Обоснование и оценка эффективности применения этидроновой кислоты для профилактики и комплексного лечения воспалительных заболеваний полости рта.

На правах рукописи

Лукоянова Татьяна Владиславовна

ОБОСНОВАНИЕ И ОЦЕНКА ЭФФЕКТИВНОСТИ ПРИМЕНЕНИЯ ЭТИДРОНОВОЙ КИСЛОТЫ ДЛЯ ПРОФИЛАКТИКИ И КОМПЛЕКСНОГО ЛЕЧЕНИЯ ВОСПАЛИТЕЛЬНЫХ ЗАБОЛЕВАНИЙ ПОЛОСТИ РТА.

14.01.14 - Стоматология

03.02.03 - Микробиология

Автореферат

диссертации на соискание ученой степени

кандидата медицинских наук

Москва - 2011

Работа выполнена в ГОУ ВПО «Российский университет дружбы народов» и ГОУ ВПО «Московский государственный медико-стоматологический университет Росздрава»

Научные руководители:

Кандидат медицинских наук, профессор Булгаков Всеволод Сергеевич

Доктор медицинских наук, профессор Царев Виктор Николаевич

Официальные оппоненты:

Доктор медицинских наук, профессор Максимовская Людмила Николаевна

Доктор медицинских наук, профессор Балмасова Ирина Петровна

Ведущая организация:

Федеральное государственное образовательное учреждение «Институт повышения квалификации ФМБА России» Федерального медико-биологического агенства России (ФГОУ ДПО ИПК ФМБА России)

Защита состоится __ ________________2011_ года в ____ часов на

заседании диссертационного совета Д.208.041.07. при ГОУ ВПО «Московский государственный медико-стоматологический университет Росздрава» по адресу: 127473, г. Москва ул. Делегатская, д.20/1.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Московского государственного медико-стоматологического университета по адресу: 127206, Москва, ул. Вучетича, д. 10а.

Автореферат разослан __ ________________2011__год.

Ученый секретарь

диссертационного совета

кандидат медицинских наук, доцент О. П. Дашкова

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность темы.

Распространенность болезней пародонта в различных регионах России во всех возрастных группах достигает 85-95% [Иорданишвили А.К., Тихонов А.В., 2010; Макеева И.М., Дорошина В.Ю., 2009; Пузин М.Н., Аветисян А.А., 2008]. Трудности лечения воспалительных процессов в тканях пародонта связаны с наличием устойчивых к терапии форм пародонтита, которые в определенной степени связаны с длительной персистенцией пародонтопатогенных видов микробов Prevotella intermedia, Tanerella forsythia, Treponema denticola, Actinobacillus actinomycetemcomitans, Porphyromonas gingivalis [Царев В.Н., 2004-2009; Николаева Е.Н., 2009; Culter C.W. et al.,1999; Сhoi B.-К. et al., 2000]. Ранее в Нижегородском регионе диагностика данных видов бактерий не проводилась из-за отсутствия соответствующих методов их выявления. Остается также открытым вопрос об эффективности оказания пародонтологической помощи больным хроническим генерализованным пародонтитом Нижегородского региона. Значимо, что в результате современных микробиологических лабораторных исследований удается наряду с клинически очерченной патологией выявить лица, у которых имеется ряд сходных с изучаемым заболеванием признаков, не достигающих уровня болезни. Это дает основание отнести условно данную категорию обследованных к группе риска [Плахтий Л.Я., 2002; Николаева Е.Н., 2008]. Раннее выявление болезни и критериев группы риска имеет большое теоретическое и практическое значение в связи с возможностью своевременной профилактики, диагностики и лечения такого труднокурабельного заболевания, как хронический генерализованный пародонтит, медико-социальной реабилитации больных. Разработка и внедрение в практическое здравоохранение новых перспективных средств для лечения и профилактики заболеваний пародонта является одной из самых важных задач стоматологии [Кулаков А.А., Кречина Е.К., 2008].

В последние годы ведутся исследования по изучению фармакологической активности препарата «Ксидифон», представляющий собой водный раствор этидроновой кислоты (Международное непатентованное название) [Колобкова Л.Н., Николаев И.В., 2007; Селезнев А.Н., Петрович Ю.А., 2002]. Препарат обладает антиоксидантным и противовоспалительным эффектом, является модулятором кислотно-основного состояния полости рта и препятствует образованию минерализованных зубных отложений [Колобкова Л.Н.,2006]. В научной литературе нет данных о применении этидроновой кислоты в качестве антисептического средства, не изучено ее непосредственное влияние на условно-патогенную и стабилизирующую микрофлору полости рта, клиническое течение хронического генерализованного пародонтита, что обуславливает актуальность настоящего исследования.

Цель исследования. Повышение эффективности комплексного лечения больных хроническим генерализованным пародонтитом легкой и средней степени тяжести с применением 2% водного раствора этидроновой кислоты.

Задачи исследования:

1. Проанализировать истории болезни пациентов Нижегородского региона, проходивших лечение у врача-пародонтолога за 10-летний период, для определения целесообразности анализа состава пародонтопатогенной микрофлоры полости рта и оценки необходимости оптимизации тактики лечебно-профилактических мероприятий больных хроническим генерализованным пародонтитом.

2. Исследовать состав и распространенность пародонтопатогенной флоры у лиц Нижегородского региона.

3. На основании лабораторных экспериментальных исследований оценить перспективы клинического использования этидроновой кислоты в качестве антисептического средства при хроническом генерализованном пародонтите.

4. Провести сравнительное исследование бактерицидного действия этидроновой кислоты in vitro с учетом влияния на эпителиоциты слизистой оболочки полости рта.

5. Разработать способ этиопатогенетического лечения хронического генерализованного пародонтита с использованием 2% водного раствора этидроновой кислоты.

6. Осуществить клиническую оценку эффективности 2% водного раствора этидроновой кислоты как средства для профилактики и комплексного лечения больных с хроническим генерализованным пародонтитом легкой и средней степени тяжести, изучить особенности его влияния на пародонтопатогенную и стабилизирующую микрофлору полости рта.

Научная новизна исследования.

Впервые в России исследован состав пародонтопатогенной микрофлоры у лиц Нижегородского региона с применением современного метода полимеразной цепной реакции.

В настоящей работе впервые определена бактерицидная активность и минимальная бактерицидная концентрация 2% водного раствора этидроновой кислоты в отношении типовых представителей грамположительной и грамотрицательной микрофлоры полости рта.

Впервые в условиях эксперимента проведена сравнительная оценка антисептической эффективности и цитотоксического действия этидроновой кислоты и ополаскивателей на основе хлоргексидина и триклозана.

Впервые проведен сравнительный анализ действия препаратов рокситромицина и 2% водного раствора этидроновой кислоты на пародонтопатогенных бактерий, состояние микробиоценоза полости рта и на клиническое течение хронического генерализованного пародонтита.

Практическая значимость работы.

1. Разработанный алгоритм этиологической диагностики пародонтита с использованием молекулярно-биологических методов исследования является предпосылкой для совершенствования организации стоматологической помощи больным с воспалительными заболеваниями пародонта.
2. Уточнены подходы к лечебно-профилактической тактике ведения больных с хроническим генерализованным пародонтитом в амбулаторных условиях.
3. На основании результатов экспериментального, микробиологического, клинического исследований разработан способ лечения хронического генерализованного пародонтита с применением 2% водного раствора этидроновой кислоты в качестве бактерицидного средства.
4. Разработаны схемы и рекомендации по применению 2% водного раствора этидроновой кислоты в качестве бактерицидного препарата и рокситромицина в комплексном лечении больных хроническим генерализованным пародонтитом, а также установлена высокая клиническая эффективность сочетанного применения 2% водного раствора этидроновой кислоты и рокситромицина у больных хроническим генерализованным пародонтитом средней степени тяжести в стадии обострения и 2% водного раствора этидроновой кислоты у больных хроническим генерализованным пародонтитом легкой степени тяжести. Разработанный способ комплексного лечения хронического генерализованного пародонтита рекомендуется для широкого применения в практике у пациентов с хроническим генерализованным пародонтитом средней степени и с хроническим генерализованным пародонтитом легкой степени тяжести.

Основные положения, выносимые на защиту:

1. Внедрение метода ПЦР-диагностики в практическую пародонтологию позволяет осуществлять дифференцированный подход к антибактериальной терапии больных хроническим генерализованным пародонтитом и выявлять пациентов группы риска.

2. На основании данных эпидемиологических, экспериментальных, микробиологических и клинических исследований установлено, что 2% водный раствор этидроновой кислоты более эффективен для местного лечения хронического генерализованного пародонтита, чем хлоргексидин и триклозан.

3. Результаты клинического и микробиологического исследований, свидетельствуют о высокой эффективности и безопасности метода лечения хронического генерализованного пародонтита с использованием лекарственных форм – 2% водного раствора этидроновой кислоты и рокситромицина.

4. Новый способ лечения эффективность, которого доказана в исследовании и защищена патентом РФ, несложен в применении, доступен для практических лечебно-профилактических учреждений и экономичен. Предлагаемое изобретение позволяет скорректировать микробиоценоз ротовой полости.

Личное участие автора. Автором лично проведено ретроспективное изучение медицинских карт стоматологических больных, клиническое стоматологическое обследование и лечение пациентов с хроническим генерализованным пародонтитом, проанализированы результаты исследований. Автор принял непосредственное участие во всех экспериментальных исследованиях этидроновой кислоты. Автором разработан способ применения 2% водного раствора этидроновой кислоты в качестве антисептического средства. Выполнены необходимые процедуры, связанные с получением патента.

Внедрение в практику. Результаты проведенного исследования использованы в учебном процессе на кафедре пропедевтики стоматологических заболеваний ГОУ ВПО РУДН. Этиологическая диагностика хронического генерализованного пародонтита с помощью полимеразной цепной реакции и предлагаемый метод лечения внедрен в практику терапевтического, хирургического, пародонтологического, ортопедического отделений МЛПУ Стоматологическая поликлиника «Жемчуг» Советского района г. Нижнего Новгорода.

Апробация работы. Основные положения и результаты исследования доложены и обсуждены на международной научно-практической конференции «Здоровье и образование в ХХI веке» 2006, 2007 (Москва), II съезде микологов России 2008 (Москва), на научно-практической конференции c международным участием XVII Российский национальный конгресс «Человек и лекарство» 2010 (Москва); материалы диссертации были представлены и рекомендованы к защите на межкафедральном заседании кафедр пропедевтики стоматологических заболеваний ГОУ ВПО «РУДН» РОСЗдрава, микробиологии, вирусологии, иммунологии ГОУ ВПО «МГМСУ» РОСЗдрава (Москва, 25 ноября 2010г.).

Публикации. По материалам диссертации опубликовано 7 печатных работ, в том числе 2 работы в журналах, рекомендованных перечнем ВАК Минобрнауки и получен 1 патент РФ на изобретение.

Объем и структура диссертации. Работа изложена на 140 страницах машинописного текста и включает: введение, обзор литературы, главу «материалы и методы», 5 глав собственных исследований и их обсуждения, заключение, выводы, практические рекомендации, список литературы. Диссертация иллюстрирована 14 таблицами и 25 рисунками. Библиографический указатель содержит 200 источников литературы: отечественных-110, зарубежных – 90, 160 работ за последние 5 лет.

Содержание работы.

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ.

Для решения поставленных задач был составлен план исследования, включающий эпидемиологическую, экспериментальную и клиническую части.

1.1Эпидемиологическое исследование.

1.1.1 Ретроспективное изучение историй болезни. Были проанализированы истории болезни 113 пациентов, проходивших лечение у врача-пародонтолога в возрасте от 22 до 82 лет за период с 1998 по 2008 год из архива МЛПУ «Стоматологическая поликлиника» Нижегородского района города Нижнего Новгорода. Из них 72 (63,7%) женщин (средний возраст 53± 15 лет) и 41 (36,3%) мужчин (средний возраст 49±18 лет). Оценивались традиционные методы диагностики пародонтита, структура заболеваемости, структура и объем лечебных манипуляций.

1.1.2 Группы обследованных пациентов:

Проведено комплексное обследование 92 больных ХГП в возрасте от 25 до 56 лет (38 мужчин и 54 женщины). Критерии включения в исследование: на основании эпидемиологических, клинико-анамнестических, рентгенологических и лабораторных данных у пациентов выявляли степень тяжести заболевания при отсутствии острых или хронических соматических заболеваний в фазе обострения; а также при условии наличия полного комплекса данных клинико-лабораторного обследования, включая ПЦР, что позволило сформировать две следующие группы:

• Больные ХГП легкой степени тяжести заболевания (52 человека);
• Больные ХГП средней степени тяжести заболевания (40 человек)

Таблица 1. Характеристика групп сравнения по демографическим показателям

Группы	Степень тяжести	Количество пациентов	Пол		Возрастной диапазон
ХГП	легкая	52	Мужской	Женский	От 25 до 40	От 41 до 56
			23	29	42	10
	средняя	40	15	25	18	22
Итого		92	38	54	92

Из исследования исключали больных ХГП тяжелой степени и сочетанной соматической патологией в фазе декомпенсации.

Клинико-лабораторное исследование включало индексную оценку состояния полости рта: индексы гигиены (ИГ) по Green-Vermillion (1964), PMA по Parma S. (1960), PI по Russel A. (1956), определение глубины пародонтального кармана с помощью методики зондирования, степени подвижности зубов. Рентгенологическое исследование – ортопантомограммы до начала курса лечения, внутриротовые рентгенограммы и компьютерную цифровую рентгенографию.

Молекулярно-биологические исследования включали проведение полимеразной цепной реакции (ПЦР) для выявления в материале маркерной ДНК пародонтопатогенных видов бактерий (A. Actinomycetemcomitans, T. forsithia, P. gingivalis, P. intermedia, T.denticola) с помощью набора реагентов МультиДент (ООО «ГенЛаб», Россия).

1.2 Экспериментальные исследования.

1.2.1 Изучение бактерицидной активности этидроновой кислоты.

Инкубацию тест-культур в растворе этидроновой кислоты, а также ополаскивателях для полости рта, содержащих хлоргексидин («President® профи», АО Бетафарма, Италия) или триклозан («Colgate® plax», ГАБА Интернатионал, Швейцария) осуществляли в течение 5 минут (рекомендованное время ротовых ванночек с этидроновой кислотой). В работе использовали коммерческий препарат «Ксидифон» (ФГУП «Мосхимфармпрепараты») 20% водный раствор этидроновой кислоты. Подсчитывали количество выросших колониеобразующих единиц (КОЕ) на чашках Петри после термостатирования (24 ч, 370С): S. epidermidis штамм 51-1, E. coli штамм 18М, C. albicans штамм 601 (коллекция кафедры микробиологии и иммунологии ГОУ ВПО НижГМА Росздрава) и Pseudomonas aeruginosa ATSS 27953.

1.2.2 Определение характера антимикробного действия этидроновой кислоты

осуществляли методом серийных разведений. Для изучения минимальной бактерицидной концентрации [Лабинская А.С., Волина Е.Г, 2008], готовили разведения, содержащие 10%, 5%, 3%, 2%, 1% или 0,5% этидроновой кислоты на ЗФР.

1.2.3 Определение жизнеспособности буккальных эпителиоцитов при воздействии на них водного раствора этидроновой кислоты.

Эпителиоциты собранные с внутренней поверхности щеки здоровых доноров-добровольцев, трижды отмывали и взвешивали в ЗФР (режим центрифугирования - 5 мин, 40g). Жизнеспособность эпителиоцитов после инкубации с препаратами оценивали по трипановому тесту. Все эксперименты ставили в 5 повторах.

1.3 Клиническое исследование.

Из группы N=92 пациентов с ХГП после комплексного обследования была сформирована клиническая группа (N=75), которым на основании клинико-лабораторных исследований было назначено комплексное лечение с использованием 2% водного раствора этидроновой кислоты.

У данных больных, на основании метода ПЦР-диагностики был выявлены пародонтопатогенные бактерии, в совокупности с клиническими симптомами пародонтита и наличием жалоб. Больные по степени тяжести заболевания и по характеру назначенного комплексного этиопатогенетического лечения, были разделены на 2 подгруппы:

• Больные ХГП легкой степени тяжести заболевания, которые полностью прошли курс лечения с использованием 2% водного раствора этидроновой кислоты (43 человека)- I группа сравнения;
• Больные ХГП средней степени тяжести в стадии обострения, полностью прошедшие курс лечения с использованием 2% водного раствора этидроновой кислоты и антибиотика с иммуномодулирующей активностью рокситромицина (32 человека) - II группа сравнения.

Методика комплексного лечения с применением 2% водного раствора этидроновой кислоты. Пациентам с ХГП легкой степени этидроновую кислоту назначали сразу после снятия зубных отложений и кюретажа пародонтальных карманов. Группе пациентов с ХГП средней степени в стадии обострения, первоначально назначали рокситромицин по 0,15 г два раза в день в течение 7 дней в сочетании с местным лечением этидроновой кислотой, после снятия обострения - примерно, на 3-4 сутки после начала приема антибиотика проводили профессиональную гигиену полости рта и кюретаж пародонтальных карманов.

В обеих группах 2% водный раствор этидроновой кислоты назначали в виде ротовых ванночек в течение 5 минут два раза в день после чистки зубов в течение двух недель.

Эффективность терапевтических мероприятий оценивали по данным клинических и лабораторных методов исследования – проводили индексную оценку состояния гигиены полости рта и тканей пародонта, ПЦР-диагностику, определяли показатель естественной колонизации (ПЕК) буккальных эпителиоцитов. Кроме того, проводили изучение органолептических свойств 2% водного раствора этидроновой кислоты. Органолептические свойства 2% этидроновой кислоты исследовали, используя специальную анкету, по оценке субъективных ощущений пациентов после двухнедельного курса полосканий.

1.4 Статистическая обработка результатов исследований включала определение процента штаммов определенного вида при расчете структуры ассоциаций бактерий, выделенных у больных основных групп сравнения до и после проведения консервативного лечения, а также у группы больных ХГП при эпидемиологическом исследовании. Для показателей, характеризующих число больных рассчитывали частоту в процентах, а для относительных величин – индексы (гигиены, PMA, глубины пародонтальных карманов, кровоточивости, пародонтальный индекс). Для параметрических значений проводили расчет средней величины с вычислением средней ошибки, коэффициента Стьюдента для малой выборки данных (Т) и вероятности различий (Р). Статистически достоверной считали разницу при значении р<0,05 (Крамер, 1981). При статистической обработке использованы компьютерные программы Biostat и Exel для Microsoft.

РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЙ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ.

Результаты ретроспективного изучения историй болезни стоматологических пациентов. При анализе причин обращения к врачу-пародонтологу (рис.1) установлено, что 42 (37,2%) человека обратились за помощью самостоятельно в связи появлением кровоточивости десен и минерализованных зубных отложений. В 17 (15%) случаях причиной обращения в стоматологическую поликлинику с последующим направлением к врачу-пародонтологу явилась острая боль. 54 (47,8%) человека, проходили курс лечебных мероприятий у врача-пародонтолога не по собственной инициативе, а по направлению врачей-стоматологов смежных специальностей (Рис.1).

Среди всех обследованных (N=113): 5 (4,4%) пациентам был поставлен диагноз хронический генерализованный катаральный гингивит, 16 (14,1%) –ХГП легкой степени. ХГП тяжелой степени – выявлен у 30 (26%) человек. Первое место в структуре заболеваемости - ХГП средней степени - 62 (55%) человека (Рис. 2).

Диагноз – ХГП ставили на основании данных объективного обследования, анамнеза заболевания и на основании диагностической рентгенограммы. Установлено, что врачи ЛПУ на предварительное микробиологическое исследование микрофлоры пародонтальных карманов пациентов не направляли. Не проводили дифференциальную диагностику основного этиологического фактора ХГП: пародонтит, ассоциированный с пародонтопатогенами, кандида-ассоциированный пародонтит или пародонтит, ассоциированный с ассоциированный с герпес-вирусной инфекцией [Царев, Ушаков, Николаева, Носик, 2004-2008].

Всем больным при ХГП в стадии обострения в 100% случаев назначали консервативное лечение: системную антибактериальную терапию метронидазолом или линкомицином. После снятия острых воспалительных явлений рекомендовали кюретаж пародонтальных карманов или профессиональную гигиену зубов и десен с применением ультразвука. В качестве местной антибактериальной терапии назначали полоскание раствором хлоргексидина, аппликации на десну с мазью «метрогил-дента». В качестве местного противовоспалительного лечения назначали аппликации на десну с нестероидными противовоспалительными мазями.

32 человека из 113 пациентов (28%), обратившихся, за пародонтологической помощью прервали курс лечения. В связи с осложнениями, возникшими в процессе комплексного традиционного лечения: кандидоза слизистой оболочки полости рта, изменения цвета зубов, темно-коричневого окрашивания пломб, раздражающего и аллергического действия при использовании ополаскивателей на основе хлоргексидина; из-за отсутствия положительной динамики в результате лечения.

После лечения 81 пациента – в 13% случаях сохранялась кровоточивость десен, экссудация из пародонтальных карманов, галитоз. Прошли полностью курс лечения у врача-пародонтолога и поставлены на диспансерный учет – 81 (71,7%) пациент. Из 81 человека, нуждающихся в диспансеризации (рис. 3) 12 (14,8%) пациентов проходили контрольные осмотры и курсы противорецидивной терапии. Выбыли из-под наблюдения, после постановки на диспансерный учет 44 (54,3%) больных. Обратились повторно с жалобами в срок от 1 года до 2- ух лет 25 (30,9%) пациентов. Среди них 16 (64%) с обострением имеющейся патологии пародонта, 9 (36%) – c осложнениями.

Результаты исследования распространенности и состава пародонтопатогенной микрофлоры у больных ХГП, проживающих в Нижнем Новгороде

100% пациентов (N=92), которым в результате комплексного обследования был поставлен диагноз ХГП, проводили этиологическую диагностику с помощью ПЦР. Выявлена следующая частота генетических маркеров пародонтопатогенных видов: P.intermedia - у 30 больных (32, 6%); T.forsithia – у 72 (78, 3%); T.denticola –у 44 больных (47, 8%); A. actinomycetemcomitans у 24 (26, 1%) и P.gingivalis- у 44 больных (47, 8%). У 14 больных с объективными клиническими признаками ХГП, то есть в 15,2% случаев не было выявлено ни одного маркера ДНК исследуемых видов пародонтопатогенов.

Из 92 обследованных диагноз ХГП легкой степени был поставлен- 52 (100%) пациентам. Частота встречаемости маркера ДНК одного вида пародонтопатогена – в 19,2% случаев - у 10 из 52 больных ХГП легкой степени; частота встречаемости маркеров двух видов пародонтопатогенов – 20 (38,5%). Частота выявления ассоциаций нескольких видов у больных ХГП легкой степени была следующей: ассоциации из трех видов пародонтопатогенов – у 6 человек (11,5%); ассоциации из четырех видов пародонтопатогенов у 10 больных (19,2%). Маркеры пяти видов пародонтопатогенных грамотрицательных анаэробных бактерий не выявлены. Отсутствовали маркеры пародонтопатогенных бактерий у 6 человек с диагнозом ХГП легкой степени – 11,5%. (рис.4).

Всего из 92 больных – 40 (100%) пациентам был поставлен диагноз ХГП средней степени тяжести в стадии обострения. До проведения антибактериальной терапии проводилась оценка частоты встречаемости отдельных видов микроорганизмов. Частота встречаемости маркера ДНК одного вида пародонтопатогена – в 10% случаев - у 4 больных ХГП средней степени тяжести. Маркеры двух видов пародонтопатогенных грамотрицательных анаэробных бактерий не выявлены. Ассоциации из трех видов пародонтопатогенов выявлены у 14 человек (35%); ассоциации из четырех видов пародонтопатогенов - у 14 больных (35%). Маркеры пяти видов пародонтопатогенных грамотрицательных анаэробных бактерий не выявлены. У 8 (20% случаев) больных с объективными клиническими признаками ХГП средней степени в стадии обострения не было выявлено маркеров ДНК исследуемых пародонтопатогенов (рис.5).

Рис.3 Анализ отношения к диспансерному наблюдению больных ХГП.

Рис.2 Структура заболеваемости воспалительными заболеваниями пародонта лиц, проживающих в Нижнем Новгороде за период с 1998 по 2008 г.г.

Рис.1 Причины обращения больных ХГП к врачу-пародонтологу.

Рис.6 Бактерицидная активность этидроновой кислоты в системах S. epidermidis, E. Coli in vitro.

Рис.7 Сопоставление бактерицидной активности и цитотоксичности этидроновой кислоты.

Рис.4 Частота встречаемости ассоциаций пародонтопатогенов у больных ХГП легкой степени тяжести.

Рис.5 Частота встречаемости ассоциаций пародонтопатогенов у больных ХГП средней степени тяжести.

Результаты экспериментальных исследований.

Эксперименты показали дозозависимый бактерицидный эффект растворов этидроновой кислоты в отношении грамположительной и грамотрицательной бактериальной флоры (табл.1) после непродолжительного (5 мин) контакта с тест-культурами (патент РФ № 2357737 «Антисептическое средство и способ его применения для лечения и профилактики воспалительных заболеваний пародонта и периимплантатных тканей»). Этидроновая кислота в концентрациях 10%, 3% и 2% (но не 1%) оказывала также и фунгицидное действие в отношении C.albicans.

Таблица 1. Бактерицидный эффект этидроновой кислоты в эксперименте со штаммами: S. epidermidis, E. Coli и C.albicans

Концентрация раствора этидроновой кислоты	Количество КОЕ (M±m)
	S.epidermidis штамм 51-1	E. coli штамм 18М	C.albicans штамм 601
Контроль	302,6 ± 46,6	218,2 ± 34,6	486,3 ± 56,8
10%	9,8 ± 4,4 *	6,2 ± 3,3 *	282,3 ± 17,4*
5%	13,8 ± 5,6 *	8,2 ± 4,7 *	----
3%	27,5 ± 11,3*	14,5 ± 8,2 *	306,6 ± 36,7*
2% **	55,0 ± 25,1*	21,2 ± 10,7*	322,6 ± 43,3*
1%	104,3 ± 40,3*	91,0 ± 37,6*	413,3 ± 78,7

* - достоверность отличий результатов от контроля р<0,05

** - терапевтическая доза препарата

Определяли минимальную бактерицидную концентрацию (МБК) раствора этидроновой кислоты как концентрацию раствора в пробирке повторный высев из которой не дал роста колоний микроорганизмов на чашке - пробирки с 0,5% водным раствором этидроновой кислоты. Минимальная подавляющая концентрация (МПК) раствора этидроновой кислота – 0,5%. Для выявления толерантности типовых представителей грамположительной и грамотрицательной бактериальной флоры S. epidermidis штамм 51-1 и E.coli к раствору этидроновой кислоты определяли отношение МБК к МПК –

0,5% (МБК)/0,5%(МПК)=1, что много меньше 32.

Сравнение бактерицидной активности и цитотоксичности выявило значимый дозозависимый эффект (рис.7). В разведениях 1%, 2%, 3% и 5% прослеживается тенденция к нарастанию бактерицидности – концентрация 1% - 34, 5% колоний, концентрация 2% - 18,2% выживших колоний, концентрация 3% - 9,10% выживших колоний относительно контроля и 5% водный раствор этидроновой кислоты – 4,60% выживших колоний, относительно контроля соответственно. С достоверными различиями между каждым разведением и низкой цитотоксичностью: 86,2%, 82,2%, 83,50% и 84,70% выживших эпителиальных клеток относительно контроля.

Сравнение бактерицидной активности 2% водного раствора этидроновой кислоты с антисептиками на основе хлоргексидина и триклозана.

После инкубации тест-культур с препаратами, содержащими хлоргексидин и триклозан, отсутствовал рост колоний S.epidermidis штамм 51-1, E. coli штамм 18М, C.albicans штамм 601, P. aeruginosa ATSS 27953 на чашках Петри. Действие 2% водного раствора этидроновой кислоты на испытуемые штаммы выявило следующий бактерицидный эффект: количество выживших КОЕ S.epidermidis штамм 51-1 на чашке Петри 18,2% относительно контроля (p<0,05), E. coli штамм 18М – 9,7% относительно контроля (p<0,05), отсутвие роста колоний P. aeruginosa ATSS 27953 на чашках Петри и незначимый (p>0,01) фунгицидный эффект – 66,2% КОЕ C.albicans штамм 601 относительно контроля.

У препаратов на основе хлоргексидина и триклозана для подавления роста колоний на чашках требовалась меньшая концентрация МПК=0,25, у этидроновой кислоты МПК была больше в два раза, как для грамположительных, так и для грамотрицательных бактерий. Тем не менее, как и у сильных антисептиков МБК этидроновой кислоты была равна МПК, что подтверждает ее бактерицидный, а не бактериостатический эффект.

Сравнительное исследование цитотоксического эффекта в отношении буккальных эпителиоцитов.

Процент выживших эпителиоцитов после 5 минут инкубации с 2% водным раствором этидроновой кислоты составил 87, 40% относительно контроля (p>0,05), что было достоверно выше (p<0,01) числа жизнеспособных эпителиальных клеток после инкубации в течении 5 минут с хлоргексидин- и триклозан-содержащими препаратами – 10% и 18,8% выживших эпителиоцитов соответственно.

Таким образом, полученные лабораторные данные по антимикробной активности 2% водного раствора этидроновой кислоты в отношении бактерий, полости рта, наряду с низкой токсичностью свидетельствуют о перспективности работ по внедрению этого средства в стоматологическую практику.

Результаты комплексного лечения больных ХГП, ассоциированного с пародонтопатогенами с применением 2% водного раствора этидроновой кислоты.

Клиническая оценка эффективности применении этидроновой кислоты в качестве антисептического средства проведена нами при комплексном лечении 75 больных ХГП легкой степени тяжести и средней степени тяжести в стадии обострения. Состояние гигиены полости рта и пародонта у обследованных оценивали до лечения, через 14 дней и через 28 дней после окончания лечения (Табл.4). При лечении 43 больных ХГП легкой степени уcтановлено, что при применении этидроновой кислоты наблюдалось существенное улучшение гигиенического состояния полости рта, регистрировалось достоверное снижение ИГ до 0,3±0,1 исходное значение = 1,7±0,1 (р<0,05). Через 14 дней после проведенного курса лечения уровень гигиены полости рта оставался удовлетворительным, отсутствовал мягкий зубной налет, минерализованные зубные отложения, ИГ составил 0,4 балла (p<0,05). Пациенты жалоб не предъявляли, отмечали исчезновение дискомфорта, болезненности десен, кровоточивости при чистке зубов. Во время клинического обследования отмечали отсутвие признаков воспаления: десна бледно-розового цвета, десневой край плотно прилегал к шейкам зубов. Индекс ПМА, и глубина ПК также были достоверно ниже исходных значений - 4,1 вместо 29,0 и 3,0 вместо 3,5 мм до лечения (p<0,05). Через 14 и 28 дней у больных, прошедших курс лечения,

кровоточивости десен и выделения экссудата не выявляли. Пародонтальный индекс составлял 0,2±0,1* баллов. Галитоз не выявили ни у одного пациента.

Таблица 4.

Сравнительная характеристика клинических параметров у больных ХГП легкой степени и больных ХГП средней степени тяжести (М ± m)

Группа	I группа (n=43)			II группа (n=32)
Сроки/ параметр	До лечения	После лечения	14 дней	До лечения	После лечения	14 дней
ИГ, балл	1,7±0,1	0,3±0,1*	0,4±0,1*	2,8±0,53	0,6±0,3*	0,6±0,3*
ПМА	29±2,3	4,1±0,2*	3,6±0,2*	47,5±4,5	6,5±1,5*	4,7±2,3*
PI, балл	2,3±0,1	0,6±0,3*	0,2±0,1*	4,6±0,4	2,1±0,2*	0,6±0,2*
ПК, мм	3,5±0,2	3,0±0,1*	3,0±0,1*	5,3±0,13	4,2±0,3*	3,9±0,1*
ИК,%	100,0	0	0	100,0	0	9,3
Экссуд., %	9,0	0	0	100,0	0	0

Обозначения: * - достоверные отличия с данными до лечения, р<0,05

Микробиологическое исследование выявило полную эрадикацию пародонтопатогенов – у 40 (83,3%) больных и резкое снижение частоты выявления маркеров ДНК представителей основных видов, потенциально способных поддерживать воспаление в тканях пародонта у 3 больных (16,6%), у которых изначально были выявлены ассоциации из 3-4 видов пародонтопатогенных бактерий. После проведенного лечения частота встречаемости T. forsithia у больных ХГП легкой степени снизилась в 10 раз: с 83,3% случаев до лечения до 8,33% - после проведенного лечения. Полностью элиминированы P. intermedia и T. denticola, маркеры ДНК, которых до лечения выделены из пародонтальных карманов в 41,6% случаев. В 2 раза снизилась частота встречаемости видов A. actinomycetemcomitans и P. gingivalis с 16,6% до 8,33%.

Показатели естественной колонизации до лечения в группе пациентов с ХГПЛС 43 колебались от 8,71 до 163,9. По показателю естественной колонизации пациенты I группы сравнения разделились на две подгруппы: среднее значение показателя естественной колонизации в каждой подгруппе было, 14,3 ± 5,1 и 143,5 ± 34,5 соответственно. У всех пациентов I группы после курса ротовых ванночек 2% водным раствором этидроновой кислоты ПЕК соответствовал физиологическому уровню естественной колонизации буккальных эпителиоцитов. У 20 больных происходило недостоверное увеличение ПЕК с 14,3 ± 5,1 до 22,5±6,3 бактерий/эпителиоцит, что связано с увеличением количества стабилизирующих видов на фоне уменьшения до единичных видов или полной элиминации пародонтопатогенов. У 23 у пациентов происходило достоверное снижение практически в три раза ПКЕ до 49,5±6,4, что находится в пределах границы нормы для ПЕК (от 10 до 59 бактерий/эпителиоцит). Отмечена более равномерная обсемененность эпителиоцитов оральными стрептококками, чем до лечения.

У пациентов, которым 2% водный раствор этидроновой кислоты был назначен в сочетании с рокситромицином (II группа), через 3-4 дня после прекращения обильного выделения гнойного экссудата из пародонтальных карманов была проведена профессиональная гигиена полости рта. На фоне проводимого комплексного лечения отмечали улучшение как субъективных, так и объективных проявлений заболевания: уменьшались болезненность и кровоточивость десен, галитоз. Объективно отмечали уплотнение десневого края за счет уменьшения отека, существенное улучшение гигиенического состояния полости рта, отмечена тенденция к снижению выделения экссудата из пародонтальных карманов. На 14 –е сутки отмечали достоверное снижение клинических индексов: ИГ с 2,8±0,53 до 0,6±0,3*; PMA с 47,5±4,5 до 6,5±1,5*(P<0,05). Выделения экссудата из ПК не отмечено, кровоточивость десен сохранялась у 3 пациентов (9,3%). Через две недели при повторном осмотре у больных II группы, состояние тканей пародонта по индексным критериям существенно не отличалось от достигнутого непосредственно после лечения. Десна бледно-розового цвета плотно прилегала к шейкам зубов, ПК глубиной до 3,9±0,1*, экссудации из ПК не отмечали, однако кровоточивость десен по-прежнему сохранялась у 3-ех пациентов. Галитоз отсутствовал у всех пациентов после проведенного лечения.

При контрольном исследовании микрофлоры через 14 дней после комплексного лечения выявлена полная эрадикация пародонтопатогенов – у 25 (77%) больных и снижение частоты выявления маркеров ДНК пародонтопатогенов в 23% случаев, то есть у 7 больных, у которых изначально были выявлены ассоциации из 3-4 видов исследуемых бактерий. После проведенного лечения частота встречаемости T. forsithia у больных ХГП средней степени тяжести снизилась практически в 4 раза: с 100% случаев до лечения до 23%. Полностью удалены и не определялись маркеры P. intermedia, T. denticolа и A. actinomycetemcomitans, в то время как до лечения они были выделены из пародонтальных карманов в 41,6%, 61,5% и 23% случаев соответственно. В 4 раза снизилась частота встречаемости P. gingivalis с 61,50% до 15,40%.

У пациентов II группы сравнения с ХГПСС в стадии обострения до начала лечения ПЕК был достоверно выше (p<0,05) в два раза выше верхней границы нормы (59 бактерий/эпителиоцит) - 118 ± 35,3 соответственно. В препаратах встречались эпителиоциты, у которых на поверхности адгезировано 300 и более бактерий, а также эпителиоциты полностью свободные от стрептококков, что свидетельствует о нарушении микробиоценоза полости рта у больных с ХГП.

После курса лечения, включающего рокситромицин в течение 7 дней и курс ротовых ванночек 2% водным раствором этидроновой кислоты в течение двух недель, происходило достоверное снижение ПЕК (p<0,05) с 118 ± 35,3 до 12±1,7, что соответствовало физиологическому уровню естественной колонизации буккальных эпителиоцитов.

Для полной характеристики комплексного лечения с использованием этидроновой кислоты были зарегистрированы субъективные критерии оценки применения ее в качестве антисептического средства. Все пациенты, проходившие курс лечения не отмечали местного раздражающего действия и других побочных эффектов. Однако 6 из 75 пациентов отмечали изменение вкусовой чувствительности и сухость в полости рта сразу после процедуры. Данные нежелательные эффекты не имели клинического значения, быстро купировались и не требовали отмены препарата. Полученные нами данные указывают на оптимальные органолептические свойства и хорошую переносимость 2% водного раствора этидроновой кислоты.

Таким образом, анализ клинических, лабораторных и микробиологических исследований показал стабильную эффективность лечения ХГП с применением этидроновой кислоты в качестве бактерицидного средства.

ВЫВОДЫ.

1. Ретроспективное исследование историй болезни выявило существенные недостатки традиционных методов диагностики и лечения ХГП: не учитывается гетерогеннность этиологических факторов ХГП и, в связи с этим, отсутствует дифференцированный подход к лечению. Проводимая антибактериальная терапия вызывает осложнения и является причиной прерывания курса лечения, отказа от постановки на диспансерный учет и курсов противорецидивной терапии.

2. Относительная частота выявления в патологических пародонтальных карманах у лиц Нижегородского региона ДНК P. intermedia- 33%, T. forsithia – 78%, T. denticola - 48%, A. actinomycetemcomitans- 26%, P. gingivalis- 48%. В 15% случаев не выявлено маркеров ДНК исследуемых пародонтопатогенов.

3. Этидроновая кислота в концентрации 1%-10% обладает выраженной дозозависимой бактерицидной активностью in vitro против грамположительной и грамотрицательной нормальной бактериальной флоры человека; в концентрациях 10%, 3% и 2% (но не 1%) оказывает слабое фунгицидное действие в отношении C.albicans. У микроорганизмов не формируется резистентность к действию данного вещества.

4. 2% раствор этидроновой кислоты проявляет антимикробную активность, сопоставимую с действием оральных антисептиков на основе хлоргексидина и триклозана, не оказывая значимого цитотоксического действия на эпителиоциты полости рта и обладая лучшими органолептическими свойствами.

5. Разработан способ лечения и профилактики воспалительных заболеваний пародонта на основе использования 2% водного раствора этидроновой кислоты в качестве антисептического средства.

6. 2% водный раствор этидроновой кислоты высоко эффективен при консервативном лечении ХГП легкой степени и при сочетанном применении с рокситромицином при лечении ХГП средней степени, способствуя нормализации клинико-лабораторных параметров и обеспечивая снижение частоты выявления в области зубодесневой борозды грамотрицательных анаэробных пародонтопатогенных видов бактерий - T. forsithia и P. gingivalis, и эрадикацию P. intermedia, T. denticola и A. actinomycetemcomitans.

ПРАКТИЧЕСКИЕ РЕКОМЕНДАЦИИ

1. Для уточнения этиологии ХГП с целью обоснованного назначения, как местного, так и системного антибактериального лечения, показано проведение мультиплексной полимеразной цепной реакции, позволяющей выявить генетические маркеры пародонтопатогенных бактерий 5 видов: T. forsythia, A. actinomycetemcomitans, P. gingivalis, P. intermedia, T. denticola.
2. В комплексном этиопатогенетическом лечении больных ХГП легкой степени тяжести, ассоциированным с пародонтопатогенами, рекомендуется проведение местной антимикробной терапии с использованием 2% водного раствора этидроновой кислоты в виде ротовых ванночек в течение 5 минут 2 раза в день после еды и последующей чистки зубов, в течение двух недель, в сочетании с профессиональной гигиеной полсти рта.
3. У больных ХГП средней степени тяжести в стадии обострения, ассоциированным с пародонтопатогенами рекомендуется местное антибактериальное лечения 2% водным раствором этидроновой кислоты в течение 14 дней в сочетании с рокситромицином (0,3 г) в течение 7 дней и профессиональной гигиеной полости рта.
4. Если после проведенного лечения ХГП происходит нормализация клинической картины, а при контрольном проведении ПЦР-диагностики выявляются единичные пародонтопатогены, целесообразно определение таких больных в группу риска. И при появлении признаков ухудшения пародонтологического статуса назначение системной антибактериальной терапии.

СПИСОК РАБОТ, ОПУБЛИКОВАННЫХ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ:

1. Булгаков В.С, Шакеров И.И., Лукоянова Т.В. Современные представления о некоторых осложнениях дентальной имлантации. Научные труды VII международной научно-практической конференции «Здоровье и образование в ХХI веке». М.: 2006; 95

2. Булгаков В.С, Шакеров И.И., Лукоянова Т.В. Современные аспекты профилактики воспалительно-деструктивных осложнений после дентальной имплантации. Научные труды VIII международной научно-практической конференции «Здоровье и образование в ХХI веке», М.: 2007, 164

3. Булгаков В.С., Лукоянова Т.В., Шакеров И.И. Роль диспансеризации в клинике ортопедической стоматологии при протезировании с использованием имплантатов // Вестник Российского Университета Дружбы Народов. Серия Медицина. -2010. - №1. - С. 125-129.

4. Заславская М.И., Лукоянова Т.В., Булгаков В.С., Шакеров И.И. Фунгицидный эффект препарата «Ксидифон» в системах с CANDIDA ALBICANS IN VITRO. Тезисы докладов Современная микология в России. II съезд микологов России. Раздел II. М: 2008 год, 292-293.

5. Лукоянова Т.В., Булгаков В.С., Царев В.Н. Оптимизация лечения и профилактики воспалительных заболеваний полости рта с помощью этидроновой кислоты. Cборник материалов конгресса XVII «Человек и лекарство» М.: 2010, 172-173.

6. Лукоянова Т.В., Булгаков В.С., Царев В.Н. Изучение токсического действия этидроновой кислоты на эпителиоциты слизистой оболочки полости рта.

Cборник материалов конгресса XVII «Человек и лекарство» М.: 2010, 667-668.

7. Лукоянова Т.В., Булгаков В.С., Кравцов Э.Г., Заславская М.И., Лукова О.А., Царев В.Н. Эффективность применения этидроновой кислоты как средства профилактики воспалительных заболеваний полости рта // Российская стоматология. – 2010. - №5, Том 3. – С. 26-28.

8. Лукоянова Т.В., Булгаков В.С., Заславская М.И., Шакеров И.И., Шакеров И.А., Шакеров Р.И Антисептическое средство и способ его применения для лечения и профилактики воспалительных заболеваний пародонта и периимплантатных тканей. Патент РФ на изобретение № 2357737 по заяв. № 2007145631/15 от 11.12.07; заявитель и патентообладатель ГОУ ВПО НИЖГМА РОСЗДРАВА, ГОУ ВПО РУДН. (опубл. в Бюл. Изобретения и полезные модели. № 16. от 10.06.09г.)