Вирусологический мониторинг как ключевой элемент контроля выполнения в российской федерации программы ликвидации полиомиелита

На правах рукописи

Иванова Ольга Евгеньевна

Вирусологический мониторинг

как ключевой элемент контроля выполнения в Российской Федерации

программы ликвидации полиомиелита

03.00.06 – вирусология

14.00.30 – эпидемиология

Автореферат

диссертации на соискание ученой степени

доктора медицинских наук

Москва – 2009

Работа выполнена в Учреждении Российской академии медицинских наук Институт полиомиелита и вирусных энцефалитов имени М.П.Чумакова РАМН.

Научный консультант: доктор медицинских наук,

профессор, академик РАМН

Дроздов Сергей Григорьевич

Официальные оппоненты: доктор медицинских наук,

профессор, академик РАМН

Семёнов Борис Фёдорович

доктор медицинских наук,

профессор,

Карпович Лидия Григорьевна

доктор биологических наук,

профессор

Тихонова Нина Тимофеевна

Ведущая организация: ФГУН «Санкт-Петербургский научно-исследовательский институт эпидемиологии и микробиологии имени Пастера» Роспотребнадзора

Защита состоится «__» ______________2009 г. в ____часов___минут на заседании диссертационного совета Д 001.026.01 при Институте полиомиелита и вирусных энцефалитов им.М.П.Чумакова РАМН по адресу: 142782, Московская область, п/о Институт полиомиелита.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Учреждения Российской академии медицинских наук Институт полиомиелита и вирусных энцефалитов имени М.П.Чумакова РАМН.

Автореферат разослан «___»________________2009 г.

Ученый секретарь диссертационного совета

кандидат биологических наук Медведкина О.А.

Общая характеристика работы

Актуальность проблемы. ХХ век был ознаменован фундаментальными открытиями в области биологии и медицины, которые предоставили новые возможности для всестороннего изучения, диагностики, терапии и предупреждения инфекционных заболеваний. Впечатляющим итогом борьбы с инфекциями стала успешное завершение в 1980 г. Программы Всемирной Организации Здравоохранения (ВОЗ) по ликвидации оспы. В 1988 г. Всемирная Ассамблея Здравоохранения приняла решение о глобальной ликвидации полиомиелита (Resolution WHA 41.28. WHO, 1988), а страны-члены ВОЗ, в том числе Российская Федерация (РФ), приступили к его выполнению. Так как вирус полиомиелита (полиовирус, ПВ) вызывает клинически выраженное заболевание только у незначительного числа инфицированных, критерием ликвидации полиомиелита является ликвидация дикого ПВ. Поэтому для реализации программы ликвидации полиомиелита было необходимо создание и практическое внедрение чувствительной, достоверной, максимально полной системы вирусологического подтверждения отсутствия а) случаев заболевания, вызванных диким ПВ, и б) дикого ПВ в любых возможных материалах (клинических пробах, пробах из объектов окружающей среды). Учитывая глобальный характер программы, система должна отвечать таким требованиям, как стандартность используемых реагентов, диагностических методов, систем и лабораторных процедур, скорость выполнения исследований, возможность анализа и оценки получаемых результатов экспертами ВОЗ.

Для максимально полного слежения за ПВ стратегия ВОЗ основывается не на клинической диагностике, как это было при ликвидации оспы, а на эпидемиологическом надзоре за заболеваниями с синдромом острого вялого паралича (ОВП). Этот вид надзора является менее специфическим, но, при соблюдении необходимых критериев (выявление не менее 1 случая ОВП на 100 тыс. детей в возрасте до 15 лет) более чувствительным (de Quadros et al., 1997; Aylward et al., 2000). Так как заболевание с синдромом ОВП может быть следствием многих причин - инфицирования ПВ, неполиомиелитными энтеровирусами (НПЭВ), другими нейротропными вирусами, бактериальными и паразитарными организмами, воздействия токсинов, травматических поражений и т.д. (Marx et al., 2000), каждый случай ОВП должен быть вирусологически исследован для установления этиологии заболевания. Если данные надзора за ОВП в течение 3-х лет подтверждают отсутствие дикого ПВ на определённой территории (регионе, стране), то ВОЗ рассматривает их как доказательство прекращения циркуляции на этой территории.

Национальная программа ликвидации полиомиелита РФ, принятая в 1996 г. (Приказ МЗ РФ № 336/142, 1996), явилась частью Европейской региональной и Глобальной программы ликвидации этого заболевания. К этому времени в РФ проблема полиомиелита как инфекционного заболевания, поражающего ежегодно сотни тысяч детей, была практически решена благодаря массовой вакцинации с помощью оральной полиовирусной вакцины (ОПВ). В 1990-94 гг. ежегодно регистрировали от 3 до 17 случаев паралитического полиомиелита, показатель заболеваемости на 100 тыс. не превышал 0,01-0,05 (Онищенко и др., 2008). Однако политические и социальные изменения, произошедшие в странах, прежде объединённых в составе СССР, привели к разрушению системы вакцинопрофилактики и негативно отразились на ситуации с полиомиелитом. В 1994-95 гг. на долю бывших республик СССР (Таджикистан, Узбекистан, Украина, Азербайджан, Туркменистан) приходилось более 80% случаев полиомиелита в Европейском регионе ВОЗ (Королёва и др., 1993; Sutter et al., 1997; Oblapenko and Sutter, 1997). Методы лабораторной диагностики полиомиелита были достаточно хорошо разработаны и внедрены в практику ещё в 60-70-х гг. ХХ века, однако системы вирусологического мониторинга ПВ, предназначенной не только для вирусологических исследований заболеваний с типичными клиническими проявлениями, а для выявления и характеристики всех циркулирующих ПВ, в РФ не существовало.

Поэтому целью данной работы явилось создание системы вирусологического мониторинга ПВ, способной решать задачи программы ликвидации полиомиелита в РФ, а, следовательно, региональной и глобальной программ ВОЗ.

В задачи работы входило:

1. Внедрить в РФ предложенный ВОЗ алгоритм вирусологического исследования материалов, полученных при выполнении эпидемиологического надзора за полиомиелитом и ОВП.
2. Проводить в Национальной лаборатории по диагностике полиомиелита (НЛ) в ИПВЭ им.М.П.Чумакова РАМН вирусологические исследования всех материалов, собранных при выполнении программы ликвидации полиомиелита в РФ.
3. Создать в НЛ базу для обеспечения вирусологических лабораторий РФ, участвующих в реализации Программы ликвидации полиомиелита, референс-материалами (культурами клеток, вакцинными штаммами Сэбина, диагностическими и тестовыми материалами и т.д.), необходимыми для проведения вирусологических исследований.
4. Проводить координационное и методическое руководство вирусологическими лабораториями РФ, участвующими в реализации Программы ликвидации полиомиелита, разработать предложения для совершенствования надзора за ПВ в РФ. Проводить анализ качества работы Национальной лабораторной сети по полиомиелиту (НЛС).
5. Провести вирусологический и эпидемиологический анализ случаев заболевания полиомиелитом в РФ, установить основные характеристики случаев вакциноассоциированного паралитического полиомиелита (ВАПП) для обоснования предложений по совершенствованию вакцинопрофилактики полиомиелита в РФ.
6. Обосновать необходимость проведения надзора за ПВ с помощью исследования сточных вод как важной составляющей вирусологического мониторинга ПВ.
7. Получить данные о циркуляции НПЭВ в РФ.

Научная новизна.

Показано, что для получения наиболее полных сведений о циркулирующих ПВ необходима система мониторинга, которая включает исследование материалов, полученных при выполнении надзора за полиомиелитом и ОВП и исследовании сточных вод, а также вирусологический анализ всех ПВ, выделенных в лабораториях страны, в соответствии с алгоритмом вирусологических исследований, предложенным ВОЗ.

Впервые проведены широкомасштабные, систематические наблюдения за циркуляцией ПВ на территории РФ в период применения ОПВ (с 1999 по 2007 гг.). Выполнены вирусологические исследования всех материалов (образцов фекалий, сточных вод, сывороток крови, выделенных штаммов ПВ), собранных при выполнении программы ликвидации полиомиелита в РФ и направленных в НЛ в соответствии с нормативно-методическими документами РФ. Впервые установлено происхождение ПВ, выделенных из разных источников (от случаев ОВП, контактных с ними здоровых лиц, сточных вод) на территории РФ с 1999 по 2007 г.

На примере вспышки полиомиелита в Чеченской республике (ЧР) в 1995 г. впервые дана характеристика вспышки, возникшей на ограниченной территории, детское население которой имело недостаточный уровень охвата прививками против полиомиелита и низкий уровень коллективного иммунитета, при общем высоком уровне коллективного иммунитета в стране. Установлена возможность быстрого глобального распространения дикого ПВ из эндемичного региона, формирования очага циркуляции, возникновения вспышечной заболеваемости. Впервые показано, что такая вспышка имеет основные характеристики, свойственные вспышкам полиомиелита в развивающихся странах в до-вакцинальную эру.

Система мониторинга ПВ позволила впервые установить существование длительной скрытой циркуляции вирусов-производных ОПВ, которая может приводить к формированию высоко нейровирулентных вариантов вакцинородственных полиовирусов (VDPV), в популяции с высоким (более 95%) уровнем охвата прививками против полиомиелита.

Впервые установлен уровень заболеваемости и основные характеристики ВАПП в РФ в период применения для вакцинации против полиомиелита ОПВ (1998-2005 гг.). Впервые проведён анализ состояния иммунитета и преморбидного статуса детей, заболевших ВАПП.

Показано, что для эффективного мониторинга ПВ необходимо вирусологическое исследование сточных вод. Информативность и чувствительность исследований может быть повышена за счёт обследования сточных вод от отдельных групп населения, в которых наиболее вероятна циркуляция ПВ. В полевых наблюдениях выполнено сравнение эффективности 2-х методов концентрирования сточных вод.

Впервые получены сведения о циркуляции НПЭВ в РФ в период 1999-2007 гг. Установлен уровень циркуляции НПЭВ среди здорового населения страны (5%), определены «эпидемические» серотипы НПЭВ.

Практическая значимость работы

Создана система вирусологического мониторинга ПВ, которая включает исследование материалов, полученных при выполнении эпидемиологического надзора за полиомиелитом и ОВП, дополнительного надзора за ПВ с помощью исследования сточных вод, анализ всех штаммов ПВ выделенных в РФ, в соответствии с алгоритмом вирусологических исследований, рекомендованным ВОЗ.

Показано, что циркуляция дикого ПВ в РФ прекращена в 1996 г. На основании данных, полученных в период 1999-2002 гг., Европейская Региональная Комиссия по сертификации полиомиелита ВОЗ признала РФ страной, «свободной от полиомиелита». РФ сохраняет этот статус до настоящего времени. Система вирусологического мониторинга позволила установить, что дикие ПВ типа 1, выявленные в РФ в 2004 г., были следствием лабораторной контаминации образцов сточных вод штаммом Mahoney.

Вспышка полиомиелита в ЧР в 1995 г. показала, что при недостаточном уровне коллективного иммунитета в регионе или стране, свободной от дикого ПВ, возможно межконтинентальное распространение вируса из пока ещё существующих эндемичных резервуаров и возникновение вспышечной заболеваемости. Для предупреждения такого развития событий необходимо продолжать вакцинацию против полиомиелита и надзор за ПВ на уровне, рекомендованном ВОЗ. Существование длительной скрытой циркуляции вирусов-производных ОПВ, которая может приводить к формированию высоконейровирулентных вариантов вакцинородственных ПВ, является веским доказательством необходимости продолжения этих мероприятий.

Для совершенствования надзора за полиомиелитом и ОВП практически подтверждена эффективность подходов, позволяющих в более короткие сроки получать результаты исследований, что необходимо для экстренной оценки ситуации и формирования эпидемиологических решений. Показана информативность исследования материалов от приоритетных «горячих» случаев ОВП. Установлена возможность оптимизации алгоритма вирусологического исследования, предложенного ВОЗ - использование двух культур клеток (RD и L20B) для выделения ПВ и сокращение общего времени исследования до 10 дней без потери чувствительности.

В полевых исследованиях показано, что эффективность двух методов концентрирования сточных вод (одномоментного и сорбционного) сопоставима; оба метода могут быть использованы для мониторинга ПВ.

Результаты анализа случаев ВАПП стали основанием для изменения схемы вакцинации против полиомиелита в РФ: с 2008 г. введена 3-х кратная вакцинация с помощью инактивированной полиовирусной вакцины (ИПВ) и ревакцинация ОПВ.

Установленный уровень циркуляции НПЭВ среди здорового населения РФ может быть использован для оценки и прогноза эпидемической ситуации по энтеровирусным инфекциям (ЭВИ). Методические подходы системы мониторинга ПВ могут быть основой для эпидемиологического надзора за неполиомиелитными ЭВИ. На основании результатов изучения циркуляции НПЭВ и опыта проведения мониторинга ПВ подготовлена научно-практическая программа «Эпидемиологический надзор и профилактика энтеровирусной (неполио) инфекции на 2009-2011 гг.» (утверждена Главным государственным санитарным врачом РФ Г.Г.Онищенко 31.12.08 г. ).

Результаты исследований были использованы при подготовке нормативных и методических документов:

Санитарные правила

1. Безопасность работы с материалами, инфицированными или потенциально инфицированными диким полиовирусом. СП.1.3.1325-03.-Москва.-2003.
2. Профилактика полиомиелита в постсертификационный период. СП 3.1.2343-08.-Москва.-2008.
3. Порядок учёта, хранения, передачи и транспортирования материалов, инфицированных или потенциально инфицированных диким полиовирусом. СП 3.1.2260-07.-Москва.-2008.

Методические указания

1. Сбор и концентрирование кишечных вирусов из воды с помощью водопроницаемых пакетов с сорбентом.-Минск-1997.
2. Энтеровирусные заболевания: клиника, лабораторная диагностика, эпидемиология, профилактика. МУ 3.1.1.2130-06.-Москва.-2006.
3. Санитарно-вирусологический контроль водных объектов. МУК 4.2.2029-05.-Москва.-2006.
4. Эпидемиологический надзор и профилактика энтеровирусной (неполио) инфекции. МУ 3.1.1.2363-08.-Москва.-2008.
5. Организация и проведение вирусологических исследований материалов от больных полиомиелитом, с подозрением на это заболевание, с синдромом острого вялого паралича (ОВП). МУК 4.2.2410-08.-Москва.-2008.
6. Организация и проведение вирусологических исследований на полиомиелит, другие(неполио) энтеровирусы материала из объектов окружающей среды. МУ 3.1.1.2357-08.-Москва.-2008.
7. Эпидемиологический надзор за полиомиелитом и острыми вялыми параличами в постсертификационный период. МУ 3.1.1.2360-08.-Москва.-2008.

Материалы диссертационной работы были использованы при подготовке практического руководства «Лабораторная диагностика опасных инфекционных болезней» (под ред. академика РАМН, профессора Г.Г.Онищенко и чл-корр. РАМН, профессора В.В.Кутырева.-Москва.-«Медицина».-2009.-470 С.)

Основные положения, выносимые на защиту

1. Для реализации программы ликвидации полиомиелита в РФ создана система вирусологического мониторинга ПВ, которая основана на исследовании материалов, полученных при выполнении эпидемиологического надзора за полиомиелитом и ОВП и дополнительных видов надзора за ПВ в соответствии с алгоритмом вирусологических исследований, рекомендованным ВОЗ.
2. Существование ограниченной территории (региона) с низким уровнем коллективного иммунитета к ПВ в неэндемичной стране (регионе) с высоким общим уровнем коллективного иммунитета является фактором риска для возникновения случаев (вспышки) заболевания полиомиелитом в случае заноса дикого ПВ из эндемичного очага. Поэтому мероприятия по иммунизации против полиомиелита и надзору за ПВ в РФ не могут быть прекращены и должны поддерживаться на уровне, рекомендованном ВОЗ.
3. С 1996 г. в РФ прекращена циркуляция дикого ПВ. Выделение дикого ПВ в РФ в 2004 г. было фактом внутрилабораторной контаминации.
4. Уровень заболеваемости и основные характеристики ВАПП в РФ в период применения для иммунизации против полиомиелита ОПВ (1998-2005 гг.) были такими же, как в развитых странах мира, применяющих ОПВ. Факторами риска для развития ВАПП являются иммунодефицитное состояние и неблагополучный преморбидный статус ребёнка.
5. В хорошо иммунизированной популяции возможна длительная скрытая циркуляция вирусов-производных ОПВ, которая может привести к формированию высоко нейровирулентных вариантов вакцинородственных полиовирусов. Изменение стратегии применения полиовирусных вакцин в РФ - прекращение применения ОПВ и замена её ИПВ - позволит предотвратить случаи ВАПП у реципиентов вакцины, значительно снизить риск возникновения VDPV.
6. При сохранении эндемичных резервуаров дикого ПВ исследования сточных вод являются важнейшей частью мониторинга ПВ в РФ. Роль этого вида надзора для выявления VDPV будет возрастать по мере сокращения использования ОПВ
7. Система вирусологического мониторинга ПВ может быть использована для решения задачи надзора за неполиомиелитными ЭВИ. Уровень циркуляции НПЭВ среди здорового населения РФ в целом без учёта возрастных, сезонных и географических факторов в межэпидемический период составляет 5±0,46%. «Эпидемическими» серотипами НПЭВ в период 1999-2007 гг. были вирусы CBV 1-6, Е7, 30, 11, 6.

Апробация работы состоялась на заседании межлабораторного Учёного совета Учреждения Российской академии медицинских наук Институт полиомиелита и вирусных энцефалитов имени М.П.Чумакова РАМН 28 апреля 2009 г.

Материалы исследований были представлены и обсуждены:

- на научных конференциях - Х Международном Вирусологическом Конгрессе (Иерусалим, Израиль, 1996); Научной конференции «Актуальные проблемы медицинской вирусологии» (Москва, 1999); Научно-практической конференции "Инфекционные болезни на рубеже ХХI века" (Москва, 2000); Научной конференции "Достижения отечественной эпидемиологии в ХХ веке. Взгляд в будущее" (Санкт-Петербург, 2001); 12-ой конференции Европейской Научной Группы по молекулярной биологии пикорнавирусов (Sea Creast, США, 2002); Международном конгрессе «Ликвидация и элиминация инфекционных болезней – прогресс и проблемы» (Санкт-Петербург, 2003.); 6-м международном форуме по глобальной вакцинологии «Вакцины и иммунизация» (Минск, Беларусь, 2003); Всероссийской научно-практической конференции «Гигиенические проблемы водоснабжения населения и войск» (Санкт-Петербург, 2003); 7-м международном симпозиуме по позитивным РНК-содержащим вирусам (Сан-Франциско, США, 2004); 6-м международном конгрессе «Вода: экология и технология» ЭКВАТЭК-2004 (Москва, 2004); конференции «Генетика в XXI веке: современное состояние и перспективы развития»(Москва, 2004); Научной конференции, посвящённой 50-летию ИПВЭ им.М.П.Чумакова РАМН (Москва, 2005); VI Межгосударственной научно-практической конференции государств-участников СНГ «Санитарная охрана территорий государств-участников Содружества Независимых Государств: проблемы биологической безопасности и противодействия биотерроризму в современных условиях» (Волгоград, 2005); Всероссиийской научной конференции «Эпидемиология, лабораторная диагностика и профилактика вирусных инфекций» (Санкт-Петербург, 2005); IX Съезде Всероссийского научно-практического общества эпидемиологов, микробиологов и паразитологов «Итоги и перспективы обеспечения эпидемического благополучия населения Российской Федерации» (Москва, 2007); Международном медицинском форуме «Индустрия здоровья», Симпозиум «Полиомиелит – прошлое, настоящее и будущее (к 100-летию установления вирусной этиологии болезни)» (Москва, 2008); Национальной конференции «Аллергология и клиническая иммунология – междисциплинарные проблемы» (Москва, 2008); Совместном заседании Восточно-Европейского совета экспертов в области вакцинопрофилактики и Совета экспертов по профилактике вирусных гепатитов (Москва, 2008); 4-ой международной конференции, посвящённой 85-летию Санкт-Петербургского НИИЭМ им.Пастера и 120-летию Парижского института Пастера (Санкт-Петербург, 2008); VII Конгрессе детских инфекционистов России (Москва, 2008);

- на совещаниях ВОЗ – 1-м Совещании Европейской Региональной Комиссии по сертификации ликвидации полиомиелита (Париж, Франция, 1996); Совещании по совершенствованию надзора за полиомиелитом и контролю за дифтерией (Берлин, 1996); 3-м совещании ВОЗ по вопросам координации операции МЕКАКАР (Ташкент, Узбекистан, 1996); 2-м консультативном совещании Глобальной лабораторной сети ВОЗ по полиомиелиту (Женева, Швейцария, 1996); 1-м совещании рабочей группы по надзору за вирусом полиомиелита в окружающей среде (Женева, Швейцария, 1997); Внутрирегиональном координационном совещании ВОЗ по вопросам эпиднадзора и сертификации ликвидации полиомиелита (Киев, Украина, 1998); Совещании Региональной сертификационной комиссии по ликвидации полиомиелита по рассмотрению документации отдельных стран СНГ и Югославии (Кишинёв, Молдова, 2000); Суб-Региональном совещании координаторов по безопасному лабораторному хранению диких полиовирусов (Вена, Австрия, 2001); Совещании по надзору за вирусом полиомиелита в окружающей среде (Копенгаген, Дания, 2002); 12-м консультативном совещание глобальной лабораторной сети по полиомиелиту ВОЗ (Женева, Швейцария, 2006); Совещании Европейской Региональной лабораторной сети по диагностике полиомиелита (Рим, Италия, 2006); Объединённом совещании по вопросам контейнмента и лабораторной сети по полиомиелиту Европейского региона ВОЗ (Мальта, Ст.Джулиан, 2007);

- на пленуме «Вакцинопрофилактика полиомиелита в современных условиях» проблемной комиссии «Полиомиелит и другие энтеровирусные инфекции» (ИПВЭ им.М.П.Чумакова РАМН, Москва, 2008);

Публикации. По результатам работы опубликовано 70 печатных работ; основные материалы представлены в 26 статьях в реферируемых научных журналах, из них 8 опубликованы за рубежом, в одной монографиии, 2 статьях в сборниках.

Структура и объем диссертации. Диссертация изложена на 273 страницах машинописного текста, состоит из введения, 7 глав (6 глав включают данные литературы, описание использованных материалов и методов, результаты собственных исследований), обсуждения, выводов и списка литературы, содержащего 284 источника (67 отечественных и 217 иностранных). Работа содержит 39 таблиц и 17 рисунков.

Содержание работы

Материалы и методы исследований

Для выполнения разделов работы, посвящённых вирусологическим результатам надзора за ОВП, исследованию приоритетных («горячих») случаев ОВП, случаев ВАПП, дополнительному надзору за ПВ, безопасному лабораторному хранению диких ПВ, были исследованы различные материалы, собранные в РФ с 1999 по 2007 гг. в соответствии с нормативными документами РФ в ходе выполнения программы ликвидации полиомиелита. При изучении вспышки полиомиелита в ЧР в 1995 г. исследовали клинические материалы от больных детей, госпитализированных в 1-ю инфекционную больницу г.Москвы, больных детей из Республики Ингушетия (РИ) и здоровых контактных лиц из этих республик. Обоснование оптимизации традиционной схемы вирусологических исследований выполнили на основании результатов исследований материалов, полученных от случаев ОВП и здоровых контактных лиц во время проведения эпиднадзора за ОВП в РФ и странах СНГ (Армении, Азербайджане, Беларуси, Грузии, Казахстане, Кыргызстане, Молдове, Таджикистане, Туркменистане, Узбекистане, Украине) в 2004-05 гг. Полевые наблюдения в разделе работы, посвящённом исследованию сточных вод, выполняли в Доме ребёнка г.Омска в 2004-05 гг. Результаты наблюдения за циркуляцией НПЭВ в РФ в 1999-2007 гг. получены при исследовании материалов, собранных при выполнении надзора за ОВП, дополнительного надзора за ПВ, от спорадических случаев и вспышек ЭВИ. Сбор материалов в рамках надзора за ОВП проводили сотрудники Федеральной службы по надзору в сфере защиты прав потребителей и благополучия человека РФ (Роспотребнадзор) и служб здравоохранения стран СНГ в соответствии с нормативными документами стран и рекомендациями ВОЗ. Виды материалов и объём исследований, соответствующие направлениям работы, представлены в табл. 1.

Алгоритм вирусологического исследования образцов фекалий (сточных вод) соответствовал рекомендациям ВОЗ (WHO, 1997; WHO, 2004; WHO, 2003) и включал следующие этапы: подготовку фекальных проб (проб сточных вод) для исследования; выделение вируса на культуре клеток; идентификацию вируса; внутритиповую дифференциацию (ВТД) ПВ; генетическую характеристику (при получении противоречивых результатов в одном из двух методов ВТД).

Использовали культуры клеток, референс-штаммы (вакцинные штаммы Сэбина 3-х типов) и диагностические системы, рекомендованные и полученные из источников ВОЗ. Выделение ПВ и НПЭВ из образцов фекалий и сточных вод проводили на культурах клеток RD, HEp-2, L20B, полученных из RIVM, Bilthoven, Нидерланды и CDC, Атланта, США. Идентификацию выделенных изолятов проводили в реакции нейтрализации микрометодом. Для идентификации ПВ использовали поликлональные моноспецифические кроличьи анти-сыворотки (RIVM), для идентификации НПЭВ – пулы иммунных к НПЭВ лошадиных сывороток (RIVM), позволяющих идентифицировать 20 серотипов вирусов ЕСНО (Е), вирус Коксаки А9 (САV9), серотипы 1-6 вирусов группы Коксаки В (СВV). Идентификацию штаммов НПЭВ, которые не могли быть идентифицированы в реакции нейтрализации, выполняли методом анализа частичной нуклеотидной последовательности для области генома VP1 (Nix et al, 2006; секвенирование выполнено А.Н.Лукашевым).

ВТД проводили с помощью а) иммуноферментного анализа (ИФА) с использованием перекрёстно-адсорбированных кроличьих антисывороток к вакцинным и диким штаммам ПВ трёх серотипов (van Wezel and Hazendonk, 1979; van der Avoort et al., 1995) производства RIVM и б) метода диагностической полимеразной цепной реакции (ПЦР), разработанного Yang et al., 1991, с праймерами, специфичными к вакцинным штаммам Сэбина,

Таблица 1

Виды материалов и объем выполненных исследований

Направление исследований	Вид материала	Объём исследований
Надзор за заболеваниями с синдромом ОВП	Образцы фекалий 842 больных с синдромом ОВП (в том числе от 308 приоритетных «горячих» случаев)	1684 пробы
	Штаммы ПВ от: - случаев ОВП и здоровых контактных лиц - сточных вод - из других источников (здоровые дети, случаи ЭВИ)	5588 штаммов: 800 3770 1018
Изучение вспышки полиомиелита в ЧР в 1995 г.	Материалы из ЧР: - образцы фекалий 53 больных - сыворотки крови 29 больных - образцы фекалий 25 здоровых контактных лиц - сыворотки крови 25 здоровых контактных лиц Материалы из РИ: - образцы фекалий 5 больных - образцы фекалий здоровых контактных лиц - сыворотки крови здоровых контактных лиц	155 проб 55 проб 61 проба 23 пробы 6 проб 91 проба 3 пробы
Паралитический полиомиелит в РФ в 1998-2005 гг.	Образцы фекалий 93 больных полиомиелитом Сыворотки крови 39 больных ВАПП Штаммы ПВ, выделенные от больных полиомиелитом Образцы фекалий, повторно собранные у 36 больных ВАПП на 60-й и 90-й день от начала заболевания; выделенные штаммы полиовирусов	186 проб 61проба 121 штамм 60 проб 15 штаммов
Исследование сточных вод как подход к контролю циркуляции ПВ в закрытых детских коллективах	Образцы фекалий детей из Дома ребёнка г.Омска; выделенные штаммы ПВ и НПЭВ Образцы сточных вод; выделенные штаммы ПВ- и НПЭВ	354 пробы 170 штаммов 194 пробы 82 штамма
Безопасное лабораторное хранение диких ПВ (контейнмент). Исследование случая внутрилаборатор-ной контаминации.	Образцы сточных вод Штаммы ПВ	6 проб 12 штаммов
Наблюдение за циркуляцией НПЭВ в РФ в 1999-2007 гг.	Штаммы НПЭВ, выделенные от случаев ОВП, здоровых контактных лиц, спорадических случаев ЭВИ, сточных вод	1048 штаммов
Оптимизация традиционной схемы вирусологических исследований	Образцы фекалий больных с синдромом ОВП и здоровых контактных лиц Штаммы ПВ и НПЭВ	1638 проб 1117 штаммов

предоставленными CDC, Атланта, США. Генетическая характеристика ПВ получена на основании определения нуклеотидной последовательности вирусного генома на участке, кодирующем белок VP1(~ 900 nt) методом частичного секвенирования (Cherkasova et al., 2002). Молекулярно-биологические исследования выполнены сотрудниками НИИ физико-химической биологии им. А.Н.Белозерского МГУ им.Ломоносова Е.А.Коротковой, Е.А.Черкасовой, М.Л.Яковенко.

Изучение нейровирулентности штаммов ПВ с помощью теста на трансгенных мышах (TgPVR-21), полученных из Центрального Института экспериментальных животных, Токио, Япония, было проведено по инициативе автора Е.М.Драгунской в Администрации по контролю пищевых и лекарственных продуктов (FDA), США (Abe et al., 1995; WHO, 2002).

Уровень нейтрализующих гуморальных антител определяли в реакции микронейтрализации со штаммами Сэбина 3-х типов на культуре клеток НЕр-2. Вакцинные штаммы Сэбина были предоставлены Национальным Институтом Биологических Стандартов и Контроля (NIBSC), Великобритания.

Анализ состояния иммунитета детей с ВАПП выполнен проф. Л.И.Краснопрошиной на основании результатов исследований, проведённых в НИИВС им. Мечникова или в медицинских учреждениях, где были госпитализированы больные, по нашей инициативе. Иммунофенотипирование лимфоцитов проводили с помощью моноклональных АТ к CD3+, CD4+, CD8+, CD16+, CD72+ и CD20+ (ООО «Сорбент»), меченых ФИТЦ («МедБиоспектр») на проточном цитофлюориметре (Jackson, 1990). Содержание сывороточных IgG, IgM, IgA определяли методом радиальной иммунодиффузии по Mancini (Mancini et al., 1970). Функциональную активность фагоцитарной системы изучали в реакции фагоцитоза со стафилококками и в НСТ-тесте (спонтанный и активированный зимозаном кислородный метаболизм) (Хаитов и др., 1995).

При исследовании сточных вод использовали а) одномоментный метод отбора воды (1,0 л) и концентрирование вирусов с помощью двухфазного разделения (одномоментный метод) и б) метод сорбции вирусов с помощью пакетов с сорбентом – макропористым стеклом (МПС) (сорбционный) и последующую элюцию (WHO, 2003).

Оценку качества работы лабораторий по диагностике полиомиелита РФ выполняли на основании анализа документов, используемых в глобальной лабораторной сети ВОЗ: ежемесячных и еженедельных форм лабораторного отчёта, листов ежегодной аккредитации лаборатории. Классификацию случаев ОВП проводили на основе «вирусологической схемы» (WHO, 1998), классификацию случаев ВАПП - в соответствии с рекомендациями ВОЗ (ВОЗ, 1998) Для классификации и характеристики случаев ОВП и ВАПП использовали карты эпидемиологического расследования случая полиомиелита и ОВП (части I, II - с результатами повторного осмотра ребёнка через 60 дней от начала паралича, III - с заключением Национальной комиссии по диагностике полиомиелита и ОВП), выписки из историй болезни. При анализе результатов исследований использовали компьютерные программы EpiInfo, Excel, таблицы Генеса (Генес, 1967). Для расчётов частоты возникновения случаев ВАПП использовали подход, применённый Kohler et al., 2002.

Результаты

Вспышка полиомиелита в Чеченской республике в 1995 г. До начала выполнения программы ликвидации полиомиелита в 1996 г., системы вирусологического мониторинга ПВ в РФ не существовало. Контроль за полиомиелитом основывался на клиническом выявлении случаев заболевания. Подтверждением присутствия диких ПВ в РФ стала вспышка полиомиелита в ЧР в 1995 г. Предпосылками её возникновения были низкий уровень вакцинации против полиомиелита в ЧР (в 1994 г. вакцинация не проводилась), неудовлетворительные санитарные условия и массовая миграция населения, связанные с военным конфликтом на территории ЧР.

Вспышка продолжалась с марта по декабрь, большинство случаев заболевания пришлось на июль-август. Географически она охватила всю территорию ЧР, затем вышла за её пределы (последний случай заболевания выявили в РИ в декабре). Всего заболело 146 детей, 6 из них умерли.

Демографический анализ (выполнен по выборкам, для которых были доступны данные) показал, что возраст больных (58 детей) не превышал 11 лет, преобладали дети в возрасте до 1 года. Среди 53 больных было 34 мальчика и 19 девочек. Все дети не были привиты против полиомиелита, за исключением 3-х, которые получили 1-2 прививки. У всех заболевание имело характерное для полиомиелита развитие и течение со стойкими остаточными парезами и параличами.

Дикий ПВ типа 1 выделяли 72% (38 из 53 обследованных больных) и 60% (3 из 5 обследованных больных) из ЧР и РИ, соответственно.

При исследовании сывороток больных установили наличие нейтрализующих антител к ПВ типа 1 в высоких титрах и отсутствие антител к ПВ типа 2 и 3 (табл. 2). В сыворотках взрослых контактных лиц выявили присутствие антител ко всем 3-м типам ПВ, у многих – в высоких титрах. При этом значительное количество контактных было вовлечено в эпидемический процесс: 7% (2 из 27 обследованных) и 21% (15 из 71 обследованного) здоровых контактных лиц из ЧР и РИ, соответственно, выделяли дикий ПВ, что могло быть связано с массивной инвазией вируса в кишечник, превосходящей протективный уровень секреторных антител. Картину широкого распространения эпидемического ПВ среди частично или полностью вакцинированной популяции наблюдали во время многих вспышек в развивающихся странах (Patriarca et al., 1997).

Таблица 2

Результаты серологического исследования больных и контактных лиц

Тип ПВ	Количество обследованных лиц
	Всего	С титрами антител (log2) к вирусам полиомиелита
		<3	3	4	5	6	7	8	9	10	11	>11
		Больные
1	29					1	3	1	12	4	4	4
2	29	28								1
3	29	27		1						1
		Контактные
1	22					1		2		3		16
2	20			1		2		5	4	3		5
3	20		4	1	3	2	4	4	2

Распространение дикого ПВ в популяции поддерживалось за счёт больных, достаточно долго выделявших вирус: 11 детей (50%) в течение месяца после начала заболевания, 9 детей (41%) – в течение 2-х месяцев, 2 ребёнка (9%) - более двух месяцев (время прекращения экскреции не было установлено, так как дети выбыли из наблюдения). На фоне продолжающейся вспышки в ЧР и появления первых клинических случаев в РИ, провели однократную кампанию вакцинации ОПВ. Циркуляция диких ПВ в РИ не была прервана, на что указывает спектр вирусов, выделенных от контактных из РИ: 13 человек выделяли дикий ПВ типа 1, 8 – вакцинный ПВ типа 1, 2 - одновременно вакцинный и дикий ПВ типа 1, по одному контактному выделяли вакцинный ПВ типа 2 и смесь вакцинных ПВ типа 1 и 3.

Генетический анализ нескольких случайно выбранных штаммов дикого ПВ типа 1 из ЧР и РИ позволил установить их тесную связь друг с другом и принадлежность к Т-генотипу (Черкасова и др., 1996; Ivanova et al., 2001). Штаммы этого генотипа циркулировали на территории бывшего СССР в 90-х годах прошлого века, с ними были связаны вспышки полиомиелита в 1993-1994 гг. (Таджикистан, Украина, Узбекистан), они обнаруживали родство со штаммами, выделенными в Пакистане в 1991 и 1995 гг. (Липская и др., 1998; Черкасова и др., 1996) Это позволило предположить, что в 90-х годах прошлого века происходило глобальное распространение дикого ПВ типа 1 с Индийского субконтинента через Центральную Азию в Европейский регион (Lipskaya et al., 1996; Липская и др., 1998).

Таким образом, эпидемиологические характеристики и клинические проявления этой вспышки были такими же, как у классических вспышек полиомиелита в развивающихся странах в до-вакцинальную эру; как и большинство вспышек того времени она была связана с диким ПВ типа 1 (Patriarca et al., 1997). Следствием интенсивной миграции жителей из эпидемического очага могли стать заносы дикого ПВ в другие регионы РФ, но отсутствие системы мониторинга ПВ не позволило оценить масштабы распространения вируса.

Национальная сеть лабораторий по диагностике полиомиелита РФ. Анализ качества работы. С 1998 г. вирусологические исследования в рамках программы ликвидации полиомиелита в РФ проводятся в Национальной сети лабораторий (НЛС) по диагностике полиомиелита (Приказ МЗ РФ № 386). Она состоит из Национальной лаборатории (НЛ) в ИПВЭ им.М.П.Чумакова РАМН и 6 Суб-национальных лабораторий (СНЛ) на базе вирусологических лабораторий ФГУЗ «Центр гигиены и эпидемиологии» Роспотребнадзора в Свердловской области, г.Екатеринбург, Ставропольском крае, г.Ставрополь, Омской области, г.Омск, Хабаровском крае, г.Хабаровск, в г.Москве и ФГУН Институт эпидемиологии и микробиологии им.Пастера, Санкт-Петербург. Порядок взаимодействия в НЛС соответствует функциональным обязанностям лабораторий по диагностике полиомиелита разного уровня, рекомендованным ВОЗ (WHO, 2004) и закреплённым нормативно-методическими документами РФ (Онищенко Г.Г. и др., 2008). Материалы от случаев ОВП и контактных лиц исследуются только в соответствующих СНЛ и НЛ. СНЛ выполняют выделение вирусов из образцов фекалий и их идентификацию. Все изоляты ПВ и НПЭВ, оригинальные образцы фекалий, из которых они были выделены, пересылают в НЛ. НЛ проводит повторное исследование позитивных образцов фекалий, ре-идентификацию изолятов, ВТД штаммов ПВ и молекулярно-генетические исследования. Выделение и идентификация вирусов должны быть закончены в течение 28 дней от момента получения фекальных образцов, ВТД – в течение 7 дней после получения изолята ПВ или его идентификации. НЛ проводит ре-идентификацию и ВТД всех штаммов ПВ, выделенных из любых материалов (сточных вод, от здоровых лиц и проч.) любыми вирусологическими лабораториями РФ. НЛ снабжает все лаборатории, участвующие в реализации Программы ликвидации полиомиелита, референс-материалами (культурами клеток, вакцинными штаммами Сэбина, диагностическими и тестовыми материалами), что обеспечивает стандартность исследований в разных лабораториях.

Все лаборатории НЛС проходят процедуры внешнего и внутреннего контроля качества в виде ежегодной аккредитации, профессионального тестирования (детекция и идентификация вирусов в зашифрованном наборе образцов фекалий), подтверждения идентификации изолятов в НЛ. Результаты исследования и показатели качества работы в виде еженедельных отчётов направляются в НЛ и Европейское региональное бюро ВОЗ. Анализ и оценка показателей качества работы НЛС в 1999-2007 гг. (табл. 3) показал, что они соответствуют требованиям ВОЗ.

Таблица 3

Качество работы НЛС РФ в 1999-2007 гг. ( критерий ВОЗ - не менее 80%)

Показа-тели Год	Индекс эпид-надзора*	Пациенты с 2-мя пробами стула, собран-ными с интерва-лом 24-48 час, %	Пробы, собранные в течение 14 дней после начала заболева-ния, %	Пробы, доставлен-ные в лаборато-рию в течение 72 часов после отбора, %	Пробы удовлет-вори-тельного качества, %	Пробы, исследо-вания которых закончено в течение 28 дней, %	Результа-ты профессионального теста ВОЗ, %. В числи-теле результа-ты СНЛ, в знамена-теле - НЛ	Подтвер-ждение идентифи-кации в НЛ вирусов, выделен-ных в СНЛ из материа-лов от случаев ОВП, %
1999	0,8	85,6	87,6	52,5	95,2	64,1	73,4/100	-
2000	0,87	96,9	90,9	69,9	93,2	88,9	96,7/100	93
2001	0,89	98	93,5	88	96	98	100/100	94,4
2002	0,9	100	92,8	95,3	96,4	99,1	100/100	96,6
2003	0,88	99,6	95,5	98,4	98,2	99	100/100	97,7
2004	0,93	100	95,2	99,4	100	99,9	100/100	97,4
2005	0,91	99,7	93	98,8	99	100	100/100	91
2006	0,92	99,8	92,3	98,7	99,4	100	100/100	98,2
2007	0,93	100	94	97,2	99,4	96,5	100/100	96,8

*индекс эпиднадзора рассчитывается путём умножения показателя заболеваемости неполиомиелитными ОВП на 100 тыс. детей в возрасте до 15 лет на процент случаев с адекватными пробами стула, собранными в течение 14 дней после начала паралитического заболевания.

Таким образом, НЛС РФ обеспечивает высокую достоверность и оперативность вирусологических исследований.

Вирусологические результаты надзора за ОВП в РФ. В течение 9 лет (1999-2007 гг.) в НЛС РФ на основании первичных донесений были исследованы 5126 случаев ОВП. Впоследствии Национальная комиссия по диагностике полиомиелита и ОВП окончательно классифицировала как ОВП 3692 случая. «Разрыв» между обследованными в лаборатории и окончательно классифицированными случаями ОВП был наибольшим до сертификации Европейского региона как «свободного от полиомиелита» в 1999-2001 гг. (до 317 случаев в 2000 г.), что объяснялось, главным образом, несовершенством клинической диагностики заболеваний с синдромом ОВП. Разрыв постепенно уменьшился в последующие годы (до 88 случаев в 2007 г.). Учитывая, что индекс эпиднадзора за полиомиелитом и ОВП на этапе после сертификации соответствовал требованиям ВОЗ и превышал показатели досертификационного периода (табл. 3), следует признать, что надзор за полиомиелитом и ОВП в РФ достиг оптимального качества.

Система верификации в НЛ материалов от случаев ОВП, из которых в СНЛ были выделены ПВ и НПЭВ, и от 10% «негативных» случаев обеспечивает высокую надёжность получаемых результатов. В 1999-2007 гг. НЛ обследовала материалы от 842 случаев ОВП. В целом в течение 9 лет в НЛС было исследовано 10301 образец фекалий от больных с синдромом ОВП и 2235 образцов фекалий от здоровых контактных лиц. Частота выделения ПВ от больных с ОВП постепенно снижалась в течение периода наблюдения от 14,4% в 1999 г. до 5,5% в 2007г. (в среднем 7,9 ± 0,27%), от контактных лиц была наибольшей в 1999 г. (5,9%), составляя в среднем 4,4 ± 0,43%. Наиболее высокое выделение ПВ в 1999 г. совпадало с проведением в РФ массовых кампаний по дополнительной иммунизации против полиомиелита, отражает интенсивность циркуляции вирусов-производных ОПВ среди населения, может быть объяснена несовершенством клинической диагностики ОВП на первоначальных этапах надзора. В целом среди 465 случаев ОВП, связанных с выделением ПВ, преобладали (p < 0,05) случаи, от которых выделяли ПВ типа 3 и смеси ПВ по сравнению с ПВ типа 1 и 2 (33,3 ± 2,2%, 27,3 ± 2,1%, 21,5 ± 1,9% и 17,9 ± 1,8%, соответственно).

В течение 8 лет (2000-2007 гг.) 5588 штаммов ПВ, выделенных из различных источников, были подвергнуты ВТД, результаты которой подтвердили их вакцинное происхождение и отсутствие циркуляции (или заноса) диких ПВ на территории РФ. На основании этого в 2002 г. Европейская Региональная Сертификационная Комиссия признала за РФ статус «страны, свободной от полиомиелита», который сохраняется в последующие годы.

Молекулярно-генетический анализ 67 штаммов, проявлявших противоречивые свойства в одном из методов ВТД, позволил идентифицировать 6 из них как VDPV - вакцинородственные, значительно (> 1% нуклеотидных замен на участке генома VP1) дивергировавшие от гомотипичного вакцинного предка (WHO, 2002) (табл. 4). Был установлен факт длительной независимой эволюции от вакцинных предков наиболее изменённых штаммов RUS 11262-99 и RUS 11264-99, выделенных от невакцинированной иммунокомпетентной 7-месячной девочки и здорового контактного из дома ребёнка г.Пермь: «возраст» штаммов к моменту их изоляции составлял около двух и полутора лет, соответственно (Cherkasova et al., 2002; Cherkasova et al., 2003). Выявление VDPV-штаммов показало, что возможности для скрытой циркуляции вирусов-производных ОПВ, которая может привести к формированию высоконейровирулентных вариантов вакцинородственных ПВ, существуют не только среди недостаточно иммунизированного населения, но и в хорошо иммунизированной популяции.

Оптимизация традиционной схемы вирусологических исследований. Скорость, достоверность, полнота вирусологических исследований важны для принятия адекватных противоэпидемических решений в ответ на случай (или вспышку) заболевания полиомиелитом. Согласно традиционной схеме вирусологического исследования образцов фекалий (WHO, 1997; 2004), главная цель которого – выделение ПВ, общая продолжительность наблюдения за

Таблица 4

Характеристики VDPV-штаммов, выявленных в РФ в 1999-2007 гг.

№ штамма	Происхождение штамма	Тип	Результат ВТД		% замен на участке генома VP1 (900 нт)
			ИФА	ПЦР
RUS 11262-99	ОВП, ВАПП	1	NSL*	Sab+***	2,65%
RUS 29008-07	ОВП	1	NSL	Sab+	1%
RUS 11264-99	здоровый ребёнок, контакт с RUS 11262-99	3			1,8%
RUS 14170-01	сточная вода	1	NSL	Sab+	1%
RUS 16690-01	сточная вода	1	NR**	Sab+	1,11%
RUS 13049-00	ребёнок, ОКИ	2	NR	Sab+	1%

* - не сходный по антигенным свойствам с вакцинным штаммом (non-Sabin-like, NSL);

**- штамм не взаимодействует с сыворотками специфичными к вакцинному и дикому штамму ПВ;

*** - штамм, имеющий вакцинное происхождение (WHO, 2004).

зараженными культурами клеток должна составлять не менее 14 дней. Мы провели ретроспективный анализ процедуры и результатов лабораторных исследований 1638 образцов фекалий от случаев ОВП и здоровых контактных лиц из РФ и стран СНГ, выполненных в НЛ в 2004-05 гг., в 557 (34%) из которых были детектированы различные вирусы (табл. 5). Культуры клеток RD, L20B и Hep-2 оказались практически одинаково чувствительны для выделения ПВ, но клетки RD позволяли выделять широкий спектр различных цитопатогенных НПЭВ.

Таблица 5

Спектр цитопатогенных вирусов, выделенных из образцов стула на различных культурах клеток

Вирусы	Количество образцов стула, содержащих вирусы, проявлявших ЦПЭ на культурах клеток
	RD	L20B	Hep-2
Полиовирусы	234	232	233
ЕСНО	91	0	0
Коксаки В	69	0	79
НТНПЭВ	94	0	7
Адено	14	3	61
Всего	502	235	380

Анализ появления выраженного (4+) цитопатического эффекта (ЦПЭ) при исследовании образцов стула, содержащих полиовирусы, на различных культурах клеток показал, что большинство образцов проявляли ЦПЭ в течение 5 дней при первичном заражении культур клеток RD и L20B (97,4% и 92,2% образцов, соответственно). Во время следующего пассажа все образцы проявили 4+ ЦПЭ в течение 5 дней. Скорость появления 4+ ЦПЭ на культуре клеток RD при инокуляции фекальных суспензий с установленным присутствием ПВ как в первичном заражении (56,9±32,2 часа), так и при последующем пассаже (28,1±13,5), была достоверно выше (p < 0,05), чем на культуре клеток L20B (71,8±33,3 и 31,8±17,2 часа, соответственно).

При использовании только одной культуры клеток возможны «потери» ПВ: наблюдали расхождение результатов при выделении ПВ на различных культурах (для 10 образцов из 1638 - 4 «негативных» образца при исследовании на культуре RD, 6 - на культуре L20B, 5 - на культуре HEp-2).

Таким образом, общее время исследования образцов может быть сокращено до 10 дней: алгоритм исследования образца фекалий «5 дней наблюдения для первичного заражения, 5 дней – для первого пассажа» обеспечивает высокую достоверность выделения ПВ. Оптимальной схемой является одновременное параллельное исследование образца на культурах RD и L20B, дополнительным преимуществом которой является возможность выделения широкого спектра цитопатогенных вирусов, главным образом группы ЕСНО. Лаборатории НЛС РФ используют также культуру HEp-2. Это позволяет дополнительно детектировать CBV, некоторые другие цитопатогенные вирусы (например, аденовирусы), что важно для расширения знаний об этиологии неполиомиелитных ОВП.

Совершенствование надзора за полиомиелитом и ОВП. С 2002 г. в систему надзора за полиомиелитом и ОВП внедрено определение «приоритетнй («горячий)» случай ОВП» (Письмо № 21ФЦ/1505 от 15.04.02 г.), к которым относятся случаи ОВП у детей, не привитых/неполностью привитых против полиомиелита, прибывших из зон военных конфликтов, эндемичных по полиомиелиту стран, беженцев, а также случаи, в которых можно заподозрить полиомиелит, у лиц любого возраста (МУ3.1.1.2360, Москва, 2008). Для полного лабораторного исследования материалов от «горячего» случая ОВП, включая ВТД ПВ в случае его выделения, в максимально короткий срок, материалы в течение 72 часов от момента отбора доставляются в НЛ. В течение 6 лет (2002-2007 гг.) 308 «горячих случаев» ОВП было зарегистрировано и исследовано в НЛ. Непривитые против полиомиелита дети составляли 32,8%, 67,3% из них были старше 3-х месяцев. Среди последних дети, относящиеся к «группам риска» составляли меньшинство (36,8%). Большая часть непривитых детей старше 3-х месяцев – «домашние» дети, которые не посещают организованные детские коллективы, являясь, таким образом, группой риска.

Частота выделения ПВ из образцов фекалий от «горячих случаев» (от 28,9% до 41%) значительно превышала частоту выделения ПВ от случаев ОВП в целом (максимально - 8,6%). Таким образом, приоритетные «горячие» случаи ОВП – это эпидемиологически точно выбранная группа, вирусологические исследования материалов из которой позволяют получать значительный объём информации о ПВ, циркулирующих в РФ.

Паралитический полиомиелит в РФ в 1998-2005 гг. Выполнена комплексная (клиническая, вирусологическая, эпидемиологическая) характеристика случаев полиомиелита, зарегистрированных в РФ в период применения ОПВ с 1998 по 2005 гг. Среди 3294 зарегистрированных случаев ОВП 93 (2,8 %) были случаи с клинической картиной полиомиелита (табл. 6), которые классифицировали следующим образом: 58 (62,4%) ВАПП у реципиентов ОПВ, 25 (26,9%) «контактный» ВАПП, 8 (8,6%) случаев ОВП, «совместимых с диагнозом полиомиелит», 2 случая (2,2%) полиомиелита неясной этиологии. Случаи полиомиелита неясной этиологии и 6 случаев, «совместимых с диагнозом полиомиелит», Национальная комиссия экспертов отнесла к случаям ВАПП у реципиентов ОПВ. Ещё 2 «совместимых» случая с большой степенью вероятности не были связаны с диким ПВ (Иванова и др., 2007). Таким образом, за 8 лет в РФ зарегистрирован 91 случай ВАПП (66 «реципиентных» и 25 «контактных).

Таблица 6

Случаи полиомиелита в РФ в 1998-2005 гг.

Год	Коли-чество случа-ев ОВП	Количество случаев полиомиелита						Количество случаев ВАПП по окончательной классификации
		Всего	ВАПП у реципи-ентов ОПВ	ВАПП у контак-тных лиц	Случаи, "сов-мести-мые" с полио-миели-том	Полио-миелит неяс-ной этиоло-гии	всего		у реципи-ентов ОПВ	контакт-ный
1998	369	6	3	2	1	-	6		4	2
1999	524	11	7	3	-	1	11		8	3
2000	452	12	11	1	-	-	12		11	1
2001	431	14	10	2	2	-	13		11	2
2002	411	15	6	5	4	-	14		9	5
2003	367	13	8	5	-	-	13		8	5
2004	385	14	9	4	-	1	14		10	4
2005	355	8	4	3	1	-	8		5	3
Всего	3294	93	58	25	8	2	91		66	25

Среди 66 больных ВАПП-реципиентов ОПВ 59 детей (89,4%) заболели после получения первой дозы, 7 (10,6%) - после второй. Среди случаев контактного ВАПП большинство детей не были вакцинированы (19 из 25, 76%), 6 детей (24%) имели сведения о вакцинации. Учитывая длительный срок от момента получения ОПВ до возникновения паралича, выделение ПВ вакцинного происхождения, установленные контакты с возможным источником ПВ, эти случаи были отнесены к контактным случаям ВАПП. У больных ВАПП-реципиентов ОПВ период времени между получением ОПВ и началом паралича колебался от 6 до 35 дней (m = 20,8±7,1). Среди больных полиомиелитом (возраст 1 - 24 мес.) преобладали дети до 1 года (82 из 93, 88,2%). Они составляли 92,4% (61 ребёнок из 66) среди случаев ВАПП у реципиентов, 80% (20 из 25) среди контактных случаев. Средний возраст всех больных полиомиелитом составил 6,4±4,4 мес., больных ВАПП-реципиентов ОПВ 5,7±3,6 мес., контактных ВАПП 7,9±5,2 мес. Результаты анализа вакцинального статуса, данные о времени развития заболевания после получения ОПВ, о возрасте больных согласуются с данными наблюдений авторов из Беларуси, США, Великобритании (Ермолович и др., 2002; Nkowane et al., 1984; Strebel et al., 1992; Joce et al., 1992).

Случаи полиомиелита были зарегистрированы в 50 административных регионах РФ, географических и сезонных закономерностей распределения случаев не наблюдали.

Клиническая картина заболевания у всех больных была типичной. Среди клинических форм преобладала спинальная (97% среди всех случаев полиомиелита, 97% среди ВАПП у реципиентов, 96% среди контактных случаев ВАПП). В зависимости от локализации поражений монопарезы составили 40%, парапарезы - 32%, тетрапарезы – 27%. Наиболее редкой формой локализации (1 случай) был трипарез. Остаточные вялые парезы с развитием контрактур, атрофией мышц и другими последствиями наблюдали у всех больных. Два случая закончились летально.

ПВ были выделены от 83 случаев ВАПП (таб. 7). Вирусы одного типа выделяли чаще (p<0,05), чем смесь ПВ (70% и 30%, соответственно) как среди случаев ВАПП у реципиентов (60%), так и у контактных (92%) случаев, p <0,05. От случаев ВАПП в целом наиболее часто выделяли ПВ типа 3, затем 2 и 1 (52,9%, 29,8%, 17,4%, соответственно, p <0,05). Такое соотношение характерно для развитых стран (Strebel et al., 1992). Среди случаев ВАПП у реципиентов ПВ типа 3 (56%) преобладал над ПВ типа 2 (27,5%) и 1 (17,4%), p <0,05. От случаев ВАПП у контактных чаще выделяли ПВ типов 3 и 2 (43,3% и 36,7%, соответственно), чем ПВ типа 1 (20%).

Все выделенные штаммы (121) имели вакцинное происхождение и все, кроме пяти, проявляли характерные для вакцинных вирусов антигенные свойства. Степень дивергенции пяти штаммов от вакцинного предка была различна (Cherkasova et al., 2002, 2003, 2005; Иванова и др., 2007). Один из них (RUS 11262-99, табл. 4) был отнесён к VDPV.

Таблица 7

Результаты вирусологического исследования случаев полиомиелита в РФ, 1998-2005 гг.

Случаи ВАПП	Количество случаев с выделением полиовирусов										Количество штаммов ПВ каждого типа, выделенных от случаев
	Всего	Один тип				Смесь ПВ
		всего	1	2	3	всего	1+2	1+3	2+3	1+2+3	1	2	3
Всего	83	58	10	13	35	25	1	5	14	5	21	36	64
У реци-пиентов	58	35	6	4	25	23	0	4	14	5	15	25	51
У кон-тактных	25	23	4	9	10	2	1	1	0	0	6	11	13

Риску развития ВАПП в наибольшей степени подвержены дети с дефектами иммунитета (Sutter, 1994; Khetsuriani et al., 2003), около 16% из них могут длительно выделять ПВ (Khetsuriani et al., 2003), который в процесс продолжительной репликации в организме хозяина способен значительно дивергировать от вакцинного предка. Для выявления возможных случаев длительной экскреции ПВ больными ВАПП, в 2002-05 гг. повторно были обследованы 36 больных ВАПП (из 49 зарегистрированных). Образцы фекалий отбирали на 60-й (28 детей) и 90-й (32 ребёнка) дни после начала заболевания. Три ребёнка (два были иммунокомпрометированы) выделяли ПВ более 2 месяцев.

Непривитой ребёнкок с гипогаммаглобулинемией выделял ПВ типа 2 в течение 78 дней (штамм RUS 18130). Выделенные штаммы ПВ проявляли антигенные свойства, нехарактерные для вакцинных, была установлена положительная динамика накопления мутаций в процессе репродукции вируса в организме ребёнка (Cherkasova et al., 2005) и высокая нейровирулентность в тесте на трансгенных мышах (Иванова и др., 2007). От ребёнка с агаммаглобулинемией, заболевшего на 128-й день после 3-й дозы ОПВ, ПВ типа 2 выделили на 15-й (штамм RUS 20494) и 112-й (штамм RUS 20420) дни. Антигенные свойства штаммов не отличались от свойств штаммов Сэбина, однако в тесте на трансгенных мышах они проявляли высокую нейровирулентность, более поздний был охарактеризован как более нейровирулентный. В антигеном сайте AgS1 участка генома VP1 было выявлено наличие мутаций (Yakovenko et al., 2006). У третьего ребёнка, заболевшего после 1-й дозы ОПВ, длительность экскреции ПВ составила 109 дней: образцы, отобранные на 23-й, 59-й и 109-й день, содержали, соответственно, смесь ПВ типа 2 и 3, ПВ типа 1 и ПВ типа 2. Все штаммы имели вакцинное происхождение и антигенные свойства, характерные для вакцинных вирусов.

Повторные исследования образцов фекалий не выявили длительных экскреторов ПВ. Потенциально им мог быть ребёнок с агаммаглобулинемией, который выделял ПВ, по-крайней мере, 3 месяца. Однако он был потерян из наблюдения, из образцов, которые удалось отобрать на 345-й и 349-й дни, был выделен вирус Е22. ПВ, выделенные от этих детей, не могут быть отнесены к VDPV, но изменения в геноме и значительное повышение нейровирулентности в процессе репродукции вируса в кишечнике, говорят о том, что больные ВАПП, особенно с дефектами иммунитета, потенциально могут быть источником ре-интродукции изменённого ПВ в популяцию.

Из 38 детей-больных ВАПП с известным преморбидным статусом 35 имели различные нарушения состояния здоровья: перинатальное поражение ЦНС (19 больных), гипогаммаглобулинемию (6), парапроктит (7), дерматит, пиодермию, фурункулёз (4) анемию (4), пневмонию, бронхопневмонию, частые респираторные заболевания (9). У большинства диагнозы были сочетанными. Среди серологически обследованных детей с реципиентным ВАПП 23 из 24 (95,8%) имели антитела к одному (8,3%), двум (29,2%) или трём типам ПВ (58,3%) в сыворотках, отобранных в начале заболевания. В периоде реконвалесценции все дети имели антитела к ПВ (к одному типу 8,3%, двум – 16,7%, трём – 75%). Исследование 15 сывороток детей с контактным ВАПП показало, что в начале заболевания 3 ребёнка (20%) не имели антител к ПВ того типа, который был выделен от них, в период реконвалесценции все дети имели антитела. Дефицит показателей гуморального и клеточного иммунитета был выявлен у всех 16 иммунологически обследованных детей с ВАПП. У большинства (81,3%) были выявлены нарушения гуморального звена иммунитета. Наблюдали снижение уровня CD3+ в 86,7%, CD4+ в 35,7% и CD8+ в 91,7% случаев. Содержание иммуноглобулинов сыворотки крови, изученное у 15 детей, показало, что уровень IgG был снижен у 6 (40%) детей, уровень IgМ у одного ребёнка (6,7%), уровень IgА у 6 (40%). У одного из детей выявили агаммаглобулинемию, у 3-х - врождённый дефицит IgА. Большинство детей (11 из 13) имели неблагоприятный преморбидный статус (частые респираторные инфекции, дисбактериоз, дерматиты). Полученные результаты указывают, что иммунодефицитное состояние является фактором риска развития поствакцинального осложнения в виде ВАПП после применения ОПВ. Образование вируснейтрализующих антител к ПВ у всех детей, свидетельствовало о способности организма к формированию специфического противовирусного иммунного ответа.

Оценили риск развития ВАПП в РФ в период применения ОПВ (1998 - 2005 гг.). Частота возникновения случаев ВАПП составила 1 случай на 1,6 млн. распределённых доз ОПВ; частота развития ВАПП у реципиентов ОПВ - 1 случай на 2,2 млн. распределённых доз ОПВ; частота развития ВАПП у реципиентов первой дозы ОПВ - 1 случай на 186 тыс. детей. Эти величины близки к показателям, полученным в США (Nkowane et al., 1987; Schonberger L.B. et al., 1976; Strebel et al., 1992), ниже показателей, полученных в Беларуси (Самойлович, 2004). Возникновение случаев ВАПП в стране, свободной от дикого ПВ нельзя считать приемлемым, поэтому в 2008 г. в Национальный календарь прививок РФ были внесены изменения, в соответствии с которыми в РФ вводится последовательная схема вакцинации против полиомиелита (ИПВ+ОПВ).

Значение дополнительного надзора за ПВ для программы ликвидации полиомиелита. Надзор за синдромом ОВП является «золотым стандартом», рекомендованным ВОЗ для слежения за ПВ (Birmingham et al., 1997), на основании результатов которого выносится заключение о существовании циркуляции (заносов) дикого ПВ в стране. Факты выделения диких ПВ или значительно дивергировавших дериватов ОПВ из сточных вод при отсутствии случаев детекции вирусов в материалах от случаев ОВП (el Bassioni L. et al., 2003; Manor et al., 1999; Tambini et al., 1993), в том числе, в странах с хорошим надзором за ОВП и хорошо иммунизированным населением (Blomqvist et al., 2004; Cernakova et al., 2005; Manor et al., 1999; WHO, WER, 2008) подтверждают необходимость дополнительной информации о циркулирующих ПВ. Такие сведения могут быть получены при вирусологических исследованиях сточных вод. В РФ эти исследования выполняются в лабораториях Центров гигиены и эпидемиологии Роспотребнадзора в соответствии с алгоритмом, рекомендованным ВОЗ (WHO, 2003; WHO, 2004). В НЛ направляются все выделенные штаммы ПВ, все выделенные неидентифицированные ЦПА (для исключения присутствия в пробе ПВ). Таким образом, вирусологические исследования сточных вод в РФ являются частью системы мониторинга за ПВ. Среди 3770 штаммов ПВ, подвергнутых ВТД в 2000-2007 гг., дикие не были обнаружены, что явилось дополнительным подтверждением отсутствия циркуляции диких ПВ в стране. Надзор за ПВ с помощью исследования сточных вод предоставляет значительно большее количество ПВ изолятов, чем надзор за ОВП (3770 и 800, соответственно). По наблюдениям 1999-2005 гг. количество штаммов ПВ с изменёнными антигенными свойствами, выделенными из сточных вод (238 из 2653, 8,9%) превышало количество таких штаммов, полученных при исследовании материалов от случаев ОВП и контактных лиц (52 из 1415, 3,7%). Это говорит об информационном значении исследования сточных вод для получения сведений о циркулирующих в стране ПВ. Находка VDPV-штаммов (RUS 14170-01, RUS 16690-01, табл. 4) подтверждает возможность формирования и циркуляции значительно дивергировавших ПВ вакцинного происхождения в хорошо иммунизированной популяции.

Исследование сточных вод определённых групп населения, в которых наиболее вероятна циркуляция ПВ, например, воспитанники домов ребёнка, детских домов (Иванова и др., 2005; Cherkasova et al., 2002; Cherkasova et al., 2005) позволяет повысить информативность и чувствительность надзора за ПВ.

Провели полевые исследования по оценке возможностей двух методов отбора и концентрирования сточных вод - одномоментного и сорбционного (WHO, 2003), для наблюдения за циркуляцией ПВ в закрытом детском коллективе. В течение 6 месяцев ежемесячно собирали пробы фекалий детей в Доме ребёнка и одновременно пробы сточных вод из коллектора Дома ребёнка и общего коллектора, принимающего стоки жилого микрорайона. Исследования сточных вод продолжили далее в течение 5 месяцев. Установили, что исследование сточных вод позволяет проводить долгосрочный мониторинг циркуляции ПВ и НПЭВ, менее трудоёмко, более эффективно - количество содержащих цитопатогенные вирусы образцов фекалий составляло 44±2,6%, образцов сточных вод 79%±7 (р<0,05) для сорбционного метода, 50±22% (p>0,05) для одномоментного. Статистически достоверной разницы между количеством позитивных проб, полученных при отборе каждым из методов, не установлено.

Исследование образцов фекалий выявило преобладание (р < 0,05) НПЭВ различных серотипов. Выделили 170 штаммов энтеровирусов: 71 (42%) штамм ПВ 3-х серотипов, 99 (58%) штаммов НПЭВ - 44 штамма Е 3, 6, 9, 25 и 29 серотипов, 1 штамм CAV9 и 54 штамма, которые не удалось идентифицировать в реакции нейтрализации (нетипирующиеся НПЭВ – нтНПЭВ). Из 32 штаммов, выделенных сорбционным методом, 23 (72%) были ПВ 3-х серотипов и 9 (28%) – НПЭВ (Е3, 6, 25, нтНПЭВ). Преобладание ПВ (р < 0,05) среди изолятов из сточных вод, отобранных сорбционным методом, может быть связано со свойствами сорбента (Баева и др., 1990; Конторович и др., 1996). Одномоментным методом выделено 4 штамма: 2 штамма ПВ типа 1 и 3 и 2 штамма вируса Е 6 и 13.

Сезонная динамика выделения энтеровирусов из проб фекалий и сточной воды имела одинаковые тенденции: удельный вес позитивных проб в целом увеличивался к октябрю (68,9% и 100%, соответственно), ПВ преобладали с мая по июль (до 31,6% и 85,7%,соответственно) доля проб, содержащих НПЭВ, увеличивалась с августа по сентябрь (67,2 и 100%, соответственно).

Сравнение эффективности методов отбора сточных вод за весь период наблюдения не выявило достоверной разницы частоты выделения вирусов (в коллекторе дома ребёнка – 72±6% для сорбционного, 50±14% для одномоментного метода; в общем коллекторе – 31±7% и 31±13%, соответственно). Сорбционный метод был более эффективен при отборе сточных вод из коллектора дома ребёнка, чем из общего коллектора (72% и 31%, соответственно, p <0,05); частота выделения вирусов с помощью одномоментного метода из коллектора дома ребёнка (50%) и общего коллектора (31%) достоверно не отличалась.

Штаммы ПВ (138), выделенные из образцов фекалий и сточных вод в ходе всего исследования, имели вакцинное происхождение. Секвенирование участка генома VP1 штаммов ПВ типа 1 с изменёнными антигенными свойствами, выделенными из пробы фекалий, отобранной от ребёнка на 66-й день после вакцинации, и из пробы сточной воды, собранной сорбционным методом в тот же день, выявило их идентичность и слабую (< 0,5% нуклеотидных замен) дивергенцию от вакцинного предка. Такая «парная» находка показала чувствительность исследования сточных вод.

Детские учреждения закрытого типа должны быть отнесены к «учреждениям риска» в отношении ПВ. Вакцинацию ОПВ проводили не одномоментно, а в разное время. Исследование охватывало детей, получивших от 1-й до 3-х доз ОПВ, а также непривитых. Наблюдали высокую частоту выделения ПВ (32% в июле, что можно считать высоким показателем (Samoilovich et al., 2003), экскрецию ПВ непривитыми на момент отбора пробы (3 ребёнка) и длительное выделение ПВ некоторыми детьми (выделение ПВ типа 1 на 301-й день после вакцинации у 1 ребёнка, смеси ПВ типа 1 и 2 ещё в течение 77 дней после следующей дозы ОПВ). Необходимой мерой для ограничения циркуляции штаммов-производных ОПВ, способных к трансформации в высоконейровирулентные VDPV, является, прежде всего, ограничение применения ОПВ и замена её ИПВ, соблюдение карантинных мероприятий.

Внутрилабораторная контаминация диким ПВ в условиях выполнения Программы безопасного лабораторного хранения диких ПВ в РФ. Глобальная ликвидация полиомиелита невозможна без системы мероприятий, направленной на выявление всех возможных неприродных источников диких ПВ и надёжного и безопасного их хранения (контейнмента). Пока население планеты активно вакцинируется против полиомиелита и уровень коллективного иммунитета высок, «утечка» дикого ПВ из лаборатории может остаться незамеченной, если такое событие произойдёт в иных условиях, последствия могут быть катастрофическими. Известны эпизоды выноса дикого ПВ из лабораторий в настоящее время (Mulders et al., 1997; WHO, 2003), имеются сообщения об обнаружении диких ПВ в коллекциях фекалий, собранных вне связи с исследованиями по полиомиелиту (Davies, et al., 2003; Pallansch and Staples, 2002; Savoilainen and Hovi, 2003). Поэтому система надзора за ПВ должна быть в состоянии выявить источник происхождения дикого ПВ в случае экстремальной ситуации.

С 1996 г. дикие штаммы ПВ не используются в качестве референс-штаммов в вирусологических лабораториях РФ (Письмо Госкомсанэпиднадзора России от 06.05.96 г. № 4/82-11). Однако в 2004 г. был выявлен факт внутрилабораторной контаминации исследуемых образцов диким штаммом Mahoney ПВ типа 1 в одной из вирусологических лабораторий (лаборатории Х), которая заявляла об уничтожении диких вирусов.

Исследовали материалы из лаборатории Х: штаммы ПВ, «выделенные» из образцов сточных вод; оригинальные образцы сточных вод; эталонные штаммы ПВ типов 1, 2 и 3 (штаммы Сэбина), используемые в лаборатории Х для проведения серологических исследований.

Шесть цитопатогенных агентов (64Х, 66Х. 67Х, 75Х. 79Х, 84Х), «выделенных» из образцов сточных вод в лаборатории Х, были идентифицированы как ПВ типа 1. По результатам ИФА штаммы обладали антигенными свойствами, нехарактерными для вакцинных ПВ (NSL), по результатам ПЦР имели вакцинное происхождение (Sab+). Такие свойства могли проявлять как слабо изменённые (<1% отличий на участке генома VP1), так и значительно дивергировавшие (>1% отличий) от вакцинного предка ПВ. Частичное секвенирование геномов (район VP1) штаммов Х и сравнительный анализ их нуклеотидных последовательностей с соответствующей последовательностью вакцинного штамма Sabin типа 1 показали, что все 6 штаммов на этом участке идентичны друг другу и имеют 8 нуклеотидных отличий от вакцинного предка (рис. 1). Образцы сточных вод были отобраны в разные дни в течение месяца в трёх разных городах, что позволило заподозрить внутрилабораторную контаминацию проб одним штаммом ПВ. Сравнение последовательности нуклеотидов штаммов Х с соответствующей известной последовательностью дикого штамма типа 1 Mahoney (GeneBank, регистрационный номер AY082689) выявило их полную идентичность. Штамм Mahoney - дикий предшественник вакцинного ПВ штамма Sabin типа 1(Sabin and Boulger, 1973) - был выделен в 1941 г. в США, при ВТД проявляет свойства NSL в ИФА и Sab+ в ПЦР. В настоящее время штамм Mahoney в природе не встречается, используется для производства ИПВ, широко применяется в вирусологических лабораториях мира в качестве эталонного штамма. Для выявления возможного источника и механизма контаминации, в НЛ были исследованы оригинальные образцы сточных вод.

Из 6 оригинальных образцов 3 дали негативный результат, из 3-х выделили смесь ПВ типов 1, 2 и 3, смесь типов 1 и 3, и ПВ типа 2. Все ПВ типов 2 и 3 были охарактеризованы как вакцинородственные. ПВ типа 1 (штаммы 66 и 67, рис. 1) проявляли такие же свойства, как и 6 штаммов Х (NSL в ИФА, Sab+ в ПЦР). Секвенирование района VP1 геномов этих штаммов и сравнительный анализ их нуклеотидных последовательностей с соответствующими последовательностями штаммов типа 1 Sabin и Mahoney показали, что штаммы идентичны друг другу, имеют 8 нуклеотидных замен по сравнению со штаммом Sabin типа 1 и 12 по отношению к штаммам Х и штамму Mahoney. Таким образом, штаммы 66 и 67 не являются штаммами Mahoney, но представляют собой измененные варианты вакцинного штамма Sabin типа 1, а наблюдаемая степень дивергенции объясняет их характеристику в ИФА как NSL. Отсутствие штамма Mahoney в оригинальных образцах сточных вод, позволило заключить, что источник контаминации находился внутри лаборатории, а сама контаминация произошла на одном из этапов исследования образцов.

Рисунок 1. Схематичное изображение нуклеотидных последовательностей ПВ штаммов на геномном участке VP1. Вертикальной чертой ( | ) отмечены нуклеотидные замены по сравнению с вакцинным штаммом Sabin типа 1. Также показано расположение участка VP1 на ПВ геноме (размеры генома приведены в тысячах нуклеотидов).

* Нуклеотидные позиции, соответствующие границам участка VP1.

Исследование штаммов Сэбина, которые использовались в лаборатории как эталонные, проверка лабораторной документации, порядка проведения исследований (Иванова и др., 2006) показали, что дикие ПВ 3-х типов, в том числе Mahoney, не были уничтожены в лаборатории и в течение, по крайней мере, 7 лет ошибочно использовались как вакцинные.

Выявление факта контаминации подтвердило эффективность и чувствительность системы вирусологического мониторинга ПВ.

Наблюдение за циркуляцией НПЭВ в РФ в 1999-2007 гг. Наиболее характерное клиническое проявление полиовирусной инфекции – синдром ОВП - может вызываться некоторыми серотипами НПЭВ - CAV, CBV, Е, EV70 и 71 (Pallansch and Roos, 2001). В то же время она может проявляться в виде асептического менингита или лёгкого лихорадочного состояния. Поэтому глобальная программа ликвидации полиомиелита ВОЗ рассматривает энтеровирусный надзор как дополнительный вид надзора за ПВ в странах, где циркуляция «местных» диких ПВ прекращена (ВОЗ, 2005). В РФ надзора за НПЭВ до недавнего времени (до 2009 г.) не существовало. Система надзора за ПВ, нацеленная, прежде всего, на обнаружение ПВ, позволяет детектировать и идентифицировать НПЭВ и вирусы, принадлежащие к другим семействам. Поэтому приоритетные сведения о НПЭВ, циркулировавших в РФ с 1999 по 2007 гг. были накоплены, главным образом, в результате надзора за ПВ.

Впервые получены данные об интенсивности циркуляции НПЭВ в РФ в период применения ОПВ. По результатам 9 лет наблюдения частота выделения НПЭВ от больных с синдромом ОВП составила 3,8±0,19 %. Ни у одного пациента, из образцов фекалий которого были выделены НПЭВ, не был диагностирован полиомиелит. Так как «целевой» группой при проведении надзора за ОВП являются дети в возрасте до 15 лет, а случаи ОВП регистрируются в течение всего года без сезонных подъёмов и спадов, можно полагать, что эта цифра отражает средний уровень циркуляции НПЭВ среди детского населения РФ в межэпидемический период. Частота выделения НПЭВ от контактных лиц составила 5±0,46%. Так как в группу контактных входили лица разного возраста, в том числе взрослые, то эта величина соответствует уровню циркуляции НПЭВ среди здорового населения РФ в целом, без учёта возрастных, сезонных и географических факторов. Эти значения могут быть использованы для эпидемиологической оценки и прогнозирования ситуации по энтеровирусам.

Результаты серотипирования изолятов НПЭВ (табл. 8), полученные при проведении различных исследований (надзор за ОВП, спорадические случаи ЭВИ, сточные воды, здоровые лица) показали, что в течение 9 лет наблюдения наиболее часто на территории РФ выделяли CBV1-6, Е7, 30, 11, 6, 25 и 13. Некоторые из этих серотипов превалировали в это же время среди НПЭВ в европейских странах (E30, 6, 11, 7, 9, CBV5) и США (Antona et al., 2007; Khetsuriani et al., 2006). Совпадение основных циркулирующих серотипов отражает способность некоторых НПЭВ к достаточно быстрому глобальному распространению, что было подтверждено на молекулярном уровне, например, для E30 (Lukashev et al., 2008; Savolainen et al., 2001). В РФ вирусы CBV 1-6, Е7, 30, 11, 6 обнаруживались практически каждый год, но с разной частотой, что позволяет отнести их к «эпидемическим» серотипам (Khetsuriani et al., 2006). «Эпидемический» характер циркуляции Е6, 7, 30 был подтвержден результатами расшифровки некоторых вспышек ЭВИ, зарегистрированных в РФ (Иванова и др., 2008; Лукашев и др., 2008; Резник и др., 2007; Яшкулов и др., 2003).

Идентификация с помощью анализа частичной нуклеотидной последовательности области генома VP1 (Nix et al., 2006) 34 серологически неидентифицированных штаммов показала, что большую часть составляли вирусы группы САV, а также вирусы Е и смеси НПЭВ; EV71, EV90, СBV1.

В разных группах наблюдения лидировали те же серотипы НПЭВ, циркуляция которых преобладала в РФ в целом: случаи ОВП и контактных лица - CBV1-6, E11, 6, 13, 25, 30; ЭВИ, включая спорадические случаи менингитов, - E30, CBV1-6, Е6, 9, 11, 7; сточные воды - Е7, CBV1-6, Е11, 6, 25, 12; здоровые дети - CBV1-6, Е30, 9, 29, 13. Вместе с тем, в группах были отмечены свои особенности. Так, НТНПЭВ значительно реже (p<0,001) обнаруживали при исследовании материалов от ЭВИ (8%). Выделение E25 от больных с синдромом ОВП (6,4%) и из сточных вод (5,6%) значительно

Таблица 9

Результаты серотипирования НПЭВ в НЛ по диагностике полиомиелита (1999-2007 гг.)

Год Серотип	1999	2000	2001	2002	2003	2004	2005	2006	2007	всего
										абс	%
СВV1-6	6	10	39	22	13	13	23	44	69	239	22,8
НТНПЭВ*	16	37	34	28	19	25	8	17	27	211	20,1
Е7	1	2	7	11	10	6	1	11	51	100	9,5
Е30		29		9	5	30		1	21	95	9,1
Е11	3	28	24	9	3	5	4	1	17	94	9,0
Е6	1	5	4	2	6	4	5	32	28	87	8,3
Е25	1	3	6	6	5		5	6	12	44	4,2
Е13		5	2	14	3	4		3	2	33	3,1
Е9			1					20	5	26	2,5
Е12	3	10	3	1		2			7	26	2,5
Е3	1	4				5	4	2	6	22	2,1
Е4						1	6		5	12	1,1
Е14		5				1		2	3	11	1,0
Е20	1			3				2	4	10	0,95
Е29		8	1						1	10	0,95
САV9									9	9	0,9
Е1			1	1	1	1				4	0,4
Е21			1	1					2	4	0,4
Е22**						3	1			4	0,4
Е33						2			1	3	0,3
Е2									2	2	0,2
Е19		1								1	0,1
Е27						1				1	0,1
Всего	35	150	130	129	80	117	67	162	292	1048	100

Изоляты, выделенные при исследовании вспышек ЭВИ или эпизодов повышенной заболеваемости, в таблицу не включены.

Порядок расположения серотипов НПЭВ находится в соответствии с количеством штаммов.

* - НТНПЭВ – нетипирующиеся неполиоэнтеровирусы – вирусы, которые не удалось идентифицировать в реакции нейтрализации с помощью набора пулов лошадиных антисывороток A-G производства RIVM.

**- вирус ЕСНО 22 в настоящее время отнесён к роду Parechovirus (Parechovirus 1).

превышало (p<0,001) выделение этого серотипа от больных ЭВИ (1,2%) и здоровых лиц (1,5%). E12 чаще всего выделяли из сточных вод (4,9%) и не выделяли от больных с синдромом ОВП (p=0,001). Роль НПЭВ в развитии заболеваний с неврологической симптоматикой однозначно не определена. Наиболее очевидные доказательства получены для EV71 (Shindarov et al.,1979; Shahmahmoodi et al. 2008). По нашим данным среди НПЭВ, выделенных от случаев ОВП, преобладали CBV1-6 и Е11, что согласуется с наблюдениями многих исследователей (Самойлович и др., 2007; Junttila et al., 2007; Bahri et al., 2005). Очевидно, что установление связи НПЭВ определённых серотипов и различных заболеваний (как с неврологической симптоматикой, так и терапевтических) требует дальнейших наблюдений на основе системы эпиднадзора за неполиомиелитными ЭВИ. Сеть лабораторий по диагностике полиомиелита РФ может быть базой для вирусологического компонента надзора.

Выводы

1. В РФ создана система вирусологического мониторинга ПВ, которая включает исследование материалов, полученных при выполнении эпидемиологического надзора за полиомиелитом и ОВП, дополнительного надзора за ПВ с помощью исследования сточных вод, вирусологический анализ всех штаммов ПВ, выделенных в РФ, в соответствии с алгоритмом вирусологических исследований, рекомендованным ВОЗ. Для проведения мониторинга создана и закреплена нормативно-методическими документами система взаимодействия лабораторий, участвующих в реализации программы ликвидации полиомиелита в РФ, которая обеспечивает непрерывность, оперативность и полноту вирусологических исследований. Высокие показатели качества работы НЛС гарантируют достоверность получаемых результатов. Выявление и расшифровка случая лабораторной контаминации диким ПВ подтвердили чувствительность системы вирусологического мониторинга ПВ и эффективность оперативного взаимодействия сети лабораторий по диагностике полиомиелита РФ.

2. Сохранение в мире эндемичных очагов дикого ПВ определяет необходимость продолжения иммунизационных и надзорных мероприятий по полиомиелиту в странах, свободных от дикого ПВ. На примере вспышки полиомиелита в Чечне и Ингушетии в 1995 г., вызванной диким ПВ типа 1, показана возможность быстрого глобального распространения дикого ПВ из эндемичного региона и возникновение вспышечной заболеваемости на ограниченной территории с низким уровнем коллективного иммунитета в неэндемичной стране.

3. Результаты вирусологического мониторинга показали, что циркуляция дикого ПВ прекращена в РФ в 1996 г. На основании этих данных 20 июня 2002 г. Европейская Региональная Сертификационная Комиссия признала РФ «страной, свободной от полиомиелита».

4. Установлен уровень заболеваемости и основные характеристики ВАПП в РФ в период применения для вакцинации против полиомиелита ОПВ (1998-2005 гг.). Частота возникновения случаев ВАПП составила 1 случай на 1,6 млн. распределённых доз ОПВ, 1 случай на 2,2 млн. распределённых доз для реципиентов ОПВ, 1 случай на 186 тыс. детей для реципиентов первой дозы ОПВ. Большинство случаев ВАПП возникало у реципиентов ОПВ после получения 1-й дозы вакцины (89,4%), у контактных – среди непривитых детей (76%). Среди больных ВАПП преобладали дети в возрасте до 1 года (88,2%). Период времени от момента получения ОПВ до развития ВАПП составил 21 день (20,8±7,1). Случаи ВАПП были связаны с ПВ-дериватами вакцинных штаммов Сэбина типа 3, затем типов 2 и 1 (52,9, 29,8, 17,4 % случаев, соответственно). Иммунодефицитное состояние и неблагополучный преморбидный статус ребёнка являются факторами риска для развития ВАПП.

5. В хорошо иммунизированной популяции возможна длительная скрытая циркуляция вирусов-производных ОПВ, которая приводит к формированию высоко нейровирулентных вариантов вакцинородственных ПВ. Прекращение применения ОПВ и замена её ИПВ позволит предотвратить случаи ВАПП у реципиентов вакцины, значительно снизить риск возникновения VDPV. В настоящее время в РФ существуют биологические условия для безопасного перехода от последовательной схемы вакцинации против полиомиелита (ИПВ+ОПВ) к исключительному применению ИПВ: высокий уровень коллективного иммунитета и отсутствие циркуляции диких ПВ.

6. В странах, в которых прекращена циркуляция дикого ПВ, вирусологические исследования сточных вод являются важнейшей частью мониторинга ПВ. Такие исследования имеют прогностическое значение для выявления заносов дикого ПВ из сохраняющихся эндемичных резервуаров, роль этого вида надзора будет возрастать для выявления циркулирующих ПВ-производных ОПВ в случае планируемого прекращения её использования. Информативность исследований может быть повышена за счёт обследования сточных вод от отдельных групп населения, в которых наиболее вероятна циркуляция ПВ.

7. Система вирусологического мониторинга ПВ позволяет получать сведения о циркуляции НПЭВ. Установленный уровень циркуляции НПЭВ среди здорового населения РФ в 1999-2007 гг. (5%) может быть использован для оценки и прогноза эпидемической ситуации по ЭВИ. Определены «эпидемические» серотипы НПЭВ - вирусы CBV 1-6, Е7, 30, 11, 6. Сеть лабораторий по диагностике полиомиелита РФ может быть лабораторной основой для эпидемиологического надзора за неполиомиелитными ЭВИ.

Список основных работ, опубликованных по теме диссертации

1. Иванова О.Е., Сейбиль В.Б., Липская Г.Ю., Мартыненко И.Н., Конторович В.Б., Царегородцев А.Д., Малышкина Л.П., Черкасова Е.А., Рогинская Е.С., Еремеева Т.П., Ефимова В.Ф., Садовникова В.Н., Лещинская Е.В., Дроздов С.Г. Вирусологическое и серологическое исследование вспышки полиомиелита в Чеченской республике в 1995 г. //Журнал микробиологии, эпидемиологии и иммунобиологии.-1996.-№3.-С.11-13.
2. Lipskaya G.Y., Kutateladze T., Saidov S., Ivanova O., Cherkasova L., Drozdov S., Pallansch M., Kew O., Agol V.I. Dynamics of wild poliovirus circulation in the former Soviet Union // X-th International congress of Virology.-1996.- Jerusalem, Israel.-P.143.
3. Черкасова Е.А., Липская Г.Ю., Белова Г.И., Бондаренко В.И., Задорожная В.И., Иванова О.Е., Конторович В.Б., Королёва Г.А., Кутателадзе Т.Н., Максумов С.С., Синяк Л.И., Дроздов С.Г. Обнаружение штаммов вируса полиомиелита в природных изолятах и их идентификация с помощью цепной полимеразной реакции//Молекулярная генетика, микробиология и вирусология.-1996.-№2.-С.25-13.
4. Конторович В.Б., Иванова О.Е., Еремеева Т.П., Ширман Г.А., Казанцева В.А.. Метод концентрирования вирусов в водных объектах окружающей среды//Вопросы вирусологии.-1996.-№1.-С.40-42.
5. Липская Г.Ю., Черкасова Е.А., Иванова О.Е., Дроздов С.Г. Генотипирование диких штаммов вируса полиомиелита, изолированных на территории России и СНГ в 1987-1995 гг. //Журнал микробиологии, эпидемиологии и иммунобиологии.-1998.-№5.-С.70-74.
6. Лещинская Е.В., Мартыненко И.Н., Леонтьева И.Я., Иванова О.Е., Рогинская Е.С., Прыткова М.И. Полиомиелит в России в 1970-1995 гг.//Эпидемиология и инфекционные болезни.-1998.-№ 3.-С.11-15.
7. Ivanova O.E., Eremeeva T.P., Karganova G.G., Rumyantsev A.A., Leshinskaya E.V., Lipskaya G.Yu., Cherkasova E.A., Korotkova E.A., Grachev V.P., Drozdov S.G.. Poliomyelitis in Russia in 1998-1999. //in F.Brown (ed.). Progress in Polio Eradication: Vaccine Strategies for the End Game. Developments in Biologicals. Karger.-2001.-Vol.105.-P. 219-223.
8. Ivanova O.E., Eremeeva T.P., Lipskaya G.Y., Cherkasova E.A., Gavrilin E.V., Drozdov S.G. Outbreak of paralytic poliomyelitis in the Chechen Republic in 1995. // in F.Brown (ed.). Progress in Polio Eradication: Vaccine Strategies for the End Game. Developments in Biologicals. Karger.-2001.-Vol.105.-P. 231-237.
9. Cherkasova E.A., Korotkova E.A., Yakovenko M.L., Ivanova O.E., Eremeeva T.P., Chumakov K.M., Agol V.A. Long-term circulation of vaccine-derived polioviruses that causes paralytic disease//J. of Virology.-2002.-Vol.76 (13).-P.6791-6799.
10. Иванова О.Е., Еремеева Т.П. Национальная лабораторная сеть Российской Федерации по диагностике полиомиелита и её роль в выполнении программы ВОЗ по ликвидации полиомиелита//Эпидемиология и вакцинопрофилактика.-2003.-№1.-С.26-30.
11. Иванова О.Е., Еремеева Т.П., Воронцова Т.В., Садовникова В.Н., Ясинский А.А. Итоги деятельности Национальной лабораторной сети по диагностике полиомиелита в Российской Федерации в 2002 году//Эпидемиология и вакцинопрофилактика.-2003.-№4.-С.37-40.
12. Иванова О.Е., Еремеева Т.П., Короткова Е.А., Яковенко М.Л., Чернявская О.П., Воронцова Т.В., Ясинский А.А. Надзор за полиомиелитом и ОВП в Российской Федерации до и после сертификации ликвидации полиомиелита в Европейском регионе, 1999-2003 гг.//Эпидемиология и вакцинопрофилактика.-2004.-№ 4(17).-C.6-12.
13. Лукашев А.Н., Иванова О.Е., Еремеева Т.П., Лашкевич В.А., Черненко К.Е.. Молекулярная эпидемиология вируса ЕСНО 30 на территории России и стран СНГ.//Вопросы вирусологии.-2004.-№ 5.-C.12-16.
14. Cherkasova E.A., Yakovenko M.L., Rezapkin G.V., Korotkova E.A., Ivanova O.E., Eremeeva T.P., Krasnoproshina L.I., Romanenkova N.I., Rozaeva N.R., Sirota L., Agol V.I., Chumakov K.M. Spread of vaccine-derived poliovirus from a paralytic case in immunodeficient child: an insight into natural evolution of oral polio vaccine.//Virology.-2005.-Vol.79(2).-P.1062-1070.
15. Иванова О.Е., Романенкова Н.И., Еремеева Т.П., Розаева Н.Р., Бичурина М.А., Чернявская О.П., Ясинский А.А. Риск развития случаев острого вялого паралича и вакциноассоциированного полиомиелита в закрытых детских коллективах - домах ребёнка и детских лечебных стационарах.//Эпидемиология и вакцинопрофилактика.-2005.-№ 1(20).-C.14-18.
16. Иванова О.Е. Вакциноассоциированный паралитический полиомиелит.//Эпидемиология и вакцинопрофилактика. - 2006.-№5(30).-С.42-48.
17. Иванова О.Е., Еремеева Т.П., Короткова Е.А., Яковенко М.Л., Курибко С.Г., Фёдорова В.Б., Бабкина Г.М., Петина В.С., Воронцова Т.В., Ясинский А.А. Ликвидация полиомиелита в мире: внутрилабораторная контаминация диким полиовирусом в условиях выполнения Программы безопасного лабораторного хранения диких полиовирусов (контейнмента) в Российской Федерации.//Вопросы вирусологии.-2006.-№ 6.-С.43-46.
18. Yakovenko M.L., Cherkasova E.A., Rezapkin G.V., Ivanova O.E., Ivanov A.P., Eremeeva T.P., Baykova O.Y., Chumakov K.M., Agol V.I. Antigenic evolution of vaccine-derived polioviruses: changes in individual epitopes and relative stability of the overall immunological properties.//J of Virology.-2006.-Vol.80(6).-P.2641-2653.
19. Краснопрошина Л.И., Иванова О.Е., Еремеева Т.П., Сходова С.А., Чернявская О.П.. Дефекты клеточного и гуморального иммунитета у детей с вакциноассоциированным паралитическим полиомиелитом.//Журнал микробиологии, эпидемиологии и иммунобиологии.-2006.-№7.-С.47-54.
20. Иванова О.Е. Значение дополнительного надзора за полиовирусом для программы ликвидации полиомиелита.//Эпидемиология и вакцинопрофилактика.-2007.-№ 5.-C.8-15.
21. Иванова О.Е, Еремеева Т.П., Лещинская Е.В., Короткова Е.А., Яковенко М.Л., Чернявская О.П., Черкасова Е.А., Драгунская Е.М., Деконенко Е.П., Мартыненко И.Н., Краснопрошина Л.И., Сорокина М.П. Паралитический полиомиелит в Российской Федерации в 1998-2005 гг.//Журнал микробиологии, эпидемиологии и иммунобиологии.-2007.-№ 5.-C.37-44.
22. Lukashev A.N., Ivanova O.E., Eremeeva T.P., Gmyl L.V. Analysis of echovirus 30 isolates from Russia and new independent states revealing frequent recombination and reemergence of ancient lineages.//J of Clinical Microbiology.-2008.-Vol.46(2).-P.665-670.
23. Лукашев А.Н., Резник В.А., Иванова О.Е., Еремеева Т.П., Каравянская Т.Н., Перескокова М.А., Лебедева Л.А., Лашкевич В.А., Михайлов М.И. Молекулярная эпидемиология вируса ЕСНО 6 – возбудителя вспышки серозного менингита в Хабаровске в 2006 г.//Вопросы вирусологии.-2008.-№ 1.-C.16-21.
24. Баранов А.А., Горелов А.В., Иванова О.Е., Идрисова Р.С., Крамарев С.А., Матвеев В.А., Михайлов М.И.. Намазова Л.С., Платонов А.Е., Подколзин А.Т., Романенко В.В., Семененко Т.А., Таточенко В.К., Харит С.М., Чернышова Л.И., Шамшева О.В., Шаханина И.Л., Шахгильдян И.В. Контроль за инфекциями с преимущественно энтеральной передачей средствами специфической профилактики в Республике Беларусь, Республике Казахстан, Российской Федерации и Украине: современное состояние вопроса.//Эпидемиология и вакцинопрофилактика.-2008.-№ 6(43).-C.3-17.
25. Иванова О.Е., Еремеева Т.П., Лукашев А.Н., Байкова О.Ю., Морозова Н.С., Мустафина А.Н. Наблюдение за циркуляцией неполиомиелитных энтеровирусов в Российской Федерации в 1999-2007 гг.//Медицинская вирусология. Труды ИПВЭ им.М.П.Чумакова РАМН.-2008.-Москва.-Т.XXV.-С.11-22.
26. Yakovenko M.L., Korotkova E.A., Ivanova O.E., Eremeeva T.P., Samoilovich E., Uhova I., Gavrilin G.V., Agol V.I. Evolution of the Sabin vaccine into pathogenic derivates without appreciable changes in antigenic properties: need for improvement of current poliovirus surveillance.//J of Virology.-2009.-Vol.83(7).-P.3402-3406.
27. Иванова О.Е., Еремеева Т.П., Байкова О.Ю., Логиновских Н.В., Чепурко Т.Г., Короткова Е.А., Яковенко М.Л., Мустафина А.Н. Исследование сточных вод в доме ребёнка как подход к надзору за циркуляцией полиовирусов.//Журнал микробиологии, эпидемиологии и иммунобиологии.-2009.-№ 1.-C.12-16.
28. McWilliam L.E.C., Bendig J., Cabrerizo M., Cardosa J., Hyypi T., Ivanova O.E., Kelly A., Kroes A.C., Lukashev A., MacAdam A., McMinn P., Roivainen M., Trallero G., Evans D.J., Simmonds P. Transmission networks and population turnover of echovirus 30.//J of Virology.-2009.-Vol.83(5).-P.2109-2118.

Монография

Онищенко Г.Г., Дроздов С.Г., Лялина Л.В., Бичурина М.А., Грачёв В.П., Иванова О.Е., Ясинский А.А., Романенкова Н.И., Жебрун А.Б. Проблемы ликвидации полиомиелита. -2008.- Санкт-Петербург. - 303 С.

Список сокращений

ВАПП – вакциноассоциированный паралитический полиомиелит

ВОЗ (WHO) – Всемирная Организация Здравоохранения (World Health Organization)

ВТД – внутритиповая дифференциация полиовирусов

ИПВ – инактивированная полиовирусная вакцина

ИФА (ELISA) – иммуноферментный анализ (enzyme linked immunosorbent assay)

НЛ – Национальная референс-лаборатория

НЛС – Национальная лабораторная сеть

НПЭВ – неполиомиелитные энтеровирусы

НТНПЭВ – нетипирующиеся неполиомиелитные энтеровирусы

ОВП - острый вялый паралич

ОПВ – оральная полиовирусная вакцина

ПВ – вирус полиомиелита (полиовирус)

ПЦР (PCR) – полиомеразная цепная реакция

РРЛ – Региональная референс-лаборатория

СНЛ – Суб-национальная референс-лаборатория

VDPV - значительно дивергировавшие от вакцинного предка полиовирусы (vaccine-derived polioviruses)

ЦПЭ (ЦПД) – цитопатический эффект (цитопатическое действие)

ЭВИ – энтеровирусная инфекция