичности проводили на беспородных белых мышах и крысах Вистар обоих полов (массой 18–20 г и 200-250 г, соответственно), полученных из питомника «Рапполово РАМН».

Экспериментальный дисбиоз кишечника у крыс вызывали внутрижелудочным введением течение 3-х дней ампициллина и метронидазола. Затем 5 дней животные получали молочнокислые закваски. На 8-ой день отбирали пробы химуса, слизи и эпителия для оценки активности фермента мальтазы. Взятие и исследование проб при изучении влияния пробиотиков на кишечное пищеварение осуществляли в соответствии с методикой, описанной ранее [Егорова и др., 1987]. Биохимические показатели сыворотки крови крыс определяли при помощи биохимического анализатора Aeroset Toshiba (США).

Модель экспериментального вагинита создавали у овариоэктомированных крыс (самки породы Вистар, масса тела 180-200г), которых интравагинально заражали смесью патогенных бактерий (Streptococcus agalactiae 219, Staphylococcus aureus LB и гемолитический штамм Escherichia coli IM). Для возобновления половых циклов крысам вводили 0,5 мкг эстрадиол-дипропионата.

Пробы маточного экссудата получали при помощи пластикового катетера, который также был использован для введения лечебных препаратов (молочнокислых заквасок или антибиотиков).

Электронная микроскопия тонких срезов колоний бактерий проведена по методике предложенной О.В. Рыбальченко [Рыбальченко О.В., 2006]

Электронная микроскопия срезов слизистых кишечника и гистологические исследования слизистых урогенитального и желудочно-кишечного тракта крыс были осуществлены по общепринятым методикам.

Статистическую обработку данных проводили с использованием компьютерных программ Microsoft Excel и STATISTICA for Windows. Связь между категориями переменных анализировали с помощью t-критерия Стьюдента (сравнение средних величин в группах). Различия считали статистически значимыми при доверительном интервале 95% (р <0,05).

Результаты и обсуждение

I Антимикробная активность LAB в системе in vitro

1. Антимикробная активность живых культур LAB

Исследование антимикробного действия живых бактерий родов Lactobacillus и Enterococcus проводили методами штриховых посевов и предложенным нами вариантом метода двухслойного агара. Антимикотическая активность LAB и их способность влиять на рост друг друга изучались также при совместном культивировании этих микроорганизмов в жидкой среде.

1. 1. Исследования методом штриховых посевов

Исследование антимикробного антагонизма LAB методом штриховых посевов было проведено с использованием среды (МРС4), предназначенной для культивирования молочнокислых бактерий. Поэтому в качестве индикаторных микроорганизмов был использован сравнительно узкий круг бактерий (стафилококки, эшерихии, клебсиеллы, лактобациллы и энтерококки), а также грибы рода Candida, способные расти на этой среде. В результате проведенных экспериментов показано, что максимальной антагонистической активностью к использованным индикаторным культурам обладала культура L. plantarum 8Р-А3. Несколько меньшую способность ингибировать рост индикаторных культур проявляли L. acidophilus EP 317/402 и пробиотические энтерококки (p <0,05). В то же время, большинство клинических изолятов (55 из 65 штаммов Lactobacillus spp. и E. faecium V1) не обладали антагонистической активностью к перечисленным выше индикаторным микроорганизмам (зоны задержки роста менее 3 мм). Исключение составляли 10 штаммов лактобацилл, выделенных из урогенитального тракта здоровых женщин. Эти бактерии ингибировали рост индикаторных культур, причем зоны задержки роста колебались в пределах 4-24 мм. Выраженной антагонистической активностью (с зонами задержки роста более 10 мм) обладали только бактерии, выделенные из пробиотиков: L. acidophilus EP 317/402, L. plantarum 8Р-А3, E. faecium L3, E. faecium M74, E. faecium SF68, а также клинические изоляты лактобацилл Z, 62 и 65. Обращало на себя внимание то, что большинство культур LAB проявляли максимальную антагонистическую активность по отношению к эшерихиям и стафилококкам, зоны задержки роста которых колебались в пределах 24-35 мм и 12-25 мм, соответственно. Кроме того было отмечено отсутствие антимикотической активности LAB. Исключение составляла культура L. plantarum 8P-A3, вызывающая образованию зон задержки роста грибов до 13 мм. В то же время, именно эта культура в отличие от других исследованных молочнокислых бактерий проявляла антагонистическую активность в отношении других штаммов лактобацилл и энтерококков, а также собственной культуры.

Метод штриховых посевов использовался лишь на первом этапе исследований, так как он позволяет изучать антимикробную активность лактобацилл и энтерококков только в отношении ограниченного числа индикаторных культур. При помощи этого метода было невозможно определить чувствительность стрептококков, псевдомонад и микоплазм к действию LAB, а также выявить статистически достоверные различия антагонистической активности, которые в ряде случаев при исследовании методом штриховых посевов были спорными.

1.2. Исследования методом двухслойного агара

Метод двухслойного агара был использован для изучения антимикробной активности тех культур, которые проявили выраженный анимикробный антагонизм при исследовании методом штриховых посевов. Преимущество предложенного нами варианта метода состоит, прежде всего, в возможности существенного расширения спектра индикаторных культур. Оказалось, что, изменяя состав верхнего слоя агара, можно исследовать антагонистическую активность LAB ко многим микроорганизмам, неспособным расти на средах, в основном предназначенных для роста лактобацилл. В результате, впервые в качестве индикаторных культур были использованы криптококки, микоплазмы, стрептококки различных групп. Важно, также, что для сравнительного исследования антимикробной активности был предложен количественный показатель МИКА. Это позволило провести сопоставление антагонистической активности молочнокислых бактерий по степени выраженности этого эффекта («силе»). Для сравнительного анализа были введены дополнительные количественные критерии, позволившие разделить индикаторные культуры на: 1) чувствительные (0-2,5 lg КОЕ/мл), 2) умеренно устойчивые (>2,5 4,5 lg КОЕ/мл) и 3) резистентные к действию антагонистов (>4,5 lg КОЕ/мл). Результаты сравнительного исследования антагонистической активности LAB по отношению к патогенным бактериям и грибам представлены в таблице1.

1.2.1. Антагонистическая активность LAB к стрептококкам и энтерококкам

Большое внимание было уделено действию LAB на бактерии родов Streptococcus и Enterococcus. В результате исследований показано, что максимальный антистрептококковый эффект LAB проявляли по отношению к СГА и СГG, промежуточное положение по чувствительности занимали СГС и CГB. МИКА молочнокислых бактерий по отношению к стрептококкам этих групп составили 1,19 lg КОЕ/мл; 2,35 lg КОЕ/мл, 2,66 lg КОЕ/мл и 4,15 lg КОЕ/мл, соответственно. В то же время, все энтерококки росли в присутствии большего количества колоний антагонистов (5,34 lg КОЕ/мл).

Наибольшую разницу в чувствительности к действию LAB удалось установить, анализируя особенности роста 10 штаммов S. pyogenes в присутствии различных молочнокислых бактерий. Показано, что все эти чувствительные к действию молочнокислых бактерий штаммы СГА существенно отличались по степени восприимчивости к действию LAB. Так, штамм S. pyogenes 3 обладал более высокой устойчивостью к действию всех энтерококков и лактобацилл. В то же время, штаммы 1 и 9 можно отнести к более чувствительным индикаторным культурам. Остальные штаммы стрептококков не отличались по чувствительности к действию использованных в работе LAB (p < 0,1).

Существенное значение имели эксперименты, в ходе которых впервые были выявлены особенности влияния двух штаммов LAB на морфологию стрептококков группы А (рис.1). Пробиотический штамм E. faecium L3 вызывал нарушение морфогенеза фимбриеподобных структур на поверхности S. pyogenes и способствовал образованию удлиненных клеток (коккообацилярной формы).

Штамм L. fermentum Z только нарушал характер деления исследуемых стрептококков, вызывая их полиморфизм, образование кокковидных и палочковидных клеток. Это дополняет наши представления о разнообразных механизмах действия LAB, доказывает высокую информативность электронно-микроскопического метода для изучения механизмов их действия.

Таким образом, полученные результаты предполагают использование пробиотических молочнокислых бактерий для профилактики и лечения инфекций верхних дыхательных путей и урогенитального тракта, вызванных СГА и СГС. По-видимому, эффективность лечебно-профилакических мер в этих случаях будет варьировать в зависимости от свойств культуры пробиотика и индивидуальной чувствительности возбудителя инфекционного заболевания к действию LAB.

Рис. 1. Влияние метаболитов культур E. faecium L3 и L. fermentum Z на ультраструктуру S. pyogenes 1 (16/49, серотип М4).

Электронная микроскопия, метод ультратонких срезов, увеличение 30000.

S. pyogenes 1, выросшие на поверхности двухслойного агара в присутствии в нижнем слое E. faecium L3 (A), L. fermentum Z (Б) и без LAB (В).

Таблица 1

Антагонистическая активность (МИКА, lg КОЕ/мл) LAB в отношении патогенных микроорганизмов

Штаммы LAB	L. mono- сytogenes EGD	S. aureus ATCC 25923*	S. pyogenes (n=10)**	S. agalactiae (n=10)**	Entero- coccus spp. (n=10)**	E.coli ATCC 25922*	P. aeru- ginosa ATCC 27853*	P. mirabilis E	Kl. pneumoniae E	C. albicans ATCC 665-853
E. faecium L3	0,88±0,05	3,34±0,22	1,07±0,06	3,52±0,02	5,28 ± 0,03	2,34±0,16	0,88±0,67	6,3±0,36	2,03±0,-4	6,31±0,39
E. faecium SF68	1,21±0,09	3,89±0,19	1,21±0,06	4,41±0,12	6,24±0,26	2,89±0,19	1,89±0,95	4,0±0,24	2,89±0,15	>7
E. faecium M74	2,48±0,18	4,3±0,03	1,58±0,-11	4,31±0,13	5,05±-0,35	3,51±0,07	2,74±0,18	3,5±0,13	2,04±0,12	>7
L..plantarum 8A-P3	0,5±0,03	2,5±0,02	0,88±0,12	3,66±0,02	4,17±0,23	1,33±0,08	0,54±0,12	0,25±0,15	2,33±0,14	3,61±0,18
L. acidophilus EP 312/407	1,2±0,06	2,37±0,04	1,33±0,08	4,33±0, 22	5,01±0, 45	1,76±0,05	1,57±0,27	2,44±0,15	3,76±0,19	>6,5
L. acidophilus Д № 75 и 76	2,5±0,09	3,68±0,07	1,35±0,08	4,88±0, 24	5,6±0, 41	2,26±0,09	1,26±0,06	3,4±0,20	2,26±0,11	>7
L. fermentum Z	1,88±0,04	3,53±0,08	1,12±0,08	4,12±0, 29	4,76±0, 32	2,50±0,07	2,50±0,13	3,83±0,23	3,53±0,21	5,17±0,31

Примечания: серым цветом выделены чувствительные культуры LAB ( МИКА <2,5 lg КОЕ/мл), подчеркнуты LAB с умеренной устойчивостью (2,5 <МИКА < 4,5 lg КОЕ/мл), устойчивые бактерии не выделены цветом (МИКА > 4,5 lg КОЕ/мл ).

Использованы штаммы, рекомендованные для определения чувствительности к антибиотикам, соответствующие критериям определения чувствительности бактерий и грибов к антибиотикам Национального комитета по клиническим лабораторным стандартам (NCCLS) 2006 года; ** - приведены средние арифметические данные по результатам исследования 10 штаммов стрептококков и энтерококков.

1.2.2. Антагонистическая активность LAB к стафилококкам

Установлено, что исследованные штаммы LAB обладают неодинаковой способностью влиять на рост и жизнеспособность S. aureus. Наибольшей антагонистической активностью по отношению к этим бактериям обладали штаммы L. acidophilus EP 317/402, L. plantarum 8Р-А3 и E. faecium L3. В меньшей степени ингибировали рост стафилококков штаммы E. faecium SF68 и M74, L. acidophilus Д № 75 и 76, а такж выделенные из влагалища штаммы лактобацилл Z и 62. Не обнаружено антистафилококкового эффекта культур E. faecium V1 и Lactobacillus sp. 64. Показано, что большей чувствительностью обладали штаммы S. aurous 209 и SH1, несколько меньшей - S. aureus ATCC 25923 и SH2 (p< 0,05). Средние МИКА для перечисленных штаммов составляли 4,2; 3,5 и 3,27lg К ОЕ/мл, соответственно. Интерес представляли наблюдения, касающиеся культуральных свойств S. aureus 209. Эти бактерии обладают ярко выраженной способностью вырабатывать золотистый пигмент. При воздействии субингибирующих концентраций (в 5-10 раз меньше МИКА) культур LAB, бактерии вырастали, однако пигментообразование не наблюдалось, в отличие от контрольных проб, в которых стафилококки не испытывали влияния молочнокислых бактерий (в нижний слой не были добавлены культуры антагонистов).

Несмотря на то, что вырабатываемый пигмент не рассматривается как фактор патогенности стафилококков, данный феномен показывает возможность выявления изменений физиологических свойств индикаторных микроорганизмов в результате воздействия метаболитов LAB, в ряде случаев важных с медицинской точки зрения.

1.2.3. Антагонистическая активность LAB к листериям

Используя метод двухслойного агара, были определены значения МИКА, характеризующие антилистериозную активность культур E. faecium SF68, L3 и M71, а также Lactobacillus spp. 8P-A3, EP 317/402, Z, Д № 75 и 76. Все они проявили себя как высокоактивные антагонисты, показатели МИКА которых колебались в пределах 0,5-2,5 lg КОЕ/мл. Несколько менее активны были лактобациллы (р <0,01), в том числе L. fermentum Z.

1.2.4. Антагонистическая активность LAB к грамотрицательным бактериям

Исследованные молочнокислые бактерии обладали высокой антагонистической активностью по отношению к штаммам кишечных палочек. МИКА колебались в пределах 1,3 -3,0 lg КОЕ/мл. В то же время, действие клинических изолятов лактобацилл и энтерококков было менее эффективным (МИКА 4,8-5,0 lg КОЕ/мл). Аналогичные результаты были получены при исследовании штаммов эшерихий, выделенных от детей при колиэнтеритах (10 штаммов) и коров при послеродовых эндометритах (5 штаммов). Анализ чувствительности отдельных штаммов E. coli к действию культур LAB не выявил статистически достоверных штаммовых различий, что может быть связано со сходными механизмами действия молочнокислых бактерий на эшерихии.

Антагонистическая активность LAB к псевдомонадам и клебсиеллам исследовалась на примере типовых штаммов. Значения МИКА молочнокислых бактерий по отношению к клебсиеллам были несколько выше (средние значения этого показателя были выше, p < 0,05). Кроме того, было показано, что максимальной активностью обладали по два пробиотических штамма энтерококков (L3 и M74) и лактобацилл (Д 75 и 76, 8Р-А3).

Все остальные штаммы молочнокислых бактерий обладали промежуточной активностью, за исключением малоэффективно действующих клинических изолятов Lactobacillus spp. 62 и 64. Важно, что практически все культуры пробиотических лактобацилл и энтерококков ингибировали рост P. aeruginosa ATCC 27853. В количестве 0,5-2,5 lg КОЕ/мл. Культуры L. fermentum Z и 62 в отличие от других LAB демонстрировали промежуточную активность (МИКА 3,5 и 3,8 lg КОЕ/мл, соответственно). Остальные клинические изоляты ингибировали рост данной индикаторной культуры только при МИКА выше 5,8 lg КОЕ /мл.

Исследования антагонистической активности LAB по отношению к протеям проводили отдельно от других индикаторных культур, так как бактерии рода Proteus при росте могут распространяться по всей поверхности плотной среды, демонстрируя «ползучий» рост. Показано, что максимальный ингибирующий эффект вызывала культура L. plantarum 8Р-А3, L. acidophilus EP 317/1402, L. fermentum Z, L. acidophilus Д № 75 и 76, значительно в меньшей степени (только при МИКА 4,0 lg КОЕ/ мл, р <0,05) ингибировали рост протеев пробиотические энтерококки (SF68, L3 и М74). Особый интерес представляла выявленная общая тенденция – способность влиять на культуральные свойства Proteus sp.. При воздействии на эти бактерии LAB в субингибирующих концентрациях (в 10 -100 раз меньше МИКА) культура P. mirabilis утрачивала способность к ползучему росту.

1.2.5. Антагонистическая активность LAB к микоплазмам

Микоплазмы являются одними из самых медленно растущих и требовательных к условиям роста бактерий. Возможно именно поэтому M. hominis 31.P ATCC 15488 оказались самой чувствительной из использованных индикаторных культур. МИКА всех LAB характеризующие их антагонистическую активность в отношении микоплазм колебались в пределах 0-2 lg КОЕ/мл.

При использовании субингибирующих концентраций молочнокислых бактерий существенно изменялась морфология колоний. Они вырастали в виде мелких колоний, не образуя на поверхности среду скопления бактерий, напоминающих яичницу «глазунью».

1.2.6. Антагонистическая активность LAB в отношении грибов

Показано, что практически все исследованные культуры молочнокислых бактерий обладали низкой антимикотической активностью, за исключением L. plantarum 8Р-А3, L. acidophilus EP 317/402 и L. fermentum Z. Индикаторные штаммы грибов проявляли умеренную устойчивость к действию данных LAB (МИКА < 4,5 lg КОЕ/мл). Обращало на себя внимание, что культура Cryptococcus neoformans росла на поверхности двухслойного агара медленнее и оказывалась более чувствительной к действию антагонистов (р <0,05).

В то же время, было отмечено, что добавление в нижний слой агара субингибирующих (в 10 раз меньше МИКА) концентраций антагонистов приводило к изменению характера размножения грибов рода Candida. Они утрачивали способность образовывать псевдомицелий.

В этом разделе работы наряду с LAB была использована контрольная культура антагонистов Saccharomyces boulardii П № 011277. Данный пробиотический штамм грибов проявил существенно большую антимикотическую активность (р < 0,01). Его показатели МИКА составляли менее 2,0 lg КОЕ/мл.

1.2.7. Антагонистическая активность молочнокислых бактерий друг к другу

Исследование способности LAB ингибировать рост друг друга позволяло изучать их влияния на микрофлору, в частности, взаимодействие с индигенными LAB в целях создания новых устойчивых консорциумов.

Как видно из данных, представленных в таблице 2, более выраженный антагонизм в отношении энтерококков и лактобацилл, а также собственных культур проявляли штаммы L. plantarum 8Р-А3 и L. acidophilus EP 317/402. Средние арифметические значения их показателей МИКА были 2,3 и 3,3 lg КОЕ/мл, соответственно.

Культура Z отличалась от других LAB сравнительно низкой антагонистической активностью ко всем лактобациллам и энтерококкам (средняя арифметическая МИКА составила 4,4 lg КОЕ/мл).

Таблица 2

Антагонистическая активность (МИКА, lg КОЕ/мл) штаммов LAB друг к другу

Антагонисты	Индикаторные культуры
	E. faecium L3	E. faecium SF68	E. faecium M74	L. plantarum 8Р-A3	L. acidophilus EP 312/407	L. fermentum Z
E. faecium L3	4,34±0,7	2,88±0,5	0,88±0,054	6,03±0,32	4,5±0,23	5,5±0,282
E. faecium SF68	2,89±0,15	2,89±0,15	0,89±0,045	5,39±0,27	4,89±0,25	3,89±0,20
E. faecium М74	3,31±0,23	2,87±0,17	0,87±0,044	4,89±0,24	5,6±0,21	4,04±0,24
L. plantarum 8Р-А3	2,04±0,12	1,54±0,10	0,54±0,027	5,54±0,28	3,54±0, 177	0,54±0,027
L. acidophilus EP 312/407	2,37±0,42	1,37±0,22	2,37±0,12	7,37±0,37	5±0,30	3,54±0, 21
L. acidophilus Д № 75 и 76	3,91±0,23	3,45±0,17	2,45±0,12	5,59±0,27	5±0,25	3,45±0,17
L. fermentum Z	5,83±0,35	3,9±0,20	3,9±0,2	>6,9	4,45±0,22	5, 45±0,27

Примечания: серым цветом выделены чувствительные культуры LAB (МИКА <2,5 lg КОЕ/мл), подчеркнуты LAB с умеренной устойчивостью (2,5 <МИКА < 4,5 lg КОЕ/мл), устойчивые бактерии не выделены цветом (МИКА > 4,5 lg КОЕ/мл).

1.2.8. Антагонистическая активность консорциумов LAB

В данной работе был проведен сравнительный анализ антимикробной активности моно - и смешанных культур молочнокислых бактерий. Показано, что при совместном культивировании энтерококков и лактобацилл, в зависимости от использованных комбинаций штаммов, суммарная антагонистическая активность может снижаться, оставаться неизменной или увеличиваться по силе и спектру. Это доказывает необходимость подбора бактериальных культур для создания симбиотических пробиотических продуктов и препаратов. В качестве примера симбиотического консорциума с высокой антимикробной активностью предложена комбинация штаммов E. faecium L3 и L. fermentum Z. Показано, что при совместном культивировании этих культур LAB суммарная антимикробная активность по отношению к стрептококкам групп А (рис. 2А) и В (рис. 2 Б); стафилококкам, листериям (Рис. 2 В) грамотрицательным бактериям и грибам (2Г) была больше, чем проявляли монокультуры антагонистов, или оставалась без изменений.

Как видно на рис. 2, штаммы антагонистов проявляли неодинаковую антимикробную активность. Как правило, более антагонистически активный штамм «компенсировал» недостаточную активность второго компонента консорциума. Примерами таких индикаторных культур могут быть штаммы S. pyogenes 5 и 7; S. agalactiae 11, 14 и 16; L. monocytogenes EGD; S. aureus, SH1, Sh 2 и 209; а также Proteus sp. и грибы рода Candida. Более сильным антагонистом, как правило, являлся штамм энтерококков. Однако в последних трех случаях антагонистическая активность монокультуры L. fermentum Z была выше E. fecium L3. Наличие взаимодополняющих спектров действия этих культур и увеличение антимикробной активности при их совместном культивировании, позволяет рассматривать эти молочнокислые бактерии как компоненты для создания нового пробиотического консорциума

1. 3. Исследование антимикробного действия LAB в жидкой среде

О симбиотических взаимоотношениях между L. fermentum Z и E. faecium L3 косвенно свидетельствуют и результаты совместного культивирования этих культур в средах МРС1 и молоке, с последующим высевом проб на селективные среды. Доказано, что данные бактерии не ингибируют рост друг друга. В то же время, совместное культивирование энтерококков с L. plantarum 8Р-А3 и L. acidophilus EP 317/402 вызывало замедление динамики роста E. faecium L3, существенное снижение их концентрации (более чем в 1000 раз) через 24 часа инкубации по сравнению с контрольными пробами (без лактобацилл) и при инкубировании с L. fermentum Z.

1. 4. Антимикробная активность супернатантов LAB

Антибактериальная активность супернатантов всех лактобацилл, полученных при их культивировании в бульоне МРС1, была больше, чем у супернатантов энтерококков, выращенных на этой среде. Она проявлялась существенным замедлением скорости роста индикаторных культур (L. monocytogenes, S. agalactiae, S. pyogenes) в фазу адаптации. Различия в проявлении антибактериальной активности были обнаружены только при определении минимальных ингибирующих разведений супернатантов, что явилось новым критерием для сравнения близких по антимикробной активности культур антагонистов. Показано, что все исследованные LAB не продуцировали перекись водорода, не имели существенных различий в продукции молочной кислоты и интенсивности подкислении среды при культивировании.

1.5. Антимикробные факторы культур E. faecium L3 и L. fermentum Z

Дальнейшие исследования антагонистически активных штаммов молочнокислых бактерий позволили нам выявить в геномах штаммов E. faecium L3 и L. fermentum Z гены, обеспечивающие продукцию ранее описанных другими авторами энтероцинов А и В, а также лактоцина F, соответственно. B культуре E. faecium L3 при помощи ОТ-ПЦР

- L3 - Z - L3+Z

Рис. 2. Антагонистическая активность (МИКА) консорциума и монокультур E. faecium L3 и

L. fermentum Z к СГА (А) и СГВ (Б) стафилококкам, листериям (В), грамотрицательным палочкам и грибам (Г).

Условные обозначения: 1, 3, 5, 7 и 9 - штаммы S. pyogenes, различных серотипов, М4 (1) или М49 (3, 5, 7 и 9); 11, 12, 14, 15 и 16 - штаммы S. agalactiae различных серотипов (58/59 Ia, 59/59 Ib, 10/84V, 13/63 III, 97/44 I ac); L.m. –Listeria monocytogenes EGD; E. c. – E. coli ATCC25922; St. a. – S. aureus ATCC 25923, 209, SH1 и Sh2; K.p. - Klebsiella pneumoniae ОШ; P.a. – Pseudomonas aeruginosa; Pr. m. – Proteus mirabilis Е; C.a. –C. albicans ATCC 885-653. Примечание: *- р<0,05

обнаружена экспрессии генов, обеспечивающих синтез специфического регуляторного феромона, самих энтероцинов и белков иммунитета. В супернатантах культуры энтерококков обнаружены пептиды. Последние были устойчивы к действию температуры, по величинам молекулярного веса соответствовали энтероцинам А и В, а также обладали характерной для рассматриваемых бактериоцинов антилистериозной активностью [Moreno M.R.F. et al., 2003; deVuyst L. and Leroy F, 2007].

1.6. Влияние феромонов на антибактериальную активность энтерококков

Особенно важно, что антибактериальная активность E. faecium L3 (в отличие от других энтерококков) существенно возрастала при его культивировании в бульоне BHI в присутствии специфического искусственно синтезированного феромона, способного по данным литературы стимулировать продукцию энтероцинов А и В. Аналогичный эффект был получен и с использованием синтетических более коротких дериватов данного регуляторного пептида (рис. 3). Это может быть связано с тем, что специфический феромон (Ent F) и его аналоги (EntF1 и EntF2) стимулируют в штамме E. faecium L3 экспрессию генов, обеспечивающих продукцию энтероцинов А и В.

Ent F Ent F1 EntF2

Рис. 3. Аминокислотные последовательности феромона и его аналогов.

EntF- полный аналог естественного феромона, Ent F1 и Ent F2 – более короткие дериваты EntF. Молекулярная масса пептидов Ent F, EntF1 и EntF2 составляла 2.7, 2.1 и 1.3 кДа, соответственно.

Кроме того, при исследовании супернатантов культуры E. faecium L3 обнаружены дополнительно фракции антимикробных пептидов с молекулярной массой 1,5-2,2 кДа, которые также обладали антибактериальной активностью по отношению к листериям, однако в большей степени ингибировали рост эшерихий.

1.7. Искусственно синтезированный энтероцин В и его аналоги

Для выяснения особенностей действия энтероцина В были синтезированы два пептида, последовательность одного из которых в точности соответствует зрелому (процессированному) энтероцину В, а второй представляет его укороченный дериват (В1). Аминокислотная последовательность этих пептидов представлена на рис. 4.

В1 В

Рис. 4. Структура искусственно синтезированных энтероцина В и его аналога (В1). Молекулярная масса пептидов В и В1 составляла 5,5 kДa и 3,2 кДa, соответственно.

Обнаружена способность этих пептидов ингибировать рост грамположительных бактерий L. monocytogenes и S. pyogenes. Впервые выявлены особенности воздействия энтероцина B на E. coli. Установлено, что рассматриваемый бактериоцин и его аналог в концентрации 2 мкг/мл вызывают образование зон задержки роста (10-15 мм) листерий, стрептококков и эшерихий, засеянных в виде газона на плотной питательной среде. Методом электронной микроскопии обнаружено повреждение цитоплазматической мембраны эшерихий, выращиваемых в присутствии данных пептидов. Это приводило к нарушению целостности бактериальных клеток и появлению множественных фрагментов цитоплазмы в межклеточном пространстве.

1.8. Исследование противовирусной активности LAB

Влияние супернатантов различных пробиотических культур на выраженность ЦПД вирусов оценивали, сравнивая количество измененных клеток при внесении потенциальных ингибиторов репродукции ВПГ-1 за 90 мин до инфицирования культуры клеток. Как показано на рис.5., вирусы одни или в присутствии супернатанта эшерихий вызывали существенное ЦПД с поражением 95-100% клеток. Добавление ацикловира полностью защищало клетки Vero от влияния ВПГ-1. Супернатанты энтерококков и лактобацилл в разведениях 1:5 ингибировали ЦПД на 30 и 88 %. Супернатанты штаммов E. faecium L3 и L. plantarum 8P-A3 действовали в больших разведениях (до 20 раз), однако эффект уменьшался по мере снижения концентрации метаболитов этих бактерий. Наиболее выраженное антивирусное действие оказывали факторы, содержащиеся в супернатанте энтерококков. В данном случае при использовании максимальной нетоксичной концентрации препарата существенно (в 10-100 раз) повышалась максимальная инфекционная доза вируса. Также ингибировал репродукцию ВПГ-1 и пептидный экстракт, полученный из супернатанта культуры E. faecium L3. Однако синтетический энтероцин В и его аналог В1 в относительно высоких концентрациях до 0,5 мг/мл не оказывал противовирусного эффекта.

Итак, результаты комплексного исследования антагонистической активности LAB по отношению к различным бактериям, а также грибам и вирусам выявили существенные различия в антимикробной активности культур лактобацилл и энтерококков в системе in vitro. Штамм L. planatarum 8Р-А3 проявлял максимальную антагонистическую активность к подавляющему большинству индикаторных микроорганизмов, однако в том числе и к самим молочнокислым бактериям. Несколько в меньшей степени была выражена способность ингибировать рост грамотрицательных и грамположительных бактерий у других пробиотических штаммов Lactobacillus spp. и Enterococcus spp.

Рис. 5. Влияние различных концентраций супернатантов пробиотических бактерий на репродукцию ВПГ-1

Условные обозначения: 1: 5, 1:10, 1: 20 – разведения супернатантов. *- р<0,05

Антимикробные свойства были выражены минимально у клинических изолятов лактобацилл и энтерококков, выделенных из урогенитального тракта и кишечника здоровых людей. Исключение составлял штамм L. fermentum Z, показатели антимикробной активности которого были сопоставимы с культурами, выделенными из пробиотических препаратов и продуктов. Одними из наиболее перспективных для дальнейшего изучения и практического использования в виде моно- и поликомпонентных пробиотических продуктов и препаратов оказались штаммы L. fermentum Z и E. faecium L3. Отличительной особенностью этих культур является наличие высокой антагонистической активности по отношению к патогенным микроорганизмам и практически полное отсутствие ингибирующего эффекта при совместном росте с другими LAB. Для изучения механизмов их антимикробного действия особенно важным оказалось выявление генов, обеспечивающих продукцию бактериоцинов в этих штаммах.

II влияние LAB на патогенные микроОрганизмы, макроорганизм и его микробиоту в системе in vivo

Существенной частью проведенного исследования являлась оценка антимикробного действия LAB в системе in vivo. В данной работе эксперименты были проведены на здоровых мышах и крысах, а также на моделях кишечного дисбиоза и урогенитальных инфекций.

1. Влияние LAB на здоровых животных и их микрофлору

Исследования на здоровых животных были важны для выяснения особенностей действия LAB при их использовании в профилактических целях, а также рассмотрения возможностей длительного приема пробиотиков.

1.1. Исследование острой и подострой токсичности LAB

Подводя итоги выполненных испытаний на мышах и крысах острой и подострой токсичности живых культур L. fermentum Z, L. acidophilus Д № 75 и 76, E. faecium L3 и L5, можно заключить, что 1) однократное введение (внутрибрюшинное, интравагинальное или пероральное) этих бактерий в количестве до 10 lg КОЕ/мл; 2) кратковременное (до 10 дней) и более продолжительное (14 и 35 дней) пероральное введение молочнокислых заквасок, содержащих 8 lg КОЕ/мл E. faecium L3, L5 и L. fermentum Z, не оказывает токсического воздействия на структуру и функцию основных органов и систем животных. Это соответствует требованиям, предъявляемым к пробиотическим штаммам бактерий.

1.2. Влияние внутрижелудочного введения E. faecium L5

Более детальное исследование влияния внутрижелудочного введения молочнокислой закваски, содержащей E. faecium L5, а также использованных в качестве контроля молока, фосфатного буфера или молочной закваски на основе эшерихий, не выявило существенных различий в аппетите и массе тела животных в течение 14 дней наблюдений. В этих экспериментах также не были обнаружены существенные сдвиги в составе микробиоты кишечника. В то же время были зарегистрированы более высокие показатели (р < 0,05) активности мальтазы эпителия тонкой кишки крыс, получавших эшерихии, по сравнению с животными, которым вводили молочнокислую закваску с энтерококками. Биохимические показатели сыворотки крови за период наблюдений практически не изменялись. Исключение составляли небольшое снижение уровня триглицеридов на фоне использования молочнокислых заквасок с энтерококками.

Статистически достоверных различий в уровне содержания иммуноглобулинов (IgA, IgM, IgG) сыворотки крови и слизи кишечника крыс выявлено не было. На 14 день исследований выявлена большая активность С3 фракции системы комплемента сыворотки крови животных, получавших пробиотические закваски, по сравнению контрольными группами. При этом, значения показателя Тlag, время до начала гемолиза, в группах крыс, которым внутрижелудочно вводили эшерихии и энтерококки (43± 13,1 с и 45,8 ±6,9 с), были меньше (р<0,05), чем у интактных животных и получавших молоко (56,7± 15,5 с и 57,1 ±17,8 с). При исследовании биоптатов слизистой кишечника крыс различных групп на 7 и 14 дни эксперимента не было обнаружено существенных различий уровнях экспрессии мРНК IL-1, IL-8, IL-18 и TLR2 рецепторов. Однако выявлены, индивидуальные особенности пробиотических бактерий при их введении здоровым крысам в течение 7 дней. Так штамм E. faecium L5 в отличие от E.coli M17 вызывал экспрессию мРНК провоспалительного цитокина IL-10.

1.2. Влияние интравагинального введения E. faecium L5

Введение здоровым крысам и мышам во влагалище высоких концентраций E. faecium L5 (до 10 lg КОЕ/мл) не изменяло состояние животных, не оказывало токсического действия на слизистую влагалища и матки животных. При гистологическом исследовании не было обнаружено признаков воспалительной реакции.

2. Экспериментальный дисбиоз

Для изучения влияния LAB на макроорганизм и его микрофлору при развитии дисбиотических состояний была разработана модель дисбиоза кишечника, вызванного внутрижелудочным введением антибактериальных препаратов (ампициллина и метронидазола). В качестве пробиотиков были использованы генетически маркированный штамм E. faecium L5, индигенные энтерококки, выделенные из кишечника здоровых крыс до антибактериального воздействия (аутопробиотики), и штамм L. fermentum Z. Отсутствие генов патогенности в геноме отобранных клонов индигенных Enterococcus spp. подтверждено при помощи ПЦР. Контрольным группам животных после воздействия антибиотиками вводили молоко. Наличие дисбиоза кишечника у крыс было подтверждено их клиническим состоянием (потеря аппетита, снижение веса, метеоризм, поносы и другими), а также результатами бактериологического анализа. Исследование фекалий крыс после воздействия антибиотиками выявило: снижение количества лактобацилл, бифидобактерий и энтерококков, а также увеличение числа патогенных и условно-патогенных бактерий и грибов рода Candida (рис. 6).

2.1. Коррекция дисбиза кишечника E. faecium L5, индигенными

энтерококками и L. fermentum Z

У всех крыс, получавших молочнокислые закваски, отмечалось более быстрое, по сравнению с животными контрольных групп, восстановление аппетита, нормализация стула и увеличение массы тела. Бактериологические исследования фекалий крыс, после воздействия пробиотическими заквасками с E. faecium L5, свидетельствовало о быстрой колонизации кишечника крыс генетически маркированными энтерококками. Это приводило к полной элиминации протея, клебсиелл, золотистых стафилококков и лактозонегативных или гемолитических эшерихий. Следует отметить, что при сравнении эффектов воздействии различных LAB на микрофлору кишечника крыс с дисбиозом выявлены существенные различия. Как видно на рис. 7., при введении молочнокислых заквасок с L. fermentum Z уменьшение числа клебсиелл происходило в меньшей степени, а при использовании индигенных энтерококков - даже увеличивалось. В то же время, указанные культуры молочнокислых бактерий способствовали более активной элиминации протея из кишечника животных.

*

*

* * * *

Рис. 6. Влияние антибиотиков на микрофлору кишечника здоровых крыс

Условные обозначения: Lb. - Lactobacillus spp., Bif. - Bifidobacterium spp., Ent. - Enterococcus spp., S. a. – Staphylococcus aureus, Pr. - Proteus spp., Kl. - Klebsiella spp., E. coli * - нетипичные эшерихии. *- р<0,05

Обращало на себя внимание то, что только культура E. faecium L5 вызывала снижение содержания эшерихий (в том числе и типичных). Культуры L. fermentum Z и индигенных Enterococcus spp. способствовали незначительному увеличению количества эшерихий в желудочно-кишечном тракте животных. Важно, что при введении животным молока происходило увеличение обсемененности желудочно-кишечного тракта крыс Klebsiella spp. и E. coli, а также только незначительное уменьшение содержания протея. Кроме того, на фоне введения молочнокислых заквасок отмечено более быстрое, по сравнению с контрольными пробами, увеличение числа лактобацилл, бифидобактерий и энтерококков в кишечнике животных (рис. 8). В большей степени этот эффект проявлялся при введении индигенных энтерококков. Молочнокислая закваска с L. fermentum Z не проявляла бифидо- и лактогенной активности, однако способствовала заселению кишечника крыс энтерококками быстрее, чем при введении животным молока или E. faecium L5. Таким образом, в серии экспериментов с введением различных молочнокислых заквасок крысам при дисбиозе кишечника впервые удалось выявить особенности антимикробного действия LAB в системе in vivo. Важно, что впервые в качестве аутопробиотиков было предложено использовать не лактобациллы и бифидобактерии, [Шендеров Б.А., 2003], а непатогенные энтерококки, выделенные из кишечника хозяина.

E. faecium L5 L. fermentum Z Enterococcus * ФБ Молоко

Рис. 7. Изменения содержания грамотрицательных бактерий в микробиоте кишечника крыс с дисбиозом после воздействии различными молочнокислыми заквасками.

Условные обозначения: ФБ – фосфатный буфер, Enterococcus * - индигенные энтерококки (аутопроботики). *- р<0,05

Рис. 8. Изменения содержания лактобацилл, бифидобактерий и энтерококков в микробиоте кишечника крыс с дисбиозом после воздействии различными молочнокислыми заквасками. Примечание: Enterococcus * - индигенные энтерококки (аутопробиотики).

2.2. Влияние LAB на метаболизм мальтозы в кишечнике

На примере животных, получавших терапию молочнокислой закваской, содержащей генетически маркированный штамм E. faecium L5 (группа А), было исследовано влияние LAB на метаболизм. В качестве контрольных групп использовались интактные крысы (группа К) и животные с дисбиозом, вызванном приемом антибиотиков, которые получали молоко (группа Б). Исследуя активность метаболических процессов, происходивших в слизи, химусе, эпителии разных участков тонкой и толстой кишки крыс с дисбиозом, нам удалось доказать участие энтерококков в углеводном обмене, в частности, ингибирование выработки мальтазы эпителиоцитами в проксимальных участках желудочно-кишечного тракта на фоне активного заселения этих участков тонкой кишки E. faecium L5. В химусе была отмечена большая активность мальтазы в пробах, взятых из толстой и проксимальных отделов тонкой кишки крыс группы А, по сравнению с контрольной группой Б. Наиболее вероятно, что энтерококки, обладающие свойством ферментировать мальтозу, активно участвовали в ее расщеплении и за счет механизмов обратной связи ингибировали выработку соответствующего фермента эпителиальными клетками тонкой кишки (рис. 9.). Аналогичный эффект, как уже было отмечено, был получен нами и при исследовании здоровых крыс. В качестве отрицательного контроля была использована культура E. coli M17, не ферментирующая мальтозу. Подобный эффект пробиотических культур ранее не был описан.

Химус Эпителий

* * *

- К – группа интактных крыс - Б – крысы с дисбиозом, получавшие молоко

- А – крысы с дисбиозом, получавшие молочнокислую закваску с E. fecium L5

Рис. 9. Активность мальтазы в эпителии слизистой оболочки и химуса кишечника крыс различных групп. Условные обозначения: 12 пк – двенадцатиперстная кишка, Т1 и Т2 – проксимальный и дистальный участки тощей кишки, П - подвздошная кишка, Тл – толстая кишка. *- р<0,05

2.3. Воздействие LAB на иммунную систему

На примере групп животных, получавших терапию молочнокислой закваской, содержащей генетически маркированный штамм E. faecium L5, было исследовано влияние LAB на иммунную систему организма. К моменту окончания эксперимента (8 день исследований) содержание IgM, IgА и IgG, а также активность C3 компонента комплемента сыворотки крови крыс с дисбиозом, получавших молочнокислую закваску с E. faecium L5 или молоко, было практически одинаковыми. Также не было обнаружено статистически достоверных различий в содержании IgG и IgA в слизи кишечника различных групп животных. Однако в слизи толстой кишки крыс, получавших пробиотическую закваску, концентрация IgM была ниже, чем в пробах, взятых от животных, получавших молоко. При исследовании биоптатов слизистых толстой и тонкой кишки крыс не было выявлено существенных различий в экспрессии мРНК IL-1, IL-18 и TLR2. Обращало на себя внимание то, что на 8 день эксперимента экспрессия мРНК IL-8 в биоптатах слизистой кишечника, была существенно выше у крыс контрольной группы, получавших молоко, у которых в отличие от опытной группы сохранялись клинико-лабораторные признаки дисбиотического состояния. Возможно, обнаружение увеличения продукции хемоатрактанта IL-8, в дальнейшем могут быть рассмотрены как маркер для неблагоприятного развития дисбиотического процесса. Следует отметить, что у всех крыс, получавших закваску с энтерококками, в отличие от контрольной группы, была выявлена повышенная экспрессия мРНК IL-10.

3. Экспериментальный вагинит

Для выявления эффектов местного введения пробиотической закваски, содержащей энтерококки, создана модель экспериментального вагинита у крыс. Синхронизацию полового цикла овариоэктамированных животных достигали введением эстрадиола, вызывающего длительную фазу течки. В этот период крысы становились более чувствительными к развитию инфекции.

3.1. Воздействие различных LAВ на микробиоту влагалища

В настоящем исследовании продемонстрирована способность E. faecium L5 ингибировать рост СГВ, эшерихий и стафилококков (рис. 10) и препятствовать колонизации этими микроорганизмами урогенитального тракта крыс. Элиминация патогенных бактерий из влагалища животных происходила под воздействием молочнокислой закваски у всех крыс не позднее 4 и 5 дня наблюдений, в отличие от животных из контрольных групп, которые получали молоко.

Культура энтерококков, устойчивых к эритромицину, в первые дни введения закваски в отделяемом из влагалища крыс не обнаруживалась. Затем обсемененность слизистых энтерококками нарастала, что по времени совпадало с постепенным снижением содержания во влагалище крыс патогенных микроорганизмов и увеличением количества лактобацилл и бифидобактерий (рис. 11). Наблюдаемые эффекты можно объяснить адаптацией E. faecium L5 к новым условиям существования. После элиминации возбудителей, чему прямо и косвенно способствовали пробиотические энтерококки, число последних увеличилось до 5,4 lg КОЕ/мл. Динамика процесса взаимодействия пробиотиков с резидентными представителями микробиоты влагалища и патогенными микроорганизмами ранее не описывалась.

E. faecium L5

и

….Streptococcus. agalactiae 219 .- Staphylococcus aures LB ---- E. coli IM Рис.10. Изменение показателей инфицированности патогенными бактериями влагалища крыс с экспериментальным вагинитом на фоне введения E. faecium L5 и молока.

Рис.11. Количество E. faecium L5 и Lactobacillus spp. в различные дни эксперимента.

3.2. Воздействие LAB на иммунную систему

Исследование иммунологических показателей крыс с экспериментальным вагинитом не выявило достоверных различий в уровне содержания иммуноглобулинов (IgM, IgA и IgG) и активности С3 компонента комплемента сыворотки крови животных, которым per vaginum в течение 5 дней вводили молоко или молочнокислую закваску. В то же время, во влагалищной слизи крыс, получавших молочнокислую закваску с энтерококками, были обнаружены меньшие, чем в контрольной группе, уровни содержания IgА и IgМ. При исследовании биоптатов слизистой влагалища крыс не было выявлено различий в уровне экспрессии мРНК IL-1 и IL-18. Однако в опытной группе животных, получавших молочную закваску с энтерококками, при помощи ОТ-ПЦР была обнаружена более выраженная экспрессия мРНК IL-10, чем в контрольной группе.

Выявленные особенности иммуномодулирующего действия энтерококков на слизистую урогенитального тракта крыс коррелируют с результатами, полученными при внутрижелудочном введении культуры E. faecium L5 здоровым животным и крысам с дисбиозом, вызванным приемом антибиотиков.

4. Послеродовой эндометрит у коров

Для оценки эффективности пробиотических препаратов при лечении острых послеродовых эндометритов крупного рогатого скота было организовано три группы животных, у которых наблюдались клинические признаки послеродовых урогенитальных инфекций. Для лечения коров двух опытных групп были использованы молочнокислые закваски на основе Lactobacillus acidophilus Д № 75 и 76 или E. faecium L3. Ежедневно на 1 или 2 дни после отела в течение 5 дней коровам внутриматочно вводили 100 мл закваски, содержащей 8,0 lg КОЕ/мл указанных LAB. Животных контрольной группы подвергали стандартному лечению: первые 3 дня внутриматочно вводили ихтиоловые палочки, затем с 5 дня до излечения антибиотики (тилозинокар или эндометромаг).

Как видно из результатов исследований, приведенных в таблице 3, использование молочнокислых заквасок оказалось более эффективным, чем стандартная терапия эндометрита ихтиолом и антибиотиками. Объяснением этому могут служить результаты бактериологических исследований проб маточного экссудата от животных, отобранных до начала их лечения. Показано, что основным этиологическим фактором развития эндометритов являлись эшерихии, стафилококки, протеи, псевдомонады, стрептококки, в отношении которых использованные культуры LAB в предыдущих сериях экспериментов проявляли выраженную антагонистическую активность. Лечение молочнокислыми заквасками, по-видимому, приводило к элиминации патогенных микроорганизмов. Доказательством этого являются результаты повторных выборочных бактериологических исследований. Так, например, после лечения в трех случаях наблюдалась элиминация эшерихий. Эффективность терапии эндометритов коров молочнокислыми заквасками, по-видимому, было связано, с подавлением патогенной и условно-патогенной микрофлоры вместе введения, а также стимуляцией регенерации эпителия слизистой оболочки матки. Нельзя исключить, что попадание в кровяное русло пробиотических лактобацилл и энтерококков через травмированную после родов поверхность слизистой оболочки матки приводило к дополнительной активации иммунного ответа. Об этом свидетельствовали увеличение общего пула IgM и IgA.

Таблица 3.

Результаты терапии послеродового эндометрита коров при лечении пробиотическими заквасками, содержащими LAB и химиопрепаратами

Группы коров с послеродовым эндометритом	Общее число животных	Число выздоровевших животных	Продолжительность лечения для выздоровевших животных (дни)	Инволюция половых органов (дни)
L. acidophilus Д №75 и 76	10	9	5	24
E. faecium L3	10	10	5	22
Ихтиол, тилозинокар (эндометромаг)	10	5	9	32-36

Заключение

В диссертации проведено сравнительное исследование антимикробных свойств молочнокислых бактерий (энтерококков и лактобацилл) в системах in vitro и in vivo. Предложены новые методы определения антагонистической активности LAB к широкому спектру бактерий, грибам и ВПГ. Предложены принципиально новые модели для изучения влияния молочнокислых бактерий на макроорганизм и его микрофлору. В работе прослеживаются особенности взаимодействия одних и тех же индикаторных бактерий (эшерихий, клебсиелл, протеев, стафилококков, стрептококков и энтерококков) и антагонистов (лактобацилл и энтерококков) в различных условиях. Эти условия не ограничиваются различными способами культивирования на питательных средах. Они дополняются наблюдениями за динамическими изменениями содержания этих бактерий в организме лабораторных животных (здоровых и с наличием патологии инфекционной природы). В результате работы предложена стратегия комплексного изучения биологических свойств культуры молочнокислых бактерий. Она включает в себя следующие необходимые этапы исследования LAB: 1) идентификацию (молекулярно- генетическую и на основании культуральных и биохимических свойств); 2) определение безвредности для макроорганизма при различных способах введения; 3) исследование антимикробного спектра действия в системе in vitro и in vivo; 4) выявление особенностей воздействия на иммунитет и 5) изучение влияния на морфофункциональные характеристики слизистых. Подробное исследование свойств пробиотических культур по предложенной схеме позволяет осуществлять их паспортизацию, а в дальнейшем индивидуальный подбор пробиотических препаратов с целью увеличения их эффективности при практическом использовании в медицине и ветеринарии.

Полученные результаты доказывают, что действие пробиотиков не сводится к простому заселению кишечника или урогенитального тракта, как это иногда представляется. Их влияние более сложно и многопланово. Оно включает конкуренцию с патогенной и условно-патогенной микрофлорой, стимуляцию роста резидентных представителей микробиоты, обеспечивающих колонизационную резистентность; взаимодействие с эпителием слизистых оболочек и мукозоассоциированной лимфоидной тканью (МАЛТ). Выявленные особенностей этих динамических процессов, зависящих от свойств отдельных культур молочнокислых бактерий или консорциумов, открывают новые перспективы для изучения свойств LAB с целью создания новых и усовершенствования уже имеющихся пробиотических пищевых продуктов и препаратов.

Выводы

1. Разработан алгоритм исследования свойств пробиотических культур, позволяющий подбирать штаммы молочнокислых бактерий с учетом особенностей их действия на микрофлору и макроорганизм в целях повышения эффективности их использования.

2. Сравнительное исследование лактобацилл и энтерококков, выделенных из различных источников, позволило охарактеризовать степень их антагонистической активности в отношении широкого круга микроорганизмов.

3. Впервые выявлена противовирусная активность продуктов метаболизма лактобацилл и энтерококков в системе in vitro.

4. Доказана возможность увеличения антибактериальной активности бактериоциногенных молочнокислых бактерий при добавлении в культуральную среду специфических синтетических феромонов.

5. Впервые показано, что синтетический энтероцин В и его аналог ингибируют рост стрептококков группы В и эшерихий, а характер повреждения поверхностных структур последних позволяет предположить общий механизм действия этого бактериоцина на грамположительные и грамотрицательные бактерии.

6. Установлено, что введение LAB крысам с дисбиозом кишечника способствует ускоренному восстановлению микробиоты, нормализации морфофункциональных показателей слизистой желудочно-кишечного тракта, а также исчезновению клинических симптомов. Динамика и характер изменений указанных параметров зависит от особенностей штаммов молочнокислых бактерий.

7. Аутопробиотические энтерококки обладают выраженным лакто- и бифидогенным эффектом, однако ингибируют рост патогенных бактерий в меньшей степени, чем пробиотические лактобациллы и энтерококки.

8. Доказана способность молочнокислых бактерий, вводимых интравагинально при экспериментальном вагините у крыс, вызывать быструю элиминацию патогенных бактерий (эшерихий, стафилококков, стрептококков группы В) и предотвращать развитие местной воспалительной реакции.

8. Впервые показано, что внутриматочное введение коровам LAB эффективно устраняет симптомы послеродового эндометрита, вызывает элиминацию патогенных микроорганизмов и стимулирует системный иммунный ответ (выработку Ig M и IgА, увеличивает лизоцимную активность сыворотки крови).

Список опубликованных работ по теме диссертации

Статьи:

1. Ермоленко Е.И. Антимикробная терапия урогенитальных инфекций, вызванных ассоциацией условно-патогенных бактерий // Сб. «Проблемы оптимизации образа жизни и здоровья», СПб, Изд-во СПб ГМУ, 1995.- С. 62-63.
2. Ермоленко Е.И. Исаков В.А., Ждан-Пушкина С.Х., Тец В.В. Количественная характеристика антагонистической активности лактобацилл// Журн. микробиол., 2004.- №5.- С. 94-98.

3. Ермоленко Е.И., Ждан-Пушкина С.Х., Суворов А.Н. Взаимодействие Candida albicans и Lactobacillus plantarum in vitro// Проблемы медицинской микологии, 2004, том 6.- №2.- C. 49-54.

4. Ермоленко Е.И., Воейкова А.В., Протасов В.А., Левченко С.К., Суворов А.Н.,Рукавишникова С.А. Влияние лактобактерий на рост Mycoplasma hominis in vitro// В Сб. «Современные направления в диагностике, лечении и профилактике заболеваний», СПб, 2004.- С. 337-341.

5. Воейкова А.В., ЕрмоленкоЕ.И., Протасов В.А., Левченко С.К., Суворов А.Н.,  Влияние лактобактерий на рост Mycoplasma hominis в системе in vitro// TERRA MEDICA nova.-2004.- № 3 (5).- C.1-5.
6. Марцинковская И.В., Ермоленко Е.И., Гончаров С.Б., Кузьмин В.А., Суворов А.Н. Изучение антимикробного действия пробиотических энтерококков in vivo// Российский ветеринарный журнал (мелкие домашние и дикие животные), 2006.- №3.- С. 15-18.
7. Колоджиева В.В., Яфаев Р.Х., Ермоленко Е.И., Суворов А.Н. Энтерококковые инфекции урогенитального тракта в условиях стационара и поликлиники//Амбулаторная хирургия, 2006. - №3(23).- C. 34-38.
8. Ермоленко Д.К., Ермоленко Е.И., Исаков В.А. Применение пребиотика при антибиотикотерапии больных с урогенитальным хламидиозом// Лечащий врач, 2006. - №9.-С. 86-87.
9. Ермоленко Е.И., Черныш А.Ю., Марцинковская И.В., Суворов А.Н., Тотолян А.А. Влияние пробиотических энтерококков на рост Streptococcus agalactiae // Журн. микробиол., 2007.-№5. - С.73-77.
10. Марцинковская И.В., Ермоленко Е.И., Кузьмин В.А. Пробиотические препараты для лечения послеродовых эндометритов крупного рогатого скота// Ветеринарная практика, 2007.- №2.- С. 56-59.
11. Ермоленко Е.И., Рыбальченко О.В. Антимикробное действие лактобацилл// Медицина XXI век. 2007- № 5 (6)- С. 41-48.
12. Yermolenko E., Suvorov A., Chernysh A., Aleshina G., Cvetkova E., Martsinkovskaya I., Totolyan A. Antagonistic activity of Enterococcus faecium L3 against different groups of pathogenic streptococci // Streptococci – New Insight into an Old Enemy. May 2006. - P. 363-366.
13. Ермоленко Е.И., Черныш А.Ю., Берлов М.Н., Тотолян А.А., Суворов А.Н. Антагонистическая активность энтерококков в отношении Streptococcus pyogenes// Вестник Санкт-Петерб. ун-та. Сер. 11, Медицина. 2008. – Вып. 1.- С.18-25.
14. Вершинин А.Е., Колоджиева В.В., Ермоленко Е.И., Грабовская К.Б., Климович Б.В., Суворов А.Н., Бондаренко В.М. Генетическая идентификация как метод для определения патогенных и симбионтных штаммов энтерококков// Журн. микробиол. 2008.- № 5.- С.83-87.
15. Ермоленко Д.К, Ермоленко Е.И., Исаков В.А. Лактулозосодержащие пребиотики как средство профилактики дисбиоза кишечника при длительной антибиотикотерапии // Вестн.С.-Петерб. ун-та. Сер. 11, Медицина 2008. - Вып. 4.- C. 109-118.
16. Бондаренко В.М., Суворов А.Н. Вершинин А.Е., Ермоленко Е.И., Колоджиева В.В., Грабовская К.Б., Климович Б.В. Различия по набору генов патогенноcти производственных и выделенных от больных штаммов энтерококков//Научно-практический журнал БИОпрепараты. Профилактика, диагностика, лечение, 2008.- №4 (32).- С. 3-6.
17. Заявка на изобретение № 2008133794 от 15.08.08 штамм Lactobacillus fermentum Z, содержащий в геноме гены, обеспечивающие выделение лактоцина F.
18. Ермоленко Е.И., Донец В.Н., Дмитриева Ю.В., Ильясов Ю.Ю., Суворова М.А., Громова Л.В. Влияние пробиотических энтерококков на функциональные характеристики кишечника крыс при дисбиозе, индуцированном антибиотиками // Вестн.С.-Петерб. ун-та. Сер.11, Медицина. 2009.Вып. 1.- C.157-167.
19. Ермоленко Е.И., Фураева В.А., Ермоленко К.Д., Исаков В.А.Угнетение репродукции вирусов простого герпеса пробиотическими бактериями в системе in vitro// Вопросы вирусологии, 2009.- № 6.- С. 34-39.
20. Ермоленко Е.И. Бактериоцины энтерококков: проблемы и перспективы. Обзор литературы//Вестн.С.-Петерб. ун-та. Сер. 11, Медицина. 2009. Вып. 3.- С. 184-201.
21. Симаненков В.И., Донец В.Н., Суворов А.Н., Ермоленко Е.И., Сундукова З.Р. Опыт экспериментального и доклинического изучения аутопробиотиков// Материалы Всероссийской конференции гастроэнтерологов юго-западного региона, 2009, Ростов - на - Дону,.25-27 апреля.- С. 83-87.
22. Бельтюков П.П., Абдурасулова И.Н., Тарасовой Е.А., Суворов А.Н., Захарова Е.Т., Соколов А.В., Карпенко М.Н., Ермоленко Е.И. Исследование влияния пробиотических эшерихий и энтерококков на иммунную систему здоровых крыс//Ученые записки Санкт-Петербургского государственного медицинского университета имени академика И.П.Павлова, 2009, Вып. 16.- № 2.- С. 54-58.
23. Ермоленко Е.И., Фураева В.А., Исаков В.А., Ермоленко Д.К., Суворов. А.Н. Противогерпетическая активность пробиотиков // Росс. журн. кож. и вен. бол. Прил.: Герпес., 2009. - №2. - С. 20-24.

Главы в книгах:

1. Ермоленко Е.И. Гефен Г.Е., Дмитриева Е.Н., Баранникова Т.А., Чуева М.Н. Некоторые особенности микробиоценоза влагалища у практически здоровых женщин в кн. «Клеточные сообщества».- СПб, Изд-во СПбГМУ, 1998.- С.130-148.
2. Ермоленко Е.И. Модели для изучения антимикробной активности пробиотиков// Глава в монографии «Модели для изучения антимикробной активности пробиотиков» в книге «Дисбиоз кишечника» под ред. Ткаченко Е.И., Суворова А.Н. - СПб, Изд-во «СпецЛит», 2007. - С. 144-148.
3. Исаков В.А., Ермоленко Д.К., Ермоленко Е.И. Герпесвирусные и папилломавирусные инфекция Глава в книге «Инфекции передаваемые половым путем» под редакцией Аковбяна В.А., Прохоренкова В.И., Е.В. Соколовского, Изд-во Медия Сфера, Москва, 2007.- С. 448-514.

Методические рекомендации:

1. Марцинковская И.В., Ермоленко Е.И., Кузьмин В.А., Ещенко И.Д. Применениепробиотических препаратов для лечения и профилактики эндометритов у коров, обусловленных условно-патогенной микрофлорой // Методические рекомендации.- Утверждены методическим советом ФГОУ ВПО «Санкт-Петербургская Государственная академия ветеринарной медицины», протокол №2 от 5 марта 2007, СПб, Изд-во СПбГАВМ, 2007. - C. 10.
2. Исаков В.А., Ермоленко Е.И., Ермоленко Д.К., Гончаров С.Б., Марцинковская И.В., Семенов А.Е. Герпесвирусные инфекции.Диагностика и лечение.- Сакнкт-Петербург- Великий Новгород, 2007.- 75 с.
3. Исаков В.А., Давидюк Д.С., Аспель Ю.В., Богданова Е.Ф. Ермоленко Е.И. Использование пробиотика лактофлор в клинической практике// Рекомендации для врачей.- Санкт-Петербург.- 2007.- 32 с.