Эпидемиологические аспекты пневмококковых инфекций и молекулярно-генетическая характеристика streptococcus pneumoniae

На правах рукописи

Мартынова

Алина Викторовна

эпидемиологические аспекты пневмококковых
инфекций и Молекулярно-генетическая
характеристика Streptococcus Pneumoniae

14.00.30 - эпидемиология

03.00.07 – микробиология

АВТОРЕФЕРАТ

диссертации на соискание ученой степени

доктора медицинских наук

Санкт-Петербург - 2008

 

Работа выполнена в ГОУ ВПО «Владивостокский государственный медицинский университет Росздрава»

 

Научные консультанты:

доктор медицинских наук профессор Огарков Павел Иванович 

доктор медицинских наук профессор Туркутюков Вячеслав Борисович

 

Официальные оппоненты:

доктор медицинских наук доцент Жоголев Сергей Дмитриевич

доктор медицинских наук профессор Баласанянц Гоар Сисаковна

доктор медицинских наук профессор Королюк Александр Михайлович

 

Ведущая организация: Государственное учреждение Научно-исследовательский институт гриппа РАМН

 

Защита состоится __________________ 2008 года в ______ часов на заседании совета по защите докторских и кандидатских диссертаций Д.215.002.12 при ГОУ ВПО «Военно-медицинская академия имени С.М. Кирова МО РФ» по адресу: 194044, г. Санкт-Петербург, ул. Академика Лебедева, д.6.

 

С диссертацией можно ознакомиться в фундаментальной библиотеке ГОУ ВПО «Военно-медицинская академия имени С.М. Кирова МО РФ».

 

 

Автореферат разослан “ ________ “ ________________ 2008 года.

 

Ученый секретарь совета

доктор медицинских наук профессор Иванов В.В.

Общая характеристика работы

Актуальность проблемы. Пневмококковые инфекции несмотря на длительное изучение, до сих пор остаются одной из наиболее актуальных проблем внутренних болезней. Streptococcus pneumoniae, возбудитель пневмококковых инфекций, вызывает не только отиты и синуситы (неинвазивные формы), но и пневмонию, менингит и бактериемию (инвазивные формы). Заболеваемость в Европе до сих пор составляет 16-20 человек на 100 тысяч населения, в США – пневмококковая инфекция ежегодно вызывает 20 тыс. случаев менингитов и бактериемий. По данным российских исследований ПеГАС-1 (фаза «А» и фаза «В» проводились НИИ антимикробной химиотерапии и Научно-методическим центром по мониторингу антибиотикорезистентности), заболеваемость пневмококковыми инфекциями в России колеблется от 5-6 до 16-20 случаев на 100 тысяч населения, встречаясь практически во всех социальных группах населения [Л.С. Страчунский, 2001; Р.С. Козлов, 2004].

Особую тревогу вызывает увеличение среди населения инвазивных форм пневмококковых инфекций (менингит и бактериемия) практически во всех возрастных группах. Это во многом связано с увеличением в структуре населения удельного веса больных с такими сопутствующими заболеваниями в анамнезе как туберкулез, гематологическая или онкологическая патология, ВИЧ и т.п., приводящими к выраженному снижению иммунного статуса. До сих пор отсутствуют достоверные результаты эпидемиологических исследований пневмококковых инфекций в различных группах населения с учетом сопутствующих заболеваний в анамнезе (ко-морбидности), несмотря на то, что предложенные в настоящее время эпидемиологические методики с вычислением интегративного показателя, в частности, индексов ко-морбидности [M.E. Charleson, 1989; M. Liu, 1993; H. Johns, 1996] позволяют оценить выживаемость (удельный вес выживших в группах пациентов с различными сопутствующими заболеваниями).

Кроме того, практически не исследуются региональные особенности серотипового состава популяции штаммов пневмококков; уровень устойчивости к антибактериальным химиопрепратам штаммов, выделенных у больных с различной ко-морбидностью, условия и характер циркуляции, а также генотипические и фенотипические особенности штаммов Streptococcus pneumoniae, что важно для определения эпидемиологической значимости пневмококковых инфекций.

Отсутствие достоверных данных по этим аспектам снижает возможности рациональной коррекции эмпирической антибактериальной химиотерапии и назначения антибиотиков с учетом индивидуальных особенностей пациента в каждом конкретном регионе, что ведет к необоснованным экономическим потерям.

Во многом сложность изучения эпидемиологии пневмококковых инфекций обусловлена несовершенством применяемых в настоящее время в России классических методов диагностики и серотипирования. Предложенные методы молекулярно-генетической диагностики, такие как пульс-электрофорез (PFGE), полимеразная цепная реакция (ПЦР) повторяющихся BOX-последовательностей (ВОХ-PCR), случайная амплификация полиморфной ДНК (RAPD), при потенциально высокой по сравнению с классическим культуральным методом разрешающей способности, не могут одновременно обеспечить задач микробиологической диагностики и эпидемиологического надзора за пневмококковыми инфекциями и требуют последовательного применения, что не всегда доступно и экономически обоснованно [Р.С. Козлов, 2004; P.W.M.Hermans, et al.,1995].

Достаточно популярным методом в молекулярной эпидемиологии является метод анализа полиморфизма длин рестрикционных фрагментов (RFLP) геномной ДНК с использованием различных гибридизационных зондов. RFLP обладает высокой воспроизводимостью и дискриминирующей способностью, однако требует подращивания материала: сама процедура длительна, требует сложного оснащения и высокой квалификации персонала. Кроме того, в случае диагностики пневмококковых инфекций отсутствует однозначное мнение не только по поводу характера гибридизационных зондов, но и по поводу достаточно информативного видо-, а тем более и штаммоспецифического молекулярного маркера. Это обусловлено пластичностью генома S.pneumoniaе, позволяющей ему осуществлять как внутри-, так и межвидовые взаимодействия в микробной ассоциации, что ведет к трудностям микробиологической диагностики данной инфекции. Вследствие этого значительно осложняются проведение эпидемиологического надзора за пневмококковыми инфекциями и рациональная организация противоэпидемических мероприятий.

Все выше сказанное объективно обосновывает необходимость дальнейшего совершенствования, а также поиска и разработки новых экспресс-методов диагностики и мониторинга пневмококковых инфекций прежде всего с применением генетического маркирования штаммов для решения задач эпидемиологического надзора за пневмококковыми инфекциями, включая и проведение клинического микробиологического мониторинга.

Цель работы изучить проявления эпидемического процесса при пневмококковых инфекциях для оптимизации профилактических и противоэпидемических мероприятий, повышения эффективности диагностики, а также рационализации региональных стандартов антимикробной химиотерапии на основании результатов исследования эпидемических и молекулярно-генетических характеристик штаммов S. pneumoniae.

Задачи исследования.

1. Провести ретроспективный эпидемиологический анализ заболеваемости пневмококковыми инфекциями среди населения субъекта РФ на примере Приморского края (1998-2005) на основе данных, полученных общепринятыми методами микробиологической диагностики S. pneumoniae.
2. Изучить роль факторов риска развития пневмококковых инфекций, оценить значение сопутствующих заболеваний в развитии пневмококковых инфекций при помощи современных эпидемиологических методик.
3. Провести клинико-микробиологический мониторинг пневмококковых инфекций с изучением особенностей формирования резистентности к антибиотикам штаммов S. pneumoniae, а также особенностей серотипового состава штаммов пневмококков, выделенных от больных с различными клиническими формами пневмококковых инфекций и от носителей.
4. Разработать метод выявления и дифференциации штаммов пневмококка на основе метода анализа полиморфизма длин концевых рестрикционных фрагментов некодируемого участка ДНК S. pneumoniae, провести апробацию метода, выявить его возможности и перспективы в клинической практике для диагностики пневмококковой инфекции, оценив его чувствительность и специфичность.
5. Изучить структуру популяции эпидемически опасных штаммов S. pneumoniae, оценить их эпидемиологическую роль с изучением генетических особенностей факторов вирулентности и механизмов резистентности к антибактериальным химиопрепаратам; при помощи предложенного варианта методики изучить клональное родство штаммов пневмококков, циркулирующих среди пациентов и носителей, с целью проведения эпидемиологического мониторинга.

Научная новизна.

Проведено ретроспективное эпидемиологическое исследование заболеваемости инвазивными (пневмониями, менингитами, бактериемиями) и неинвазивными пневмококковыми инфекциями (отитами, синуситами) с учетом всех нозологических форм данной этиологии, отраженными в различных разделах МКБ-10. Исследована заболеваемость пневмококковыми инфекциями с учетом наличия сопутствующих заболеваний (с применением индекса ко-морбидности [Charleson ME et al., 1989] и их влияния на развитие инфекционного процесса при пневмококковых заболеваниях; определены факторы риска развития различных форм пневмококковых инфекций, а также оценен риск формирования носительства.

Впервые экспериментально обоснован метод молекулярно-генетической диагностики пневмококковой инфекции, основанный на принципе анализа концевого полиморфизма длин рестрикционных фрагментов ДНК (TRFLP).

В качестве перспективного диагностического и молекулярно-эпидемиологического маркера штаммов S. pneumoniae изучен некодирующий участок ДНК SP_1922 и SP_1923, обозначенный как NCR (non-coding region). Охарактеризованы такие молекулярно-генетические особенности этого участка, как: фланкированность видоспецифичным геном (ген ply), приемлемый размер ампликона; а также наличие статистически значимой вариабельности рестрицируемых фрагментов.

Разработанный алгоритм применения метода анализа полиморфизма длин концевых рестрикционых фрагментов с предложенным праймером NCR позволил выделить 11 групп пневмококков, объединенных по результатам рестрикции NCR участка ДНК S. pneumoniae, что обеспечило позволяет проведение эпидемиологических исследований по выявлению источника инфекции и путей передачи.

Изучены молекулярно-биологические свойства штаммов пневмококка с оценкой вирулентности и устойчивости к антибактериальным химиопрепаратам, оценена возможность формирования и распространения эпидемических геновариантов S. pneumoniae. Оценено генетическое родство выделенных штаммов, изучены эволюционные изменения популяции штаммов пневмококка с учетом генотипа и фенотипа выделенных изолятов, приводящие к формированию эпидемического варианта.

Практическая значимость.

На основании ретроспективного эпидемиологического анализа пневмококковых инфекций с учетом всех нозологических форм пневмококковой инфекции, отраженной в МКБ-10, на примере субъекта Российской Федерации (Приморского края), установлены доминирующие нозологические формы инфекции; оценена тенденция заболеваемости пневмококковыми инфекциями; изучены факторы риска развития заболевания пневмококковыми инфекциями и носительства.

Так, в структуре инвазивных пневмококковых инфекций лидирующее место занимает пневмококковая пневмония. Среди всех неинвазивных пневмококковых инфекций чаще регистрируются острые синуситы (или обострения хронических синуситов), острые отиты с различными осложнениями. Выраженный подъем заболеваемости, как и при инвазивных формах инфекций, отмечается у детей до 14 лет и у лиц старше 55 лет.

Уровень носительства S. pneumoniae при наличии хронической патологии увеличивается в 3 раза у детей и в 5 раз – у взрослых, что является важным фактором риска в развитии инфекционного процесса любой локализации, т.е. как инвазивных, так и неинвазивных форм пневмококковых инфекций.

Полученные данные исследования эпидемиологических особенностей пневмококковых инфекций позволяют оценивать эффективность, прогнозировать и корригировать лечение больных с пневмококковыми инфекциями, в том числе и с различными сопутствующими заболеваниями.

Впервые был исследован серотиповой состав популяции пневмококков, выделенных при различных формах пневмококковых инфекций. Установлено, что в группе штаммов, вызвавших инвазивные формы инфекции, преобладают нетипируемые 20,5 % (61/298) и редкотипируемые 11,4 % (34/298) изоляты. Это составляет больше половины исследуемой популяции, вызвавшей инвазивные формы инфекции. В группе штаммов, выделенных от носителей, также наблюдается преобладание нетипируемых и редкотипируемых штаммов - соответственно 20,4 % (17/83) и 15,6 % (13/83).

Вместе с тем, при анализе серотипового состава популяции полирезистентных штаммов пневмококка, вызвавших инвазивные формы пневмококковых инфекций, отмечается несколько случаев повторного выделения штаммов серотипов 6А, 9V, 14, 19F, 23F. В группе штаммов, вызвавших неинвазивные случаи заболевания, были выделены штаммы серотипов 6А, 23F. У носителей так же были выделены штаммы 9V, 19F серотипов.

Среди штаммов S. pneumoniae, вызвавших различные нозологические формы пневмококковых инфекций, развивались сходные тенденции формирования антибиотикоустойчивости, характеризовавшиеся значительной долей штаммов, резистентных к препаратам группы макролидов и фторхинолонов, а также к тетрациклину, клиндамицину, триметоприм-сульфаметоксазолу, что требует коррекции стандартов проведения антибактериальной химиотерапии.

Оценен уровень устойчивости к антимикробным химиопрепаратам штаммов S. pneumoniae различных серотипов, выделенных у больных пневмококковыми инфекциями.

Создана региональная коллекция штаммов пневмококка, позволяющая проводить молекулярно-эпидемиологический мониторинг за пневмококковыми инфекциями.

Анализ генетической последовательности NCR фрагмента позволил применить данный участок ДНК пневмококка в качестве диагностической мишени для обнаружения S. pneumoniae.

На основе метода анализа полиморфизма концевых рестрикционных фрагментов ДНК S. pneumoniae стало возможным организовать эпидемиологический надзор за пневмококковыми инфекциями. Применение этого метода для исследования различного лабораторного биологического материала, позволило выявить тенденцию идентифицируемых штаммов пневмококка к клонально-поликлональному распространению, что продемонстрировало важность изучения особенностей эпидемического геноварианта для организации эпидемиологического надзора.

Выявленные различия в фрагменте NCR позволили адаптировать метод анализа полиморфизма концевых рестрикционных фрагментов для диагностики пневмококковых инфекций на основе применения данного фрагмента, исключив ложноположительные/ложноотрицательные результаты, а также диагностировать ассоциацию нескольких штаммов пневмококка в одном клиническом образце.

Основные положения, выносимые на защиту.

1. В исследуемом субъекте Российской Федерации (Приморском крае) отмечен высокий уровень заболеваемости пневмококковыми инфекциями. В структуре заболеваемости инвазивных форм превалируют пневмококковые пневмонии, доминирующие у детей до 14 лет и у лиц старше 55 лет; при этом отмечается гиподиагностика менингитов пневмококковой этиологии. В структуре неинвазивных пневмококковых инфекций чаще встречаются синуситы и отиты, преобладающие в группе детей младше 14 лет и у взрослых старше 55 лет.
2. Основным фактором риска развития пневмококковых инфекций является наличие сопутствующих заболеваний, что увеличивает риск носительства S. pneumoniae. Выживаемость больных инвазивными пневмококковыми инфекциями с сопутствующей патологией, оцениваемой индексом ко-морбидности около «10», составляет 55,5%; а выживаемость больных с индексом более «18» — 42,3%.
3. Особенности формирования устойчивости к антибактериальным химиопрепаратам, и высокий удельный вес в серотиповом составе популяции выделенных штаммов пневмококка нетипируемых изолятов обусловливают необходимость проведения регулярного молекулярно-эпидемиологического мониторинга за циркуляцией штаммов S. pneumoniae.
4. Проведение генотипирования с использованием метода анализа полиморфизма концевых рестрикционных фрагментов NCR участка ДНК S. pneumoniae позволяет выявить особенности распространения генетических детерминант устойчивости к антибактериальным химиопрепаратам и детерминант основных факторов вирулентности в штаммах пневмококка, принадлежащих к одному генотипу, что дает возможность выявлять эпидемический геновариант.
5. Применение метода анализа полиморфизма концевых рестрикционных фрагментов NCR участка ДНК S. pneumoniae позволяет решить проблему микробиологической диагностики штаммов пневмококка в разнообразном клиническом материале, диагностировать пневмококк как в монокультуре, так и в ассоциации, что обусловливает возможность рациональной организации диагностического процесса в интересах эпидемиологического надзора.

Личный вклад автора в проведенное исследование. Сбор материала производился лично диссертантом. Самостоятельно проводился ретроспективный эпидемиологический анализ заболеваемости: анализировались отчетные формы и микробиологические журналы лечебно-профилактических учреждений; проводилось анкетирование и обработка полученных данных для выявления роли факторов риска у пациентов и носителей; осуществлялось выделение штаммов S. pneumoniae, формирование исследуемой коллекции, исследование выделенных штаммов на устойчивость к антибактериальным химиопрепаратам диско-диффузионным методом и методом серийных разведений. Молекулярно-эпидемиологические исследования, отраженные в исследовании так же были проведены автором самостоятельно: постановка реакции ПЦР, подбор необходимого праймера, постановка анализа полиморфизма концевых рестрикционных фрагментов как с референтными штаммами, так и с клиническими образцами. Статистическая обработка полученного материала, включая построение дендрограмм и матриц соответствия, была произведена лично автором.

Апробация результатов работы. Материалы научно-исследовательской работы доложены: на Зальцбургских семинарах по инфекционным болезням (Зальцбург, Австрия, 2003, 2004); на Международном симпозиуме по изучению проблем устойчивости к антибактериальным химиопрепаратам (ISAAR, Сеул, Южная Корея, 2003; Манила, Филлипины, 2005); на Европейском конгрессе по клинической микробиологии и инфекционным заболеваниям (ECCMID, Прага, Чехия, 2004; Копенгаген, Дания, 2005); на Международном симпозиуме по изучению пневмококков и пневмококковых инфекций (ISPPD, Анкоридж, США, 2002; Хельсинки, Финляндия, 2004; Элис Спрингс, Австралия, 2006); на Международной конференции по созданию коллекций культур (ICCC, Токио-Цукуба, Япония, 2004); на Международном Конгрессе по антимикробной химиотерапии (ICAAC, Вашингтон, США, 2004); на Международном семинаре по инфекционным заболеваниям Фонда Гаслини (Генуя, Италия, 2004, 2005); на Европейском симпозиуме по изучению молекулярной биологии пневмококков (Брауншвайг, Германия, 2005;Флоренция, Италия, 2006; Оейрас, Португалия, 2007); на Европейском Респираторном Конгрессе (ERS, Стокгольм, Швеция, 2003; Копенгаген, Дания, 2005; Мюнхен, Германия, 2006); на Международном симпозиуме по изучению патогенных нейссерий (Кейрнс, Австралия, 2006); на Семинаре по Молекулярно-биологическим основам эпидемиологического контроля (ITEC, Дели-Чандигарх, Индия, 2006); на международном конгрессе по детским инфекциям (WSPID, Бангкок, Таиланд, 2007).

Материалы диссертационной работы были представлены на краевом семинаре «Госпитальная эпидемиология» при департаменте здравоохранения Администрации Приморского края (2004, 2005, 2006, 2007), а также на заседании Дальневосточного отделения Конгресса «Человек и лекарство» в 2007 году в г. Владивостоке. Работа обсуждена на заседании проблемной комиссии по микробиологии, иммунологии, эпидемиологии Владивостокского государственного медицинского университета (июнь, 2007).

Внедрение результатов работы. По материалам исследования были изданы Методические рекомендации «Метод анализа полиморфизма концевых фрагментов, полученных при рестрикции некодирующего участка ДНК в диагностике пневмококковых инфекций», утвержденные Президиумом СО РАМН «Дальневосточный научный центр» (27.06.2007). Опубликованы информационные письма, утвержденные Департаментом здравоохранения Приморского края: «Об эпидемиологических особенностях заболеваемости пневмококковыми инфекциями» (Владивосток, 2007); «Молекулярно-генетические особенности формирования резистентности при пневмококковых инфекциях» (Владивосток, 2007); «О молекулярно-эпидемиологических методах диагностики пневмококковой инфекции» (Владивосток, 2007), внедренные в работу лечебно-профилактических и медико-профилактических учреждений Дальневосточного Федерального округа.

Результаты исследования использованы при подготовке Государственного доклада «О состоянии здоровья населения Российской Федерации в 2007 году»; а также при создании формуляров Центра фармако-технической информации и клинической фармакологии Департамента здравоохранения Приморского края и были внедрены в работу лечебно-профилактических учреждений края.

Получены удостоверения на рационализаторские предложения: «Способ улучшения статистической отчетности по регистрации различных форм пневмококковых инфекций» (№ 2689, ВГМУ); «Способ анализа полиморфизма рестрикционных фрагментов для диагностики пневмококковых инфекций» (№ 2688, ВГМУ); «Способ оценки роли сопутствующих заболеваний при пневмококковых инфекциях» (№ 2690, ВГМУ).

Материалы диссертации используются в учебном процессе при подготовке врачей на кафедре терапии ФПК; кафедре госпитальной терапии; кафедре микробиологии; кафедре эпидемиологии и военной эпидемиологии Владивостокского государственного медицинского университета; на кафедре микробиологии, иммунологии и вирусологии Дальневосточного государственного медицинского университета; на кафедре микробиологии и вирусологии Амурской государственной медицинской академии; на кафедре эпидемиологии Воронежской государственной медицинской академии им.Н.Н. Бурденко; на кафедре гигиены, эпидемиологии и организации госсанэпидслужбы Ставропольской государственной медицинской академии; на кафедре микробиологии, вирусологии и иммунологии Дагестанской государственной медицинской академии.

По материалам диссертации опубликовано 45 печатных работ, в том числе в российских и иностранных журналах, рекомендуемых ВАК России 15 статей.

Объем и структура диссертации.

Работа изложена на 354 страницах машинописного текста и состоит из введения, обзора литературы, главы материалы и методы, 5 глав собственных исследований, заключения, выводов, практических рекомендаций, указателя литературы. Диссертация иллюстрирована 43 таблицами, 86 рисунками, 10 схемами. Список литературы содержит 422 литературного источника, из них 90 принадлежат отечественным и 332 зарубежным авторам.

Научно-исследовательская работа по теме диссертации зарегистрирована во Всероссийском Научно-Техническом Информационном Центре, регистрационный номер 01.20.03 02174.План научно-исследовательской работы был утвержден Этическим комитетом ГОУ ВПО «Владивостокский государственный медицинский университет Росздрава».

СОДЕРЖАНИЕ ДИССЕРТАЦИИ

Объем, материалы и методы исследования.

Обоснованием цели проведенного исследования послужили данные ретроспективного эпидемиологического анализа заболеваемости пневмониями, менингитами, отитами и синуситами на примере субъекта Российской Федерации (Приморского края), где было установлено, что данные заболевания преимущественно вызваны пневмококковой этиологией. Ретроспективные данные о заболеваемости за период с 1998 по 2005 год, а также медико-демографические показатели были предоставлены нам Медицинским информационно-аналитическим центром (МИАЦ) Приморского края: ф.12 «Сведения о числе заболеваний, зарегистрированных у больных, проживающих в районе обслуживания лечебного учреждения»; Статистический справочник «Здоровье населения г. Владивостока. Ресурсы здравоохранения и их использование 1996-2000 гг., 2001-2005 гг.», «Анализ статистических материалов по годовым отчетам о деятельности МЛПУ». Анализ этиологической структуры изучаемых нозологических форм проводился при выкопировке данных из форм № 254/у «Журнал регистрации исследований и результатов определения чувствительности микроорганизмов к химиотерапевтическим препаратам» (8 750 результатов лабораторных исследований) и из амбулаторных карт больных и за период 01.12.1998 по 31.12.2005 (1500 амбулаторных карт). Методической основой работы послужила система эпидемиологической диагностики: ретроспективный эпидемиологический анализ частоты выявления пневмококковых инфекций по результатам микробиологического и клинического обследования [Дегтярев А.А., 1982]. Ретроспективный анализ проводился по традиционной схеме c расчетом инцидентного и превалентного показателей и включал изучение многолетней динамики заболеваемости, структуры заболеваемости с распределением пациентов по полу и возрасту. Влияние сопутствующих заболеваний на развитие пневмококковых инфекций оценивалось при помощи коэффициента Charleson M.E. (1987). Проведенное исследование позволило оценить заболеваемость различными формами пневмококковых инфекций, выявить преобладающие факторы риска.

Нозологическая структура пневмококковых инфекций, а также микробиологические свойства штаммов S. pneumoniae, выделенных у больных пневмококковыми инфекциями проводились в период с 20.12.2003 по 31.12.2004 года в стационарах г. Владивостока. Основным контингентом исследованbя были 378 больных ведущими формами пневмококковой инфекции (пациенты учреждений здравоохранения г. Владивостока), находившихся на стационарном лечении с диагнозами «пневмококковая пневмония» (J13), «бактериальный менингит, вызванный S. pneumoniae» (G00.1), «пневмококковая бактериемия» (A40.3), «отит» (H67.8), «синусит» (I32.0-32.9) и с другими нозологическими формами пневмококковой инфекции (M00.1; М13.0;М01.8;H66.0;H75.8).

Для исследования явления носительства возбудителя и для выявления роли носительства возбудителя в формировании заболеваемости у так называемых «групп риска» по пневмококковой инфекции, нами был проведен поисковый скрининг среди групп населения, обратившихся за медицинской помощью в ЛПУ г. Владивостока Участники данного обследования (413 человек), являвшиеся носителями S. pneumoniae составили группу, в которой затем согласно целям и задачам исследования были выделены 2 подгруппы: носители с сопутствующей хронической заболеваемостью (275 человек) и полностью здоровые (138 человек).

Всего в исследование были вовлечены пациенты, лечившиеся в учреждениях г. Владивостока и Приморского края, обслуживающие больных пневмониями. Взрослые пациенты (старше 18 лет) были обследованы в ГКБ № 1, ГКБ № 2, ГКБ № 3, инфекционном отделении медсанчасти рыбаков, медсанчасти «Больница строителей». Данные о выделяемости пневмококка у пациентов детского возраста (младше 18 лет) были получены из педиатрических стационаров г. Владивостока (ГКБ № 1, ГКБ № 2, ГКБ № 3). Данные о носительстве пневмококка у пациентов с различной сопутствующей патологией получены у пациентов вышеуказанных клиник, получающих лечение в дневных стационарах, в отделениях медико-социальной помощи, в онкогематологическом отделении.

Проведение исследования было одобрено Независимым Этическим комитетом ГОУ ВПО «ВГМУ Росздрава», а при проведении исследования были получены информированное согласие пациентов и обследуемых на проведение исследования взятого от них клинического материала и использования анамнестических данных для настоящего исследования.

Выделенные у больных и носителей штаммы S. pneumoniae (n=378 от больных и 83 штамма от носителей) были выращены в чистой культуре согласно Приказу № 535 «Об унификации микробиологических методов исследования в лечебно-профилактических учреждениях», серотипированы согласно методике Quelling с соответствующими серотиповыми сыворотками. Устойчивость к антибактериальным химиопрепаратам диско-диффузионным методом и методом серийных разведений определялась согласно стандартам NCCLS (среда Muller-Hinton, National Clinical Committee Laboratory Standards, CDC). В исследуемой коллекции штаммов была определена группа полирезистентных штаммов пневмококка (n=34), выделявшихся как при инвазивных формах пневмококковых инфекций, так и у больных с неинвазивными формами и у носителей. Изучены молекулярно-генетические особенности вирулентности (праймеры к основным генам вирулентности ply, lytA, pspA, pspC) и устойчивости к антибактериальным химиопрепаратам (праймеры к генам mefE, ermB, parC, gyrA, pmrA, Tn1545, Tn917).

Различия в формах инфекционного процесса, серотиповом составе и сходные особенности в формировании антибиотикорезистентности обосновали необходимость разработки метода эпидемиологического надзора, позволившего дентифицировать штаммы, вызывающие сходный патогенетический процесс, обладающие идентичными особенностями факторов вирулентности и антибактериальной устойчивости, то есть идентифицировать эпидемические геноварианты. Для разработки такого метода нами был выбран принцип анализа полиморфизма концевых рестрикционных фрагментов. После анализа генома (база данных GenBank), выбран участок SP_1923 и SP_1922 ДНК S. pneumoniae, на основе которой был написан праймер NCR (non-coding region):

5`-CCG-ATT-TGC-CAC-TAG-TGC-GTA-AGC-3`, обратный праймер к нему:

5`-aaa-ggc-tgc-acg-gac- attg-3`

Контролем служил праймер к гену GAPDH глицеральдегид-3-фосфатдегидрогеназы: 5-GGA-TCC-TTG-CTT-GCA-CAC-TTG-TTG-AAA-TAC-3,обратный праймер: 5-AAG-CTT-TTA-TTT-AGC-AAT-TTT-TGC-GAA-GTATT-3.

В лабораторных условиях была доказана специфичность выбранной нами диагностической мишени c референтными и клиническими штаммами пневмококка (n=100), стрептококка (n=100), различными видами моракселл и гемофил; контрольными методами служили: (n=100) серотипирование (L.J. Chandler, B.S. Reisner,2000), (n=30) мультилокусное сиквенстипирование (M.C. Enright, 1987), (n=100) пульс-электрофорез (A. Whatemore,2000).

Подобрана последовательность рестриктаз, включавшая последовательное применение Alu1, Dde1 и Mse1. Метод анализа полиморфизма концевых рестрикционных фрагментов участка NCR с применением предложенной нами схемы рестриктаз испытан на 100 клинических образцах лабораторного материала; контрольным методом служил бактериологический метод, проведенный на тех же образцах лабораторного материала. При проведении анализа полиморфизма концевых рестрикционных фрагментов образцы клинического материала 3 раза отмывали в 0,02 М фосфатном буфере, затем обрабатывали раствором для гомогенизации мокроты «Sutasol» (производитель фирма Oxoid) согласно инструкции производителя, затем центрифугировались в течение 5 минут со скоростью 12 000 об/мин. Осадок ресуспендировался в 1,5 мл фосфатного буфера и центрифугировался в течение 5 минут со скоростью 12 000 об/мин 3 раза. ДНК выделяли при помощи быстрого фенольного метода, затем проводили ПЦР идентификацию с предложенным нами NCR праймером и рестрицировали полученный ампликон. Условия амплификации (GeneAmp PCR System 2400, Perkin-Elmer) были следующие: первоначально денатурация шла в течение 3 мин при 94 0С, последующие этапы денатурации (29 циклов) проводились по 1 мин при 94 0С. Отжиг шел в течение 30 циклов по 1 минуте при температуре 45 0С; воссоединение полученных цепей ДНК длилось в течение 30 циклов по 3 минуты при температуре 72 0С, с конечным этапом синтеза по 10 минут при 72 0С в течение 30 циклов, затем-инкубация при 10 0С. Условия рестрикции: готовили реакционную смесь в объеме 14 мкл, содержащей 2 мкл буфера NE 2, 0,2 мкл BSA, 11,3 бидистиллированной воды, 0,5 мкл рестрикционного фермента Alu1 («NewBioLabs», Великобритания), к которой добавляли 6 мкл ПЦР продукта. Рестрикцию проводили в течение 1-2 часов при температуре 37 0С, инактивировали рестрикицонный фермент при 65 0С в течение 20 минут. Для выявления нескольких штаммов S. pneumoniae рестрикцию проводили несколько раз, применяя последовательно рестрикционные ферменты Alu1, Dde1 и Mse1.

Регистрация полиморфизма рестрицированных фрагментов проводилась при помощи капиллярного электрофореза (Agilent 2100 Bioanalyzer, производитель Agilent Technologies, Калифорния, США) с использованием микрочипа (LabChip 7500; Caliper Technologies, Mountain View, Калифорния,США), что согласно методу, позволяет определить даже минимальный полиморфизм исследуемых образцов, и повышает, в целом, чувствительность данного метода. Результаты молекулярно-генетических исследований были проанализированы методами вариационной статистики с применением программного обеспечения Bionumerics 2.0.

Группа (n=34) полирезистентных штаммов S. pneumoniae, выделенная у больных инвазивными формами пневмококковых инфекций, неинвазивными формами и у носителей, была проанализирована предложенным нами методом анализа полиморфизма концевых рестрикционных фрагментов, также было проведено мультилокусное сиквенстипирование по семи локусам и пульс-электрофорез. Полученные результаты были обработаны методами вариационной статистики и представлены при помощи программного обеспечения MEGA 3.1, Agilent Bioanalzyer 2.5; LIAN 3.5. При исследовании данным методом различного клинического материала (155 образцов) удалось установить преобладание монокультур и ассоциаций, идентифицировать принадлежность штаммов пневмококка к определенному эпидемически значимому генотипу и определить характер распространения данного эпидемического геноварианта. Полученные результаты также анализировались методами вариационной статистики и представлены при помощи программного обеспечения MEGA 3.1, Agilent Bioanalzyer 2.5.

В ходе статистической обработки материалов главными показателями служили: средняя арифметическая (М), ее средняя ошибка (± m), ошибка к проценту относительной величины; кроме того, указывались точки экстремумов исследуемых величин (А max и А min), рассчитывался доверительный интервал (ДИ) с достоверностью 95%. Совокупность полученных данных проверялась на нормальность распределения ( 1 =  2,  1   2) с использованием критерия Колмогорова-Смирнова (K-S), критерия Лилиефорса (L) и критерия Шапиро-Вилкса (Sh-W), а также графическим методом с построением ожидаемой кривой распределения величин. Статистическая достоверность различий параметрических величин подтверждалась парным критерием Стьюдента (Т) для изучения различий между связанными совокупностями; критерием Стьюдента (t) для одной совокупности.

Для исследования непараметрических величин рассчитывались - 2, критерий (F) Фишера (для малых выборок). С целью изучения различий множественных выборок проводился дисперсионный анализ варианта ANOVA (для сравнения по одному признаку) и МANOVA (для изучения многофакторного влияния).

Для изучения вопроса о степени риска отношение шансов (ОШ); а также корреляционный критерий Пирсона для изучения вопроса о наличии связей между исследуемыми величинами. Кроме того, исследовались чувствительность (Se) и специфичность (Sp) диагностических манипуляций; рассчитывалась прогностическая ценность положительного результата (ПЦПР) и прогностическая ценность отрицательного результата (ПЦОР). Дискриминирующая способность теста рассчитывалась при помощи коэффициента Симпсона с расчетом корреляции Кендалла. Все статистические данные считались достоверными при уровне статистической значимости менее 5%.

Обработка данных и оформление результатов исследования осуществлялась на персональном компьютере при помощи пакета MS Office, MS Excel 2000.

Подробнее объем, материалы и методы указаны в таблице 1.

Таблица 1- Материалы и методы исследования

№ п/п	Направления исследований	Методы исследования	Объем исследований
	Эпидемиологические исследования	Ретроспективный эпидемиологический анализ заболеваемости [А.А. Дегтярев, 1982] (указаны результаты лаб.иссл.)	8750
	Эпидемиологические исследования	Изучение амбулаторных карт больных пневмококковыми инфекциями; Ведение журнала микробиологических исследований. Опрос носителей S.pneumoniae из групп с сопутствующей заболеваемостью и без; Изучение сопутствующей заболеваемости по методу Charleson ME (1986)	1850 960 413 (275 и 138) 378
	Микробиологические исследования	Экспресс-диагностика (микроскопия мазка с окраской по Граму) Выделение культур пневмококков их идентификация,серотипирование. [Р.С. Козлов,2004]	378 378
	Разработка этиологической диагностики пневмококковой инфекции на основе метода анализа концевого полиморфизма длин рестриктов NCR фрагментов S. pneumoniae	Подбор и характеристика участка ДНК S.pneumoniae для создания специфичного и чувствительного праймера. Постановка реакции ПЦР с репрезентативной выборкой штаммов S.pneumoniae и близкородственными видами. Постановка метода (TRFLP) анализа концевого полиморфизма длин рестриктов NCR фрагмента ДНК S.pneumoniae. Подбор оптимальных праймеров для постановки метода TRFLP. Постановка метода анализа концевого полиморфизма длин рестриктов NCR фрагмента с использованием праймера NCRspan3 в репрезентативной выборке клинических образцов.	10 136 136 100 60
	Молекулярно-эпидемиологические исследования	Метод анализа полиморфизма рестрикционных фрагментов NCR участка S.pneumoniae. Мультилокусное сиквенстипирование (MLST) [MC Enright,2001] Пульс-электрофорез, PFGE [D.R. Murdoch,2003] Серотипирование [Serum Statens] Построение дендрограмм, оценка формирования эпидемического клона.	134 64 134 134 134
	Исследование устойчивости к антибиотикам	Изучение устойчивости к антибиотикам [NCCLS 2004]; Гибридизация с праймерами к генам устойчивости к антибиотикам, сиквенирование	378 34
	Статистические исследования	Методы вариационной статистики: [А.А.Лукьянова, 2002] программа компьютерной обработки изображений Statistica 6.0, MEGA 3.1, Agilent Bioanalzyer 2.5; LIAN 3.5	Все числовые показатели

Результаты исследования и их обсуждение

В Приморском крае постоянно регистрируется высокий уровень заболеваемости пневмониями 57,06±2,32 ‰о, отитами 42,06 ± 4,51 ‰о, и синуситами 90,57± 2,6 ‰о. В г. Владивостоке постоянно регистрируется высокий уровень заболеваемости пневмококковыми инфекциями: за исследуемый период (1998-2005) заболеваемость пневмококковыми инфекциями составляет 6,13±0,29, при этом минимальный уровень был 4,5 на 10 000 населения, максимальный уровень заболеваемости достигал 6,6 на 10 000 населения (рисунок 1). Наблюдается достоверно выраженная тенденция к повышению заболеваемости пневмококковыми инфекциями с темпом прироста 6,3 % в год. Согласно литературным данным как российских [Р.С. Козлов, 2005; Л.С. Страчунский, 2003], так и зарубежных специалистов [A.Tomasz, 2006; D.Musser, 2003], средний показатель заболеваемости пневмококковыми пневмониями с учетом данных о заболеваемости пневмониями, отитами и синуситами — заболеваниями, где пневмококк является ведущим этиологическим агентом должен составить 32,73±1,58 ‰o, отитами 12,13±0,54 ‰o, синуситами 36,2±1,04 ‰o, что подтверждает предположение о недостаточном качестве диагностики и наличии сложностей в организации эпидемиологического надзора в отношении пневмококковых инфекций.

Рисунок 1 -Заболеваемость пневмококковыми инфекциями в г. Владивостоке (1998-2005 гг.), ‰о

Объективно существует проблема гиподиагностики заболеваемости, вызванной S. pneumoniae, что ведет к отсутствию регулярного учета заболеваемости и отсутствию системы мер противоэпидемических мероприятий в отношении пневмококковой инфекции.

Изучив структуру пневмококковых инфекций методом ретроспективного анализа заболеваемости, мы обнаружили, что в структуре инвазивных пневмококковых инфекций (рис. 2), лидирующее место занимает пневмококковая пневмония (78,8 %), заболеваемость которой преобладает у детей до 14 лет (в 2004 году заболеваемость составила 2,74 на 10 тысяч) и у взрослых старше 55 лет (по данным 2004 года заболеваемость была 10,66 на 10 тысяч). Пневмококковые бактериемии чаще всего регистрируются у детей младше 14 лет (2,23 на 10 тысяч), вместе с тем, они отмечаются и у взрослых (18-55 лет)  — 0,29 на 10 тысяч, а также у лиц старше 55 лет — 0,42 на 10 тысяч. Заболеваемость пневмококковыми менингитами у детей составляет 0,11 на 10 тысяч, при том, что пневмококковые менингиты не были отмечены ни в какой другой возрастной группе (рис. 3).

Рисунок 2 - Нозологическая структура инвазивных пневмококковых

инфекций

Рисунок 3 - Заболеваемость инвазивными формами пневмококковых

инфекций в различных возрастных группах (по данным 2004 года)

Основным фактором риска развития заболевания инвазивными формами пневмококковых инфекций является курение (ОШ=4,45), не менее важным является и учет информации о перенесенном остром отите (ОШ=8,4) и пневмонии (ОШ=5,9). Регулярное употребление алкоголя увеличивает вероятность развития инвазивных форм пневмококковых инфекций в 2,57 раз, наличие хронического тонзиллита в анамнезе — в 2,29 раз, неконтролируемого применения антибактериальных химиопрепаратов — в 2,11 раз. При этом сочетание 2-х факторов риска отмечалось у 136 (45,63 %) пациентов, 3-х и более – у 82 (27,8 %) пациентов. Отмечена особая роль в развитии пневмококковых инфекций наличия в анамнезе хронической патологии и снижения иммунного статуса: при хронических сопутствующих заболеваний вероятность развития инвазивных пневмококковых инфекций увеличивается в 14,4 раз.

При анализе эпидемической ситуации по неинвазивным пневмококковым инфекциям, было установлено, что в структуре заболеваемости лидирует острый синусит (или обострения хронических синуситов) с различными осложнениями в 52,5 % случаев; в 47,5 %  — зарегистрирован острый отит. Несмотря на проблему гиподиагностики неинвазивных форм (когда существующий показатель регистрируемых, к примеру, пневмококковых отитов у детей в десятки раз ниже регистрируемых показателей в других регионах России и зарубежья), в возрастной структуре заболеваемости можно отметить не только преобладание заболевших детей младше 14-ти лет, но и подъем заболеваемости в возрастной группе старше 55 лет, с дальнейшим формированием достаточно постоянного уровня заболеваемости в других старших возрастных группах (рис. 4).

Рисунок 4 - Заболеваемость неинвазивными формами

пневмококковых инфекций

Наиболее актуальным фактором риска развития неинвазивных форм пневмококковых инфекций является наличие в анамнезе пневмонии (ОШ=6,83), различной хронической соматической патологии с нарушением иммунного статуса (ОШ=5,45); также актуальны и указания на перенесенный острый отит (ОШ=1,6) и острый синусит (ОШ=2,3).

При оценке носительства штаммов S. pneumoniae в группах обследуемых без сопутствующих заболеваний и в группах обследуемых с сопутствующими заболеваниями оказалось, что наличие сопутствующих заболеваний действительно влияет на возможность развития пневмококковой инфекции, причем в большей мере, чем возрастной фактор, что подтверждается результатами наших исследований. Так, частота носительства S. pneumoniae у людей с сопутствующей заболеваемостью составляет 56,48±3,07 %, тогда как у обследуемых любого возраста без сопутствующих заболеваний частота носительства возбудителя: у взрослых – 10,13±3,61 %, а у детей – 18,72±3,61 %. При этом у взрослых с сопутствующими заболеваниями она в среднем составляет 51,9±6,17 %, а у детей – 52,75±6,77 %. Таким образом, уровень носительства при наличии хронической патологии увеличивается в 3 раза у детей и в 5 раз – у взрослых. Сопутствующие заболевания являются важным фактором риска в развитии пневмококковых инфекций любой локализации, т.е. как инвазивных, так и неинвазивных форм пневмококковой инфекции, что подтверждается наличием подъема заболеваемости в группе носителей S. pneumoniae c наличием сопутствующих заболеваний (ко-морбидного фона) в анамнезе.

Несмотря на актуальность проблемы, до сих пор эпидемиологические особенности инфекционной патологии не рассматривались в связи с анамнезом больного и состоянием его иммунного статуса, что, являясь немаловажным критерием для оценки течения инфекционного процесса, не позволяло прогнозировать исход тех или иных форм пневмококковой инфекции. Применив для проспективной оценки заболеваемости метод Charleson ME (1987), мы провели прогностический анализ выживаемости больных инвазивными пневмококковыми инфекциями, согласно которому больные с сопутствующей патологией, оцениваемой индексом ко-морбидности около 10 имеют выживаемость в случае инвазивных пневмококковых инфекций 55,5 %; больных с индексом ко-морбидности 1842,3 % (рис. 5).

Рисунок 5 - Прогностический анализ выживаемости больных инвазивными пневмококковыми инфекциями по методу Charleson MЕ (1989)

При анализе исследуемой популяции штаммов пневмококка, был обнаружен ряд особенностей развития процессов устойчивости к антибактериальным химиопрепаратам в зависимости от формы инфекционного процесса.

В популяции штаммов S. pneumoniae, вызвавших инвазивные формы пневмококковых инфекций, значительную часть составляют штаммы, нечувствительные к ТМП-сульфаметоксазолу (52,34 %), к препаратам ряда тетрациклинов (58,04 %), к клиндамицину (32,88 %); к препаратам ряда макролидов устойчивостью к эритромицину обладают 12,08 % (при этом умеренно устойчиво всего 11,4 %); к препаратам ряда фторхинолонов к ципрофлоксацину устойчиво 12,75 %, тогда как к левофлоксацину всего 4,02 %; к пенициллину: устойчиво всего 4,36 %, а умеренно устойчиво 7,04 %. В целом, полученные данные позволяют предположить, что в популяции штаммов S. pneumoniae, вызывающих инвазивные формы пневмококковых инфекций, развиваются процессы формирования устойчивости к препаратам ряда макролидов и фторхинолонов.

Среди штаммов пневмококка, выделенных от носителей, при отсутствии пенициллинустойчивых штаммов, достаточно высок удельный вес штаммов, устойчивых к триметоприм-сульфаметоксазолу (22,89 %), тетрациклину (12,04 %), к эритромицину (18,07 %).

В популяции штаммов, вызвавших неинвазивные пневмококковые инфекции, при низком содержании в изучаемой популяции штаммов, устойчивых к пенициллину (5 %), отмечается высокий удельный вес штаммов, устойчивых к триметприм-сульфаметоксазолу (30 %), тетрациклину (30 %) и клиндамицину (22,5 %), выражена устойчивость к эритромицину (17,5 %); к препаратам ряда фторхинолонов ципрофлоксацину (10 %) и левофлоксацину (7,5 %) (рис. 6).

Рисунок 6 -Устойчивость к антиабактериальным химиопрепаратам штаммов, выделенных от больных инвазивными, неинвазивными формами пневмококковых инфекций и от носителей

В целом, во всех трех группах, наблюдается тенденция к увеличению числа штаммов пневмококка, нечувствительных к препаратам ряда бета-лактамов (рис. 7), так к пенициллину нечувствительны 11,4 % штаммов, выделенных от больных инвазивными формами инфекции, 8,75 % штаммов, выделенных от больных с неинвазивными заболеваниями, и 3,61 % штаммов, выделенных от носителей. Также отмечается снижение чувствительности к макролидам штаммов, вызвавших инвазивные формы инфекции, среди них нечувствительных к эритромицину было выделено 23,49 %, среди штаммов, выделенных от больных с неинвазивными формами пневмококковых инфекций - 32,5 %; а у носителей - 38,5 %. Регистрируется также снижение чувствительности к фторхинолонам, среди инвазивных штаммов выделено 29,86 % нечувствительных к ципрофлоксацину; а среди неинвазивных - 27,5 %, у штаммов, выделенных от носителей, — 21,64 %. Отмечается явление полирезистентности, связанное со снижением чувствительности к пенициллину отмечаемое, прежде всего, в отношении штаммов, нечувствительных к эритромицину и фторхинолонам.

Несмотря на различное эпидемиологическое значение (инвазивная инфекция, неинвазивная, или носительство), отсутствуют различия в частоте выделения устойчивых и умеренно-устойчивых штаммов пневмококка в зависимости от клинического материала в популяции штаммов, выделенных от больных с инвазивными формами инфекций (12,08 %), неинвазивными формами инфекций (17,5 %) и от носителей (18,07 %). Тем не менее, отмечаемые различия в чувствительности к антибактериальным химиопрепаратам внутри группы штаммов S. pneumoniae, вызвавших инвазивные формы пневмококковых инфекций, могут быть объяснены сосуществованием в макроорганизме нескольких штаммов возбудителя с различным паттерном устойчивости к антибактериальным химиопрепаратам. Это обеспечивает генотипические и фенотипические различия в антибактериальной чувствительности у этиологически значимых штаммов одного вида, выделенных из разных источников у больного с одной нозологической формой пневмококковой инфекции.

Рисунок 7 - Распределение устойчивых и умеренно-устойчивых к антибактериальным химиопрепаратам штаммов пневмококка в различных группах

Наиболее часто (рис. 8) среди выделенных S. pneumoniae, вызывающих инвазивные формы инфекций, встречаются нетипируемые штаммы (22,81 %). При этом распределение штаммов различных серотипов внутри возрастных групп пациентов инвазивными формами пневмококковых инфекций подтверждает полученный вывод о том, что среди штаммов пневмококка, вызывающих инвазивные заболевания, лидируют нетипируемые штаммы (у детей – 22,22 %, у взрослых-16,9 %, у пациентов старше 65 лет- 23,33 %).Рассматривая серотиповой состав штаммов S. pneumoniae, вызвавших неинвазивные формы заболеваний, можно отметить, что при значительной роли 6, 23 и 35 серотипов (8,75 %, 7,5 % и 7,5 %, соответственно), не представляется возможным выделить преобладание какого-либо серотипа. При анализе серотипового состава штаммов, выделенных у здоровых лиц, также можно отметить роль штаммов пневмококка 6 серотипа (13,25 %), а также нетипируемых штаммов (20,73 %).

Распределение штаммов S. pneumoniae в разных возрастных группах носителей также характеризуется значительной ролью редко встречающихся и нетипируемых штаммов (так, у детей такие штаммы выделяются в 14,07 % и 20,73 % случаев).

Рисунок 8 - Распределение нетипируемых штаммов в исследуемых группах

Таким образом, при исследовании популяции штаммов пневмококка, выделенной у больных инвазивными формами, неинвазивными формами пневмококковых инфекций, а также у носителей, оказалось, что при различной эпидемиологической значимости, к которой относится и возможность вызывать различные проявления эпидемического процесса, все три исследуемые группы характеризуются сходными тенденциями в формировании устойчивости к антибактериальным химиопрепаратам, обладая, при этом, различным серотиповым составом. Изученные популяции штаммов S. pneumoniae не могут характеризоваться преобладанием штаммов какого-либо серотипа. Полученные данные подтверждают, с одной стороны, взаимосвязь исследуемых популяций, однако дают минимальную информацию в плане эпидемиологического надзора. Штаммы S. pneumoniae одного и того же серотипа из групп, выделенных от больных инвазивными формами, неинвазивными и от носителей, различаются по устойчивости к антибактериальным химиопрепаратам (включая и изменения минимальной ингибирующей концентрации), обладают различным генотипом. Для характеристики предполагаемого эпидемического геноварианта S. pneumoniae был проведен мониторинг популяции полирезистентных штаммов пневмококка, выделенных в группах больных инвазивными, неинвазивными формами инфекции, а также – у носителей, методом анализа полиморфизма рестрикционных фрагментов в предложенном нами варианте с рестрикцией NCR участка ДНК.

Методика анализа полиморфизма рестрикционных фрагментов позволила выделить в исследуемой популяции 11 генотипов пневмококка, индивидуальность которых была подтверждена данными мультилокусного сиквенстипирования, а также серотиповыми различиями и различиями в генотипах, выделенных методом пульс-электрофореза (рис. 9).

Рисунок 9 - Молекулярно- эпидемиологический анализ 34 полирезистентных штаммов S.pneumoniae, выделенных от больных инвазивными пневмококковыми инфекциями (ST-II), неинвазивными пневмококковыми инфекциями (ST-NI) и носителей (ST-CI) (22 RFLP типа, анализ полиморфизма рестрикционых фрагментов) ( Программы Agilent Bioanalzyer 2.5; MEGA 3.1)

Среди возбудителей пневмококковых инфекций, выделенных от больных инвазивными и неинвазивными фомрами пневмококковых инфекций, а также от носителей, методом мультилокусного сиквенс-типирования, выявлено, что все штаммы, выделенные во всех трех популяциях, представляют собой родственные изоляты вида S. pneumoniae, большинство из которых обладают уникальным генотипом, определяющим наличие одного сиквенс-типа для каждого штамма. При этом определено 6 кластерных групп, которые содержат штаммы, выделенные от разных больных, обладающие различными молекулярно - эпидемическими характеристиками (серотип, устойчивость к антибиотикам), которые, являясь генетически близкородственными, вызвали различные проявления пневмококковых инфекций.

При количественном анализе генетических особенностей выделенных штаммов выявлено, что, их популяция является достаточно вариабельной, коэффициент генетического разнообразия составил 0,808 ± 0,02). Наиболее вариабельными являются штаммы, выделенные от носителей: коэффициент вариабельности по большинству локусов (gdh, gki, spi, xpt, dd1) составляет 1; за исключением локусов recP (0,6667) и локуса aroE (0,6667).

Коэффициент ассоциации с учетом всех исследованных локусов ДНК штаммов пневмококка, выделенных от носителей, составляет 0,904 ± 0,06, что выше, чем в ДНК штаммов, выделенных от больных неинвазивными формами инфекций (0,802 ± 0,03) и больных инвазивными формами инфекций (0,789 ± 0,03). Это подтверждает то, что штаммы, вызвавшие инвазивные формы инфекций, обладают фено- и генотипическим сходством.

Таким образом, выявленные нами особенности гибридизации с праймерами к основным генетическим детерминантам устойчивости к антибактериальным химиопрепаратам, позволяют предположить, что существует преобладание определенных механизмов устойчивости к антибактериальным химиопрепаратам в штаммах S. pneumoniae различных TRFLP-группах, что и было подтверждено нами результатами сиквенирования.

Из вышеприведенных данных следует, что ведущим механизмом выработки устойчивости к антибактериальным химиопрепаратам ряда макролидов является активация mef- оперона, а именно, гена mefE (64,7 %); до 20,5 % исследуемых нами штаммов обладают коньюгативным транспозоном Tn1545, являющимся маркером устойчивости к макролидам и тетрациклину и способным только к горизонтальному переносу, причем следует отметить, что его могут содержать от 30 до 50 % штаммов в отдельных TRFLP-группах (группа H). Устойчивость к фторхинолонам, распространенная в отдельных TRFLP-типах, в целом обусловлена индуцибельной активацией генов устойчивости к фторхинолонам, что установлено у 23,88 ± 11,91 % штаммов.

Несмотря на значимость пневмококковых инфекций эпидемическая ситуация в отношении данной инфекции обусловлена во многом объективной сложностью микробиологической диагностики S. pneumoniae, не позволяющей до настоящего времени создать так называемый «золотой» стандарт диагностики, а также проводить мониторинг пневмококковых инфекций. Для решения данной задач был применен метод анализа полиморфизма рестрикционных фрагментов NCR участка ДНК S. pneumoniae, где в качестве диагностической мишени был использован некодирующий фрагмент геномной ДНК S. pneumoniae, ранее не применявшийся в таком качестве (рис. 10).

Рисунок 10 - Схематическое изображение некодирующего фрагмента ДНК (штамм TIGR4, GenBank)

Некодирующий фрагмент (NCR) геномной ДНК S. pneumoniae является видоспецифичным участком и обладает свойствами, объясняющими его использование в качестве оптимальной диагностической мишени для диагностики пневмококка, в связи с техническими преимуществами выполнения полимеразной цепной реакции, которые не были достигнуты при использовании других участков генома S. pneumoniae, такие как локализация изучаемого фрагмента в непосредственной близости от гена, кодирующего видоспецифический фактор вирулентности пневмококка- пневмолизин; консервативность фланкирующих их участков (SP1922 (гипотетический протеин) и SP1923 (пневмолизин)); наиболее приемлемый размер (1182 bp) выбранного ампликона; амплификация вариабельного участка генома.

В связи с применением для создания праймера новой диагностической мишени была изменена схема ПЦР реакции для оптимизации параметров ренатурации с целью увеличения выхода конечного ПЦР-продукта. В частности, мы пришли к выводу, что оптимальным числом циклов, обеспечивающих максимально возможный выход амплифицированного продукта, является 30; другие параметры не нуждались в оптимизации и были проведены согласно общепринятым правилам.

В результате серии проведенных опытов с использованием предложенного нами варианта ПЦР реакции праймер, созданный на основе последовательности NCR фрагмента, действительно оказался высокочувствительным и высокоспецифичным видовым маркером. Реакция была положительна как с контрольными, так и с референтными штаммами (R6, TIGR4), и она была отрицательна с близкородственными штаммами семейства стрептокококков, а также была отрицательна со штаммами, неродственными S. pneumoniae, но наиболее часто выделяемыми вместе с ним в составе ассоциаций микроорганизмов из клинических образцов (рис. 11).

Кроме того, чувствительность NCR фрагмента S.  pneumoniae не связана с серотиповой принадлежностью выделенного штамма. Проведенный количественный анализ ПЦР продукта показал отсутствие взаимосвязи, и вне зависимости от серотипа средний размер амплифицированного фрагмента составлял 1268 ± 6,57 пар оснований [1254,997-1281,603].

Для проведения предложенного нами варианта метода анализа полиморфизма концевых рестрикционных фрагментов NCR участка ДНК пневмококка были выбраны рестриктазы – Alu1, Dde1, Mse1- и охарактеризован полиморфизм фрагментов, являющийся уникальным для каждого штамма.

1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12

Рисунок 11 – ПЦР реакция c NCR фрагментом: 1- 4- ПЦР с праймером NCR; 5- отрицательный контроль с праймером NCR; 6-9- реакция ПЦР с праймером к гену GAPDH; 10- маркер молекулярного веса X; 11-отрицательный контроль с праймером к гену GAPDH; 12-не занято.

Изучение характера полиморфизма концевых рестрикционных фрагментов при применении данных рестриктаз позволило создать оптимальную схему и последовательность их применения в предложенном нами варианте метода для диагностики пневмококковых инфекций. Кроме того, были обнаружены характерные особенности полиморфизма рестрикционных фрагментов, свидетельствующие о возможности дифференцировать несколько штаммов пневмококка в одном клиническом образце (рис. 12).

Рисунок 12 - Метода анализа полиморфизма концевых рестрикционных фрагментов в диагностике пневмоккковых инфекций

При исследовании клинического образца, было выяснено, что максимальная вероятность идентификации монокультуры при рестрицировании ДНК только одной рестриктазой не превышает 69 % (Alu1), а максимальная вероятность выделения ассоциации при использовании одной рестриктазы не превышает 42 % (Mse1). Тем не менее, при применении последовательного рестрицирования по предложенной нами схеме вероятность идентификации монокультуры возрастает до 95 %, при этом «не идентифицированными» штаммами, то есть штаммами, входящими в состав ассоциаций штаммов пневмококка, для идентификации которых может потребоваться дополнительная рестрикция, являются только 5 %.

Чувствительность и специфичность метода составили 98,98 % и 97,09 %, при этом ПЦПР (прогностическая ценность положительного результата) и ПЦОР (прогностическая ценность отрицательного результата) соответственно 97 % и 99,01 %. При применении метода для исследования различных клинических образцов было выяснено, что она фактически является 100 %-ной, что в сравнении с чувствительностью и специфичностью применения рутинного бактериологического метода, позволяет считать предлагаемый нами вариант метода анализа полиморфизма концевых рестрикционных фрагментов ПЦР продукта NCR фрагмента более перспективным (табл. 2).

Таблица 2 - Чувствительность и специфичность

в различных клинических образцах

Вид клинического материала	TRFLP		Бактериологический метод
	A/A+В	Se	A/A+В	Se
Мокрота	30/30	100%	13/20	65%
С/м жидкость	10/10	100%	7/10	70%
Назофарингеальный мазок	29/30 (29/1; 0/30)	100%	18/30	60%
Se(M±m)	23±5,4	100%	12,66±3,17	65±2,88

Примечание: А- истинноположительные результаты выделения S.pneumoniae, подтвержденные методикой;В- ложноположительные результаты

Разрешающая способность предлагаемого нами варианта метода достаточно высока 0,97 [0,96-0,98], при том, что разрешающая способность наиболее популярного метода эпидемиологического исследования - серотипирования - составляет всего 0,93 [0,92-0,94], пульс-электрофорез способен идентифицировать внутривидовые различия в 95 % случаев. Это подтверждает вывод о том, что разрешающая способность варианта метода анализа полиморфизма концевых рестрикционных фрагментов ПЦР продукта NCR фрагмента превышает разрешающую способность других методов, направленных на решение аналогичных задач, обладая при этом в лабораторных условиях идентифицировать 42 типа пневмококка из 100 штаммов с максимальным возможным пределом допустимых межтиповых различий 5 %.

Результаты, полученные при проведении метода анализа полиморфизма рестрикционных фрагментов NCR участка ДНК S. pneumoniae TRFLP-группах, выявили особенности распространения генетических детерминант (а также механизмов их обусловливающих) в популяциях штаммов, вызвавших инвазивные и неинвазивные формы пневмококковых инфекций, а также выделенных от носителей, что было подтверждено выявлением коньюгативных и неконьюгативных транспозонов и что доказало возможность распространения в определенных TRFLP-группах полирезистентных штаммов пневмококка, что может привести к формированию эпидемического варианта.

Представленные результаты подтверждают эпидемиологическую значимость TRFLP-типирования как метода, позволяющего оценить вирулентность исследуемых штаммов: штаммы TRFLP-групп (C, F, I, K) имеют уникальный паттерн геновариантов исследованных нами факторов вирулентности; группы A, B, E, H, J обладают геновариабельностью в пределах двух аллелей (за исключением генов ply и lytA в группах H и A, соответственно), что также может иметь как эпидемиологическое, так и микробиологическое значение (табл. 3).

Таблица 3 - Гено-фенотипическая характеристика вирулентности штаммов пневмококка из различных TRFLP-групп (указано число аллелей)

№ п/п	TRFLP		Факторы вирулентности				Фенотип
	группы		ply*	lytA	pspA	pspC	прозрачный	матовый
1	A	22	4	5	2	2	9 (40,9)	13 (59,09)
2	B	23	1	8	1	2	8(34,7)	15(65,3)
3	C	11	1	1	1	2	2(18,2)	9(81,8)
4	D	66	2	8	3	2	32 (48,5)	34(51,5)
5	E	15	6	7	2	1	2 (13,1)	13(86,9)
6	F	10	1	2	1	2	3(30)	7(70)
7	G	28	5	7	2	1	7(25)	21(75)
8	H	26	3	5	1	2	8(30,7)	18(69,23)
9	I	38	1	9	1	1	5(13,1)	31(81,57)
10	J	33	5	6	1	1	6(18,2)	27(81,8)
11	K	16	2	8	2	1	3(18,75)	13(81,25)

Примечание: * в скобках указан % от исследуемой группы.

Изучение генетических взаимосвязей между штаммами, выделенными в различном клиническом материале, позволило выявить, что несмотря на то, что в целом, характер распространения пневмококка в популяции носит поликлональный характер, штаммы определенных TRFLP-групп, как например, групп D и H, обладают способностью к клонально-поликлональному распространению, а в некоторых случаях (как было обнаружено на примере исследования крови и ликвора), и к клональному распространению. Это позволяет говорить об особой роли штаммов данных групп и позволяет считать их эпидемическими геновариантами.

Рисунок 13 - Распределение штаммов S. pneumoniae различных TRFLP-групп в популяции (n=378 штаммов) из различного лабораторного материала, выделенного от больных инвазивными, неинвазивными формами пневмококковых инфекций и от носителей

На основании вышесказанного можно сделать вывод, что TRFLP-типирование, проведенное с применением метода анализа полиморфизма рестрикционных фрагментов NCR участка ДНК S. pneumoniae позволяет оценить распространение основных генетических детерминант не только антибиотикорезистентности, но и наиболее значимых в патогенезе пневмококковой инфекции факторов вирулентности, определяющих развитие различных форм пневмококковых инфекций, анализ эпидемических особенностей которых позволяет обосновать проведение противоэпидемических мероприятий при пневмококковых инфекциях (рис. 13).

Кроме того, применение метода анализа полиморфизма концевых рестрикционных фрагментов NCR участка ДНК S. pneumoniae позволяет решить проблему микробиологической диагностики штаммов пневмококка в разнообразном клиническом материале, диагностировать пневмококки, как в монокультуре, так и в ассоциации, что обусловливает возможность рациональной организации диагностического процесса и определяет адекватную диагностику инвазивных и неинвазивных форм пневмококковых инфекций.

Таким образом, метод анализа полиморфизма рестрикционных фрагментов NCR участка ДНК S. pneumoniae служит адекватной современной методикой при организации и проведении противоэпидемических мероприятий при пневмококковой инфекции. Это дает возможность не только ретроспективно изучать эпидемические свойства возбудителя пневмококковых инфекций, S. pneumoniae, но и возможность прогнозировать появление эпидемических вариантов на основе изучения фазовых генетических изменений.

Из вышесказанного следует, что принципиальная схема эпидемиологического надзора за пневмококковыми инфекциями должна включать элементы как молекулярно-эпидемиологического мониторинга, так и эпидемиологических исследований за пневмококковой инфекцией.

ВЫВОДЫ

1. В исследуемом субъекте РФ, на примере Приморского края, регистрируется высокая заболеваемость пневмококковыми инфекциями: средний уровень которой за период с 1998 по 2005 составлял 6,13 ± 0,29 на 10 тысяч населения с достоверно выраженной тенденцией к повышению и средним темпом прироста 6,3 % в год. В структуре инвазивных пневмококковых инфекций чаще всего (78,8 %) регистрируется пневмококковая пневмония, среди неинвазивных пневмококковых инфекций преобладает острый синусит  или обострение хронических синуситов — в 52,5 % случаев.
2. При различных формах пневмококковых инфекций особенностей факторов риска не выявлено, ведущими из них были курение (ОШ=4,45 при инвазивных формах и ОШ=1,69 при неинвазивных формах) и перенесенная пневмония в анамнезе (ОШ=5,98 при инвазивных формах и ОШ=6,83 при неинвазивных формах); получение антибактериальных химиопрепаратов в предыдущие 3 месяца (ОШ=2,11 при инвазивных формах и ОШ=1,58 при неинвазивных формах). Наличие сопутствующей патологии и снижение иммунного статуса является ведущим фактором риска по развитию инвазивных форм пневмококковых инфекций (ОШ=14,4). Выживаемость больных с инвазивными пневмококковыми инфекциями, с сопутствующей патологией, оцениваемой индексом ко-морбидности около «10», составляет 55,5 %; а выживаемость больных с индексом «18» и более 42,3%).
3. Клинико-микробиологический мониторинг позволил идентифицировать выделенную популяцию штаммов следующим образом. Штаммы пневмококка, выделенные у больных с инвазивными и неинвазивными формами пневмококковых инфекций, а также у носителей, характеризуются сходными тенденциями в формировании устойчивости к антибактериальным химиопрепаратам. При этом, они обладают различным серотиповым составом. Установлен рост числа штаммов пневмококка, нечувствительных к тетрациклину, клиндамицину, ТМП-сульфаметоксазолу, макролидам и фторхинолонам. Популяция штаммов пневмококков, вызвавших инвазивные формы инфекции, представлена 6А, 9V, 19F, 23F серотипами. В группе штаммов, вызвавших неинвазивные случаи заболевания, доминируют 6А, 6B, 23F, а у носителей 9V, 19F серотипы S. pneumoniae, что подтверждает как взаимосвязь выделенной популяции, так и свидетельствует о наличии выраженных генотиповых различий.
4. Рост числа нетипируемых штаммов в структуре популяции штаммов S. pneumoniae, вызвавших различные формы пневмококковых инфекций, а также распространенность полирезистентных штаммов, позволяет обосновать актуальность применения новых молекулярно-эпидемиологических методов, наиболее перспективным из которых является метод анализа полиморфизма концевых рестрикционных фрагментов для проведения эпидемиологического надзора.
5. Метод анализа полиморфизма концевых рестрикционных фрагментов NCR участка ДНК S. pneumoniae является чувствительной и специфичной методикой, которая позволяет проводить молекулярно-эпидемиологический мониторинг в интересах эпидемиологического надзора и оценить распространение основных генетических детерминант по антибиотикорезистентности и наиболее значимым в патогенезе пневмококковых инфекций факторам вирулентности.
6. Некодирующий фрагмент (NCR) геномной ДНК S. pneumoniae является видоспецифичным участком и обладает свойствами, позволившими на его основе создать видоспецифичный и высокочувствительный маркер, на основе которого можно проводить генотипирование, дискриминирующая способность которого подтверждена данными мультилокусного сиквенстипирования, а также серотиповыми различиями и различиями в генотипах, выделенных методом пульс-электрофореза. Применение этого фрагмента позволяет решить проблему микробиологической диагностики штаммов пневмококка в разнообразном клиническом материале, диагностировать пневмококки как в монокультуре, так и в ассоциации, что дает возможность рациональной организации и повышения эффективности диагностического процесса.
7. Для проведения варианта метода анализа полиморфизма концевых рестрикционных фрагментов ПЦР продукта NCR фрагмента при исследовании пневмококковых инфекций оптимальными являются рестриктазы – Alu1, Dde1, Mse1. Охарактеризован полиморфизм фрагментов, являющийся фактически уникальным для каждого штамма.
8. Изучение структуры популяции эпидемически опасных штаммов пневмококка, выделенных при различных клинических формах методом анализа полиморфизма концевых рестрикционных фрагментов NCR участка ДНК штаммов S. pneumoniae, обосновывает тот факт, что идентификация штаммов генотипов групп D и Н S. pneumoniae служит критерием эпидемического геноварианта, в связи с тем, что у них помимо маркеров конститутивной устойчивости чаще других штаммов выделяются генетические маркеры, кодирующие индуцибельную устойчивость к антибактериальным химиопрепаратам. Формирование устойчивости штаммов S. pneumoniae к макролидам осуществляется путем активации mef- оперона, а именно, гена mefE (64,7 %). До 20,5 % исследуемых штаммов обладают коньюгативным транспозоном Tn1545, а 8,8 % штаммов обладают неконьюгативным транспозоном Tn917 (8,8%). Резистентность к фторхинолонам в исследованной популяции обусловлена как индуцибельной, так и конститутивной активацией генов к фторхинолонам: parC (47 %), gyrA (23,5 %), pmrA (17,6 %).
9. Кроме того, несмотря на выявленный поликлональный характер распространения штаммов пневмококка, штаммы D и H групп обладают способностью к клональному распространению, что дает возможность на их основе прогнозировать появление эпидемических геновариантов и проводить молекулярно-эпидемиологический мониторинг в рамках эпидемиологического надзора за пневмококковыми инфекциями.

ПРАКТИЧЕСКИЕ РЕКОМЕНДАЦИИ

1. В связи с распространением нетипируемых штаммов пневмококков в инетерсах эпидемиологического надзора рекомендуется применять метод анализа полиморфизма концевых рестрикционных фрагментов NCR участка ДНК S. pneumoniae. Сочетание данных генотипирования по NCR фрагменту с данными об антибиотикорезистентности позволяет прогнозировать появление эпидемических вариантов возбудителя.
2. Метод анализа полиморфизма концевых рестрикционных фрагментов NCR участка ДНК S. pneumoniae рекомендуется для диагностики монокультуры и ассоциации штаммов пневмококка в различных образцах клинического материала в эпидемической ситуации, когда выделение возбудителя классическим методом затруднено.
3. Метод анализа полиморфизма концевых рестрикционных фрагментов позволяет выявлять распространение эпидемических геновариантов пневмококка, идентифицировать клональный или поликлональный характер распространения, что обеспечивает выбор противоэпидемических мероприятий в отношении пневмококковых инфекций.
4. Для рационализации и повышения эффективности эмпирической антимикробной химиотерапии пневмококковых инфекций целесообразно использовать антибактериальные химиопрепараты ряда бета-лактамов, ограничив применение макролидов и фторхинолонов, что связано не только с распространением их полирезистентных изолятов практически во всех возрастных группах, но и с выработкой полирезистентности к этим трем препаратам.
5. С целью совершенствования системы регистрации заболеваемости пневмококковыми инфекциями назрела необходимость введения в отчетную форму 12 «Сведения о числе заболеваний, зарегистрированных у больных, проживающих в районе обслуживания лечебного учреждения», данных об этиологической характеристике пневмоний и отитов.
6. При клиническом обследовании и ведении пациентов с различными формами пневмококковых инфекций необходимо оценивать у них роль сопутствующих заболеваний путем интегративной оценки и прогнозирования исхода основного заболевания с использованием коэффициента ко-морбидности Charleson M.E. (1987).

Список работ, опубликованных по теме диссертации

1. Martynova A.V. Macrolide Resistance in Streptococcus pneumoniae Strains Collected in the Far East of Russia from 2000 to 2002 / A.V. Martynova and V.B. Turcutyuicov // J. Clin. Microbiol.- 2003.-Vol.41, № 10-P. 4906.
2. Мартынова А.В. Антибиотикорезистентность культур S.  pneumoniae, выделенных у лиц с внебольничной пневмонией. /А.В. Мартынова, В.Б. Туркутюков // Журнал микробиологии, эпидемиологии и иммунобиологии.-2004.- № 2.-С.81-83.
3. Martynova A.V. Analysis of macrolide –resistant isolates of Streptococcus pneumoniae gained at the Far East of Russia / A.V. Martynova, V.B. Turcutyucov // Clinical Microbiology and Infection.- 2004.- Vol.10, Suppl. 3.-P.316.
4. Мартынова А.В. Заболеваемость болезнями органов дыхания у жителей Приморского края в 2002-2003 гг. / А.В. Мартынова, А.А. Шепарев, Ю.Е Скурихина, Э.В. Слабенко // Вестник РГМУ.-М.-2005. –Т.42,№3.-С.31
5. Мартынова А.В.Проблемы идентификации S.pneumoniae при формировании устойчивых к оптохину штаммов возбудителя./ А.В. Мартынова, В.Б. Туркутюков // Журнал микробиологии, эпидемиологии и иммунобиологии.- 2005.- №6.-С.65-69
6. Martynova A.V. Fluoroquinolone-resistant strains of Streptococcus pneumonaie at the Far East of Russia / A.V. Martynova, A. A. Sheparyov, V. B. Turkutjukov // European Respiratory Journal.- 2005.-Vol.26, Suppl. 49.- P.639.
7. Martynova A.V. Epidemiology of COPD in the Far East of Russia in 1990-2004 years / A.V. Martynova, A.A. Sheparyov, V.B. Turkutjukov // European Respiratory Journal.- 2005.-Vol. 26, Suppl.49.- P.593.
8. Martynova A.V. Emergence of fluoroquionolone-resistant clones of Streptococcus pneumoniae in far eastern Russia / A.V. Martynova, V.B. Turkutyukov, Y. E. Scurichina, A.A. Scheparyov, E.V. Slabenko // Clinical Microbiology and Infection.- 2005.-Vol.11, Suppl.2.- P.663.
9. Martynova A.V. Epidemiological aspects of hospital-acquired pneumonia in intensive care units in the far east of Russia / A.V. Martynova, E.V. Slabenko, V.B. Turkutyukov // Clinical Microbiology and Infection.-2005.-Vol.11, Suppl. 2.-P.677.
10. Мартынова А.В. Анализ заболеваемости взрослого населения г. Владивостока и Приморского края в 2002-2003 гг./ А.В.Мартынова, Ю.Е. Скурихина, А.А. Шепарев, С.Н. Чуриков // Вестник РГМУ.-2005.-Т.42, №3.- С.149
11. Мартынова А.В. Аспекты диагностики устойчивости к фторхинолонам штаммов S. pneumoniae, выделенных в 2002—2003 гг. / А.В.Мартынова, В.Б. Туркутюков // Клиническая лабораторная диагностика.-2004.-№9.- С.34
12. Лучанинов Э.В. Эпидемиологическая оценка заболеваемости внебольничных пневмоний молодых людей в условиях закрытого коллектива / Э.В.Лучанинов, А.М. Балябин, А.В. Мартынова // Бюллетень национального НИИ общественного здоровья.-2005.-Вест.7.-с.129.
13. Turkutjukov V.B. Peculiarities of community-acquired pneumonia course, caused by multiresistant strains of S. pneumoniae / V. B. Turkutjukov, V. A. Nevzorova, I. M. Martynenko, A.V. Martynova // Eur Respir J.- 2006.- Vol. 28, Suppl. 50.-P.165
14. Hathaway L.J. Use of the Agilent 2100 Bioanalyzer for Rapid and Reproducible Molecular Typing of Streptococcus pneumoniae / L.J. Hathaway, S. Brugger, A.V. Martynova, S. Aebi, K. Mhlemann // Journal of Clinical Microbiology.- 2007.- Vol. 45, №3.-P. 803-809.
15. Мартынова А.В. Оценка эпидемиологической значимости инвазивных форм пневмококковых инфекций / А.В. Мартынова // Казанский медицинский журнал.-2007.- T. 88, № 3.-С. 294-295
16. Мартынова А.В. Молекулярно-эпидемиологический мониторинг неинвазивных штаммов S.pneumoniae / А.В.Мартынова, В.Б. Туркутюков // Вестник новых медицинских технологий.-2007.-Т.14, №2.-C.143.
17. Мартынова А.В. Эпидемиологический анализ заболеваемости инвазивными и неинвазивными формами пневмококковых инфекций в различных группах населения / А.В. Мартынова, В.Б. Туркутюков // Вестник Российской АМН — 2007.- № 9.- C.12-16.
18. Мартынова А.В. Особенности молекулярно-эпидемиологической диагностики неинвазивных штаммов S.pneumoniae / А.В.Мартынова, В.Б. Туркутюков // Российская оториноларингология.-2007.-№3.-С.88-90.
19. Martynova A.V. Serotype distribution and antimicrobial resistance in Streptococcus pneumoniae causing invasive and other infection in the Far East of Russia (Vladivostok) / A.V. Martynova, V.B. Turcutiyucov, I.V. Strizhak, N.M. Kondrashova // Proceeding of the 1st FEMS Congress of European Microbiologists. Ljubljana,(Slovenia)June 29 - July 3, 2003.-Ljubljana, 2003. - P.6-9.
20. Martynova A.V. Pattern of resistance to erythromycin
    in Streptococcus pneumoniae isolates gained at the Far Eastern isolates of Russia. (Vladivostok, Russia) / A. Martynova, V. Turcutyiukov // Proceedings of the 23rd International Congress of Chemotherapy (Durban, South Africa. July 7-9, 2003)-Durban, 2003.-P.193.
21. Martynova A.V. Antimicrobial agents resistance of Streptococcus pneumoniae at the far East of Russia: results of investigation / A.V. Martynova, V.B. Turcutiycov, I.V. Strizhak, B.G. Andryukov // Program and Abstarct Book ISAAR 2003.- Seoul, South Korea.-P.14.
22. Martynova A.V. Antibiotic Resistance and Serotype Composition of Carriage and Invasive Isolates of Streptococcus Pneumoniae among Young Adults at the Far East of Russ / A.V. Martynova, V.B. Turcutiycov // General ASM 103d Meeting Abstract Book.- Washingthon, the USA- P.106-107.
23. Martynova A.V. Serotype distribution in Streptococcus Pneumoniae strains, gained at the Far East of Russia / A.V. Martynova, V.B. Turcutiycov // Abstract Book of Society for General Microbiology -11 April 2003,152nd Meeting – University of Edinburgh, the UK – P.7.
24. Martynova A.V. Molecular Epidemiology of Erythromycin-resistant Isolates of Streptococcus pneumoniae from Young Adults at the Far East of Russia / A.V. Martynova // International Journal of Infectious Diseases.- 2004.- Vol. 8, Suppl. 1.-P.97.
25. Мартынова А.В. Клиническое течение внебольничных пневмоний пневмококковой этиологии у лиц молодого возраста / А.В. Мартынова // Сборник тезисов 4 Съезд врачей-инфекционистов, 29-31 октября. Санкт-Петербург.- CПб, 2004.- С.422.
26. Martynova A.V. Molecular aspects of Macrolide-Resistance in Streptococcus pneumoniae isolated at the Far East of Russia / A.V. Martynova // The Proceedings of the 4th International Symposia of Pneumococcal Diseases, 9-16 May,2004 -Helsinki, Finland, 2004.- P.131.
27. Martynova A.V.Epidemiology Analysis of Enterococci Species and its Impact in Hospital Antibiotic Resistance / A.V. Martynova, I.V. Strizhak, V.B. Turcutyuicov, B.G. Andryukov, E.V. Slabenko // «JRME NIIGATA’04» The Proceedings of the Eleventh International Symposium of the Japan-Russia Medical Exchange.-Niigata, Japan, 2004.-P.462.
28. Martynova A.V. Clinical Aspects of Pneumococcal infection in immunocompromised patients / A.V. Martynova, V.B. Turcutyuicov // «JRME NIIGATA’04» The Proceedings of the Eleventh International Symposium of the Japan-Russia Medical Exchange.-Niigata, Japan, 2004.-P.417.
29. Martynova A.V. Fluoroquinolones resistance of Streptococcus pneumoniae isolates gained at the Far East of Russia / A.V. Martynova, V.B. Turcutyuicov // Proceedings of the Tenth International Congress for Culture Collections and Innovative Roles of Biological Resource Centers 10-15 October 2004/ed. Makoto Watanabe.-Tsukuba,2004.-P.657.
30. Martynova A.V. Genomic analysis of diversity of macrolide resistant genes in Streptococcus pneumoniae isolates at the Far East of Russia / A.V. Martynova, V.B. Turcutyuicov // Proceedings of the Tenth International Congress for Culture Collections and Innovative Roles of Biological Resource Centers 10-15 October 2004/ed. Makoto Watanabe.-Tsukuba,2004.-P.658.
31. Martynova A.V. Epidemiology of antibiotic-resistant strains of Streptococcus pneumoniae in the Far East of Russia / A.V. Martynova, V.B. Turcutyuicov. // International Journal of Antimicrobial Agents.-2004.-Vol.23, №2. -P.641-643.
32. Мартынова А.В. Факторы патогенности штаммов пневмококков различных серотипов, выделенные у лиц молодого возраста закрытых коллективов /А.В.Мартынова, В.Б. Туркутюков // Всероссийская научно-практическая конференция «Медицинская микробиолоигя- 21 век» (Саратов, 28-30 сент, 2004)-Саратов, 2004.-С.149-151.
33. Мартынова А.В. Генотипирование эритромицин-резистентных штаммов пневмококка, выделенных от больных внебольничными пневмониями./ А.В.Мартынова, В.Б.Туркутюков // Труды научной конференции с международным участием «Современные средства иммунодиагностики, иммунно- и экстренная профилактика актуальных инфекций», Санкт-Петербург, 2004.-СПб,2004 - С.246-247.
34. Martynova A.V. Epidemiology of Fluoroquionolone-Resistant Isolates of Streptococcus pneumoniae Gained at the Far East of Russia /A.V. Martynova // Program and Abstract Book of the 44thICAAC Conference, Washington.-Washington( the USA),2004-P.1728.
35. Martynova A.V. Opthochine –resistant strains of S.pneumoniae gained at the Far of Russia / A.V. Martynova // The Proceedings of the 2nd International Symposium Resistant Gram-Positive Infections, Berlin.- 12 Dec 2004.-Berlin, 2004-P. 248
36. Мартынова А.В. Анализ макролидрезистентности штаммов пневмококка, выделенных в закрытых коллективах./ А.В. Мартынова. // Инфекционная патология в Приморском крае: тезисы докл. 4-й науч-практ конф.-Владивосток,2004.- С.14.
37. Martynova A.V. Fluoroquinoloneresistance of S.pneumoniae at the Far East of Russia in 2003-2004 years / A.V. Martynova, A.A. Sheparyov, Yu.E. Skurihina, V.B. Turkutyukov // Abstract Book of the 24th ICC in Manila (Phillippins), June 2005.-Manila, 2005.-P.225-226.
38. Мартынова А.В. Серотиповая характеристика и выраженность факторов патогенности у штаммов пневмококков, возбудителей внебольничных пневмоний у лиц молодого возраста в закрытых коллективах / А.В.Мартынова, В.Б. Туркутюков // Тихоокеанский медицинский журнал. - Владивосток.-2004 - №3. - С. 49 – 51.
39. Martynova A.V. Emergence of antimicrobial resistance at the Eastern part of Russia / A.V. Martynova // Program and Abstract Book, Europneumo 2005, 7th European Meeting on the Molecular Biology of Pneumococcus, Braunschweig, Germany.9-16 May,2005.-Braunschweig, 2005.-P.40.
40. Martynova A.V. Epidemiology of community-acquired pneumoniae caused by Streptococcus pneumoniae / A.V. Martynova, V.B. Turkutjukov, Ju.E. Skurihina, A.A. Sheparjov // The Proceedings of the 5th International Symposium on Pneumococci and Pneumococcal Diseases.-Alice Springs (Australia), 2006.- P.192.
41. Martynova A.V. Evaluation of co-morbidity on the incidence of pneumococcal infection in the Far East of Russia / A.V. Martynova, V.B. Turkutjukov, Ju.E. Skurihina, A.A. Sheparjov // The Proceedings of the 5th International Symposium on Pneumococci and Pneumococcal Diseases.-Alice Springs (Australia), 2006.- P.180.
42. Martynova A.V. Antimicrobial Susceptibility of Haemophilus influenzae, Neisseria meningitidis and Streptococcus pneumoniae Isolates Causing Meningitis at the Far East of Russia in 2003-2004 / A.V. Martynova // The Proceedings of the ISPN, 10-15 September. Cairns (Australia).- Cairns,2006.- P.42.
43. Мартынова А.В. Эпидемиологические аспекты заболеваемости внебольничными пневмониями лиц молодого возраста в закрытых коллективах/А.В. Мартынова // Тихоокеанский медицинский журнал.- 2006.- №3.-С.73-76.
44. Мартынова А.В. Анализ эпидемиологических особенностей пневмококковой инфекции у больных с коморбидным фоном / А.В.Мартынова //Здоровье населения и среда обитания: ЗНиСО.- 2007.-Т.168, № 3.- С.15.
45. Мартынова А.В. Оценка роли сопутствующей заболеваемости при пневмококковых инфекциях / А.В. Мартынова // Дальневосточный журнал инф.патол.-2007.-№10-C.79-83.