Система цитокинов и их рецепторов при хронических вирусных инфекциях: молекулярные механизмы дизрегуляции
На правах рукописи
Зима Анастасия Павловна
Система цитокинов и их рецепторов
при хронических вирусных инфекциях: молекулярные механизмы дизрегуляции
14.00.16 – патологическая физиология
03.00.25 – гистология, цитология, клеточная биология
Автореферат
диссертации на соискание ученой степени
доктора медицинских наук
Томск – 2008
Работа выполнена в Государственном образовательном учреждении высшего профессионального образования «Сибирский государственный медицинский университет Федерального агентства по здравоохранению и социальному развитию»
Научные консультанты:
доктор медицинских наук, Рязанцева
профессор Наталья Владимировна
доктор медицинских наук,
профессор, академик РАМН, Новицкий
Заслуженный деятель науки РФ Вячеслав Викторович
Официальные оппоненты:
доктор медицинских наук, Степовая
профессор Елена Алексеевна
доктор медицинских наук, Дыгай
профессор, академик РАМН Александр Михайлович
доктор медицинских наук, Шкурупий
профессор, академик РАМН Вячеслав Алексеевич
Ведущая организация:
Государственное учреждение научно-исследовательский институт вирусологии имени Д.И. Ивановского Российской академии медицинских наук (г. Москва)
Защита состоится «___» __________2009 г. в ______часов на заседании диссертационного совета Д 208.096.01 при Сибирском государственном медицинском университете (643050, г. Томск, ул. Московский тракт, 2)
С диссертацией можно ознакомиться в научно-медицинской библиотеке Сибирского государственного медицинского университета
Автореферат разослан «___» __________ 2008 г.
Ученый секретарь
диссертационного совета Суханова Г.А.
ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ
Актуальность исследования. Проблема персистентных вирусных инфекций приобретает все большую актуальность в современной медико-биологической науке и практическом здравоохранении в связи с возросшей заболеваемостью, их широким распространением среди трудоспособного населения, недостаточной эффективностью современных методов профилактики. Особо следует подчеркнуть трудность прогнозирования характера течения заболевания, выявления предрасположенности/резистентности к развитию хронических форм инфекции, отсутствие молекулярных технологий предупреждения развития осложнений: дегенеративных, фибротических и опухолевых процессов. Актуальным аспектом практической медицины остается недостаточная эффективность противовирусной терапии, а также отсутствие четких предикторов эффективности проведения дорогостоящих лечебных мероприятий применительно к конкретному пациенту. Принципиально важно, что растет число вялотекущих, стертых и бессимптомных форм вирусных инфекций [Воробьев А.А. и соавт., 2000; Покровский В.И. и соавт., 2000; Шевченко Ю.Л., 2000; Пименов Е.В. и соавт., 2003; Ивашкин В.Т., 2004; Hoffman H.R., 2006; Львов Д.К., Злобин В.И., 2007; Kneisson V.M. et al., 2007].
Эволюция инфекционной патологии ставит перед медициной новые задачи, обусловливая необходимость расширения и углубления фундаментальных исследований процессов в системе патоген-хозяин. Представления о патогенезе инфекционных заболеваний человека весьма динамичны. В настоящее время многие вопросы, касающиеся молекулярной патофизиологии инфекций, вызванных вирусами семейства Flaviviridae, остаются открытыми. В частности, до конца не установлены факторы, определяющие разные исходы болезни: от полной элиминации инфекта и бессимптомного носительства до трансформации в прогредиентную хроническую форму с формированием осложнений (цирроз печени, гепатоцеллюлярная карцинома в случае вирусного гепатита С, парезы, параличи и аутоиммунные процессы при клещевом энцефалите). Это обосновывает необходимость проведения фундаментальных исследований, направленных на идентификацию общих и специфических для конкретной нозологии молекулярно-генетических факторов, определяющих ключевые фенотипические характеристики заболевания – от исхода взаимодействия патогена и организма человека до риска развития тяжелых форм заболевания и его осложнений, вероятности адекватного ответа на лекарственную терапию.
На современном этапе медицинских знаний нет сомнений в том, что форма течения инфекционного процесса определяется сложным комплексом взаимодействия патогена и организма человека. Известно, что особенности формирования и течения хронической инфекции обусловлены, с одной стороны, гетерогенностью самого патогена (вирулентность, контагиозность, лекарственная устойчивость), а, с другой, – определяются состоянием иммунной системы организма, от адекватности функционирования которой зависят характер течения и исход заболевания [Richardson M.M., 2006; Holden A.F. et al., 2007]. Факт формирования расстройств иммунного реагирования при развитии вирусных инфекций установлен давно. Известно, что возбудители инфекционных заболеваний обладают иммуномодулирующей активностью, вызывая иммунодефицитные состояния, степень выраженности которых связана непосредственно с характером и тяжестью инфекционного процесса и зависит от преморбидного фона пациента [Долгих В.Т., 2000; Павлович С.А., 2001; Субботин А.В. и соавт., 2002; Чуйкова К.И., 2002; Ивашкин В.Т. и соавт., 2004; Серов В.В. и соавт., 2004; Рязанцева Н.В. и соавт., 2006]. Особо следует акцентировать внимание на том, что флавивирусы, в том числе вирус гепатита С (hepatitis C virus – HCV) и вирус клещевого энцефалита (tick-borne encephalitis virus – TBEV), способны размножаться в эффекторных клетках иммунной системы, реализуя тем самым механизмы «ускользания» от иммунного надзора [Букринская А.Г., 1986; Погодина В.В. и соавт., 1986; Серов В.В., Мухин Н.А., 2000; Ивашкин В.Т. и соавт., 2001; Пименов Е.В. и соавт., 2003].
Особую роль в дизрегуляции функционирования иммунной системы при развитии инфекционного процесса играют нарушения межклеточной сигнализации. Известно, что в становлении и стабилизации контактов между взаимодействующими в ходе реализации противоинфекционной защиты клетками макроорганизма важное значение принадлежит биологической мультисистеме – цитокин-рецепторной сети [Ярилин А.А., 1999; Фрейдлин И.С. и соавт., 2001; Хаитов Р.М., 2001; Симбирцев А.С., 2004]. В современной мировой литературе существуют данные, свидетельствующие о том, что возбудители могут использовать разные молекулярные механизмы, опосредующие изменение роли системы цитокинов в межклеточной кооперации иммуноцитов. В основе этого могут лежать как непосредственное воздействие патогенов на продукцию цитокинов мононуклеарными лейкоцитами и рецепторный аппарат лимфоцитов, так и опосредованное их влияние путем супрессии внутриклеточных сигналов активации, механизмов сигнальной трансдукции и транскрипции [Ивашкин В.Т. и соавт., 2000; Кетлинский С.А., 2002; Царегородцева Т.М., Серова Т.И., 2003; Gomez I. et al., 2004; Nelson B.H., 2004; Best S.M. et al., 2005; Smith P.L. et al., 2005; Boettler T. et al., 2005; Bolacchi F. et al., 2006; Werme K. et al., 2008].
Высказывается предположение о генетически детерминированных нарушениях коммуникативных рецепторзависимых взаимодействий эффекторных клеток, а, следовательно, формирования иммунного ответа и элиминации инфекта. Установлено, что гены цитокинов и их рецепторов в популяции человека характеризуются аллельным полиморфизмом и наличием изоформ, что определяет их способность модулировать направление иммунного ответа и лежит в основе предрасположенности к саморазрешающейся инфекции или развитию хронического инфекционного процесса [Al Sharif F. et al., 1999; Рахманова А.Г. и соавт., 1999; Цой Р.М., 2001; Сенников С.В. и соавт., 2002; Ракова И.Г., Коненков В.И., 2004; Бархаш А.В. и соавт., 2005; Richardson et al., 2005; Коненков В.И. и соавт., 2006; Фрейдин М.Б. и соавт., 2006; Авдошина В.В. и соавт., 2007; Коненков В.И. и соавт., 2007; Chen T.Y. et al., 2007; Hennig B.J. et al., 2007; Lund R.J. et al., 2007; Persico M. et al., 2007; Hegazy D. et al., 2008].
Изучение механизмов, определяющих связь генотипа или аллельного варианта и клинических особенностей инфекционных заболеваний, является одним из приоритетных направлений молекулярной медицины. Многие вопросы, касающиеся молекулярно-генетических основ предрасположенности и резистентности организма к инфекции, являются дискутабельными. Накопленные в обозначенной тематике факты, однако, зачастую носят сугубо феноменологический характер. В связи с этим представляется весьма актуальным оценить ассоциированность предрасположенности/резистентности организма человека к персистентному течению флавивирусных инфекций с рядом аллельных вариантов генов иммуноцитокинов и их рецепторов. Анализ распространенности различных аллелей генов интерлейкинов и их рецепторов среди пациентов с хронической персистенцией вирусов семейства Flaviviridae позволит установить общие факторы, определяющие связь между индивидуальным молекулярно-генетическим профилем системы межклеточной кооперации и характером течения инфекционного процесса. В то же время логично предположить существование совокупности специфических молекулярно-генетических маркеров для каждого конкретного заболевания. Полученные в указанном аспекте фундаментальные знания не только дополнят существующие на сегодняшний день представления о механизмах генетически детерминированной предрасположенности и резистентности организма человека к хроническому течению Flaviviridae-инфекции, но и могут послужить основанием для разработки иммуногенетических подходов для ранней диагностики, прогноза, лечения и профилактики заболеваний.
Цель исследования: установить молекулярные механизмы дизрегуляции цитокинопосредованной кооперации иммунокомпетентных клеток крови при хронических инфекциях, вызванных вирусами семейства Flaviviridae.
Задачи исследования:
- Оценить продукцию цитокинов (IL2, IL4, IL10, TNF и IFN) мононуклеарными лейкоцитами крови и направленность Th1/Th2–поляризации иммунного ответа при длительной персистенции вирусов семейства Flaviviridae (хронический вирусный гепатит, длительная антигенемия вируса клещевого энцефалита).
- Дать комплексную оценку состояния рецепторного аппарата (IL2R, IL4R, IL10R, TNFR, sTNFR, IFNR) лимфоцитов крови у пациентов с длительной персистенцией вирусов семейства Flaviviridae.
- Установить общие закономерности и особенности изменений цитокинопосредованной кооперации иммунокомпетентных клеток крови при хроническом вирусном гепатите С и клещевом энцефалите в зависимости от нозологической принадлежности инфекта, клинического течения инфекции.
- Выявить молекулярно-генетические механизмы дизрегуляции цитокиновой системы при хронической Flaviviridae-инфекции у лиц европеоидной популяции, проживающих на территории Западной Сибири.
Научная новизна. Впервые с привлечением современных гематологических, иммунологических и молекулярно-биологических методов исследования представлены знания фундаментального характера о роли генетически детерминированных механизмов дизрегуляции системы цитокинов в формировании длительной персистенции вирусов семейства Flaviviridae.
Показано, что у пациентов с хроническим носительством вирусов семейства Flaviviridae (хронический вирусный гепатит, длительная антигенемия вируса клещевого энцефалита) развивается дисбаланс цитокинопосредованного кооперативного взаимодействия иммунокомпетентных клеток крови, опосредующий поляризацию иммунного ответа в направлении Th2, что подтверждается фактом обнаружения угнетения продукции и рецепции мононуклеарными лейкоцитами крови Th1-цитокинов (IL2, IL2R, IL12, TNF, TNFR) и увеличения – Th2-цитокинов (IL4, IL4R, IL10, IL10R) и комплиментарных им рецепторов (IL2R и TNFR).
Установлено, что характер и направленность изменений продукции и рецепции цитокинов (IL2, IL4, IL10, TNF, IFN) не зависят от этиологического варианта флавивирусной инфекции и согласуются с концепцией типовых механизмов развития инфекционного процесса.
Показано, что при остром клещевом энцефалите возрастает продукция мононуклеарными лейкоцитами крови Th1-цитокинов (TNF, IL2, IFN), в то время как длительная антигенемия вируса клещевого энцефалита сопровождается дисбалансом продукции и рецепции цитокинов эффекторными клетками крови. Установлено, что закономерности нарушения системы цитокинов и их рецепторов при персистенции TBEV определяются активностью инфекционного процесса.
Впервые комплексно и в сравнительном аспекте представлена характеристика системы цитокинов и их рецепторов у пациентов с длительной антигенемией вируса клещевого энцефалита, сопровождающейся остаточными проявлениями нейроинфекции в виде цереброгенной астении, пациентов с бессимптомным носительством антигена вируса клещевого энцефалита и больных хроническим клещевым энцефалитом (полиомиелитическая форма, рецидивирующее течение). Установлено, что цитокиновый статус крови у пациентов с длительной антигенемией TBEV и больных хроническим клещевым энцефалитом характеризуется однонаправленными различной степени выраженности изменениями продукции и рецепции основных иммунорегуляторных цитокинов (IL2, IL4, IL10, TNF, IFN).
Выявлено, что у больных хроническим вирусным гепатитом С слабовыраженной и умеренной степени активности (на основании определения полуколичественного гистологического индекса активности - индекс Knodell), изменения в системе цитокинов и их рецепторов носят однонаправленный характер, при этом являются более выраженными в отношении изменения продукции Th2-цитокинов у больных хроническим вирусным гепатитом С умеренной степени активности.
Впервые проведено исследование полиморфизма генов цитокинов и рецепторов (IL2, IL4, IL4R, IL10, IL12, TNF) у лиц европеоидной популяции с хронической Flaviviridae-инфекцией, проживающих на территории Западной Сибири. Определено, что полиморфизмы в промоторных регионах генов IL10 и IL4RA50 обладают протективным эффектом в отношении HCV-инфекции; генов TNFA, IL12p40 и IL4RA50 – в отношении длительной антигенемии TBEV. Предрасположенность к развитию хронического вирусного гепатита С ассоциирована с аллелями промоторных регионов -330G гена IL2 и -592A гена IL10; клещевой нейроинфекции с C/C генотипом промоторного региона A-1188C гена IL12p40, Val/Ile генотипом промоторного региона Ile-50Val гена IL4R, полиморфизмами в промоторных регионах Q-576R гена IL4R и C-592A гена IL10.
Теоретическая и практическая значимость. Впервые установлены закономерности нарушения цитокинопосредованного кооперативного взаимодействия иммунокомпетентных клеток крови у пациентов с длительной персистенцией вирусов семейства Flaviviridae (хронический вирусный гепатит, длительная антигенемия вируса клещевого энцефалита). Определена важная роль в этом процессе нарушения продукции и рецепции иммунорегуляторных цитокинов (IL2, IL4, IL10, TNF, IFN), регулирующих баланс Th1/Th2-пути антигенспецифического иммунного ответа. Установлены иммуногенетические факторы, обладающие протективным эффектом и определяющие риск прогрессирования и хронизации вирусного гепатита в отношении длительной персистенции вирусов гепатита С и антигенемии вируса клещевого энцефалита.
Положения исследования могут служить основанием для разработки стратегии изучения молекулярных и клеточных механизмов формирования длительной персистенции вирусов в организме. Полученные фундаментальные знания представляют основу для разработки новых подходов к прогнозированию клинического течения клещевого энцефалита и вирусного гепатита С, а также технологии персонализированной коррекции дизрегуляции цитокинопосредованного кооперативного взаимодействия иммунокомпетентных клеток крови с целью проведения патогенетически обоснованной терапии иммунных нарушений и своевременной профилактики развития хронических форм инфекции, а также осложнений, возникающих при длительной вирусной персистенции.
Положения, выносимые на защиту:
1. При хронических вирусных инфекциях, вызванных вирусами семейства Flaviviridae (длительная антигенемия вируса клещевого энцефалита, хронический вирусный гепатит С), развивается типовой дисбаланс системы цитокинов.
2. Преимущественная активация Th2-пути иммунного ответа при длительной персистенции вирусов семейства Flaviviridae (длительная антигенемия вируса клещевого энцефалита, хронический вирусный гепатит С) выражается в угнетении продукции IL2, IL12 и TNF, увеличении секреции IL4 и IL10 мононуклеарными лейкоцитами крови.
3. Длительная персистенция вирусов семейства Flaviviridae (длительная антигенемия вируса клещевого энцефалита, хронический вирусный гепатит С) сопровождается дисбалансом продукции IL2, IL4, IL10 и TNF, а также презентации на лимфоцитах комплиментарных им рецепторов (IL2R, IL4R, IL10R и TNFR1), опосредующим нарушение межклеточной коммуникации иммунокомпетентных клеток крови.
4. Интра- и интернозологическая (длительная антигенемия вируса клещевого энцефалита, хронический вирусный гепатит С) оценка нарушений функционирования системы цитокинов при хронической Flaviviridae-инфекции демонстрирует однонаправленность, но различную степень их выраженности.
5. Среди лиц европеоидной популяции, проживающих на территории Западной Сибири, степень риска прогрессирования и хронизации вирусного гепатита С ассоциирована с аллелями промоторных регионов -330G гена IL2 и -592A гена IL10 (С/А генотип); клещевого энцефалита A-1188C гена IL12p40 (C/C генотип), Ile-50Val гена IL4R, Q-576R гена IL4R, C-592A гена IL10; резистентность к заболеванию хроническим вирусным гепатитом С C-592A гена IL10 (C/С генотип) и Ile-50Val гена IL4RA50; в отношении длительной антигенемии TBEV G-308A гена TNFA, A-1188C гена IL12p40 (А/А генотип), Ile-50Val гена IL4R.
Апробация и реализация работы. Результаты проведенных исследований докладывались и обсуждались на второй международной конференции «Патофизиология и современная медицина» (Москва, 2004); V Международном конгрессе молодых ученых и специалистов «Науки о человеке» (Томск, 2004); III российский конгрессе по патофизиологии с международным участием «Дизрегуляционная патология органов и систем (экспериментальная и клиническая патофизиология)» (Москва, 2004); Всероссийской конференции «Актуальные вопросы гематологии и трансфузиологии» (Санкт-Петербург, 2004); VI конгрессе с международным участием «Паллиативная медицина и реабилитация в здравоохранении» (Анталия, 2004); II Международной конференции «Молекулярная медицина и биобезопасность» (Москва, 2005); Всероссийской конференции «Компенсаторно-приспособительные процессы: фундаментальные экологические и клинические аспекты» (Новосибирск, 2004); Всероссийской научно-практической конференции «Вирусные гепатиты - проблемы эпидемиологии, диагностики, лечения и профилактики» (Москва, 2005); Всероссийской научно-практической конференции с международным участием к 100-летию со дня рождения А.Г. Панова «Современное состояние проблемы нейроинфекций» (Санкт-Петербург, 2005); Международном конгрессе «Иммунитет и болезни: от теории к терапии» (Москва, 2005); Всероссийском научном симпозиуме «Цитокины. Стволовая клетка. Иммунитет.» (Новосибирск, 2005); V Сибирском физиологическом съезде (Томск, 2005); ХII Российском Национальном конгрессе «Человек и лекарство» (Москва, 2005); Всероссийской научно-практическая конференции «Современная ситуация и перспективы борьбы с клещевыми инфекциями в ХХI веке» (Томск, 2006); Российском медицинском форуме с международным участием «Фундаментальная наука и практика» (Москва, 2006); Съезде неврологов Сибирского федерального округа (Ярославль, 2006); 15 Российско-Японский Симпозиуме медицинского обмена «Москва-2007» Пути развития и перспективы (Благовещенск, 2007); II Российско-Германской конференции Форума Коха-Мечникова «Туберкулез, СПИД, вирусные гепатиты, проблемы безопасности крови и менеджмент в здравоохранении» (Томск, 2007); Всероссийской научной конференции «Современные научные и прикладные аспекты клещевого энцефалита», Москва, 15-16 ноября 2007.
Основные положения и выводы диссертационной работы используются в учебном процессе кафедры патофизиологии (разделы «Патофизиология системы крови», «Патофизиология инфекционного процесса», «Патофизиология иммунной системы», «Патофизиология клетки»), микробиологии (разделы «Рабдо- и арбовирусы», «Возбудители гепатитов»), кафедры фундаментальных основ клинической медицины (разделы «Клиническая патофизиология реактивности организма», «Молекулярные основы патологии»), кафедры морфологии и общей патологии («Инфекция и иммунитет»), а также в лекционном курсе по инфекционным болезням для студентов лечебного, педиатрического и медико-биологического факультетов Сибирского государственного медицинского университета.
В работе приводятся результаты исследований, поддержанных Советом по грантам при Президенте РФ для поддержки ведущих научных школ РФ по проблеме «Молекулярные механизмы нарушения структуры, метаболизма и функции клеток крови при патологии» (НШ-1051.2003.4), «Молекулярные основы нарушения гомеостаза клеток крови при актуальных заболеваниях инфекционной и неинфекционной природы» (НШ-4153.2006.7), «Роль генетически детерминированных реакций системы крови в патоморфозе инфекционных заболеваний» (НШ-2334.2008.7), а также результаты научно-исследовательских работ «Молекулярные механизмы предрасположенности и резистентности организма человека к персистентным бактериальным и вирусным инфекциям» РИ-112/001/158 (Государственный контракт от 05.09.2005 г. № 02.445.11.7110), «Молекулярные и клеточные основы управления реактивностью системы крови при актуальных заболеваниях инфекционной природы» 2006-РИ–112.0/001/384 (Государственный контракт от 09.06.2006 г. № 02.445.11.7419), «Молекулярные основы персонализированной терапии социально-значимых инфекционных заболеваний и прогнозирование исхода взаимодействия инфектогена и иммунной системы макроорганизма» (Государственный контракт от 27.02.07 г. № 02.512.11.2040), «Молекулярно-генетические основы управления адаптационной реактивностью системы крови человека при инфекции» (Государственный контракт от 05.06.2007 г. № 02.512.11.2112), в выполненных в рамках Федеральной целевой научно-технической программы «Исследования и разработки по приоритетным направлениям развития науки и техники на 2002-2006, 2007-2012 годы».
Публикации. По теме диссертации опубликовано 44 работы, из них 16 статей в ведущих рецензируемых журналах и изданиях, определенных ВАК РФ, 28 статей и тезисов в материалах конференций, конгрессов и съездов.
Структура и объем диссертации. Диссертация изложена на 352 страницах машинописного текста и состоит из введения, четырёх глав, выводов и списка использованной литературы. Работа иллюстрирована 15 рисунками и 97 таблицами. Библиографический указатель включает 534 источника (203 - отечественных и 351 - иностранных).
ХАРАКТЕРИСТИКА КЛИНИЧЕСКОГО МАТЕРИАЛА И
МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ
В основу настоящей работы положены результаты комплексного клинико-лабораторного обследования 311 человек (188 мужчин и 123 женщины в возрасте от 18 до 55 лет, средний возраст – 33±3 лет), инфицированных вирусами клещевого энцефалита и гепатита С. Обследованные пациенты находились на стационарном лечении и диспансерном учете в инфекционном отделении госпитальных клиник ГОУ ВПО СибГМУ Росздрава (главный врач – Заслуженный врач РФ канд. мед. наук В.М. Шевелев, заведующий отделением – канд. мед. наук, доцент Н.С. Бужак), в терапевтическом отделении медико-санитарной части «Строитель» г. Томска (главный врач – Н.Н. Бартфельд, заведующий отделением – О.В. Буров), гастроэнтерологическом отделении Томской областной клинической больницы (главный врач – Заслуженный врач РФ Б.Т. Серых, заведующий отделением – С.Ю. Стан) и инфекционном отделении городской больницы №3 г. Томска (главный врач – канд. мед. наук М.А. Лукашев, заведующий отделением – Г.В. Западаева).
Набор клинического материала осуществлялся при непосредственном участии заведующего кафедрой инфекционных болезней ГОУ ВПО СибГМУ Росздрава д-ра мед. наук, профессора А.В. Лепехина, заведующего кафедрой терапии ФУВ и ППС ГОУ ВПО СибГМУ Росздрава д-ра мед. наук, профессора Э.И. Белобородовой и профессора кафедры неврологии и нейрохирургии ГОУ ВПО СибГМУ Росздрава д-ра мед. наук Н.Г. Жуковой.
Клинически и анамнестически у всех обследованных лиц были исключены инфекционные заболевания другой этиологии, обострение хронических воспалительных процессов, аутоиммунные, наследственные и психические болезни, а также злоупотребление алкоголем и прием гепатотоксических лекарств.
В зависимости от этиологического фактора и ведущей органной патологии обследованные пациенты были разделены на две группы. Первую группу составили 196 человек, инфицированных вирусом клещевого энцефалита, ко второй – были отнесены 115 пациентов с хроническим вирусным гепатитом С.
Контрольной группой служили 80 здоровых доноров с аналогичными характеристиками по полу и возрасту (54 мужчины и 26 женщин в возрасте от 20 до 42 лет, средний возраст – 29±4 лет).
Согласно клинической классификации, предложенной Н.Г. Жуковой и соавт. [2002], все обследованные пациенты с антигенемией вируса клещевого энцефалита были разделены на следующие группы:
I группа – 25 пациентов с острой антигенемией вируса клещевого энцефалита (манифестная лихорадочная формы средней степени тяжести);
II группа – 89 пациентов с длительным бессимптомным носительством антигена TBEV (более 6 мес после острого периода клещевого энцефалита);
III группа – 75 пациентов с длительной антигенемией TBEV, сопровождавшейся остаточными проявлениями клещевого энцефалита (более 6 мес после острого периода клещевого энцефалита);
IV группа – 7 больных, страдающих хроническим клещевым энцефалитом (полиомиелитическая форма, рецидивирующее течение).
Первую группу обследованных лиц составили пациенты с острой антигенемией вируса клещевого энцефалита. Диагноз клещевого энцефалита (рубрика А84.0 МКБ-10) в острый период заболевания верифицировался на основании данных оценки неврологического статуса, определения уровня специфических антител к антигену вируса клещевого энцефалита в клеще (35%) и крови у пациентов (100%) методами непрямой реакции гемагглютинации и иммуноферментного анализа (ИФА), специфических антител классов IgM (87%) и IgG (74%) к антигену TBEV (ИФА), обнаружения вирусной РНК в крови методом полимеразно-цепной реакции (ПЦР), а также результатов инструментальных исследований.
Лабораторное обследование пациентов с клещевым энцефалитом осуществлялось в диагностическом центре ФГУП Микроген «НПО Вирион» в г.Томске. При этом 12,6% обследованных лиц проходили плановую противоэнцефалитную вакцинацию; 85,7% обратившихся на пункты серопрофилактики было проведено введение специфического иммуноглобулина с целью экстренной серопрофилактики и лечения клещевого энцефалита. Инкубационный период оказался весьма вариабельным (от нескольких часов до 60 дней и более) и продолжался в среднем 10,2±0,9 сут. Клиническая картина обследованных пациентов с острой антигенемией TBEV характеризовалась гипертермией различной степени тяжести от 37,2 до 39,6 С (длительность – от 3 до 7 дней). Заболевшие предъявляли жалобы на головную боль, общую слабость, тошноту, мышечные и суставные боли разной локализации, сонливость. У больных отмечались явления менингизма без воспалительных изменений цереброспинальной жидкости, но со значительным повышением внутричерепного давления. В клинической картине острого периода инфекции обращали на себя внимание нарушения со стороны вегетативной нервной системы в виде дистального гипергидроза, стойкого красного дермографизма и лабильности артериального давления. У пациентов была обнаружена рассеянная неврологическая симптоматика в виде легкого центрального пареза мимических мышц, неравномерности кожных и глубоких рефлексов, непостоянных симптомов орального автоматизма, нарушения конвергенции и болезненности точек выхода тройничного нерва.
У лиц, отнесенных ко II группе [пациенты с длительным (более 6 мес после острого периода нейроинфекции) бессимптомным носительством антигена вируса клещевого энцефалита], при наличии в крови вирусной РНК клиническая картина начального периода заболевания практически редуцировалась. Пациенты во время обследования активно жалоб не предъявляли, каких-либо патологических изменений со стороны неврологического и соматического статуса выявлено не было. Следует отметить, что при различных физических и/или эмоциональных нагрузках у незначительного числа обследованных (13,2%) выявлялись клинические признаки астенического синдрома.
III группу составили лица с остаточными проявлениями нейроинфекции в виде цереброгенной астении и длительной антигенемии вируса клещевого энцефалита (более 6 мес после острого периода инфекционного процесса). Основными резидуальными явлениями были симптомы, входящие в рамки стойкого астено-вегетативного синдрома (быстрая утомляемость, раздражительность, нарушение концентрации внимания, снижение инициативы и ухудшение памяти, нарушение аппетита, расстройства сна, головокружение, слабость и эмоциональная лабильность), упорные головные боли, особенно к окончанию рабочего дня и после эмоционального напряжения. В неврологическом статусе выявлялись рассеянные органические микрознаки: слабость конвергенции, легкий центральный парез мимической мускулатуры, анизорефлексия глубоких брюшных рефлексов. Из вегетативных расстройств обращали на себя внимание бледность кожных покровов, гипергидроз дистальных отделов конечностей, повышенная общая потливость. Пациенты с остаточными проявлениями клещевого энцефалита характеризовались наличием тревожности и дистимическими нарушениями, частота встречаемости которых была существенно ниже по сравнению с периодом острой антигенемии, однако значительно выше по сравнению с аналогичным показателем у лиц с длительным бессимптомным носительством антигена TBEV.
Клиническая история пациентов IV группы, страдающих хроническим клещевым энцефалитом (полиомиелитическая форма, рецидивирующее течение), продолжалась более 8 мес после стационарного лечения лихорадочной формы острого клещевого энцефалита. Ведущим симптомом данной формы инфекции являлось наличие вялых параличей мышц шеи, плечевого пояса и конечностей (преимущественно верхних). Ретроспективный анализ выявил наряду с длительной антигенемией TBEV появление новой очаговой неврологической симптоматики, характерной для клещевого энцефалита. По срокам развития у всех пациентов диагностировалась прогредиентная форма хронического клещевого энцефалита. У больных регистрировалось нарастание возникших ранее парезов мышц шеи, плечевого пояса, при этом сухожильные и периостальные рефлексы с ног были повышенными. В зоне пораженных мышц выявлялось снижение болевой чувствительности. У 33,3% пациентов обнаруживались амиотрофии, протекающие со снижением или полной утратой рефлексов. В зоне пораженных мышц выявлялось снижение болевой чувствительности чаще по сегментарному типу. У 75,0% лиц была выявлена нейросенсорная тугоухость, 50,0% обследованных страдали вегетативными кризами.
В программу обследования были включены 115 пациентов, страдающих вирусным гепатитом С (по МКБ-10 рубрика В18.2 – хронический вирусный гепатит С). Все пациенты представляли группу риска по инфицированию возбудителем гепатита С (в анамнезе были оперативные вмешательства с переливанием крови, лечебные инъекции многоразовыми шприцами, лечение и удаление зубов, эпизоды наркомании, сексуальные контакты с больными вирусными гепатитами, работа с препаратами крови и больными у медицинских работников). Давность заболевания составляла от 1 года до 16 лет (в среднем 5±2 года).
Анамнестически у всех пациентов были определены сроки и источник инфицирования, оценивались жалобы, характер течения заболевания и объективные признаки. Проводились общий и биохимический анализ крови, оценка иммунного статуса. В клинике пациенты проходили ультрасонографическое исследование органов брюшной полости для исключения сопутствующей патологии, а также сцинтиграфическое исследование печени, выявившее умеренное диффузно неравномерное накопление радиофармпрепарата в паренхиме органа, характерное для воспалительного процесса.
Диагноз хронического вирусного гепатита основывался на наличии клинико-инструментальных симптомов (гепато-, спленомегалия), клинико-лабораторных синдромов (холестаза, цитолиза, мезенхимально-воспалительного). Этиологическая верификация диагноза проводилась путем выявления в крови РНК вируса гепатита С (HCV) (метод ПЦР), серологических маркеров HCV (анти-HCV Ig к cor, С-протеину, неструктурным белкам NS-3, NS-4, NS-5, анти-HCV IgM) (метод ИФА).
С целью морфологического подтверждения диагноза и определения степени активности воспалительного процесса с использованием гистологического индекса активности по A. Knodell [1981] и стадии фиброза по U. Desmet [1995] всем пациентам проводилась пункционная биопсия печени по Mengini. По данным морфологического анализа полученного биопсийного материала, различали минимальную (1-3 балла), слабовыраженную (4-8 баллов), умеренную (9-13 баллов) и выраженную степени активности воспалительного процесса (более 13 баллов).
В соответствии с классификацией, принятой Всемирным конгрессом гастроэнтерологов в Лос-Анжелесе (1994) [Ивашкин В.Т., 1995], были выделены следующие группы. По степени активности воспалительного процесса: I группа – больные хроническим гепатитом С умеренной степени активности воспалительного процесса в печени; II группа – больные хроническим гепатитом С слабовыраженной степени активности. По стадии фиброза печени: I группа – больные хроническим гепатитом С, стадия фиброза 1; II группа – больные хроническим гепатитом С, стадия фиброза 2.
Анализ клинической картины у больных хроническим вирусным гепатитом умеренной степени активности показал, что наиболее часто выявлялся астено-вегетативный синдром (87,8%). Диспептический синдром (непереносимость жирной пищи, тошнота, горечь во рту, изжога, метеоризм) встречался у 65,9% пациентов. Синдром холестаза (желтушное окрашивание кожи и склер, зуд, билирубинемия) обнаруживался у больных хроническим гепатитом С в 45,2% случаев. В большинстве случаев гепато- и спленомегалия, выявленные физикально, подтверждались результатами ультразвукового исследования. При анализе биохимических показателей крови ведущим синдромом был цитолиз. У больных хроническим гепатитом С повышение активности аланинаминотрансферазы (АЛТ) и аспартатаминотрансферазы (АСТ) отмечалось в 77,4% случаев. Мезенхимально-воспалительный синдром (увеличение значений СОЭ, тимоловой пробы, повышение уровня -глобулинов) по частоте встречаемости среди обследованных данной категории находился на втором месте.
Пациенты с хроническим гепатитом С слабовыраженной степени активности характеризовались отсутствием клинической симптоматики поражения печени, нормальными значениями биохимических показателей. Из серологических маркеров HCV-инфекции у них выявлялся анти-HCV IgG. Эпизодически они получали курсы общеукрепляющей терапии. Трудовая деятельность не страдала.
Материалом исследования являлась венозная кровь обследованных лиц, взятая утром до приема пищи (кровь стабилизировали гепарином - 25 Ед/мл).
У пациентов с длительной персистенцией вирусов клещевого энцефалита, гепатита С, а также у здоровых доноров проводили комплексное сравнительное исследование иммунофенотипического статуса лимфоцитов, выявление особенностей продукции мононуклеарными лейкоцитами крови иммунорегуляторных цитокинов, анализ спонтанной и индуцированной in vitro рецепции цитокинов лимфоцитами, а также анализ полиморфизма генов цитокинов и их рецепторов (табл. 1).
Определение общего количества лейкоцитов крови и подсчет их отдельных морфологических форм проводили стандартными гематологическими методами [Меньшиков В.В., 1987].
Иммунофенотипирование лимфоцитов крови по CD-маркерам (CD3+, CD4+, CD8+, CD22+) проводили иммуноцитохимическим методом [Тотолян А.Н. и соавт., 2002]. Результаты выражали в относительных и абсолютных значениях.
Мононуклеарные лейкоциты выделяли в стерильных условиях из цельной крови методом градиентного центрифугирования с использованием Ficoll-Paque («Pharmacia», Швеция) (=1,077 г/см3) [Натвиг Дж. и соавт., 1980]. Выделенные клетки культивировали в течение 18 ч при температуре 37 и 5% СО2 в полной культуральной среде (90% RPMI-1640 (“Вектор-Бест”, Новосибирск), 10% инактивированная эмбриональная телячья сыворотка (“Биолот”, Санкт-Петербург), 0,3 мг/мл L-глутамина) без митогена или с добавлением 10 мкг/мл фитогемагглютинина (ФГА) (“Difco”, Германия) для активации лимфоцитов [Хаитов Р.М. и соавт., 1995]. Затем проводили оценку содержания цитокинов (IL2, IL4, IL10, IL12, TNF, IFN) и растворимого рецептора к TNF в супернатантах культур мононуклеарных лейкоцитов методом иммуноферментного анализа согласно инс-
трукциям, предлагаемым производителями тест-систем («Procon», Россия; «Biosource», Бельгия, «Cytimmun», США). Учет результатов проводили с применением фотометра для микропланшетов «Multiscan EX» («ThermoLabSystems», Финляндия) при длине волны 450 нм.
Оценку презентации мембраносвязанных форм рецепторов к IL2, IL4, IL10, TNF и IFN на лимфоцитах крови проводили методом проточной лазерной двухцветной цитометрии с использованием моноклональных антител к цитокиновым рецепторам, меченных флуоресцентными метками. Регистрацию презентации цитокиновых рецепторов на лимфоцитах проводили согласно протоколу фирмы производителя («R&D Systems», США). Анализ образцов клеточных суспензий осуществляли на проточном цитометре Epics XL («Beckman Coulter», Франция) с применением автоматического программного обеспечения и методов сбора и анализа данных с высоким разрешением (1024 канала) (рис. 1).
Рис. 1. Распределение лимфоцитов по интенсивности флуоресценции в FL1-канале (оценка содержания TNFR1+-клеток, меченных FITC, в гейте лимфоцитарных клеток).
а – принцип автоматического выделения гейта лимфоцитов по показателям малоуглового (FS) и бокового (SS) светорассеивания;
б – одномерная гистограмма интенсивности флуоресценции в гейте лимфоцитарных клеток по FL1-каналу (слева от оси – несветящиеся клетки, справа – FITC-положительные лимфоциты)
ДНК выделяли по инструкции, предлагаемой производителем тест-системы (“Лаборатория МЕДИГЕН”, Россия). Метод выделения основан на специфической обратимой сорбции ДНК в присутствии хаотропной соли (гуанидинизотиоцианат) на частицы силикагеля [Boom R. et al., 1991]. Генотипирование аллельных вариантов генов цитокинов и их рецепторов (G-308A TNFA, T-330G IL2, C-590T IL4, Ile50Val IL4R, Q-576R IL4R и C-592A IL10) осуществляли методом рестрикционного анализа продуктов амплификации (ПДРФ-анализ) специфических участков генома. Амплификацию осуществляли в пробирках типа «Эппендорф» путем полимеразной цепной реакции, используя структуру праймеров и параметры температурных циклов, описанных в литературе (табл. 2), и учитывая применение нами амплификатора «Tercik MC2» («ДНК- технология», Россия).
Оценку полученных результатов проводили методами статистического описания и проверки статистических гипотез. При анализе имеющихся выборок данных использовали гипотезу нормальности распределения (критерий Шапиро-Вилка). Для нормально распределенных выборок вычисляли средневыборочные характеристики: среднее арифметическое (Х), среднее квадратичное отклонение (), ошибка среднего (m). Для выборок, распределение которых отличалось от нормального, рассчитывали медиану (Ме), первый и третий квартили (Q1, Q3). С целью попарного сравнения показателей в исследованных группах применяли критерий Манна-Уитни для независимых групп. Различие двух сравниваемых величин считали достоверным при уровне значимости р<0,05. С целью обнаружения связи между исследованными показателями проводили корреляционный анализ путем вычисления коэффициента ранговой корреляции Спирмена (r) [Гланц С., 1999; Боровиков В.П., 2001].
Распределение генотипов по исследованным полиморфным локусам прове-
Таблица 2
Характеристика исследованных полиморфизмов генов цитокинов
| Ген | Полимор-физм | Структура праймера | Температура отжига (°С) | Фермент рестрикции |
| TNFA | G-308A | 5’- aggcaataggttttgagggccat -3’ 5’- acactccccatcctcccggct -3’ | 57 | Bsp19 I (Nco I) |
| IL2 | T-330G | 5’-tattcacatgttcagtgtagttct-3’ 5’- acattagcccacacttaggt -3’ | 48 | Mae I |
| IL4 | C-590T | 5’- cagggagagccaatcagt-3’ 5’- atgatgtccagactccaggatct -3’ | 57 | Bsm FI |
| IL4R | Ile-50Val | 5’- gcg agt gga aga tga atg gt -3’ 5’- cgc tgg gct tga agg ag – 3’ | 65 | Rsa I |
| IL4R | Q-576R | 5’- cccccaccagtggctacc-3’ 5’- gccccaaacccacatttc -3’ | 93 | Msp I |
| IL10 | C-592A | 5’- atccaagacaacactactaa -3’ 5’- taaatatcctcaaagttcc -3’ | 54 | Rsa I |
| IL12 | А-1188C | 5’- ctgatccaggatgaaaatttgg -3’ 5’- cccatggcaacttgagagctgg -3’ | 62 | Taq I |
ряли на соответствие равновесию Харди-Вайнберга с помощью точного теста Фишера. Для сравнения частот аллелей между различными группами использовали критерий 2 Пирсона и точный тест Фишера. Обработку результатов генетических исследований осуществляли с использованием критерия отношения шансов OR с расчетом для него 95% доверительного интервала (CI) [Флейс Дж., 1989].
РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЯ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ
- Система цитокинов и их рецепторов в межклеточной коммуникации иммунокомпетентных клеток крови у пациентов с длительной
персистенцией возбудителей семейства Flaviviridae
Исследования особенностей реагирования системы иммунитета на различные антигенные структуры как в норме, так и при патологических процессах свидетельствуют о том, что существующий в организме баланс показателей клеточного звена иммунитета является одним из важнейших условий поддержания эффективного иммунного ответа на внедрение многообразных патогенов. Ключевая роль принадлежит иммунокомпетентным клеткам крови, в частности лимфоцитам и моноцитам/макрофагам [Кетлинский С.А., 2002; Симбирцев А.С., 2004; Ярилин А.А., 2004].
В проведенном нами исследовании была предпринята попытка выявить общие закономерности и особенности цитокинопосредованной межклеточной коммуникации иммунокомпетентных клеток крови при персистентном течении Flaviviridae-инфекции.
При рассмотрении фундаментальной проблемы взаимоотношения вируса и организма человека посредством концентрации внимания на роли в этом процессе цитокинопосредованного взаимодействия иммунокомпетентных клеток на первый план выходят ряд вопросов: являются ли изменения системы цитокинов отражением реактивности организма (в т.ч. иммунной системы) на вторжение патогена или неполноценный противовирусный иммунный ответ может быть генетически детерминирован; каковы молекулярные механизмы предрасположенности организма человека к хроническому течению (бессимптомному вирусоносительству) флавивирусных инфекций; возможен ли в перспективе переход к персонализированной профилактике и терапии вирусных инфекций на основе идентификации молекулярных механизмов повреждения?
Особенности состояния системы IFN–IFNR мононуклеарных лейкоцитов крови у пациентов с длительной персистенцией возбудителей семейства Flaviviridae. Известно, что ведущую роль в защите организма от вирусной агрессии играют интерфероны, обладающие противовирусным, иммуномодулирующим и антипролиферативным эффектами [Ершов Ф.И., 1998; Кузнецов В.П., 1998; Ройт А. и соавт., 2000; Samuel C.E., 2001; Кадагидзе З.Г., 2003; Maldonado R.A. et al, 2004].
Нами было установлено, что in vitro как в покое, так и при стимуляции ФГА мононуклеарные лейкоциты крови у пациентов с острой антигенемией TBEV секретировали значительно более высокие концентрации IFN, чем клетки у здоровых людей (рис. 2). Обнаруженный факт увеличения продукции IFN мононуклеарными лейкоцитами, на наш взгляд, мог быть обусловлен рядом причин. С одной стороны, возрастание синтеза IFN можно рассматривать как универсальную реакцию иммунной системы, направленную на элиминацию вируса путем нарушения работы вирусного генома и вирусных протеинов [Samuel C.E., 2001; Вершинина М.Ю. и соавт., 2003; Nobuhiro F. et al., 2004; Bonjardim C.A., 2005]. С другой стороны, протективный эффект IFN обусловлен в значительной степени его иммуномодулирующей активностью, нежели непосредственно противовирусным действием. Роль IFN в противовирусном иммунном ответе связана с его активирующим влиянием на фагоцитарную активность макрофагов, прямую цитотоксичность Т-лимфоцитов, антителоопосредованный лизис инфицированных клеток макрофагами и полиморфноядерными лейкоцитами [Samuel C. E., 1988, 1991, 2001; Павлова Л.Е. и соавт., 2000; Sun P. et al., 2006; Keller B.C. et al., 2006; Park G.S. et al., 2007].
Формирование иммунного ответа в условиях длительной персистенции вирусов является сложным и многокомпонентным процессом. Так, нами было установлено, что длительная персистенция HCV и TBEV сопровождается также повышением продукции IFN мононуклеарными лейкоцитами крови относительно соответствующих показателей у здоровых индивидов. При этом у больных с хронической HCV-инфекцией имело место возрастание и числа IFN-R+-лимфоцитов (рис. 2, 3).
Таким образом, в остром периоде флавивирусной инфекции мы отмечали высокий потенциал иммунокомпетентных клеток крови продуцировать IFN. Однако иммуномодулирующая и антирепликативная способность этого противовирусного цитокина оказалась недостаточной для элиминации вируса. На наш взгляд, хроническое течение инфекции само по себе является доказательством того, что противовирусный иммунитет оказывается нерезультативным для естественного
завершения инфекции. Вероятно, неэффективность действия интерферонов является следствием нарушения трансдукции сигналов активации от цитокина. В последние годы в литературе появились сообщения, что вирусы семейства Flaviviridae обладают способностью ингибировать внутриклеточный каскад трансдукции сигнала (Jak/STAT) в ответ на действие IFN [Levy D.E., Darnell J.E., 2002; Best S.M. et al., 2005; Palmer D.R. et al., 2005; Lin R.J. et al., 2006; Park G.S. et al., 2007; Werme K. et al., 2008]. Высказываются предположения, что NS5 вирусов семейства Flaviviridae либо связывается с субъединицами рецептора к IFN, вызывая нарушение их пространственной конформации, и, следовательно, блокируя реализацию внутриклеточных эффектов, либо сам непосредственно выступает в роли вирусного эквивалента негативного регулятора белковой фосфатазы тирозина, удаляя фосфатные группы от каталитических доменов JAK [Best S.M. et al., 2005]. B.G. Neel, N.K. Tonks [1997] и M.M. Brierley, E.N. Fish [2002] высказывалось предположение, что вирусы комплекса клещевого энцефалита активируют SOCS-белки, подавляя тем самым действие интерферонов.
Особенности состояния системы TNF–TNFR мононуклеарных лейкоцитов крови у пациентов с длительной персистенцией возбудителей семейства Flaviviridae. Особую роль в формировании специфического иммунного ответа, развивающегося при действии различных патогенных агентов – носителей чужеродной генетической информации, играет TNF. Общеизвестно, что в физиологических условиях TNF функционирует как иммунорегуляторный медиатор и обеспечивает пролиферацию и дифференцировку разных типов клеток, активирует нейтрофилы, Т- и В-лимфоциты, участвует в регуляции апоптоза [Кашкин К.П., 1998; Блохин Б.М. и соавт., 1999; Логинов А.С., 2001; Царегородцева Т.М., Серова Т.И., 2003; Симбирцев А.С., 2004; Собчак Д.М., Монакова Э.А., 2004; Wang L. et al., 2007]. TNF, являясь одним из основных цитокинов, обладающих провоспалительной функцией, запускает "цитокиновый каскад" в очаге воспаления, увеличивая продукцию IL1, IL2, IL6, IL10 и INF, которые в свою очередь оказывают влияние на экспрессию TNF и его рецептора [Zylberberg H. et al., 1999; Kim K. et al., 2000; Зубова С.Г., 2001; Barash J. et al., 2003]. Таким образом, TNF опосредует не только реализацию неспецифического иммунного ответа, но и выступает в качестве индуктора дифференцировки Th0 в Th1, модулируя тем самым направление специфического иммунного ответа в сторону преобладания клеточного звена резистентности [Luster M.I. et al., 1994; Ihle J.N., 1995; Возианов А.Ф. и соавт., 1998; Roitt E.I. et al., 1998; Friedman S.L., 1999; Ивашкин В.Т. и соавт., 2003].
Учитывая одну из ведущих ролей TNF в пара- и аутокринной цитокиновой регуляции функциональной активности иммунокомпетентных клеток, изучение аспектов кооперации иммуноцитов при участии TNF является перспективным с точки зрения выявления маркеров хронизации и разработки патогенетически обоснованной терапии хронических вирусных инфекций.
Проведенный нами иммуноферментный анализ содержания TNF в супернатантах культур мононуклеарных лейкоцитов крови установил увеличение продукции исследуемого цитокина интактными иммунокомпетентными клетками, полученными у больных острым клещевым энцефалитом (рис. 2, 3).
Оценка продукции TNF лейкоцитами крови при длительном течении флави-
вирусных инфекций выявила иные закономерности. Проведенный нами детальный анализ позволил констатировать факт угнетения базальной и индуцированной in vitro ФГА продукции TNF мононуклеарами крови у пациентов с длительной персистенцией вирусов семейства Flaviviridae (рис. 2, 3). Существует мнение, что гиперпродукция TNF может являться одним из основных механизмов активации инфекционного процесса при переходе из латентного состояния в фазу клинических проявлений и свидетельствует о прогрессировании заболевания. Угнетение продукции TNF в более поздних стадиях заболевания может быть связано с глубокой дизрегуляцией иммунного ответа [Хаитов Р.М., 2001; Ивашкин В.Т. и соавт., 2002; Царегородцева Т.М., Серова Т.И., 2003; Gelderblom H.C. et al., 2007; Wang L. et al., 2007].
Известно, что хроническая инфекция, индуцированная HCV, может сопровождаться изменением продукции TNF. Это, вероятно, обусловлено свойствами самих вирусов и реализацией их онкогенного потенциала [Ягода А.В. и соавт., 2000; Ивашкин В.Т. и соавт., 2000; 2001; 2003; Логинов А.С. и соавт., 2001; Маммаев С.Н. и соавт., 2002; Царегородцева Т.М., Серова Т.И., 2003]. Однако следует отметить, что данные литературы, касающиеся продукции TNF при флавивирусных инфекциях, носят весьма противоречивый характер. Так, рядом авторов установлено, что либо мононуклеарные клетки у больных хроническим вирусным гепатитом С in vitro продуцируют меньшее количество TNF, чем у здоровых людей [Cohen M.C., Cohen S., 1996], либо уровень TNF мало изменяется по сравнению с аналогичным показателем в контрольной группе [Корочкина О.В. и соавт., 2003].
Кроме того, известно, что нативный TNF находится в биологических жидкостях в форме тримера, что характерно для всех лигандов и рецепторов семейства TNF. Существуют данные о возможности аномального фолдинга TNF, приводящего к формированию димерных молекул вместо тримерных. Такой белок стабилен в растворе лишь непродолжительное время и не способен к спонтанному переходу в истинно нативную конформацию [Суровцева Е.В. и соавт., 2005]. Однако для формирования комплексного представления об участии TNF в механизмах хронизации вирусных инфекций и систематизации уже имеющихся в настоящее время данных литературы необходима комплексная оценка взаимодействия этого цитокина с рецепторным комплексом иммунокомпетентных клеток.
Известно, что растворимые рецепторы к TNF являются важными регуляторами активности цитокина [Степанец О.В. и соавт., 2003; Алекперов Р.Т. и соавт., 2004; Wang M. et al., 2004]. Показано, что они могут как препятствовать связыванию TNF с мембранными рецепторами и таким образом нарушать проведение сигнала, так и, выступая в роли переносчиков, защищать цитокин от разрушения протеазами, удлиняя время его пребывания в системном кровотоке [Itoh Y. et al., 1999; Barash J. et al., 2003; Chodorowska G. et al., 2003]. Установленное нами в ходе настоящего исследования достоверное увеличение средних величин базальной и индуцированной ФГА in vitro продукции мононуклеарными лейкоцитами sTNFR1 отмечалось у всех обследованных пациентов независимо от этиологического варианта инфекции и длительности антигенемии вируса.
Нами также обнаружено наличие отрицательных корреляционных связей между содержанием sTNFR1 и TNF в супернатантах культуры мононуклеарных лейкоцитов как у больных хроническим вирусным гепатитом С (r=-0,593, p<0,05 и r=-0,613, p<0,05 в интактной и ФГА-стимулированных культурах клеток, соответственно), так и у пациентов с длительной антигенемией вируса клещевого энцефалита (r=-0,593, p<0,05 и r=-0,613, p<0,05 в интактной и ФГА-стимулированных культурах клеток, соответственно).
Исходя из полученных нами результатов, становится очевидным, что одним из возможных механизмов снижения уровня TNF в культуральных жидкостях мононуклеарных лейкоцитов у пациентов с длительной HCV- и TBEV-инфекцией может быть возрастание содержания «ловушек» цитокина, в роли которых выступают растворимые формы рецептора [Ивашкин В.Т. и соавт., 2002; Анисимова Н.Ю. и соавт., 2003; Рязанцева Н.В. и соавт., 2005].
В настоящее время обсуждаются различные причины возрастания концентрации растворимых рецепторов цитокинов в биологических жидкостях. Согласно данным литературы, растворимые формы рецептора к TNF могут быть результатом возрастания вирусиндуцированного шеддинга рецепторов с мембран клеток вследствие активации последних в процессе интернализации мембранассоциированных форм при связывании молекул TNF, и, что особенно значимо, в результате деструктивных процессов в плазматической мембране (интенсификация перекисного окисления липидов и, как следствие, изменение упорядоченности и микровязкости липидного бислоя мембран, ведущие к модификации их структуры) [Владимиров Ю.А., Добрецов Г.Е., 1980; Cohen M.C., Cohen S., 1996; Геннис Р., 1997; Игнатьева Г.А., 1997; Фрейдлин И.С., 1998; 2001; Анисимова Н.Ю. и соавт., 2003; Новицкий В.В. и соавт., 2003]. При вирусных инфекциях происходят существенные изменения физико-химических свойств плазматических мембран иммунокомпетентных клеток [Мищенко В.А. и соавт., 1994; Панин Л.Е. и соавт., 2003; Рязанцева Н.В. и соавт., 2003; Рязанцева Н.В., Новицкий В.В., 2004; Токарева Н.В., 2004]. Среди возможных механизмов возрастания концентрации растворимых рецепторов цитокинов называют также оверэкспрессию альтернативно сплайсированных мРНК мононуклеарных лейкоцитов, диссоциацию комплексов цитокин-рецептор [Степанец О.В. и соавт., 2003].
Реализация биологической роли TNF осуществляется посредством его связывания со специфическими высокоаффинными мембранными рецепторами [Cohen M.C., Cohen S., 1996; Анисимова Н.Ю. и соавт., 2003; Степанец О.В. и соавт., 2003]. Однако действие TNF на клетку, опосредованное TNFR1, не однозначно. Во-первых, TNF активирует транскрипционные факторы NF-kB и JNK, ведущие к индукции провоспалительных и иммуномодулирующих генов. Во-вторых, TNFR1 служит сенсором внеклеточных сигналов к апоптозу [Nagata S., 1997; Simpson K.J. et al., 1997; Ramadori G., Christ B., 1999; Herbein G., O'brien W.A., 2000; Пальцев М.А., 2004; Holtmann M.H., Neurath M.F., 2004; Schneider-Brachert W. et al., 2004].
Для нас представлялась интересной, наряду с определением методом иммуноферментного анализа уровня TNF и растворимого рецептора к нему в супернатантах культур мононуклеарных лейкоцитов крови, оценка с использованием проточной лазерной цитометрии количества TNFR1-несущих лимфоцитов крови (рис. 2, 3). Следует отметить, что у обследованных здоровых доноров были выявлены корреляционные связи между продукцией растворимых рецепторов мононуклеарными лейкоцитами крови и содержанием TNFR1-несущих лимфоцитов (r=-0,86, p<0,05 и r=-0,54, p<0,05 в интактной клеточной культуре, так и при стимуляции ФГА, соответственно). У пациентов с острой формой клещевого энцефалита количество TNFR1+-лимфоцитов в культуре мононуклеарных лейкоцитов соответствовало таковому у здоровых людей. При этом у больных, страдающих хроническим вирусным гепатитом С, у пациентов с длительной антигенемией TBEV и больных хроническим клещевым энцефалитом отмечалось снижение числа клеток, презентирующих на мембране рецепторы к TNF (рис. 2, 3).
Таким образом, нами был установлен выраженный дисбаланс продукции и рецепции TNF мононуклеарными лейкоцитами крови у пациентов с длительной флавивирусной инфекцией. С одной стороны, угнетение продукции TNF можно рассматривать как фактор дизрегуляции иммунного ответа, недостаточной противовирусной активности иммунитета, что негативно сказывается на течении заболевания. С другой стороны, ограничение продукции TNF в условиях длительной вирусной персистенции может выступать в качестве адаптивной реакции системы иммунитета, направленной на предотвращение реализации проапоптотического потенциала клеток и развития необратимого повреждения тканей, обусловленного действием самого вирусного агента [Хаитов Р.М., 2001; Ивашкин В.Т. и соавт., 2003].
Особенности продукции IL12 мононуклеарными лейкоцитами крови у пациентов с длительной персистенцией возбудителей семейства Flaviviridae.. IL12 является ключевым иммунорегуляторным цитокином, который служит связующим звеном между неспецифической защитой и специфическим иммунным ответом [Фрейдлин И.С., 1999; Pitzurra L. et al., 2000; Plummeridge M.J. et al., 2000; Durali D. et al., 2003; Lund R.J. et al., 2004]. Этот интерлейкин обладает уникальной способностью регулировать баланс Th1 и Th2, является стимулятором продукции и синергистом действия IFN [Фрейдлин И.С., 1999; Ивашкин В.Т. и соавт., 2001, 2002; Sun P. et al., 2006].
Нами было установлено, что у пациентов с длительной антигенемией TBEV и у больных с HCV-инфекцией спонтанная продукция IL12 мононуклеарными лейкоцитами крови оставалась в пределах нормы (57,84(42,36-90,23) пг/мл, 54,42(46,15-68,32) пг/мл и 49,15(35,81-57,16) пг/мл у пациентов с TBEV-, HCV-инфекцией и здоровых доноров, соответственно). Однако секреция IL12, индуцированная в условиях эксперимента ФГА, оказалась ниже таковой у здоровых людей (205,88(164,71-327,59) пг/мл, 243,17(186,82-264,27) пг/мл и 386,84(300,53-442,75) пг/мл, у пациентов с TBEV-, HCV-инфекцией и здоровых доноров, соответственно). Высказывается предположение, что именно ингибирование эффектов IL12 является одним из ведущих механизмов поляризации баланса Th1/Th2-лимфоцитов [Sun P. et al., 2006; Chareonsirisuthigul T. et al., 2007; Zhou Y. et al., 2007]. Эффекты IL12 реализуются путем связывания его с IL12R [Szabo S. et al., 1997]. Известно, что IL4 и IFN оказывают модулирующее действие на экспрессию IL12R после активации Т-клеток. IL4 угнетает экспрессию IL12R, что ведет к блокированию эффектов соответствующего лиганда IL12, смещая, соответственно, направление реализации иммунного ответа в сторону Th2.
Таким образом, несмотря на то, что до сих пор остаются неясными точные молекулярные механизмы дефекта в системе IL12 и его рецепторов при длительной вирусной персистенции и отсутствуют данные о влиянии флавивирусов на внутриклеточные факторы трансдукции сигналов активации, не вызывает сомнения, что изменения в системе IL12 и его рецепторов играют существенную роль в нарушении межклеточной кооперации иммунокомпетентных клеток в условиях развития хронической вирусной инфекции. Имеется предположение, что смещение направления иммунного ответа в сторону Th2 при нормальной и сниженной продукции IL12 может быть обусловлено длительной стимуляцией иммунокомпетентных клеток IL4 (что и было выявлено в поведенных нами исследованиях) и ингибированием функциональной активности IL12R.
Особенности состояния системы IL2–IL2R мононуклеарных лейкоцитов крови у пациентов с длительной персистенцией возбудителей семейства Flaviviridae. В соответствии с общими закономерностями иммунопатогенеза персистентных вирусных инфекций важным условием эффективности механизмов защиты макроорганизма от инфекции является интенсивность иммунного ответа, определяемая функциональной активностью Т-лимфоцитов [Соринсон С.Н., 1996; Freeman A.G. et al., 2001]. Основной результат активации Т-клеток состоит в индукции экспрессии генов ростовых факторов и их рецепторов. IL2, являясь основным аутокринным ростовым фактором Т-лимфоцитов, обеспечивает их клональную экспансию при ответе на антиген [Мищенко В. А. и соавт, 1994; Симбирцев А.С., 1998, 2004; Eckels D.D. et al., 1999; Хаитов Р.М., 2001; Корочкина О.В. и соавт., 2003; Gomez I. et al., 2004].
При проведении оценки цитокинового статуса у пациентов с острой антигенемией TBEV нами было зарегистрировано увеличение, а у пациентов с длительной флавивирусной инфекцией, напротив, угнетение продукции IL2 мононуклеарными лейкоцитами крови в ФГА-стимулированных in vitro культурах клеток по сравнению с таковым у здоровых доноров (рис. 3). Стимуляция продукции IL2 в остром периоде заболевания соответствует классическим представлениям об активации противовирусного иммунитета в ответ на вирусную агрессию, однако механизмы подавления индуцированного синтеза IL2 при вирусных инфекциях остаются недостаточно изученными. По-видимому, имеет место не один, а несколько типов ингибирования [Сенников С.В. и соавт., 2003; Gomez I. et al., 2004]. Особенности действия, уровень продукции цитокина и его биологическая активность находятся под влиянием различных факторов: соотношения рецепторов – агонистов и антагонистов («ловушек»), связи с компонентами внеклеточного матрикса и белками плазмы, в частности с 2–макроглобулином, способствующим инактивации циркулирующего цитокина, величины рН, антиоксидантного потенциала клетки [Ивашкин В.Т. и соавт., 2003]. Имеются сведения, например, что белковые продукты HCV могут блокировать внутриклеточную передачу сигналов от рецепторов IFN и снижать секрецию IL2 и IFN активированными Т-лимфоцитами, что также вызывает смещение баланса в пользу Th2, являясь частью стратегии выживания вируса [Jia H. et al., 2003; Kasprzak A. et al., 2004]. Известно, что мыши, дефицитные по IL2 и/или IL2R, обладают фатальными аутоиммунными осложнениями, а люди, цитокиновый статус которых характеризуется угнетением продукции IL2, отличаются повышенной восприимчивостью к инфектам вирусной и бактериальной природы [Sadlack B. et al., 1995; Sharfe et al., 1997; Lin J-X., Warren J.L., 2000; Ma A. et al., 2000; Nelson B.H., 2004].
В результате проведения цитофлуориметрического исследования рецепторного аппарата иммунокомпетентных клеток нами было установлено снижение у пациентов как с острой, так и с хронической флавивирусной инфекцией количества лимфоцитов, презентирующих мембранную молекулу рецептора к IL2, вне зависимости от содержания самого исследуемого цитокина в супернатантах культур мононуклеарных лейкоцитов крови (рис. 2, 3). При этом следует подчеркнуть, что у пациентов с длительной антигенемией TBEV было зафиксировано более низкое относительное количество IL2R-позитивных лимфоцитов (в 1,4 раза) в интактной культуре мононуклеаров, а также снижение продукции IL2 (в 1,4 раза) и абсолютного количества CD25-несущих лимфоцитов (в 2,3 раза) в условиях стимуляции in vitro культуры клеток ФГА.
Таким образом, еще в начале инфекционного процесса развивается дисбаланс продукции и рецепции IL2, усугубляющийся при длительной персистенции флавивирусов.
Известно, что связывание IL2R со своим лигандом после активации Т-лимфоцита может приводить к нескольким альтернативным исходам, включая пролиферацию, дифференцировку, стимуляцию функциональной активности и апоптоз. Согласно современным представлениям, CD4+CD25+-клетки (Tregs) способны поддерживать иммунологическую толерантность организма автономными механизмами межклеточной кооперации Т-лимфоцитов, ограничивая активную экспансию Т-лимфоцитов в экспериментах in vitro и подавляя действие аутореактивных Т-лимфоцитов в естественных условиях [Annacker O. et al., 2001; Surh C.D., Sprent J., 2002; Bach J.F., 2003; Симбирцев А.С., 2004; Nelson B.H., 2004; Boettler T., et al., 2005; Bolacchi F. et al., 2006]. In vivo после гомеостатической экспансии Tregs и выполнения ими специфической функции CD4+CD25+-лимфоциты теряют -цепь IL2R и становятся нечувствительными к IL2.
В результате проведенных нами методом проточной лазерной цитофлуориметрии с использованием двойной метки исследований количества CD4+CD25+-Tregs крови было установлено, что в интактных культурах мононуклеарных клеток число CD4+CD25+-лимфоцитов увеличивалось у больных хроническим вирусным гепатитом С (55,63(50,47-59,83) % и 32,65(28,45-39,72) % у пациентов с HCV-инфекций и здоровых доноров, соответственно), а в ФГА-стимулированных in vitro – оказалось значительно ниже значений аналогичного показателя у здоровых людей (3,18(2,57-3,59) %) как у пациентов с хронической персистенцией HCV (9,15(7,20-9,64) %), так и с длительной антигенемией TBEV (6,53(5,02-7,28) %). Необходимо отметить, что количество CD4+CD25+-лимфоцитов у больных хроническим вирусным гепатитом С и у пациентов с длительной персистенцией вируса клещевого энцефалита имело положительную корреляцию с числом CD4+-клеток. Можно говорить о том, что флавивирусная инфекция способна приводить к экспансии CD4+CD25+-T-клеток, которые, с одной стороны, выполняют иммунорегуляторную роль, предотвращая развитие аутоиммунных процессов, с другой стороны, способны подавить ответ CD8+-лимфоцитов на вирусные антигены с последующей хронизацией инфекционного процесса. При этом T. Manigold et al. [2006], проведя оценку количества CD4+CD25+-лимфоцитов в крови у больных и в экспериментах in vitro, утверждают, что именно HCV индуцирует истощение клона CD4+CD25+-Tregs, способствуя тем самым длительной персистенции вируса, сопровождающейся явлениями аутоагрессии макроорганизма, что и подтверждается полученными нами результатами.
Имеются данные, что IL2 оказывает влияние не только на CD4+-Tregs, но и на CD8+-Tregs субпопуляции [Stephens L.A., Mason D., 2000; Graca L et al., 2002; Bach J.F., 2003; Jonuleit H., Schmitt E., 2003; Nelson B.H., 2004]. Нами было установлено, что у пациентов с длительной антигенемией TBEV количество CD8+CD25+-лимфоцитов не изменялось относительно аналогичного показателя у здоровых людей; у больных с HCV-инфекцией число CD8+CD25+-Tregs возрастало. Механизмы иммунорегулирующего действия CD8+CD25+-клеток до сих пор остаются малоизученными. Однако существует гипотеза, что именно возрастание численности клона CD8+CD25+-Tregs может приводить при длительной антигенной нагрузке к истощению CD4+CD25+ субпопуляции T-лимфоцитов [Suzuki H. et al., 1995; Leung D. et al., 2000].
Следует отметить, что среди механизмов клеточной защиты в противовирусном иммунитете ведущее место занимают CD8+-цитотоксические лимфоциты, основная функция которых направлена на эрадикацию возбудителя, что обусловлено, с одной стороны, их способностью непосредственно вызывать гибель инфицированных клеток, а, с другой, – способностью продуцировать противовирусные факторы. Активация эффекторных клеток с фенотипом CD8+ требует, помимо связывания антигена, комплексированного с МНС I класса, воздействия IL2, источником которого служат Th1-клетки и сами CD8+-лимфоциты [Хаитов Р.М., 2001]. Как показало проведенное нами исследование, содержание CD8+-лимфоцитов у пациентов с бессимптомной антигенемией TBEV было выше соответствующих показателей у здоровых доноров ((1,17±0,22)·109/л и (0,47±0,05) ·109/л, соответственно). Можно предположить, что выявленное нами снижение резервной способности мононуклеарных лейкоцитов крови продуцировать IL2 непосредственно связано с изменением пролиферации и дифференцировки цитотоксических лимфоцитов.
Особенности состояния системы IL4–IL4R мононуклеарных лейкоцитов крови у пациентов с длительной персистенцией возбудителей семейства Flaviviridae. Общеизвестно, что две основные группы лимфокинов, продуцируемых соответственно Th1- и Th2-лимфоцитами, оказывают положительное взаимное влияние. При этом, обладая выраженными контрвоспалительными свойствами, IL4 и IL10 стимулируют преимущественно гуморальное звено иммунитета, способствуя дифференцировке по Th2-пути иммунного ответа [Ярилин А.А., 1997; Фрейдлин И.С., 2001; Хаитов Р.М., 2001; Kim S.H. et al., 2006; Lund R.J. et al., 2007; Odaka M. et al., 2007].
Нами было установлено, что в условиях острой антигенемии TBEV как продукция мононуклеарными лейкоцитами IL4, так и количество лимфоцитов, несущих IL4R, соответствовали норме. При этом обращало на себя внимание значительное возрастание как конституциональной, так и индуцированной in vitro ФГА продукции иммунокомпетентными клетками крови IL4 у пациентов с длительной персистенцией вирусов семейства Flaviviridae. При этом изменения количества лимфоцитов, несущих мембранную форму рецептора к IL4, у пациентов с длительной антигенемией TBEV и у HCV-инфицированных лиц имели одинаковую направленность, однако разный характер выраженности: у пациентов с длительной антигенемией TBEV относительная доля CD124+-лимфоцитов в интактных культурах клеток превышала их уровень у здоровых людей, тогда как у больных хроническим вирусным гепатитом С она увеличивалась как по сравнению с контролем, так и относительно пациентов с антигенемией TBEV. У больных хроническим клещевым энцефалитом количество лимфоцитов, несущих мембранный рецептор к IL4, также достоверно превышало их содержание у здоровых людей (рис. 2, 3).
Анализируя роль IL4 и его рецепторов в аутокринной и паракринной цитокиновой регуляции межклеточной кооперации иммуноцитов, необходимо отметить, что лиганд-рецепторная система IL4 в большинстве случаев выступает в качестве антагониста IFN при воздействии на макрофаги, Т- и В-лимфоциты. Прежде всего, IL4 ингибирует продукцию мононуклеарами провоспалительных цитокинов и хемокинов TNF, IL1, IL12 (р40) и IP10, синтез которых индуцируется или стимулируется IFN. Способность IL4 ингибировать IFN-индуцируемые свойства может быть опосредована через супрессию транскрипции соответствующих генов. Параллельно IL4 ингибирует продукцию макрофагами супероксидных и нитроксидных радикалов и нарушает ответ макрофагов на действие отдельных субклассов иммуноглобулинов, изменяя экспрессию соответствующих рецепторов [Paludan S., 1998; Фрейдлин И.С., 2001]. Считается, что IL4 является основным фактором в определении дифференцировки стимулированных антигеном наивных CD4+-Т-клеток в Th2. Однако механизмы, которые способствуют гиперсекреции IL4 и увеличению числа лимфоцитов, презентирующих соответствующие рецепторы к нему, у людей с длительной персистенцией флавивирусов до сих пор остаются неизученными. Имеются сведения, что Т-лимфоциты, приобретающие в процессе дифференцировки способность продуцировать IL4, утрачивают при этом способность секретировать IL2 [Horuk R. et al., 1998]. Возможно, именно это обстоятельство предопределяет вирусиндуцированный дисбаланс Th1/Th2 путей иммунного ответа в сторону активации гуморального иммунитета, а выявленные нами изменения продукции и рецепции IL4 являются одним из ведущих факторов дизрегуляции коммуникаций в системе иммуноцитов, осложняющихся невозможностью макроорганизма элиминировать вирусы и, соответственно, развитием длительной персистенции последних. Однако это предположение носит гипотетический характер и требует дополнительного специального исследования.
Особенности состояния системы IL10–IL10R мононуклеарных лейкоцитов крови у пациентов с длительной персистенцией возбудителей семейства Flaviviridae. Основным синергистом IL4 в реализации негативной цитокиновой регуляции провоспалительных функций иммунокомпетентных клеток является IL10 [Фрейдлин И.С., 2001; Matsui T. et al., 2007].
Как показали результаты проведенных нами исследований, у пациентов с острой антигенемией вируса клещевого энцефалита абсолютное и относительное количество лимфоцитов, экспрессирующих IL10-R, содержание IL10 в супернатантах интактных и стимулированных in vitro ФГА культур мононуклеарных лейкоцитов не отличались от аналогичных показателей у здоровых людей. Оценка продукции и рецепции IL10 мононуклеарными лейкоцитами крови у пациентов с длительной персистенцией вирусов семейства Flaviviridae показала, что как количество IL10-R+-лимфоцитов, так и концентрация лиганда в супернатантах культур мононуклеарных лейкоцитов возрастали относительно медианных значений соответствующих показателей у здоровых людей (рис. 2, 3).
Известно, что IL10 является физиологическим антагонистом и ингибитором синтеза цитокинов, опосредующих Th1-ответ. IL10 ингибирует продукцию мононуклеарными лейкоцитами большинства провоспалительных цитокинов, экспрессию рецепторов к TNF и IL12 на NK-клетках. Ингибирование IL10 продукции IFN Т-лимфоцитами связывают с супрессией презентации на мембране антигенпредставляющих клеток костимулирующих молекул В7 и синтеза макрофагами IL12. Обращает на себя внимание способность самих макрофагов продуцировать IL10, являющийся для них аутокринным ингибитором [Lester M. et al., 1995; Isomaki P. еt. al., 1998]. Как правило, мононуклеары продуцируют и секретируют последовательно провоспалительные цитокины, в том числе и IL12, а затем IL10, но с преобладанием IL12. Однако в некоторых случаях продукция IL10 может резко увеличиваться, что и было зарегистрировано нами при обследовании пациентов с длительной HCV-инфекцией. Установлено, что избыток IL10 ведет к снижению противоинфекционной защиты и развитию хронических форм инфекций [Фрейдлин И.С., Кузнецова С.А., 1999; Sutterwala F., Mosser D., 1999; Фрейдлин И.С., 2001; Сенников С.В. и соавт., 2004; Chen R.F. et al., 2005; Aborsangaya K.B. et al., 2007; Blackburn S.D., Wherry E.J., 2007; De Maria A. et al., 2007; Rigopoulou E.I. et al., 2007; Swarup V. et al., 2007; Saito K. et al., 2008].
Таким образом, в результате реализации исследования нами были выявлены закономерности нарушения цитокинопосредованной коммуникации иммунокомпетентных клеток крови при персистенции двух различных представителей семейства Flaviviridae – вируса гепатита С и вируса клещевого энцефалита. Приведенный выше фактический материал убедительно свидетельствовует, что изменения продукции и рецепции основных иммунорегуляторных цитокинов как в случае длительной персистенции вируса гепатита С, так и в случае длительной антигенемии вируса клещевого энцефалита носят однонаправленный характер, однако, характеризуются различной степенью выраженности.
- Клинико-иммунологические закономерности дисфункции
системы цитокинов у пациентов с длительной персистенцией
возбудителей семейства Flaviviridae
Анализ возможных причин различных исходов длительной персистенции вирусов в настоящее время сфокусирован главным образом на факторах возбудителя инфекции (генотип, вирусная нагрузка). Однако не менее важное влияние на течение заболевания оказывает, без сомнения, состояние системы иммунитета [Маянский А.Н., 1999; Абдурахманов Д. Т., 2001; Boot J.C.L. et al., 2001]. В связи с этим нами была предпринята оценка цитокинового статуса мононуклеарных лейкоцитов как основных участников реализации специфического иммунного ответа в зависимости от клинических особенностей течения клещевой нейроинфекции (клинические проявления цереброгенной астении на фоне длительной антигенемии TBEV или бессимптомное носительство), формы острого периода перенесенного заболевания (в анамнезе) в случае клещевого энцефалита, а также от степени активности, стадии хронизации вирусного гепатита в случае хронического вирусного гепатита С.
При выявлении клинико-иммунологических параллелей между продукцией и рецепцией цитокинов, с одной стороны, и клиническим проявлением течения инфекционного процесса, с другой стороны, у пациентов с длительной антигенемией вируса клещевого энцефалита была установлена однонаправленность изменений цитокиновой системы как у пациентов без клинической симптоматики, так и у пациентов с остаточными признаками нейроинфекции. Так, цитокиновый статус у пациентов с цереброгенной астенией на фоне перенесенного клещевого энцефалита с длительной антигенемией TBEV характеризовался выраженным дисбалансом продукции и рецепции основных иммунорегуляторных Th1/Th2 цитокинов (более глубокое угнетение продукции и рецепции TNF, IL2, митоген-стимулированной продукции IL12 и, напротив, более выраженная активация системы IL4 и IL10, а также повышенное содержание растворимого рецептора к TNF). Продукция и акцепция IFN у пациентов с остаточными проявлениями клещевой нейроинфекции в сочетании с длительным носительством антигена TBEV соответствовала таковой у здоровых людей. Однако у пациентов с бессимптомной антигенемией вируса клещевого энцефалита нами было установлено увеличение как продукции IFN мононуклеарными лейкоцитами крови в эксперименте in vitro, так и количества лимфоцитов, несущих молекулу CD119w, являющуюся цепью интерферонового рецептора. Вероятно, данный факт можно рассматривать как частичное сохранение компенсаторных механизмов макроорганизма по защите от вирусной агрессии.
Необходимо отметить, что у пациентов с длительной антигенемией вируса клещевого энцефалита как количество клеток, несущих цитокиновые рецепторы, так и концентрация соответствующих лигандов в супернатантах культур мононуклеаров не зависели от формы острого периода заболевания (лихорадочная, стертая и субклиническая формы острого периода).
Кроме того, нами была проведена сравнительная оценка цитокинпродуцирующей и рецепторпрезентирующей функции мононуклеарных лейкоцитов у пациентов с острой антигенемией TBEV и больных прогредиентной формой хронического клещевого энцефалита. Закономерными, на наш взгляд, являются выявленные у пациентов с острой формой носительства антигена вируса клещевого энцефалита изменения в системах таких цитокинов, как TNF, IL2 и IFN, являющиеся признаками активации системы иммунитета в ответ на внедрение вирусного агента. Однако нами не было обнаружено увеличения продукции IL12 – провоспалительного цитокина, выполняющего роль связующего звена в переключении неспецифического иммунного ответа на специфический и активации клеточного (Th1) звена иммунитета. Также не было выявлено ожидаемых положительных корреляционных связей между продукцией IL12 и IFN – синергистов в реализации противовирусного иммунитета. Таким образом, еще на начальных стадиях формирования специфического иммунного ответа у пациентов с TBEV-инфекцией выявляются признаки дизрегуляции основных иммунорегуляторных Th1/Th2 цитокинов, которые, во-первых, могут модулировать механизмы реализации противовирусного иммунитета, нарушать эффективную элиминацию патогена и приводить к формированию длительной персистенции, во-вторых, усугубляя дисбаланс Th1/Th2, приводить к активации гуморального звена иммунитета и формированию признаков аутоагрессии. Изменения цитокинового статуса у больных хронической прогредиентной формой клещевого энцефалита имели одинаковую направленность и степень выраженности с таковыми у пациентов с остаточными симптомами клещевой нейроинфекции. По всей видимости, длительная персистенция TBEV приводит к дизрегуляции цитокинопосредованной кооперации иммуноцитов, степень выраженности которой в дальнейшем определяется индивидуальными особенностями макроорганизма.
Резюмируя представленные результаты исследования, необходимо также остановиться на особенностях цитокинопосредованной коммуникации лейкоцитов крови у больных хроническим вирусным гепатитом С. Как известно, под степенью активности гепатита понимают совокупность клинических данных, активности трансаминаз и результатов гистологического исследования биоптатов печени. Проведенная нами оценка цитокинового статуса лимфоцитов у больных хроническим вирусным гепатитом С в зависимости от степени активности, основываясь на определении полуколичественного гистологического индекса активности (индекс Knodell) (слабовыраженная и умеренная) позволила установить, что изменения носили однонаправленный характер.
Кроме того, у обследованных нами пациентов с длительной флавивирусной инфекцией уровень продукции и рецепции иммунокомпетентными клетками крови не определялись длительностью течения заболевания (до 1 года, от 1 до 3 лет и более 3 лет в случае длительной антигенемией вируса клещевого энцефалита; менее 5 лет и более 5 лет в случае хронической персистенции вируса гепатита С).
Таким образом, результаты проведенного нами исследования свидетельствуют о выраженном дисбалансе продукции и рецепции основных иммунорегуляторных Th1/Th2 цитокинов как при продолжительной персистенции вируса гепатита С, так и при длительной антигенемии TBEV. Очевидно, что выявленные изменения, с одной стороны, являются следствием нарушения иммунологического равновесия, необходимого для адекватного реагирования макроорганизма на вирусную интервенцию. С другой стороны, принимая во внимание лимфотропные свойства TBEV и HCV, указанные нарушения могут выступать в качестве причины нарушения коммуникации иммунокомпетентных клеток посредством модуляции функциональной активности лимфоцитов на молекулярно-генетическом уровне (рис. 4).
3. Молекулярно-генетические механизмы изменения системы цитокинов у пациентов с длительной персистенцией возбудителей
семейства Flaviviridae
Рассматривая проблему взаимоотношения вируса и организма человека посредством концентрации внимания на роли в этом процессе цитокинопосредованной коммуникации иммунокомпетентных клеток, мы затронули лишь одну
сторону вопроса: все рассмотренные выше изменения продукции цитокина рассматривались с точки зрения ответной реакции организма на вторжение патогена. Но возможна и другая ситуация, когда неполноценный противовирусный иммунный ответ может быть генетически детерминирован. В связи с этим в последние годы в центре внимания исследователей все чаще оказываются генетические факторы, определяющие характер взаимодействия возбудителя и макроорганизма и, соответственно, исход инфекционного заболевания. С одной стороны, особенности формирования и течения хронической инфекции обусловлены генетической гетерогенностью самого патогена (вирулентность, контагиозность, лекарственная устойчивость и др.), а, с другой, – определяются иммуногенетическими особенностями организма.
В настоящее время не установлены генетические маркеры, позволяющие достоверно прогнозировать характер течения инфекционного процесса, а также вероятность развития осложнений. Изучение механизмов, определяющих связь генотипа макроорганизма и клинических особенностей инфекционных заболеваний, является приоритетным направлением молекулярной медицины. Предпосылкой к изучению данной проблемы стало также утверждение, что, согласно мультифакторной модели, заболевание развивается только у тех субъектов, чей комбинированный груз генетических и средовых факторов превысит определенный пороговый уровень [Пузырев В.В. и соавт., 2002].
Известно, что нормальное функционирование иммунной системы строится на генетически детерминированном балансе Th1 и Th2 лимфоцитов [McClain C.J. et al., 1999; Симбирцев А.С., 2001; Хаитов Р.М., 2001]. Исследования аллельного полиморфизма генов в целом и отдельных аллелей генов, ассоциированных с повышенной либо сниженной продукцией соответствующего цитокина, весьма актуальны при изучении функционирования цитокиновой сети в условиях вирусной агрессии. С помощью такого подхода можно понять межиндивидуальные различия в реагировании иммунной системы на стимулы [Nebert D.W., 1997; Баранов В.С., 2000; 2004; Бархаш А.В. и соавт., 2005]. Показано существование аллелей генов многих цитокинов и рецепторов к ним, а также доказана связь аллельных вариантов генов цитокинов с тяжестью и продолжительностью заболеваний. Помимо роли цитокинов в патогенезе и клинических проявлениях заболеваний, установлено, что структурные особенности белковых продуктов полиморфных генов цитокинов ведут к различному качеству иммунного ответа и, соответственно, к различным особенностям течения и вариантам исхода болезни [Ben-Ari Z. et al., 2003; Ракова И.Г., Коненков В.И., 2004].
Установлено, что полиморфные варианты промотора гена TNFA обеспечивают различную предрасположенность к персистенции вирусов [Wilson A.G. et al., 1993; Аrias A.I. et al., 1997; Brinkman B.M. et al., 1997; Hohler T. et al., 1998; Louis E. et al., 1998; Fernandez-Arquero M. et al., 1999; Смольникова М.В. и соавт., 2004]. Известно, что точечная замена GА в позиции -308 промотора влияет на экспрессию гена TNFA и, следовательно, на уровень его белкового продукта. Для нас представлялось интересным проанализировать распределение аллелей гена TNFА в данном полиморфном локусе, которое помогло бы сделать вывод о предрасположенности либо резистентности организма к хроническому течению вирусного гепатита С и развитию длительной антигенемии вируса клещевого энцефалита.
Анализ полиморфизма промоторного региона гена TNFA в участке G-308A у здоровых лиц европеоидного происхождения, проживающих на территории Западной Сибири, больных хроническим вирусным гепатитом С и пациентов с длительной антигенемией TBEV того же этнического состава, показал, что распределение генотипов TNFA в контрольной группе соответствовало таковому у европеоидов других стран, где генотип G/G занимает доминантное положение [Fernandez-Arquero M. et al., 1999; Rosen H. et al., 2002; Goyal А. et al., 2004; Mangia A. et al., 2004]. Так, анализ распределения аллельных вариантов гена TNFA у пациентов с длительной антигенемией TBEV позволил зарегистрировать доминирование гомозиготного варианта G/G (68%) над гетерозиготными G/А (22%) и А/А (8%) (рис. 5). При этом значения критерия отношения шансов были существенно меньше единицы (OR=0,26), что является вероятным свидетельством протективного характера генотипа G/G в отношении длительной антигенемии TBEV. У больных вирусным гепатитом С, несмотря на то, что имелась тенденция к увеличению частоты генотипа G/А (20 против 8 %), разница в распределении частот генотипов между группами не достигла критерия достоверности (рис. 5).
Роль TNF в патогенезе вирусных инфекций связывают с изменением его продукции мононуклеарными лейкоцитами [Hohler T. et al., 1998]. Имеются данные, что транзиция -308 G/A сопровождается повышением секреции TNF почти в 2 раза [Wilson A.G. et al., 1997; Hohler T. et al., 1998]. Однако проведенное нами исследование подобной закономерности не выявило: в частности, не зависимо от генотипа содержание TNF в супернатантах культур мононуклеарных лейкоцитов крови у пациентов с длительной персистенцией вирусов семейства Flaviviridae оставалось сниженным.
Представляют интерес результаты анализа распределения частот аллельных вариантов полиморфизма Т-330G гена IL2: среди пациентов с длительной персистенцией HCV нами зарегистрировано доминирование гетерозиготного варианта T/G (59%) над гомозиготным T/T (36%) (рис. 5). При этом у HCV-инфицированных лиц частота генотипа Т/Т оказалась достоверно ниже (2=8,71; р<0,01), а варианта Т/G, напротив, выше (2=8,08; р<0,01), чем у здоровых индивидов. Учитывая значения критерия отношения шансов (OR=3,48), мы предположили, что степень риска дальнейшего прогрессирования и неблагоприятного исхода хронического вирусного гепатита С положительно ассоциирована с гетерозиготным T/G генотипом. В связи с тем, что замена нуклеотида локализована в промоторной области гена IL2, мы предположили, что ее фенотипический эффект может заключаться в изменении экспрессии гена и, следовательно, уровня его белкового продукта. Однако у больных хроническим вирусным гепатитом С и пациентов с TBEV-антигенемией носителей разных генотипов полиморфного участка Т-330G гена IL2 уровень спонтанной и стимулированной продукции IL2 статистически значимо не различался.
Оценка распределения генотипов гена IL12p40 одного из ключевых цитокинов активации неспецифического и специфического звеньев иммунореактивности и, в частности, Th1-лимфоцитов, у пациентов с длительной антигенемией TBEV позволила определить, что частота гомозиготного варианта C/C (27%) оказалась выше (2=11,02; р<0,001), чем аналогичные показатели у здоровых людей (2%) (рис. 5). Зная значения критерия отношения шансов (ОR=17,41), можно говорить о том, что гомозиготный вариант С/С промоторного варианта A-1188C гена IL12p40 выступает в качестве предиктора длительной антигенемии TBEV в организме.
Сопоставление результатов распределения генотипов промоторного региона A-1188C гена IL12p40 с уровнем секреции соответствующего цитокина показало, что у пациентов с длительной антигенемией TBEV выявлялся схожий уровень продукции IL12 у носителей разных генотипов полиморфного локуса A-1188C гена IL12p40.
Склонность к хроническому затяжному течению вирусных инфекций может быть связана с аллельным вариантом C-590T гена IL4. Рядом авторов была показана ассоциация генотипа T/T промоторного региона C-590T гена IL4 с гиперпродукцией цитокина при инфекции, определяющая быстрое прогрессирование заболевания [Смольникова М.В., 2002; Пузырев В.П., 2002]. Среди пациентов с длительной флавивирусной инфекцией и здоровых людей статистически значимых различий в распределении генотипов промоторного региона C-590T гена IL4 обнаружено не было (рис. 5). Анализ ассоциированности генотипа клеток, продуцирующих IL4, и содержания IL4 в супернатантах культур мононуклеарных лейкоцитов крови у пациентов с длительной персистенцией вирусов семейства Flaviviridae показал, что генотип Т/Т чаще выявляется среди индивидов с высоким уровнем продукции цитокина. Однако статистически значимой зависимости продукции этого контрвоспалительного цитокина от генотипа промоторного региона C-590T гена IL4 установлено не было.
Анализ полиморфизма промоторного региона Q-576R гена IL4RA576 показал, что среди пациентов с длительной персистенцией флавивирусов достоверные различия по сравнению со здоровыми людьми отсутствовали (рис. 5). Однако предпринятая нами попытка оценить распределение генотипов и аллелей гена IL4RA576 среди пациентов с длительной антигенемией вируса клещевого энцефалита в зависимости от клинических проявлений нейроинфекции позволила установить статистически значимое (2=6,92; р<0,01) преобладание частоты гетерозиготного варианта Q/R (69%, ОR=3,05) над гомозиготным вариантом Q/Q (20%) промоторного региона Q-576R гена IL4RA576 у пациентов с остаточными проявлениями клещевой нейроинфекции.
Оценка распределения генотипов гена IL4RA50 у пациентов с длительной персистенцией вирусов семейства Flaviviridae позволила определить, что частота гетерозиготного варианта Val/Ile (61%) гена IL4RA50 оказалась статистически значимо выше (2=4,61; р<0,05), а гомозиготного Ile/Ile (30%) – ниже (2=4,95; р<0,05), чем аналогичные показатели у здоровых людей. Основываясь на значениях критерия отношения шансов, можно предположить, что генотип Ile/Ile является протективным фактором в условиях длительной антигенемии TBEV (ОR=0,39), а увеличение частоты гетерозиготного варианта Val/Ile (ОR=1,03) указывает на его положительную ассоциацию с длительной персистенцией TBEV в организме.
По данным литературы, иммуногенетическим фактором резистентности к развитию хронического вирусного гепатита С является генотип А/А гена IL10 в точке аллельного полиморфизма C-592A [Yee L.J. et al., 2001; Смольникова М.В. и соавт., 2002; Knapp S. et al., 2003]. Среди больных хроническим вирусным гепатитом С нами было выявлено преобладание варианта С/А полиморфного региона гена IL10 в участке С-592A (96%), положительно связанного с риском дальнейшего прогрессирования и неблагоприятного исхода инфекции (ОR=8,74) (рис. 5). Обращало на себя внимание отсутствие среди HCV-инфицированных лиц с гомозиготным генотипом по аллелю С. Необходимо подчеркнуть, что у пациентов с длительной антигенемией TBEV была показана инверсия в частоте распределения генотипов и аллелей промоторного региона гена IL10 в участке C-592А по сравнению с аналогичными показателями у здоровых лиц: генотип С/С превышал частоту вариантов С/А и А/А (рис. 5). Следует также отметить, что OR оказался равным 5,15, что свидетельствовало в пользу ассоциации генотипа С/С участка C-592А гена IL10 с длительной персистенцией TBEV.
Современные исследователи склонны считать, что феномен гиперпродукции IL4 и IL10, регистрируемый при длительной персистенции вирусов, а также другой патологии (например, атопическом дерматите), может быть обусловлен не одним аллельным вариантом гена, а комплексом генов, от которых зависит уровень продукции цитокинов Th1- и Th2-типа [Mosmann T.R., Sad S., 1996; Kraslova I. et al., 2003].
Итак, поскольку нормальное функционирование иммунной системы возможно лишь путем поддержания определенного баланса продукции и акцепции цитокинов, чрезвычайно важным является определение всех факторов, влияющих на изменение гомеостаза цитокиновой сети [Arai K. et al., 1991; Коненков В.И. и соавт., 2006]. Полиморфизм генов цитокинов, вероятно, является существенным фактором предрасположенности (резистентности) к инфицированию вирусами и к последующей персистенции (элиминации) инфекта в макроорганизме (рис. 6). В то же время пока не ясно, какие мутации и каких именно генов имеют решающее значение. По-видимому, большую роль играют не столько отдельные аллели генов, сколько их сочетания. В связи с этим перспективным направлением иммуногенетических исследований при персистентных вирусных инфекциях является изучение роли сочетаний аллелей генов при оценке подверженности к инфицированию и длительному пребыванию вируса в организме с учетом этнических особенностей пациентов.
Таким образом, использование современных молекулярно-биологических методов исследования позволяет значительно расширить возможности изучения патогенеза персистентных инфекций. По мнению современных исследователей, ключом к разгадке феномена персистенции вирусов в организме человека служит генетически детерминированная иммунореактивность системы крови, баланс влияний Th1- и Th2-путей иммунитета. Результаты настоящего исследования с убедительностью продемонстрировали, что предиктором развития длительной персистенции возбудителей семейства Flaviviridae являются нарушения генетически детерминированных молекулярных механизмов регуляции системы цитокинов в кооперации иммуннокомпетентных клеток. Длительная персистенция вирусов семейства Flaviviridae (на модели длительной антигенемии вируса клещевого энцефалита и хронического вирусного гепатита С) сопровождается дисбалансом продукции основных про- и противовоспалительных цитокинов (IL2, IL4, IL10 и TNF), количеством лимфоцитов, презентирующих комплиментарные им рецепторы (IL2R, IL4R, IL10R и TNFR1). Существенным фактором предрасположенности (резистентности) к длительной флавивирусной инфекции является полиморфизм генов цитокинов (C-592A гена IL10, Ile-50Val гена IL4RA50, G-308A гена TNFA, A-1188C гена IL12p40, T-330G гена IL2). Резюмируя представленный выше фактический материал, следует отметить общую направленность и характер изменений показателей иммунофенотипического и цитокинового статуса мононуклеарных лейкоцитов крови у пациентов с длительной персистенцией Flaviviridae-вирусов.
В целом, представленные данные отвечают лишь на отдельные вопросы пробле-
А
Б
мы дизрегуляции иммунного ответа при инфицировании макроорганизма вирусами семейства Flaviviridae и открывают новые перспективы изучения молекулярных и клеточных механизмов модификации продукции и рецепции цитокинов, а также трансдукции полученных от них сигналов активации при длительной персистенции вирусов с целью прогноза темпа прогрессирования хронической инфекции, а также для создания персонализированных профилактических и терапевтических средств поддержания защитных сил инфицированного организма.
ВЫВОДЫ
- Механизмы развития хронического носительства вирусов семейства Flaviviridae (хронический вирусный гепатит, длительная антигенемия вируса клещевого энцефалита) сопряжены с типовым дисбалансом цитокинопосредованного взаимодействия иммунокомпетентных клеток крови.
- Нарушения системы IL2 при длительной персистенции вирусов семейства Flaviviridae (хронический вирусный гепатит, длительная антигенемия вируса клещевого энцефалита) проявляются снижением индуцированной ФГА in vitro продукции цитокина, абсолютного и относительного количества CD25+лимфоцитов, что приводит к угнетению Th1-пути иммунного ответа.
- Активация продукции и рецепции IL4 мононуклеарными лейкоцитами крови является одним из факторов, способствующих поляризации иммунного ответа в направлении Th2 при хроническом вирусном гепатите и длительной антигенемии вируса клещевого энцефалита.
- Дисбаланс системы TNF и его рецепторов, проявляющийся в снижении продукции мононуклеарными лейкоцитами крови цитокина и презентации комплиментарного ему мембраносвязанного рецептора при одновременном повышении продукции растворимых форм рецептора, является звеном патогенеза угнетения антигенспецифического иммунного ответа при длительной персистенции вирусов семейства Flaviviridae.
- Иммуногенетическим фактором, обладающим протективным эффектом в отношении длительной персистенции вирусов гепатита С среди лиц европеоидной популяции, проживающих на территории Западной Сибири, являются генотип C/C промоторного региона C-592A гена IL10 и генотип Ile/Ile промоторного региона Ile-50Val гена IL4RA50; в отношении длительной антигенемии вируса клещевого энцефалита генотипы G/G промоторного региона G-308A гена TNFA и А/А промоторного региона A-1188C гена IL12p40, генотип Ile/Ile промоторного региона Ile-50Val гена IL4R.
- Механизмы развития неэффективного противовирусного иммунного ответа при хроническом вирусном гепатите С ассоциированы с Т/G генотипом промоторного региона -330G гена IL2 и С/А генотипом – -592A гена IL10; клещевом энцефалите с C/C генотипом промоторного региона A-1188C гена IL12p40, Val/Ile генотипом промоторного региона Ile-50Val гена IL4R, Q/R генотипом промоторного региона Q-576R гена IL4R, C/С генотипом промоторного региона C-592A гена IL10.
- Закономерности нарушения системы цитокинов при персистенции вируса клещевого энцефалита определяются активностью инфекционного процесса: в остром периоде заболевания возрастает продукция мононуклеарными лейкоцитами крови провоспалительных Th1-цитокинов (TNF, IL2, IFN); длительная антигенемия вируса клещевого энцефалита характеризуется дисбалансом системы цитокинов, обусловливающим поляризацию иммунного ответа в направлении Th2.
- Основными признаками дисбаланса системы цитокинов, отличающими длительную антигенемию вируса клещевого энцефалита, сопровождающуюся проявлениями нейроинфекции в виде цереброгенной астении, от бессимптомного носительства антигена вируса клещевого энцефалита, являются более выраженное увеличение продукции мононуклеарными лейкоцитами IL4, sTNFR, количества лимфоцитов, презентирующих рецепторы к IL4, IL10, снижение продукции TNF, количества лимфоцитов, презентирующих рецепторы к TNF и IL2. Пациенты с бессимптомным носительством антигена вируса клещевого энцефалита характеризуются сохранной функцией эффекторных клеток иммунной системы отвечать увеличением продукции IFN и презентации комплиментарных рецепторов в ответ на инфекцию.
- Изменения системы цитокинов у больных хроническим вирусным гепатитом С различной степени активности (слабовыраженная и умеренная) носят однонаправленный характер, при этом являются более выраженными в отношении продукции IL4 и IL10 у больных хроническим вирусным гепатитом С умеренной степени активности.
СПИСОК РАБОТ, ОПУБЛИКОВАННЫХ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ
- Патофизиология иммунных нарушений при хронических вирусных гепатитах / О.Б. Жукова, Н.В. Рязанцева, В.В. Новицкий, Т. Т. Радзивил, С.Л. Михеев, А.П. Мельникова // Материалы Второй международной конференции «Патофизиология и современная медицина», Москва, 22-24 апреля 2004 г. - Москва, 2004. - С. 154-157.
- Иммунорегуляторные Th1- и Th2-цитокины при хронической инфекции, вызванной вирусами гепатитов В и С / И.О. Наследникова, Н.В. Рязанцева, Е.В. Белобородова, В.В. Белоконь, М.А. Антошина, Ю.В. Томсон, Е.С. Зверева, Н.В. Токарева, О.Б. Жукова, А.П. Мельникова // Материалы Второй международной конференции «Патофизиология и современная медицина», Москва, 22-24 апреля 2004 г. - Москва, 2004. - С. 86-87.
- Хронические вирусные гепатиты - актуальная проблема медико-социального значения / О.Б. Жукова, А.П. Мельникова, Н.В. Рязанцева и др. // Сборник научных работ «Актуальные проблемы биологии, медицины и экологии». - Томск, 2004. -№2. - С. 347.
- Молекулярно-генетические механизмы дисфункции лимфоцитов крови при хронической вирусной инфекции / И.О. Наследникова, Н.В. Рязанцева, В.В. Новицкий, О.Б. Жукова, А.П. Мельникова и др. // Всероссийская конференция «Актуальные вопросы гематологии и трансфузиологии», Санкт-Петербург, 8-10 июня 2004 г. - СПб., 2004. - С. 204-205.
- Иммунофенотипические особенности лимфоцитов при длительной вирусной персистенции / И.О. Наследникова, Н.В. Рязанцева, О.Б. Жукова, А.П. Мельникова и др. // Сборник научных работ VI конгресса с международным участием «Паллиативная медицина и реабилитация в здравоохранении», Турция, г. Анталия, 24-30 апреля 2004 г. – Паллиативная медицина и реабилитация. - 2004. - №2. - С. 29-30.
- Молекулярно-генетические механизмы хронизации вирусной инфекции / Н.В. Рязанцева, В.В. Новицкий, О.Б. Жукова, И.О. Наследникова, А.П. Мельникова и др. // III российский конгресс по патофизиологии с международным участием «Дизрегуляционная патология органов и систем (экспериментальная и клиническая патофизиология)», Москва, 9-12 ноября 2004 г. - Москва, 2004. - С. 142.
- Закономерности изменений цитокинпродуцирующей способности лимфоцитов при хроническом вирусном гепатите / И.О. Наследникова, Н.В. Рязанцева, В.В. Новицкий, О.Б Жукова, А.П. Мельникова и др. // III российский конгресс по патофизиологии с международным участием «Дизрегуляционная патология органов и систем (экспериментальная и клиническая патофизиология)», Москва, 9-12 ноября 2004 г. - Москва, 2004. - С. 72.
- Хронический вирусный гепатит С: продукция фактора некроза опухолей альфа и его растворимого рецептора мононуклеарными лейкоцитами / И.О. Наследникова, Н.В. Рязанцева, А.П. Зима и др. // Сибирский журнал гастроэнтерологии. - 2004. - №18 - С. 45-46.
- Роль нарушений иммунофенотипического профиля лимфоцитов крови в формировании хронической антигенемии вируса клещевого энцефалита / О.Е. Чечина, О.Б. Жукова, Н.В. Рязанцева, В.В. Новицкий, А.П. Зима и др. // Материалы Всероссийской конференции «Компенсаторно-приспособительные процессы: фундаментальные экологические и клинические аспекты», Новосибирск, 5-7 октября, 2004 г. - Новосибирск, 2004. - С. 86-87.
- Молекулярные механизмы изменения продукции ФНО- мононуклеарами крови при хроническом вирусном гепатите С / Н.В. Рязанцева, И.О. Наследникова, А.П. Зима и др. // Бюллетень экспериментальной биологии и медицины. - 2005. - №2. - С. 191-195.
- Изменение межклеточной кооперации мононуклеарных лейкоцитов в механизмах формирования персистентных вирусных инфекции / А.П. Зима, Ю.В. Миноченко, В.С. Козырева и др. // Материалы V1 Международного конгресса молодых ученых и специалистов «Науки о человеке», Томск, 20-21 мая 2005 г. - Томск, 2005. - С. 24.
- Фактор некроза опухолей альфа при хронических вирусных гепатитах / Н.В. Рязанцева, В.В. Новицкий, А.П. Зима и др. // Материалы 6-й Всероссийской научно-практической конференции «Вирусные гепатиты - проблемы эпидемиологии, диагностики, лечения и профилактики», Москва, 25-26 мая 2005 г. - С. 297-298.
- Механизмы межклеточной кооперации иммунокомпетентных клеток крови при хронической персистенции вируса клещевого энцефалита / Н.В. Рязанцева, А.П. Зима, В.В. Новицкий и др. // Материалы всероссийской научно-практической конференции с международным участием к 100-летию со дня рождения А.Г. Панова «Современное состояние проблемы нейроинфекций», г. Санкт-Петербург, 19-22 мая 2005 г. - Нейроиммунология. - 2005. - №2. - С. 17.
- Зима А.П. Молекулярно-генетические механизмы реализации противовирусного иммунитета у пациентов с хроническими вирусными гепатитами / А.П. Зима, Н.В. Рязанцева, И.О. Наследникова // Материалы Международного конгресса «Иммунитет и болезни: от теории к терапии», г. Москва, 3-8 октября 2005 г. - Журнал Ассоциации Детских Аллергологов и Иммунологов России. - 2005. - Т.6, №5 (Приложение 1). - С. 197-198.
- Изменение межклеточной кооперации мононуклеарных лейкоцитов в механизмах формирования персистентных вирусных инфекций / Н.В. Рязанцева, А.П. Зима, В.В. Новицкий и др. // Всероссийский научный симпозиум «Цитокины. Стволовая клетка. Иммунитет.», г. Новосибирск, 19-21 июля 2005г. - Цитокины и воспаление. - 2005. - Т.4, №2. - С. 97-98.
- Роль изменения экспрессии цитокинов и их рецепторов мононуклеарными лейкоцитами в условиях формирования противовирусного иммунитета / А.П. Зима, Ю.В. Миноченко Н.В. Рязанцева и др. // Тезисы докладов V Сибирского физиологического съезда, г. Томск, 29 июня - 1 июля 2005 г. - Бюллетень сибирской медицины. - 2005. - Т.4, Приложение 1. - С. 95.
- Роль нарушений продукции фактора некроза опухоли альфа мононуклеарами крови в механизмах модуляции апоптоза при гепатите С / В.В. Новицкий, Н.В. Рязанцева, О.Б. Жукова, Т.Т. Радзивил, Е.В. Белобородова, А.П. Зима и др. // Медицинская иммунология. - 2005. - № 4. - С. 417-420.
- Хронический вирусный гепатит С: иммунорегуляторные цитокины и хронизация инфекции / И.О. Наследникова, Е.В. Белобородова, Н.В. Рязанцева, Э.И. Белобородова, В.В. Новицкий, Г.Э Черногорюк, В.В. Белоконь, М.А. Антошина, А.П. Зима // Клиническая медицина. - 2005. - № 9. - С. 40-44.
- Полиморфизм промоторного участка генов G-308A TNFA, T-330G IL2, C590T IL4, C-703T IL5 и C-592A IL10 у больных вирусным гепатитом C / В.В. Авдошина, В.В. Коротченко, Е.В. Белобородова, И.О. Наследникова, Н.В. Рязанцева, В.И. Коненков, А.П. Зима // Цитокины и воспаление. - 2005. - № 2. - С. 78.
- Дизрегуляция клеточного звена иммунитета при хроническом вирусном гепатите / И.О. Наследникова, Н.В. Рязанцева, Е.В. Белобородова, В.В. Новицкий, Э.И. Белобородова, О.Б. Жукова, А.П. Зима и др. // Бюллетень СО РАМН. - 2005. - № 4. - С. 59-63.
- Разработка технологии прогнозирования течения и исходов вирусных инфекций на основе идентификации молекулярных мишеней повреждения ключевых систем гомеостаза человека / О.Б. Жукова, Н.В. Рязанцева, А.П. Зима и др. // Материалы II Международной конференции «Молекулярная медицина и биобезопасность», г. Москва, 20-21 октября 2005 г. - Москва, 2005. - С.132-133.
- Нарушения продукции цитокинов мононуклеарами периферической крови при персистенции вируса клещевого энцефалита / Н.В. Рязанцева, В.В. Новицкий, А.П. Зима и др. // Журн. неврологии и психиатрии им. С.С. Корсакова. - 2006. - №12. - С. 57-62.
- Иммунопатогенетические особенности клещевого энцефалита / Н.В. Рязанцева, В.В. Новицкий, А.П. Зима и др. // Вопросы вирусологии. - 2006. - №6. - С. 35-39.
- Закономерности нарушений межклеточной кооперации иммунокомпетентных клеток при антигенемии вируса клещевого энцефалита / А.П. Зима, Р.Ф. Насырова, Н.Г. Жукова и др. // Всероссийская научно-практическая конференция «Современная ситуация и перспективы борьбы с клещевыми инфекциями в ХХI веке». Томск, 14-15 февраля 2006 г.- С. 48-49.
- Направленность клеточной дифференцировки в условиях хронического носительства вируса клещевого энцефалита / Р.Ф. Насырова, Н.Г. Жукова, О.Б. Жукова, А.П. Зима и др. // Всероссийская научно-практическая конференция «Современная ситуация и перспективы борьбы с клещевыми инфекциями в ХХI веке». Томск, 14-15 февраля 2006 г.- С. 96-97.
- Молекулярные основы противовирусной стратегии организма при клещевом энцефалите / Н.В. Рязанцева, В.В. Новицкий, О.Б. Жукова, А.П. Зима // Всероссийская научно-практическая конференция «Современная ситуация и перспективы борьбы с клещевыми инфекциями в ХХI веке». Томск, 14-15 февраля 2006 г.- С. 50-51.
- Молекулярные и клеточные основы патогенеза клещевого энцефалита / Насырова Р.Ф., Н.В. Рязанцева, Н.Г. Жукова, А.П. Зима и др. // Бюллетень сибирской медицины. - 2006. - Т.5, Приложение 1. - С. 42-52.
- Современные клинические проявления клещевого энцефалита в Томской области / Н.Г. Жукова, А.В. Лепехин, Лукашева Л.В., Р.Ф. Насырова, Н.В. Рязанцева, М.Р. Карпова, М.Н. Добкина, А.П. Зима // Бюллетень сибирской медицины. - 2006. - Т.5, Приложение 1. - С. 52-57.
- Избранные вопросы состояния клеточных факторов резистентности при клещевых природно-очаговых микст-инфекциях / Н.П. Пирогова, М.Р. Карпова, В.В. Новицкий, А.П. Зима и др. // Бюллетень сибирской медицины. - 2006. - Т.5, Приложение 1. - С. 144-151.
- Цитокины и противовирусный иммунитет / Н.В. Рязанцева, В.В. Новицкий, В.В. Белоконь, А.П. Зима и др. // Успехи физиологических наук. - 2006. - № 4. - С. 1-11.
- Молекулярно-клеточные основы патогенеза хронических вирусных гепатитов / О.Б. Жукова, Н.В. Рязанцева, А.П. Зима и др. // Российский медицинский форум с международным участием «Фундаментальная наука и практика» г. Москва, 18-20 октября 2006 г. - Москва, 2006. - С. 52.
- Механизмы изменения продукции фактора некроза опухоли альфа при персистенции вируса клещевого энцефалита / А.П. Зима, Н.В. Рязанцева, О.Б. Жукова и др. // Съезд неврологов Сибирского федерального округа, г. Ярославль, 30-31 мая 2006 г. - Ярославль, 2006. - С. 108-109.
- TNF-mediated apoptosis of peripheral blood lymphocytes in chronic hepatitis C / O.B. Zhukova, N.V. Ryazantseva, V.V. Novitskiy, A.P. Zima et al. // 4th Conference Cytokines and Inflammation. – USA, California, January 30-31, 2006. - Р. 236.
- Распределение аллелей полиморфных участков промоторов генов интерлейкина-4 С-590Т IL-4 и генов рецепторов к нему IL-4RA Q-576R и 4RA Ile-50Val среди больных вирусным гепатитом С / В.В. Авдошина, В.И. Коненков, В.В. Дортман, Е.В. Белобородова, И.О. Наследникова, А.П. Зима и др. // Журнал микробиологии, эпидемиологии и иммунологии. 2007 - №1. - С. 43-46.
- Дисбаланс иммунорегуляторных Th1- и Th2-цитокинов при персистентных вирусных инфекциях / И.О. Наследникова, Н.В. Рязанцева, В.В. Новицкий, С.Б. Ткаченко, А.П. Зима // Медицинская иммунология. - 2007. - № 1. - С. 53-60.
- Молекулярно-генетические механизмы формирования вирусной персистенции / Н.В. Рязанцева, О.Б. Жукова, И.О. Наследникова, А.П. Зима и др. // Материалы 15 Российско-Японского Симпозиума медицинского обмена «Москва-2007» Пути развития и перспективы. - г. Благовещенск, 2007 г. - С. 236.
- Аллельный полиморфизм генов ИЛ-4 и ИЛ-10 как один из возможных механизмов, способствующих хронизации вирусных гепатитов / Н.В. Рязанцева И.О. Наследникова, В.И. Коненков, В.В. Новицкий, С.Б. Ткаченко, А.П. Зима и др. // Иммунология. - 2007. - Том 28, №2. - С. 68-72.
- Роль генетически детерминированной продукции иммунорегуляторных цитокинов в иммунопатогенезе хронических вирусных гепатитов / И.О. Наследникова, В.И. Коненков, Н.В. Рязанцева, В.В. Новицкий, С.Б. Ткаченко, А.П. Зима и др. // Бюллетень экспериментальной биологии и медицины. - 2007. - Т. 143, № 6. - С. 648-654.
- Хронический вирусный гепатит: генетически детерминированная продукция иммунорегуляторных цитокинов и хроническая инфекция / И.О. Наследникова, А.П. Зима, Е.В. Белобородова // Тезисы II Российско-Германской конференции Форума Коха-Мечникова Туберкулез, СПИД, вирусные гепатиты, проблемы безопасности крови и менеджмент в здравоохранении, Томск, 9-12 сентября 2007 г. - С. 164.
- Молекулярные основы дизрегуляции системы цитокинов при клещевом энцефалите / Н.В. Рязанцева, А.П. Зима, В.В. Новицкий и др. // Всероссийская научная конференция «Современные научные и прикладные аспекты клещевого энцефалита (К 70-летию открытия вируса клещевого энцефалита)», Москва, 15-16 ноября 2007 г. - С. 106-107.
- Система фактора некроза опухолей альфа и его рецепторов в иммунопатогенезе персистентных вирусных инфекций / А.П. Зима, Н.В. Рязанцева, В.В. Новицкий и др. // Иммунология. - 2007. - Том 28, №6. - С. 357-361.
- Механизмы дизрегуляции системы цитокинов при клещевом энцефалите / А.П. Зима, Н.В. Рязанцева, О.Б. Жукова и др. // Омский научный вестник. - 2007. - №3, Прил. 2. - С. 124-125.
- Молекулярные основы персонализированной терапии социально-значимых инфекционных заболеваний и прогнозирование исхода взаимодействия инфектогена и иммунной системы макроорганизма / В.В. Новицкий, Н.В. Рязанцева, О.И. Уразова, И.О. Наследникова, О.В. Воронкова, А.П. Зима и др. // Сборник работ по результатам выполнения мероприятий за 2007 год в рамках приоритетного направления «Живые системы» ФЦП «Исследования и разработки по приоритетным направлениям развития научно-технологического комплекса России на 2007-2012 годы» – Москва, 2007. - С. 50-51.
- Дисбаланс продукции и рецепции IL2 и IL4 при длительной антигенемии вируса клещевого энцефалита / А.П. Зима, Н.В. Рязанцева, В.В. Новицкий и др. // Медицинская иммунология. - 2008. - № 4-5. - С. 389-396.
СПИСОК ИСПОЛЬЗОВАННЫХ СОКРАЩЕНИЙ
ДНК – дезоксирибонуклеиновая кислота
ИФА – иммуноферментный анализ
TBE – клещевой энцефалит
ПЦР – полимеразная цепная реакция
РНК – рибонуклеиновая кислота
ФГА – фитогемагглютинин
CD – кластер дифференцировки
HCV – вирус гепатита С
IFN – интерферон
Ig – иммуноглобулин
IL – интерлейкин
JAK – киназы семейства Janus
МНС – главный комплекс гистосовместимости
NF-kB – транскрипционный ядерный фактор kB
NS – неструктурный белок
Th – Т-хелпер
TNF – фактор некроза опухоли
Tregs – T-регуляторные лимфоциты
