Изучение, разработка и стандартизация микротест-системы для выявления и идентификации уреаплазм
На правах рукописи
Безруков Владислав Михайлович
Изучение, разработка и стандартизация
микротест-системы для выявления и идентификации уреаплазм
03.00.07 – микробиология
Автореферат диссертации на соискание ученой степени
кандидата медицинских наук
Москва – 2006
Работа выполнена в ГОУ ВПО Московская медицинская академия имени И.М. Сеченова Росздрава
Научный руководитель:
доктор медицинских наук,
профессор Быков Анатолий Сергеевич
Официальные оппоненты:
доктор медицинских наук,
профессор Воропаева Светлана Дмитриевна
доктор биологических наук Раковская Ирина Валентиновна
Ведущая организация:
ГУ Научно-исследовательский институт вакцин и сывороток имени
И.И. Мечникова РАМН
Защита состоится «___» ___________ 2006 года в ___ часов на заседании диссертационного совета Д.208.040.08 при Московской медицинской академии имени И.М. Сеченова по адресу: 119992, г. Москва, ул. Трубецкая, д. 8, стр. 2.
С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке ГОУ ВПО Московская медицинская академия имени И.М. Сеченова (117998, Москва, Нахимовский проспект, д. 49)
Автореферат разослан «___»___________ 2006 г.
Ученый секретарь
диссертационного совета
доктор медицинских наук,
профессор Миронов Андрей Юрьевич
ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ
Актуальность темы
Уреаплазменная инфекция продолжает оставаться одной из актуальных проблем клинической микробиологии. Возбудители - Ureaplasma urealyticum и Ureaplasma parvum часто колонизируют урогенитальную систему человека. Обычно наблюдается бессимптомное носительство уреаплазм среди клинически здоровых лиц. Вместе с тем, уреаплазменная инфекция может сопровождаться развитием патологических процессов, в числе которых негонококковый уретрит, хориоамнионит, преждевременные роды, поражение дыхательной системы и ЦНС у преждевременно родившихся детей, артриты у лиц со сниженным иммунитетом и др. (Гамова Н.А., 1993; D. Taylor-Robinson, 1996; Раковская И.В., 1999; M. Abele-Horn et al., 2000; C. Skevaki, D.A. Kafetzis, 2003). В связи с этим, существует необходимость в объективном и достоверном выявлении Ureaplasma spp. в клиническом материале.
Лабораторные методы исследований играют решающую роль в диагностике уреаплазменной инфекции вследствие отсутствия четких клинических проявлений, широкого распространения бессимптомного носительства и частого сочетания уреаплазм с другими инфекционными агентами. Несмотря на широкое использование в настоящее время молекулярно-биологических методов диагностики уреаплазменной инфекции, микробиологический метод сохранил позиции наиболее достоверного и информативного метода, позволяющего с высокой чувствительностью и специфичностью выявлять бактерии рода Ureaplasma, определять их количество в исследуемом клиническом материале, а также чувствительность выделенных штаммов к антибактериальным препаратам (K.B. Waites et al., 2001; Дмитриев Г.А., 2003).
Культивирование уреаплазм, чрезвычайно требовательных к составу питательных сред, связано с рядом трудностей, в числе которых отсутствие сред определенного состава, сложность состава сред, необходимость максимального соответствия состава питательным потребностям бактерий рода Ureaplasma, а также необходимость оценки ростовых свойств сред и их отдельных компонентов (Раковская И.В., 1999; K.B. Waites et al., 2001).
В настоящее время отмечается тенденция перехода от классических микробиологических исследований к современным технологиям анализа; при этом большее значение придается оптимизации, стандартизации, а также упрощению и автоматизации метода. Весьма перспективным является использование микротест-систем, избавляющих практических микробиологов от трудоемких работ и позволяющих получить стандартные, воспроизводимые результаты (Скала Л.З. и соавт., 2004).
Стремление к усовершенствованию и стандартизации микробиологического метода реализовано разработкой и внедрением в практику за рубежом ряда наборов для выявления и идентификации урогенитальных микоплазм, определения их количества и чувствительности к антибактериальным препаратам, в числе которых «Mycoplasma Lyo», «Mycoplasma IST» (bioMerieux, Франция); «Mycoplasma Duо», «Mycoplasma SIR» (Bio-Rad, Франция); «Mycofast All-In», «Mycofast Evolution 2», «Mycofast US» (International Microbio, Франция). Показано, перечисленные выше наборы обладают высокой диагностической эффективностью (M. Sillis, 1993; M. Abele-Horn et al., 1996; S.A. Poulin, R.B. Kundsin, 1997; Гладкова Н.С. и соавт., 1999; R. Aaltone et al., 2002; F.-C. Cheah et al., 2005). Однако в России эти диагностические наборы имеют ограниченное использование, прежде всего, в связи с их достаточно высокой ценой; некоторые из них недоступны вообще.
В нашей стране еще недостаточно решена проблема микробиологической диагностики уреаплазменной инфекции, хотя имеются питательные среды лабораторного изготовления для выявления Ureaplasma spp.; однако, производственный выпуск данных препаратов, разрешенных для использования в Российской Федерации, отсутствует.
В свете сказанного, несомненно важнейшей задачей является совершенствование микробиологического метода как основного, наиболее объективного и информативного метода диагностики уреаплазменной инфекции. Перечисленные выше предпосылки позволили сформулировать цель и определить задачи работы.
Цель исследования – разработка и стандартизация микротест-системы для выявления и идентификации Ureaplasma spp..
Задачи исследования
1. Разработать селективную питательную среду для культивирования Ureaplasma spp.. Изучить рост штаммов уреаплазм на предложенной среде. Оценить селективные свойства среды и пригодность для выявления уреаплазм в образцах клинического материала.
2. Разработать транспортную среду для сохранения жизнеспособности уреаплазм в образцах клинического материала.
3. Разработать метод оценки роста уреаплазм на основе измерения оптической плотности культур в процессе роста на предложенной питательной среде.
4. Разработать методику оценки ростовых свойств питательной среды для культивирования и выявления Ureaplasma spp. в лабораторных условиях.
5. Создать микротест-систему для выявления и идентификации Ureaplasma spp. и внедрить ее в практику здравоохранения.
6. Разработать методику оценки качества микротест-системы для выявления и идентификации Ureaplasma spp. в клинико-эпидемиологических испытаниях.
7. Разработать программу проведения государственных испытаний микротест-системы совместно с ГИСК им. Л.А. Тарасевича и Комитетом МИБП.
Основные положения, выносимые на защиту
1. Предложенная микротест-система для выявления и идентификации Ureaplasma spp. «Уреаплазма Микротест» обеспечивает стандартизацию микробиологического метода диагностики уреаплазменной инфекции.
2. Методы определения наиболее вероятного количества бактерий и полимеразной цепной реакции в режиме реального времени позволяют определить концентрацию уреаплазм в исследуемом материале.
3. Изменение оптической плотности среды в экспоненциальной фазе роста культуры Ureaplasma spp. в стандартных условиях культивирования отражает накопление жизнеспособных клеток уреаплазм.
4. Анализ кривых изменения оптической плотности среды в процессе роста культур тест-штамма в средах сравнения и испытуемой в стандартных условиях позволяет оценить ростовые свойства испытуемой среды.
5. Критерий диагностической эффективности U=U(P) позволяет в клинико-эпидемиологических испытаниях определить ценность микротест-системы «Уреаплазма Микротест», предназначенной для выявления и идентификации условно-патогенных бактерий рода Ureaplasma.
Научная новизна
В связи с необходимостью усовершенствования микробиологической диагностики уреаплазменной инфекции, нами разработаны селективная питательная среда для культивирования и выявления Ureaplasma spp. и транспортная среда для сохранения жизнеспособности уреаплазм в образцах клинического материала. На основе разработанных сред впервые предложена микротест-система для выявления и идентификации Ureaplasma spp. - «Уреаплазма Микротест».
Использование микротест-системы позволяет: 1) выявлять и идентифицировать бактерии рода Ureaplasma; 2) определять обсемененность исследуемого материала уреаплазмами, что важно для оценки их этиологической роли в развитии патологических процессов в урогенитальной системе; 3) оценивать чувствительность выделенных штаммов к антибактериальным препаратам, являющуюся основанием для рационального выбора антибактериальной терапии и одновременно дифференциально-диагностическим критерием идентификации (по отношению штаммов Ureaplasma spp. к антибиотикам групп макролидов и линкозамидов).
Впервые предложен оригинальный метод определения концентрации уреаплазменных культур в экспоненциальной фазе роста по измерению оптической плотности среды, что позволило разработать метод строгой оценки ростовых свойств питательной среды в условиях лаборатории и стандартизовать инокулят при определении чувствительности штаммов Ureaplasma к антибактериальным препаратам.
Впервые разработан метод оценки ростовых свойств питательной среды для культивирования и выявления Ureaplasma spp., основанный на анализе кривых изменения оптической плотности среды в процессе роста тест-штамма в средах сравнения и испытуемой.
Разработана программа клинико-эпидемиологических испытаний диагностической микротест-системы с использованием принципов доказательной медицины. Показана высокая диагностическая эффективность микротест-системы «Уреаплазма Микротест», предназначенной для выявления и идентификации условно-патогенных бактерий рода Ureaplasma.
Научно-практическая значимость
В теоретическом плане проведенные исследования расширяют представления о биологических свойствах бактерий рода Ureaplasma; позволяют оптимизировать методические подходы к определению количества уреаплазм в культурах и образцах клинического материала и стандартизовать процесс выявления и идентификации Ureaplasma spp..
Практическая значимость работы заключается в том, что разработана технология производства микротест-системы для выявления и идентификации Ureaplasma spp. «Уреаплазма Микротест». Разработаны и утверждены фармакопейная статья предприятия ФСП № 42-0115624405 на микротест-систему для выявления и идентификации Ureaplasma spp. «Уреаплазма Микротест»; инструкция по применению препарата № 01-041/135-05 и производственный регламент № 01897593-00805.
Получен патент 2265656 на разработанную питательную среду для выявления Ureaplasma spp. и способ диагностики.
Полученный фактический материал представляет интерес при конструировании препаратов для диагностики урогенитальных микоплазмозов другой этиологии, например, вызванных Mycoplasma hominis.
Апробация работы
Материалы диссертации доложены на 1-й Всероссийской конференции по вакцинологии «Медицинские иммунобиологические препараты для профилактики, диагностики и лечения актуальных инфекций» (Москва, 2004); 5-й Всероссийской научно-практической конференции «Генодиагностика инфекционных болезней» (Москва, 2004); научной конференции кафедры микробиологии с вирусологией и иммунологией ММА им. И.М. Сеченова (14 июня 2006 года, протокол № 29).
Публикации
По теме диссертации опубликовано 15 научных работ, в том числе 5 в центральной печати.
Структура и объем диссертации
Диссертация изложена на 176 страницах машинописного текста, иллюстрирована 18 рисунками и 39 таблицами; состоит из введения, обзора литературы, главы материалов и методов исследования, пяти глав собственных исследований, обсуждения результатов исследования, выводов, списка литературы и приложения. В работе использовано 39 отечественных и 223 зарубежных источников литературы.
СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ
МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ
В работе использовали штаммы микроорганизмов: 1) Ureaplasma spp. и Mycoplasma hominis коллекционные, из коллекции живых культур ГУ НИИ эпидемиологии и микробиологии им. Н.Ф. Гамалеи РАМН (U. parvum серотип 1, U. urealyticum серотип 8, M. hominis Н-34) и авторской коллекции штаммов урогенитальных микоплазм, выделенных от пациентов Клиники акушерства и гинекологии ММА им. И.М. Сеченова (U. parvum 455, 465, 468, 481; U. urealyticum 1Т, 2Т; M. hominis 199, 205, 233), а также свежевыделенные от пациентов Клиники акушерства и гинекологии ММА им. И.М. Сеченова; 2) коллекционные штаммы бактерий (Staphylococcus aureus, Streptococcus agalactiae, Enterococcus faecalis, Lactobacillus acidophilus, Neisseria gonorrhoeae, Escherichia coli, Proteus morganii, Proteus vulgaris, Proteus mirabilis), а также штамм Candida albicans из государственной коллекции патогенных микроорганизмов ГИСК им. Л.А. Тарасевича.
Для культивирования штаммов Ureaplasma spp. использовали питательную среду для выявления Ureaplasma spp. (Шипулин Г.А., Безруков В.М., 2004); стандартный бульон 10С (M.C. Shepard, C.D. Lunceford, 1978) и дифференциальный агар А7 (M.C. Shepard, C.D. Lunceford, 1976). Для культивирования штаммов M. hominis использовали стандартный бульон 10В (K.B. Waites et al., 2001). Коллекционные штаммы грамположительных и грамотрицательных бактерий, а также штамм Candida albicans культивировали на питательном агаре, приготовленном на основе сердечно-мозговой вытяжки.
Штаммы Ureaplasma spp. засевали в 10 мл питательной среды, инкубировали при температуре 37 оС в течение 16-20 часов. Затем 100 мкл культуры в экспоненциальной фазе роста (о чем свидетельствовало начало изменения цвета питательной среды с желтого на красный) засевали вновь в 10 мл среды роста, инкубировали при температуре 37 оС в течение 16-20 часов до момента начала изменения цвета среды. Подготовленные таким образом культуры уреаплазм находились в экспоненциальной фазе роста и содержали минимальное количество нежизнеспособных клеток.
Культивирование уреаплазм в жидкой питательной среде в стандартных условиях проводили в 96-луночных плоскодонных планшетах (Sarstedt, Германия) в объеме среды 250 мкл. Для предотвращения испарения среды, а также улетучивания и распространения аммиака, в лунки вносили по 70 мкл стерильного минерального масла. Оптическую плотность среды в процессе роста культур измеряли с помощью планшетного фотометра MRX (Dynex technologies, Inc., США) при длине волны 570 нм.
Штаммы Ureaplasma spp. также культивировали на дифференциальном агаре А7 при температуре 37 оС в атмосфере, содержащей 5% СО2, в течение 72 часов.
Штаммы M. hominis засевали в 10 мл бульона 10B и инкубировали при температуре 37 оС в течение 36-48 часов до момента изменения цвета среды с красного на малиновый.
Культуры коллекционных штаммов грамположительных и грамотрицательных бактерий и Candida albicans пересевали в пробирку и чашку Петри с питательным агаром и инкубировали при температуре 37 оС в течение 18-20 часов. Выросшие на питательном агаре культуры каждого штамма проверяли визуально на чистоту роста и отсутствие диссоциации и пересевали в пробирку со скошенным питательным агаром. После инкубации посевов при температуре 37 оС в течение 18-20 часов культуры штаммов смывали с поверхности агара стерильным 0,9% раствором натрия хлорида, доводили концентрацию микробной взвеси до 10 единиц по стандарту мутности, что соответствует примерно 109 клеток/мл. Полученные взвеси разводили стерильным 0,9% раствором натрия хлорида до концентрации 108 клеток/мл.
Для определения количества жизнеспособных клеток Ureaplasma spp. готовили серию 10-кратных (от 10-1 до 10-8) и 2-кратных (от 10-4 до 0,062510-4; от 10-5 до 0,062510-5; от 10-6 до 0,062510-6) разведений культуры уреаплазм в питательной среде. Каждое разведение вносили по 250 мкл в 10 лунок культурального планшета, в лунки добавляли по 70 мкл стерильного минерального масла. Планшеты инкубировали в термостате при температуре 37 оС в течение 72 часов. Затем подсчитывали в каждом ряду количество лунок, в которых произошло изменение цвета среды вследствие роста уреаплазм. Число цветообразующих единиц (ЦОЕ50) рассчитывали по методам L.J. Reed, H. Muench (1938) и B. Behrens, C. Karber (1935). Наиболее вероятное количество (НВК) бактерий рассчитывали по методу D.J. Finney (1952) и с использованием таблиц НВК (Дж. Мейнелл, Э. Мейнелл, 1967).
Определение чувствительности штаммов Ureaplasma spp. к антибактериальным препаратам проводили микрометодом серийных разведений в жидкой питательной среде. Для этого штаммы Ureaplasma spp., находящиеся в экспоненциальной фазе роста, культивировали при температуре 37 оС в течение 16-24 часов в 96-луночных планшетах под слоем минерального масла в 250 мкл питательной среды, содержащей доксициклин, эритромицин, кларитромицин, мидекамицин, джозамицин, азитромицин, линкомицин, клиндамицин, ципрофлоксацин и офлоксацин в концентрации 0,125; 0,25; 0,5; 1; 2; 4; 8; 16 и 32 мкг/мл и спирамицин в концентрации 40, 50 и 60 мкг/мл. Концентрация уреаплазм в среде составляла 104±0,2104 клеток/мл. Минимальную ингибирующую концентрацию антибактериального препарата определяли как наименьшую концентрацию препарата, ингибирующую рост (т.е. предотвращающую изменение цвета питательной среды) в течение 16-24 часов инкубации посевов в термостате.
Для идентификации Ureaplasma spp. методом ПЦР использовали систему олигонуклеотидных праймеров, специфичных для генов 16S рРНК Ureaplasma spp. и позволяющих идентифицировать вид уреаплазм (Безруков В.М. и соавт., 1998).
Определение количества копий генома Ureaplasma spp. проводили методом ПЦР в режиме реального времени (ПЦР-РВ) с использованием TaqMan-зондов. В качестве мишени для праймеров и TaqMan-зонда в геноме Ureaplasma spp. использовали участок гена 16S рРНК. Зонд с красителем Fam использовали для детекции ДНК Ureaplasma spp., зонд с красителем Joe – для детекции неконкурентного внутреннего контрольного образца. ДНК Ureaplasma spp. выделяли с помощью набора «ДНК-Сорб-АМ» (ЦНИИ эпидемиологии) из 100 мкл культуры с добавлением 1,0104 копий/мл неконкурентного внутреннего контрольного образца для оценки эффективности выделения и амплификации. ПЦР в режиме реального времени проводили с использованием набора «Ureaplasma species – FRT» (ЦНИИ эпидемиологии) в термоциклере с системой детекции флюоресцентного сигнала в режиме реального времени «Rotor Gene 3000» (Corbett Research, Австралия). Полученные данные – кривые накопления флуоресцентного сигнала по двум каналам – анализировали с помощью программного обеспечения Rotor-Gene Analysis Software v.6.0. Для количественной оценки содержания копий генома Ureaplasma spp. была приготовлена линейка калибраторов с концентрациями 2,5103; 2,5104; 2,5105 и 2,5106 копий/мл. Для оценки эффективности выделения и амплификации ДНК была приготовлена линейка калибраторов для внутреннего контрольного образца с концентрациями 1,0103; 1,0104 и 1,0105 копий/мл. Эффективность выделения ДНК и амплификации составляла 80-90%.
Для построения графиков зависимости оптической плотности среды от времени штаммы Ureaplasma spp., находящиеся в экспоненциальной фазе роста, разводили питательной средой и вносили по 250 мкл в лунки 96-луночного планшета, затем в каждую лунку добавляли по 70 мкл стерильного минерального масла. Планшеты инкубировали в термостате при температуре 37 оС. Измерение оптической плотности среды в процессе роста культур осуществляли с помощью планшетного фотометра при длине волны 570 нм в моменты времени 4, 17, 21, 24, 28, 30, 41 и 45 часов инкубации в термостате. Для каждого штамма через полученные экспериментальные значения оптической плотности среды строили кубический сплайн – кривую вида s(t)=a3t3+a2t2+a1t+a0, позволяющую точно соединять измеренные точки. Коэффициенты a0, a1, a2, a3 вычисляли для каждого промежутка между соседними замерами, исходя из условий совпадения сплайна с опытными данными и непрерывности самого сплайна и его первой и второй производных s'(t)=3a3t2+2a2t+a1 и s"(t)=6a3t+2a2 в точках замеров. Точка перегиба t* сплайна s(t) отвечала двум условиям: s"(t*)=0, s'(t*)0.
Результаты определения численности бактерий в исходной пробе, основанные на определении количества жизнеспособных клеток методами ЦОЕ50 и НВК и копий генома методом ПЦР-РВ, сравнивали с помощью критерия Блэнда–Альтмана (С. Гланц, 1999). Данные организовывали парами: (ПЦР-РВ – ЦОЕ50) и (ПЦР-РВ – НВК). Для каждого набора пар измерений вычисляли их разность и полусумму, затем для разностей находили среднее значение и стандартное отклонение. Среднее значение разностей характеризовало систематическое расхождение между методами, а стандартное отклонение разностей - степень разброса результатов. Оценкой значения измеряемой величины (численности бактерий) служила полусумма пары. Если во всех парах разности лежали в пределах двух стандартных отклонений от среднего значения, то с достоверностью 0,95 оба подхода давали одинаковые результаты, т.е. наблюдаемые между ними расхождения не являлись значимыми. Далее строили графики, в которых для каждого замера по оси абсцисс откладывалась полусумма результатов (ПЦР-РВ – ЦОЕ50) и (ПЦР-РВ – НВК), а по оси ординат – их разность. По виду графиков проверяли, зависит ли расхождение от значения измеряемой величины.
РЕЗУЛЬТАТЫ СОБСТВЕННЫХ ИССЛЕДОВАНИЙ
Разработка питательной среды для выявления Ureaplasma spp.
Для культивирования и выявления Ureaplasma spp. в образцах клинического материала необходим комплекс сред, состоящий из двух компонентов: основного - питательной среды, предназначенной для обеспечения оптимальных условий для роста бактерий рода Ureaplasma; и вспомогательного - транспортной среды, назначение которой заключается в обеспечении оптимальных условий для сохранения жизнеспособности Ureaplasma spp. в образцах клинического материала, разведении исследуемого клинического материала для устранения (или снижения) эффекта ингибиторов роста уреаплазм и предотвращения размножения в образцах сопутствующей микрофлоры.
При разработке питательной среды для культивирования и выявления уреаплазм учитывали следующие их биологические свойства: 1) сложные питательные потребности вследствие простоты организации и ограниченных биосинтетических возможностей; 2) высокую требовательность к составу питательной среды; 3) потребность для роста в холестероле; 4) уреазную активность и потребность для роста в мочевине; 5) рост в жидких питательных средах без помутнения; 6) устойчивость к антибиотикам, ингибирующим синтез клеточной стенки бактерий, а также к полимиксинам, линкомицину и амфотерицину В.
Питательная среда для культивирования и выявления Ureaplasma spp. в образцах клинического материала должна максимально соответствовать следующим требованиям: 1) обеспечивать рост «всего своего», т.е. всех штаммов уреаплазм; 2) полностью подавлять рост «всего чужого», т.е. сопутствующих микроорганизмов. В соответствии с этим основными направлениями разработки являлись улучшение ростовых и повышение селективных свойств среды.
Решение поставленной задачи возможно при выборе оптимальных условий: 1) состава основы среды; 2) источников факторов роста уреаплазм; 3) концентрации лошадиной сыворотки; 4) набора и концентрации антибиотиков, обеспечивающих селективные свойства среды; 5) рН-индикатора, необходимого для визуализации роста уреаплазм.
При выборе основы среды и источников факторов роста предпочтение отдавалось стандартизованным компонентам, позволяющим уменьшить вариации ростовых свойств различных серий среды. В качестве основы питательной среды использовали регламентированные в производстве компоненты питательных сред, применяемые для культивирования наиболее требовательных микроорганизмов – сердечно-мозговую вытяжку (20 г/л) и триптозу (10 г/л) (Difco Manual, 1998). В качестве источников низкомолекулярных веществ, необходимых для роста уреаплазм, использовали дрожжевой экстракт (3 г/л) (Difco Manual, 1998) и среду 199 (4,95 г/л) (J.F. Morgan et al., 1950). Содержание лошадиной сыворотки в питательной среде увеличили до 25% с целью восполнения дефицита некоторых факторов, необходимых для роста уреаплазм, и повышения буферной емкости среды.
В качестве селективных добавок использовали антибиотики, не влияющие на рост Ureaplasma spp., но активные в отношении различных бактерий и грибов - ампициллина натриевую соль (1 г/л), ванкомицина гидрохлорид (0,05 г/л), полимиксина В сульфат (0,01 г/л), линкомицина гидрохлорид (0,03 г/л) и амфотерицин В (0,01 г/л).
В качестве рН-индикатора использовали феноловый красный (0,05 г/л), поскольку изменение цвета культуральной среды в процессе роста уреаплазм происходило четко на фоне желтого собственного цвета среды и в одной области спектра, что позволяло регистрировать изменение оптической плотности среды с помощью спектрофотометра.
Содержание мочевины в питательной среде составляло 0,5 г/л, L-цистеина гидрохлорида – 0,125 г/л; значение рН среды в пределах 6,1-6,3.
Известно, что уреаплазмы чрезвычайно чувствительны к неблагоприятным условиям окружающей среды. Для обеспечения сохранения жизнеспособности уреаплазм в исследуемом материале нами была создана транспортная среда, являющаяся производной питательной среды. Транспортная среда отличается от питательной отсутствием мочевины и линкомицина гидрохлорида. Транспортная среда обеспечивает сохранение жизнеспособности уреаплазм при температуре 18-23 оС до 5 часов и при температуре 2-8 оС до 96 часов.
Предложен способ применения разработанных сред, предполагающий внесение исследуемого клинического материала в транспортную среду, приготовление серии разведений образца в питательной среде, культивирование в 96-луночных планшетах под слоем минерального масла. Выделение культуры уреаплазм основано на создании условий, при которых выделяемый микроорганизм количественно преобладал в накопительной культуре. Это было достигнуто селективной обработкой исследуемого материала антибиотиками в транспортной среде и в процессе инкубации посевов в термостате, а также последовательным разведением материала в питательной среде до содержания единичных (или одной) клеток микроорганизмов в объеме среды.
Рост Ureaplasma spp. в питательной среде сопровождается изменением цвета среды с желтого на красный, без помутнения (рис. 1).
Одноэтапные выделение и идентификация бактерий рода Ureaplasma основаны на следующих культурально-биохимических свойствах: 1) росте в богатой питательной среде, содержащей лошадиную сыворотку; 2) уреазной активности; 3) росте без помутнения культуральной среды; 4) устойчивости к антибиотикам, ингибирующим синтез клеточной бактерий (ампициллину, ванкомицину), а также к полимиксину В, линкомицину и амфотерицину В.
Изучение ростовых и селективных свойств разработанной питательной среды, проведенное на чистых культурах микроорганизмов показало, что среда обеспечивала рост всех исследованных коллекционных и свежевыделенных штаммов Ureaplasma spp. и ингибировала рост штаммов M. hominis, а также других представителей микрофлоры (табл. 1).
Рис. 1. Посев образцов клинического материала в питательную среду для выявления Ureaplasma spp.. 1, 3, 4, 6-8, 10, 11 – есть рост уреаплазм; 2, 5, 9, 12 – отсутствует рост уреаплазм.
Таблица 1
Результаты исследования ростовых и селективных свойств питательной среды для культивирования и выявления Ureaplasma spp. в образцах клинического материала при посеве чистых культур микроорганизмов
| Наименование микроорганизмов | Количество штаммов | Исходная концентрация в среде, кл/мл | Количество штаммов, выросших в питательной среде |
| Ureaplasma spp. | 28 | 104 | 28 |
| Mycoplasma hominis | 8 | 105 | 0 |
| Neisseria gonorrhoeae | 1 | 106 | 0 |
| Enterococcus faecalis | 1 | 106 | 0 |
| Escherichia coli | 1 | 106 | 0 |
| Proteus morganii | 1 | 106 | 0 |
| Proteus vulgaris | 1 | 106 | 0 |
| Proteus mirabilis | 1 | 106 | 0 |
| Staphylococcus aureus | 1 | 106 | 0 |
| Streptococcus agalactiae | 1 | 106 | 0 |
| Lactobacillus acidophilus | 1 | 106 | 0 |
| Candida albicans | 1 | 106 | 0 |
В то же время, при посеве чистых культур микроорганизмов на питательную среду сравнения (10С) наблюдался рост Escherichia coli, Proteus spp. и Candida albicans, сопровождавшийся выраженным помутнением среды и формированием придонного осадка. Рост Proteus spp. сопровождался также изменением цвета среды с желтого на красный.
Вместе с тем, при посеве образцов клинического материала в разработанную среду в сравнении со стандартной средой 10C наблюдали увеличение количества выделенных штаммов Ureaplasma spp. и значительное снижение роста сопутствующих микроорганизмов (табл. 2, 3).
При посеве в разработанную питательную среду всех 87 образцов клинического материала, которые были положительными в ПЦР с праймерами, специфичными для генов 16S рРНК Ureaplasma spp., наблюдался рост уреаплазм. Все выросшие культуры являлись культурами Ureaplasma spp.. Доказательством этого являлись положительный результат в ПЦР с праймерами, специфичными для генов 16S рРНК уреаплазм, и рост на агаре А7 с образованием мелких (порядка 20-60 мкм), с характерной морфологией, темно-коричневых колоний (положительный уреазный тест).
Таблица 2
Рост Ureaplasma spp. при посеве клинического материала на известной (10C) и предлагаемой среде для культивирования и выявления Ureaplasma spp.
| Питательная среда | Количество произведенных посевов | Количество образцов, положительных в ПЦР | Количество выделенных культур |
| 10C | 197 | 87 | 76 |
| предлагаемая среда | 197 | 87 | 87 |
Таблица 3
Рост сопутствующих микроорганизмов при посеве клинического материала на известной (10C) и предлагаемой среде для культивирования и выявления Ureaplasma spp.
| Питательная среда | Количество произведенных посевов | Количество образцов, в которых наблюдался рост сопутствующих микроорганизмов |
| 10C | 197 | 42 |
| предлагаемая среда | 197 | 1 |
При этом из 87 положительных в ПЦР образцов на стандартной среде 10C выделено только 76 культур уреаплазм. При посеве 42 образцов клинического материала наблюдался рост сопутствующих микроорганизмов, проявившийся в выраженном помутнении среды и образовании придонного осадка. Признаки роста сопутствующих микроорганизмов на разработанной нами среде были только при посеве только 1 образца.
Кроме того, рост Ureaplasma spp. на разработанной питательной среде наблюдался при большем разведении исследуемого материала, что свидетельствовало о более высокой ее чувствительности (табл. 4).
Таблица 4
Рост Ureaplasma spp. при посеве клинического материала в разных разведениях на известной (10C) и предлагаемой среде для культивирования и выявления Ureaplasma spp.
| Разведение исследуемого материала | Количество образцов с ростом Ureaplasma spp. на среде 10C | Количество образцов с ростом Ureaplasma spp. на предлагаемой среде |
| 10-1 | 76 | 87 |
| 10-2 | 76 | 87 |
| 10-3 | 69 | 87 |
| 10-4 | 50 | 72 |
Таким образом, использование предложенной питательной и транспортной среды позволяет с высокой эффективностью выявлять бактерии рода Ureaplasma в образцах клинического материала.
Количественная оценка роста бактерий рода Ureaplasma в жидкой питательной среде
В процессе разработки питательной среды для культивирования и выявления Ureaplasma spp. мы столкнулись с необходимостью количественного учета роста уреаплазм. Одной из задач нашего исследования являлось определение концентрации бактерий в культурах Ureaplasma spp., выращенных в разработанной питательной среде. Определение количества клеток в культурах уреаплазм необходимо для оценки ростовых свойств питательной среды, а также определения чувствительности штаммов Ureaplasma spp. к антибактериальным препаратам. Кроме того, определение количества условно-патогенных бактерий рода Ureaplasma в образцах клинического материала необходимо для установления их этиологической роли в патологии человека.
Количественная оценка роста Ureaplasma spp. сопряжена с определенными трудностями, так как многие из методов определения концентрации бактериальных культур неприменимы в отношении уреаплазм.
Мы сопоставили два подхода к нахождению численности бактерий рода Ureaplasma, основанные на определении количества жизнеспособных клеток и копий генома.
Для определения количества жизнеспособных клеток уреаплазм исследуемый образец разводили в питательной среде до такой степени, чтобы при взятии пробы из образца бактерии могли как оказаться, так и не оказаться в ней (рис. 2). Значения концентрации получали путем статистического анализа экспериментальных результатов. Нами были испытаны два метода расчета численности жизнеспособных клеток Ureaplasma spp.: 1) метод определения наиболее вероятного количества (НВК) бактерий, примененный ранее для оценки количества нетребовательных к условиям культивирования микроорганизмов (Дж. Мейнелл, Э. Мейнелл, 1967); 2) метод 50% дозы цветообразующих единиц (ЦОЕ50) со статистической обработкой результатов по L.J. Reed, H. Muench (1938) и B. Behrens, C. Karber (1935).
Рис. 2. Серия последовательных 10-кратных (а) и 2-кратных (б) разведений для определения количества жизнеспособных клеток U. parvum 465.
Количество копий генома уреаплазм определяли методом полимеразной цепной реакции в режиме реального времени (ПЦР-РВ).
Для различных штаммов Ureaplasma spp. в экспоненциальной фазе роста результаты, полученные методами НВК, ЦОЕ50 и ПЦР-РВ достаточно близки (табл. 5). Для уточнения того, насколько хорошо это совпадение, мы применили критерий Блэнда-Алтмана (С. Гланц, 1999). Выяснилось, что достоверностью 0,95 методы НВК и ЦОЕ50 дают те же результаты, что и ПЦР-РВ.
Таблица 5
Накопление клеток уреаплазм по данным трех методов исследования
| Штамм уреаплазм | Метод | Накопление клеток на время инкубации | Количество клеточных делений за 4 часа | Время генерации, часов | |
| 17 часов | 21 час | ||||
| 2Т | ПЦР-РВ | 1,1·106 | 2,4·106 | 2,18 | 1,83 |
| НВК | 1,0·106 | 2,2·106 | 2,20 | 1,82 | |
| ЦОЕ50 | 1,0·106 | 2,1·106 | 2,10 | 1,90 | |
| 455 | ПЦР-РВ | 5,0·105 | 1,1·106 | 2,20 | 1,82 |
| НВК | 4,0·105 | 9,0·105 | 2,25 | 1,78 | |
| ЦОЕ50 | 4,4·105 | 8,9·105 | 2,02 | 1,98 | |
| 465 | ПЦР-РВ | 1,8·105 | 4,0·105 | 2,22 | 1,80 |
| НВК | 1,8·105 | 3,8·105 | 2,11 | 1,90 | |
| ЦОЕ50 | 2,1·105 | 4,3·105 | 2,04 | 1,96 | |
| 481 | ПЦР-РВ | 8·105 | 1,7·106 | 2,13 | 1,87 |
| НВК | 7,8·105 | 1,7·106 | 2,19 | 1,82 | |
| ЦОЕ50 | 1,0·106 | 2,1·106 | 2,10 | 1,90 | |
Таким образом, примененные для Ureaplasma spp. методы НВК бактерий и ПЦР-РВ позволяли определить концентрацию уреаплазм в исследуемых образцах. Использование метода серийных разведений с соответствующей статистической обработкой дало надежный способ количественного определения бактерий рода Ureaplasma, позволяющий проводить дальнейшую идентификацию и определение чувствительности штаммов уреаплазм к антибактериальным препаратам, а также оценивать ростовые свойства разных серий разработанной нами питательной среды и отдельных ее компонентов. Определение числа жизнеспособных клеток методами НВК и ЦОЕ50 более пригодно к использованию в практических лабораториях. При этом метод ЦОЕ50 требует математических расчетов; в то время как для нахождения НВК бактерий созданы таблицы (Дж. Мейнелл, Э. Мейнелл, 1967), что позволяет оценивать концентрацию уреаплазм, не прибегая к сложным вычислениям.
Нами предложены стандартные условия культивирования. Стандартные условия обеспечиваются культивированием в 96-луночных планшетах, лунки которых имеют одинаковые размеры; в одинаковом объеме среды (в 250 мкл); под слоем минерального масла, предотвращающего улетучивание аммиака и испарение культуральной среды. Благодаря использованию стандартных условий культивирования нами были получены данные, позволяющие предположить, что изменение ОП среды в процессе роста культур Ureaplasma spp. может количественно отражать накопление клеток уреаплазм.
Изучение взаимосвязи ОП среды и количества накопленных бактериальных клеток легло в основу разработки спектрофотометрического экспресс-метода определения концентрации культур Ureaplasma spp. в процессе их роста.
Показанные на рис. 3 и 5 графики изменения ОП среды в процессе роста различных штаммов Ureaplasma spp. в жидкой питательной среде, независимо от их начальной концентрации, имели типичный ступенькообразный вид и состояли из 3-х фаз: 1) длительной латентной фазы с низким постоянным значением ОП; 2) сменяющей ее короткой фазы экспоненциального роста ОП; 3) фазы замедления роста и выхода на высокий уровень ОП, далее почти не меняющийся. Кривая изменения ОП имела характерную точку – точку перегиба, до которой ОП росла с ускорением, а после нее – с замедлением, что соответствовало переходу от второй фазы к третьей. Форма кривой изменения ОП среды в процессе роста не зависела от посевной дозы, и соответственно, времени культивирования. На рис. 3 видно, что значения ОП в точках перегиба кривых, соответствующих разным разведениям, отличались незначительно, но моменты точки перегиба были существенно различны. Зависимость момента перегиба кривой изменения ОП среды от логарифма разведения культуры показана на рис. 4; эта зависимость линейная, что свидетельствовало о том, что характер роста ОП вплоть до этого момента действительно близок к экспоненциальному.
| Рис. 3. Изменение оптической плотности среды в процессе роста штамма U. urealyticum 2Т в разведениях 10-1 (1), 10-2 (2), 10-3 (3), 10-4 (4). Исходная концентрация уреаплазм составляла 106 клеток/мл. | Рис. 4. Зависимость момента перегиба кривой изменения оптической плотности среды в процессе роста штамма U. urealyticum 2Т от логарифма разведения культуры. |
Мы использовали два подхода для изучения накопления бактерий в процессе роста культур Ureaplasma spp., основанные на определении количества: 1) жизнеспособных клеток методами ЦОЕ50 и НВК; 2) копий генома методом ПЦР-РВ. При культивировании Ureaplasma spp. в питательной среде наблюдалась последовательная смена фаз. Графики накопления жизнеспособных клеток штаммов Ureaplasma spp. (при условии, если исходные культуры находились в экспоненциальной фазе роста) имели типичный вид и включали 3 основные фазы развития бактериальных популяций (рис. 6): 1) фазу экспоненциального роста, характеризующуюся максимальной скоростью накопления клеток и увеличением численности в геометрической прогрессии; 2) короткую стационарную фазу (всего 4 часа) – фазу максимального накопления в культуре жизнеспособных клеток (для разных штаммов Ureaplasma spp. в пределах 1,2·106-2,8·106 клеток/мл); 3) фазу отмирания с резким снижением жизнеспособности культуры (за 12 часов количество жизнеспособных клеток снижалось более, чем в 104 раз).
График накопления копий генома Ureaplasma spp. в процессе роста культуры, показанный на рис. 6, состоял из 2-х фаз: 1) фазы экспоненциального роста, практически идентичной аналогичной фазе накопления жизнеспособных клеток; 2) стационарной фазы, характеризующейся максимальным накоплением копий генома, которое соответствует максимальному накоплению жизнеспособных клеток, но без снижения в фазе отмирания культуры.
| Рис. 5. Изменение оптической плотности среды в процессе роста штаммов U. parvum 455, 468, 481 и U. urealyticum 2Т. Исходная концентрация штаммов 455 – 1,2104; 468 - 3104; 481 - 2104; 2Т - 4103 клеток/мл среды. | Рис. 6. Накопление жизнеспособных клеток (НВК) и копий генома (ПЦР-РВ) штамма U. parvum 455. |
В экспоненциальной фазе роста уреаплазменных культур деление клеток происходило синхронно с репликацией ДНК, и соответственно, содержание копий генома отражало накопление жизнеспособных клеток. Полное соответствие этих двух показателей позволило сделать вывод о том, что одна ЦОЕ, выявляемая с помощью методов НВК или ЦОЕ50, соответствовала одной клетке Ureaplasma spp.. Кроме того, по-видимому, в процессе роста культур уреаплазм не происходило образования «многоядерных» клеток, содержащих несколько нуклеоидов.
Данные проведенного нами сопоставления изменения ОП среды и накопления клеток в процессе роста Ureaplasma spp. представлены в табл. 7. Латентную фазу продолжительностью 14-17 часов с низким значением ОП среды (в пределах 0,52-0,54) наблюдали от момента внесения уреаплазм в питательную среду до накопления в культуре не менее 2·105 клеток/мл. Затем происходил выраженный рост ОП: латентная фаза сменялась фазой экспоненциального роста ОП. Фаза экспоненциального роста ОП до момента максимальной скорости изменения ОП (точки перегиба) несущественно отличалась среди различных штаммов. При дальнейшем увеличении в процессе роста культуры ОП до значения в пределах 1,0-1,2, соответствующего перегибу кривой изменения ОП, скорость накопления клеток снижалась и культура вступала в стационарную фазу роста. Таким образом, экспоненциальный рост ОП среды наблюдался при накоплении в культуре достаточно большого количества клеток Ureaplasma spp., что соответствовало поздней экспоненциальной фазе роста. ОП среды и соответствующее ей накопление клеток в фазе экспоненциального роста ОП приведены в табл. 8.
Таблица 7
Изменение оптической плотности среды и накопление клеток в процессе роста культур Ureaplasma spp.
| Фаза кривой изменения оптической плотности среды | Соответствующая фаза роста культуры |
| латентная | лаг-фаза и экспоненциальная до накопления 2105 клеток/мл |
| экспоненциального роста | экспоненциальная |
| точка перегиба | замедление роста и вступление в стационарную фазу |
| замедления роста | стационарная и отмирания |
Таблица 8
Накопление клеток Ureaplasma spp. в экспоненциальной фазе роста оптической плотности среды
| оптическая плотность среды | накопление клеток в 1 мл среды |
| 0,6 | 0,6106 ± 0,2106 |
| 0,7 | 0,9106 ± 0,2106 |
| 0,8 | 1,3106 ± 0,3106 |
| 0,9 | 1,6106 ± 0,4 106 |
| 1,0 | 1,8106 ± 0,6106 |
| 1,11 | 1,9106 ± 0,6106 |
| 1,2 | 1,9106 ± 0,6106 |
Таким образом, измерение ОП среды в процессе роста бактерий рода Ureaplasma в разработанной питательной среде в стандартных условиях культивирования позволяет оценить накопление жизнеспособных клеток уреаплазм. Полученные нами результаты использованы для контроля качества питательной среды и стандартизации инокулята при определении чувствительности штаммов Ureaplasma spp. к антибактериальным препаратам.
Оценка ростовых свойств питательной среды для выявления Ureaplasma spp.
Оценка ростовых свойств разных серий питательной среды для выявления Ureaplasma spp., а также основных ее компонентов, является важнейшим этапом приготовления среды, необходимым для успешного обнаружения уреаплазм в образцах клинического материала.
Нами предложен оригинальный метод оценки ростовых свойств питательной среды, основанный на анализе кривых изменения ОП среды. Оценка ростовых свойств включает в себя 2 этапа: 1). Культивирование тест-штамма Ureaplasma spp. в среде сравнения и испытуемой в стандартных условиях в течение одного и того же времени при одинаковой концентрации тест-штамма в контрольных и опытных лунках. 2). Анализ кривых изменения оптической плотности среды в процессе роста тест-штамма в среде сравнения и испытуемой.
Кривые изменения ОП среды будут одинаковыми в том случае, если условия культивирования тест-штамма в контрольных и опытных лунках также одинаковы. Это возможно при соблюдении следующих условий: 1) культивировании в стандартных условиях; 2) инкубации в течение одного и того же времени; 3) одинаковой концентрации тест-штамма Ureaplasma spp. в контрольных и опытных лунках (условия 1-3 задаются при постановке методики); 4) одинаковых ростовых свойствах питательных сред (сравнения и испытуемой). На рис. 7 представлены кривые изменения ОП в процессе роста тест-штамма в средах, обладающих одинаковыми ростовыми свойствами.
Изменение (ухудшение, обусловленное присутствием ингибиторов роста уреаплазм) ростовых свойств испытуемой среды сопровождалось изменением накопления клеток и, как следствие, изменением кривой зависимости ОП среды от времени. В процессе роста штамма U. parvum 455 в питательной среде, содержащей 250 мМ хлорида натрия (известно, что уреаплазмы высоко чувствительны к изменению осмотического давления среды), наблюдали увеличение латентной фазы, а также снижение скорости изменения ОП среды в экспоненциальной фазе (рис. 8).
Таким образом, изменение ОП среды в процессе роста культур тест-штамма в питательных средах сравнения и испытуемой, отражающее накопление жизнеспособных клеток, при соблюдении определенных условий (стандартных условий культивирования в планшетах, одинаковой концентрации клеток тест-штамма в начальный момент в контрольных и опытных лунках, одинаковом времени инкубации) позволяет сравнить ростовые свойства сред. Предложенный метод позволяет проводить сравнение сред в процессе роста культур как по интегральному показателю (площади под кривыми изменения ОП), так и по отдельным показателям (продолжительности латентной фазы, скорости изменения ОП, значения ОП в точке перегиба кривых).
| Рис. 7. Изменение оптической плотности среды в процессе роста штамма U. parvum 468 в питательной среде сравнения (1) и испытуемой среде (2). Концентрация жизнеспособных клеток уреаплазм в начальный момент составляла 2104 клеток/мл (1, 2). | Рис. 8. Изменение оптической плотности среды в процессе роста штамма U. parvum 455 в питательной среде сравнения (1) и испытуемой среде (2). Испытуемая среда содержала 250 мМ хлорида натрия. Концентрация жизнеспособных клеток уреаплазм в начальный момент составляла 2104 клеток/мл (1, 2). |
Определение чувствительности штаммов Ureaplasma spp.
к антибактериальным препаратам
Бактерии рода Ureaplasma являются условно-патогенными микроорганизмами; вместе с тем при наличии клинических проявлений заболевания, при доказанной этиологической значимости уреаплазм назначают антибактериальные препараты (АБП).
Нами предложен микрометод определения чувствительности штаммов Ureaplasma spp. к АБП, являющийся модификацией метода серийных разведений в жидкой питательной среде и основанный на использовании пограничных концентраций препаратов. Пограничные концентрации АБП позволяют отнести штаммы уреаплазм к определенной группе по степени чувствительности (чувствительных, умеренно-чувствительных и устойчивых). По нашему мнению, пограничные концентрации должны отражать МИК50 и МИК90, которые являются основными показателями, характеризующими активность АБП. Минимальная пограничная концентрация, разделяющая чувствительные и умеренно-чувствительные штаммы, соответствует МИК50; максимальная, дифференцирующая умеренно-чувствительные и устойчивые штаммы - МИК90. Значения МИК, которые были определены классическим микрометодом серийных разведений АБП в жидкой питательной среде, представлены в табл. 9.
Таблица 9
Минимальные ингибирующие концентрации антибактериальных препаратов
| Антибактериальный препарат | Минимальная ингибирующая концентрация, мкг/мл | |||
| пределы колебаний | МИК50 | МИК90 | ||
| минимальное значение | максимальное значение | |||
| доксициклин | 0,125 | 16,0 | 0,25 | 2,0 |
| эритромицин | 0,25 | 16,0 | 2,0 | 8,0 |
| азитромицин | 0,125 | 4,0 | 0,5 | 2,0 |
| кларитромицин | 0,125 | 4,0 | 2,0 | 4,0 |
| мидекамицин | 0,125 | 4,0 | 2,0 | 4,0 |
| джозамицин | 0,125 | 4,0 | 2,0 | 4,0 |
| спирамицин | 32,0 | > 60,0 | - | - |
| линкомицин | > 32,0 | - | - | - |
| клиндамицин | 32,0 | - | - | - |
| ципрофлоксацин | 0,5 | 8,0 | 2,0 | 4,0 |
| офлоксацин | 0,5 | 4,0 | 2,0 | 4,0 |
Установленные значения МИК50 и МИК90 использовали для приготовления ряда питательных сред с АБП для оценки чувствительности клинических штаммов Ureaplasma spp. методом пограничных концентраций (рис. 9, табл. 10).
Рис. 9. Определение чувствительности одного из штаммов Ureaplasma spp. к антибактериальным препаратам методом серийных разведений с использованием пограничных концентраций. Клм5 – клиндамицин 5 мкг/мл; Лм30 – линкомицин 30 мкг/мл; Крм2, Крм4 – кларитромицин 2, 4 мкг/мл; Азм2 – азитромицин 2 мкг/мл; См50 – спирамицин 50 мкг/мл; Эм2, Эм8 – эритромицин 2, 8 мкг/мл; Мм2, Мм4 – мидекамицин 2, 4 мкг/мл; Дм2, Дм4 – джозамицин 2, 4 мкг/мл; Оф2, Оф4 – офлоксацин 2, 4 мкг/мл; Цф2, Цф4 – ципрофлоксацин 2, 4 мкг/мл; Дц2 – доксициклин 2 мкг/мл. К+ положительный контроль; К- отрицательный контроль.
Получены данные, свидетельствующие о существовании штаммов Ureaplasma spp. с различной степенью чувствительности к АБП. Большинство исследованных штаммов были высоко чувствительны к доксициклину и макролидам (за исключением эритромицина и спирамицина, обладающих меньшей активностью). Доксициклин и макролиды ингибировали рост большинства штаммов уреаплазм (от 72,8% для мидекамицина и до 100% для азитромицина) в низкой концентрации (МИК 2 мкг/мл). Однако, наряду со штаммами Ureaplasma spp., обладающими высокой чувствительностью к доксициклину и макролидам, были выявлены устойчивые штаммы. Так, 2,9% штаммов были устойчивы к доксициклину, 3,8% - к эритромицину, 0,7% - к мидекамицину, 0,2% - к джозамицину. При этом не выявлено ни одного штамма, устойчивого к азитромицину и кларитромицину. Менее эффективными in vitro в отношении Ureaplasma spp. оказались фторхинолоны. Значительное количество исследованных штаммов было устойчиво к ципрофлоксацину и офлоксацину (42,7% и 17,9%, соответственно). Высоко чувствительными к ципрофлоксацину и офлоксацину оказались только 37,2% и 44,9% штаммов, соответственно.
Таблица 10
Распределение штаммов Ureaplasma spp. (общее количество 452) по степени чувствительности к антибактериальным препаратам
| Антибактериальный препарат | Абсолютное число и процент штаммов | ||
| чувствительных | умеренно-чувствительных | устойчивых | |
| доксициклин1 | 439 (97,1) | - | 13 (2,9) |
| эритромицин | 89 (19,7) | 346 (76,5) | 17 (3,8) |
| азитромицин2 | 452 (100) | - | 0 |
| кларитромицин | 416 (92) | 36 (8) | 0 |
| мидекамицин | 327 (72,3) | 192 (27) | 3 (0,7) |
| джозамицин | 392 (86,7) | 59 (13,1) | 1 (0,2) |
| спирамицин3 | - | 178 (39,4) | 274 (60,6) |
| линкомицин | 0 | 0 | 452 (100) |
| клиндамицин | 0 | 0 | 452 (100) |
| ципрофлоксацин | 168 (37,2) | 91 (20,1) | 193 (42,7) |
| офлоксацин | 203 (44,9) | 168 (37,2) | 81 (17,9) |
Примечание.
1, 2 Использовали одну пограничную концентрацию доксициклина и азитромицина 2 мкг/мл, дифференцирующую штаммы уреаплазм на чувствительные и устойчивые.
3 Использовали одну пограничную концентрацию спирамицина 50 мкг/мл, дифференцирующую штаммы уреаплазм на умеренно-чувствительные и устойчивые.
Как и следовало ожидать, все исследованные штаммы Ureaplasma spp. были устойчивы к линкозамидам линкомицину и клиндамицину. При этом, как отмечено ранее, все штаммы были чувствительны к макролидам азитромицину и кларитромицину. Предлагаем использовать такое различное отношение штаммов к указанным антибиотикам как дополнительный дифференциальный признак для идентификации бактерий рода Ureaplasma spp..
Таким образом, результаты проведенного исследования свидетельствовали о целесообразности определения чувствительности штаммов Ureaplasma spp. к АБП. Определение чувствительности штаммов Ureaplasma spp. к АБП in vitro может служить, во-первых, основанием для рационального выбора антибактериальной терапии, направленной на элиминацию уреаплазм из организма, и, во-вторых, дополнительным критерием идентификации штаммов уреаплазм по их чувствительности к антибиотикам группы макролидов азитромицину и кларитромицину и устойчивости к антибиотикам группы линкозамидов линкомицину и клиндамицину.
Разработка микротест-системы для выявления и идентификации Ureaplasma spp. «Уреаплазма микротест» и оценка ее диагностической эффективности в государственных испытаниях
На основе предложенных сред нами разработана микротест-система для выявления и идентификации Ureaplasma spp. «Уреаплазма Микротест». Микротест-система предназначена для культивирования штаммов Ureaplasma spp. в стандартных условиях; выявления и идентификации Ureaplasma spp. в образцах клинического материала; определения концентрации жизнеспособных клеток в культурах Ureaplasma spp. и образцах клинического материала; а также определения чувствительности штаммов Ureaplasma spp. к АБП.
В состав микротест-системы входят пять компонентов: транспортная среда, среда роста, среды с АБП, стерильное минеральное масло, стерильный 96-луночный планшет. Стандартный формат планшетов делает их пригодными для проведения как визуального, так и автоматизированного учета результатов исследования с помощью планшетных фотометров.
Основным преимуществом микротест-системы «Уреаплазма микротест» является стандартизация микробиологического метода диагностики уреаплазменной инфекции, позволяющая получить достоверные, воспроизводимые результаты. Нами это было достигнуто стандартизацией основных компонентов микротест-системы (использование стандартизованных компонентов сред, соблюдение технологии приготовления, оценка ростовых свойств питательной среды и ее отдельных компонентов) и методики проведения исследования (микротест-система содержит все необходимые для проведения исследования компоненты, методика исследования изложена в виде инструкции по применению микротест-системы).
Обусловленная широким распространением бессимптомного носительства уреаплазм и отсутствием четких клинических проявлений уреаплазменной инфекции невозможность разделения на опытную («больных») и контрольную («здоровых») группы затрудняла оценку микротест-системы «Уреаплазма микротест» в клинико-эпидемиологических испытаниях.
В связи с этим нами была разработана и использована новая методика сравнительной оценки эффективности микротест-системы, предназначенной для диагностики инфекции, вызываемой условно-патогенными бактериями рода Ureaplasma. Методика позволяет вычислять критерий диагностической эффективности U в условиях отсутствия четкого деления на опытную и контрольную группы. В такой ситуации показатель чувствительности Se нельзя найти из опытов с достаточной точностью, но показатель специфичности Sp можно определить по группе пациентов с отрицательными результатами ПЦР, т.е. с достоверным отсутствием возбудителя. Критерий диагностической эффективности: U(P) = P·Se + (1–P)·Sp характеризует точность диагностического препарата, т.е. насколько правильно микротест-система выявляет наличие или отсутствие возбудителя при распространенности заболевания P.
Нами предложено ранее не применявшееся понятие доли всех положительных результатов тестов W (отношение общего числа положительных тестов к общему числу всех тестов). Se, Sp и W связаны между собой формулой: W = PSe + (1–P)(1–Sp). Исходя из этого: Se = (W – (1–P)(1–Sp)) / P и, соответственно, U (P) = W – (1–P)·(1–2Sp). На основе данных, полученных при проведении государственных испытаний и представленных в табл. 11, строили графики зависимости U от P: U = U(P).
Таблица 11
Результаты выявления Ureaplasma spp. в образцах клинического материала с использованием микротест-системы «Уреаплазма микротест» и контрольных сред (ГУ НИИЭМ им. Н.Ф. Гамалеи и bioMerieux) и в ПЦР
| Питательная среда | Результаты посева | Результаты ПЦР | |
| положительный результат | отрицательный результат | ||
| «Уреаплазма микротест» (1) | Рост Ureaplasma spp. | 141 | 2 |
| Отсутствие роста Ureaplasma spp. | 2 | 60 | |
| ГУ НИИЭМ (2) | Рост Ureaplasma spp. | 141 | 2 |
| Отсутствие роста Ureaplasma spp. | 2 | 60 | |
| bioMerieux (3) | Рост Ureaplasma spp. | 143 | 0 |
| Отсутствие роста Ureaplasma spp. | 0 | 62 | |
Из графиков U=U(P), показанных на рис. 10, видно, что микротест-система «Уреаплазма Микротест», имеет диагностическую эффективность такую же как питательная среда ГУ НИИЭМ им. Н.Ф. Гамалеи и соизмеримую с диагностической эффективностью среды bioMerieux.
Рис. 10. Диагностическая эффективность U микротест-системы «Уреаплазма микротест» (1), питательных сред для выявления Ureaplasma spp. ГУ НИИЭМ им. Н.Ф. Гамалеи (2) и bioMerieux (3) в зависимости от распространенности заболевания P.
Таким образом, разработанная микротест-система для выявления и идентификации Ureaplasma spp. «Уреаплазма Микротест», обеспечивающая стандартизацию микробиологического метода диагностики уреаплазменной инфекции, обладает высокой диагностической эффективностью.
ВЫВОДЫ
1. Разработаны питательная среда для культивирования бактерий рода Ureaplasma, обладающая высокими ростовыми и селективными свойствами, и транспортная среда, обеспечивающая оптимальные условия для сохранения жизнеспособности уреаплазм. Использование сред позволяет эффективно выявлять Ureaplasma spp. в образцах клинического материала.
2. Показано, что примененные для Ureaplasma spp. методы определения наиболее вероятного количества бактерий и полимеразной цепной реакции в режиме реального времени могут быть использованы для определения концентрации уреаплазм в исследуемом материале.
3. Показано, что изменение оптической плотности среды в процессе роста бактерий рода Ureaplasma в стандартных условиях культивирования на разработанной питательной среде отражает накопление жизнеспособных клеток уреаплазм в поздней экспоненциальной фазе роста культур.
4. Разработан метод оценки ростовых свойств питательной среды для культивирования и выявления Ureaplasma spp. на основе анализа кривых изменения оптической плотности среды в процессе роста тест-штамма в стандартных условиях культивирования в средах сравнения и испытуемой. Метод позволяет дифференцировать ростовые свойства разных серий указанной среды, а также отдельных ее компонентов.
5. Предложен микрометод определения чувствительности штаммов Ureaplasma spp. к антибактериальным препаратам, являющийся модификацией метода серийных разведений в жидкой питательной среде, с использованием пограничных концентраций.
6. Разработана микротест-система для выявления и идентификации Ureaplasma urealyticum (Ureaplasma spp.) «Уреаплазма микротест», обеспечивающая стандартизацию выявления, оценки количества и определения чувствительности бактерий рода Ureaplasma к антибактериальным препаратам.
7. Разработана методика оценки качества микротест-системы «Уреаплазма микротест» в клинико-эпидемиологических испытаниях, позволяющая определить диагностическую эффективность препарата, предназначенного для выявления и идентификации условно-патогенных бактерий.
СПИСОК НАУЧНЫХ РАБОТ, ОПУБЛИКОВАННЫХ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ
- Безруков В.М., Назаренко Е.Г., Доронина Е.П., Екимов А.Н., Файзуллин Л.З., Сухих Г.Т., Говорун В.М. Клиническое значение определения биоваров Ureaplasma urealyticum с использованием ПЦР-диагностики. «Полимеразная цепная реакция в диагностике и контроле лечения инфекционных заболеваний» Сборник трудов под редакцией академика РАМН Ю.М. Лопухина. Москва, 1998. С. 31-34.
- Безруков В.М., Бердникова З.Е., Шобухова Т.С. «Метод оценки питательных сред для диагностики уреаплазмоза». Материалы Международной конференции «Ликвидация и элиминация инфекционных болезней – прогресс и проблемы». Санкт-Петербург, 2003, с. 50.
- Шипулин Г.А., Безруков В.М. Питательная среда для выявления Ureaplasma urealyticum и способ диагностики урогенитальных уреаплазмозов. Патент РФ 2265656 С1, 2004.
- Безруков В.М., Шобухова Т.С. Новые микротест-системы для выявления и идентификации Mycoplasma hominis и Ureaplasma urealyticum. Материалы Всероссийской научно-практической конференции «Медицинская микробиология - XXI век». Саратов, 2004, с. 32-33.
- Безруков В.М., Шобухов А.В. Определение Ureaplasma urealyticum в жидкой питательной среде методом наиболее вероятного количества. Материалы научной конференции, посвященной 75-летию Нижегородского НИИЭМ «Новые технологии в профилактике, диагностике, эпиднадзоре и лечении инфекционных заболеваний». Нижний Новгород, 2004, с. 255-258.
- Безруков В.М., Шобухов А.В., Шобухова Т.С. Об условиях применимости метода наиболее вероятного количества для определения концентрации бактерий Ureaplasma urealyticum в жидкой питательной среде. Тезисы 1-й Всероссийской конференции по вакцинологии «Медицинские иммунобиологические препараты для профилактики, диагностики и лечения актуальных инфекций». Москва, 2004, с. 9-10.
- Безруков В.М., Шобухов А.В., Шобухова Т.С. Сравнение методов определения Ureaplasma urealyticum. Тезисы международной конференции «Развитие международного сотрудничества в области изучения инфекционных заболеваний». Новосибирск, 2004, с. 225.
- Безруков В.М., Шипулин Г.А. «Уреаплазма микротест» и «Микоплазма микротест» - новые микротест-системы для диагностики урогенитальных микоплазмозов. Сборник трудов 5-й Всероссийской научно-практической конференции «Генодиагностика инфекционных болезней» под редакцией академика РАМН В.И. Покровского, М., 2004, т.1, с. 10-12.
- Жуховицкий В.Г., Шобухова Т.С., Спирина Г.В., Шмелева Л.П., Кириллов М.Ю., Шарая В.С., Безруков В.М., Парашина В.А. Сравнительная оценка диагностических препаратов с учетом прогностической ценности. Журнал микробиологии, эпидемиологии и иммунобиологии. 2004, № 6, с. 53-55.
- Безруков В.М., Волкова Р.А., Эльберт Е.В., Шалунова Н.В., Шобухова Т.С., Жуховицкий В.Г. Оценка диагностической ценности ПЦР-тест-систем по результатам государственных испытаний. Журнал микробиологии, эпидемиологии и иммунобиологии. 2005, № 2, с. 69-73.
- Безруков В.М., Шобухов А.В. О применении жидкой селективной питательной среды для количественного определения U. urealyticum. Клиническая лабораторная диагностика. 2005, № 9, с. 31.
- Гамова Н.А., Безруков В.М. Сравнение диагностической ценности различных сред для выделения из клинического материала U. urealyticum и M. hominis. Клиническая лабораторная диагностика. 2005, № 9, с. 32-33.
- Медуницын Н.В., Волкова Р.А., Бондаренко В.М., Жуховицкий В.Г, Безруков В.М., Шобухов А.В., Петухов В.Г., Шобухова Т.С., Горбунов М.А., Быков А.С. К вопросу о программе проведения государственных испытаний диагностических медицинских иммунобиологических препаратов при регистрации их в Российской Федерации. Биопрепараты. 2006, № 1 (21), с. 23-27.
- Безруков В.М., Цеслюк М.В., Шобухов А.В., Шобухова Т.С., Быков А.С. Разработка стандарта цветности для определения концентрации уреаплазменных культур в жидкой питательной среде. Материалы научной конференции, посвященной 85-летию со дня рождения академика РАМН И.Н. Блохиной «Новые технологии в профилактике, диагностике, эпиднадзоре и лечении инфекционных заболеваний». Нижний Новгород, 2006, с. 145-147.
- Безруков В.М., Быков А.С., Цеслюк М.В., Шобухов А.В. Технология количественной оценки концентрации уреаплазменных культур в жидкой питательной среде. Технологии живых систем. 2006, т. 3, № 2, с. 28-37.
СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ
АБП – антибактериальный препарат
МИБП – медицинский иммунобиологический препарат
МИК – минимальная ингибирующая концентрация
МИК50 – минимальная ингибирующая концентрация, подавляющая рост не менее 50% исследованных штаммов
МИК90 – минимальная ингибирующая концентрация, подавляющая рост не менее 90% исследованных штаммов
НВК – наиболее вероятное количество
ОП – оптическая плотность
ПЦР – полимеразная цепная реакция
ПЦР-РВ – полимеразная цепная реакция в режиме реального времени
ФСП – фармакопейная статья предприятия
ЦОЕ – цветообразующая единица
