Гибридизация, полиморфизм и филогенетические отношения видов рода rosa l.
на правах рукописи
Шанцер Иван Алексеевич
Гибридизация, полиморфизм и филогенетические отношения видов рода Rosa L.
03.02.01 – Ботаника
Автореферат
диссертации на соискание ученой степени
доктора биологических наук
Москва, 2011 г.
Работа выполнена в Учреждении Российской академии наук
Главный ботанический сад им. Н.В. Цицина РАН
| Научный консультант | доктор биологических наук, профессор Игнатов Михаил Станиславович |
| Официальные оппоненты: | доктор биологических наук, |
| Кочиева Елена Зауровна | |
| доктор биологических наук, | |
| Семихов Владимир Фаресович | |
| доктор биологических наук, | |
| Сытин Андрей Кириллович | |
| Ведущая организация | Московский государственный университет им. М.В. Ломоносова |
Защита состоится "30" июня 2011 г. в 13.00 на заседании диссертационного совета Д 002.028.01 при Учреждении Российской академии наук Главный ботанический сад им. Н.В. Цицина РАН по адресу: 127276, Москва, Ботаническая ул., 4.
Факс: (499) 977-91-72
Тел.: (499) 977-91-36
С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Учреждения Российской академии наук Главный ботанический сад им. Н.В. Цицина РАН
Автореферат разослан "15" апреля 2011 г.
Ученый секретарь
диссертационного совета
доктор биологических наук Ю.К. Виноградова
Общая характеристика работы
Актуальность работы. Род Rosa L. (роза, шиповник) представлен многолетними, преимущественно кустарниковыми растениями, распространенными по всей внетропической части северного полушария. По современным оценкам разных авторов род включает от 190 (Wissemann, 2003) до 400–500 (Хржановский, 1958, Бузунова, 2001) дикорастущих видов. Такой разброс оценок связан с существующими противоречиями в систематике Rosa, которые не были разрешены и с привнесением в нее молекулярно-генетических методов.
Усилиями систематиков разных стран в течение XVIII-XXI вв. было описано более 3000 видов и внутривидовых таксонов шиповников (IPNI, http://www.ipni.org). К объективным причинам, затрудняющим разграничение видов и создание стабильной системы рода Rosa, относятся:
1) слабые морфологические различия между многими видами и наличие внутривидового полиморфизма;
2) отсутствие значительных генетических различий между многими видами, вероятно, связанное с их недавним возникновением;
3) способность многих видов к гибридизации;
4) распространенность полиплоидии, свидетельствующая о сетчатой эволюции во многих группах шиповников;
5) особый тип мейоза и система размножения, получившая название сбалансированной гетерогамии, характерные для крупнейшей секции рода, Caninae (DC.) Ser., свидетельствующие об ее аллополиплоидном происхождении.
К субъективным причинам относится тот факт, что систематикой рода Rosa занималось очень много ученых, описавших огромное количество видов и высказавших множество различных несовпадающих мнений об их родстве.
Таким образом, для разработки системы и филогении рода Rosa необходимо понять, что представляют собой виды шиповников и как их можно объективно разграничивать друг от друга. С другой стороны, необходимо понять, какие признаки, морфологические и молекулярные, и какие методы их анализа могут быть пригодны для установления родства видов и реконструкции филогении всего рода. Так как имеющиеся данные указывают на возникновение многих современных групп шиповников в результате недавней быстрой дивергенции (Wissemann, Ritz, 2005; Joly et al., 2006; Koopman et al., 2009), род Rosa может быть хорошим модельным объектом для изучения процессов видообразования (Crawford, 2010).
Цель и задачи исследования. Целью настоящей работы является установление границ ряда модельных видов, выявление возможных механизмов видообразования и роли межвидовой гибридизации в эволюции рода Rosa, а также установление основных групп родства шиповников и вероятных отношений между ними.
Исходя из этого, задачи диссертации были определены следующим образом:
1) изучить изменчивость различных видов шиповников в природных популяциях с использованием морфологических признаков и молекулярно-генетических маркеров;
2) экспериментально изучить гибридизационные процессы в природных популяциях и оценить их потенциальное значение для поддержания видовых границ и видообразования;
3) определить возможные модели видообразования в роде Rosa;
4) установить группы родства шиповников по молекулярно-генетическим данным;
5) установить филогенетические отношения между основными группами родства.
Научная новизна работы. Впервые на основании исследования природных популяций шиповников европейской части России и Украины с использованием молекулярно-генетических маркеров продемонстрировано существование спонтанной межвидовой гибридизации. Впервые установлено, что такая гибридизация может вести к различным последствиям для контактирующих видов и их гибридов, от разной степени интрогрессии до репродуктивной изоляции. Впервые показано, что Rosa majalis Herrm., так же как и некоторые близкие к ней североамериканские виды секции Cinnamomeae, представляет собой один полиморфный вид, а не комплекс гибридизирующих между собой симпатрических видов. Впервые выявлена гомологическая изменчивость ряда морфологических признаков, охватывающая все секции рода Rosa. Впервые для анализа филогенетических связей видов в роде Rosa применен метод иерархического анализа генеалогий хлоропластных гаплотипов и показана его эффективность для выявления основных групп родства и их филогенетических связей.
Теоретическая и практическая значимость работы. Полученные результаты могут быть использованы для ревизии видовых границ и таксономического состава рода, в пределе – для проведения полной современной таксономической ревизии рода Rosa. Установленные группы родства могут использоваться, в том числе, с целью поиска хозяйственно ценных видов. Результаты исследований в природных популяциях и анализа генеалогий гаплотипов могут использоваться при чтении университетских курсов по теории эволюции, используются автором при чтении курса для магистрантов и аспирантов в ВГПУ. Разработанные методы изучения гибридизационных процессов в природе могут быть применены для изучения видов других таксономических групп (успешно применены при изучении родов Galium, Lotus и Hedysarum).
Апробация работы. Материалы диссертации были представлены в устных и стендовых докладах на совещаниях и конференциях: XI Международном совещании по филогении растений (Москва, 28-31 января 2003 г.); XVII Международном ботаническом конгрессе (Вена, Австрия, июль 2005); Международной научно-практической конференции "Теоретические и прикладные исследования в ботанике и методике преподавания биологии" (Белгород, 21-23 сентября 2005 г.); IX Всероссийском семинаре "Особь и популяция – стратегии жизни" (Башкортостан, Уфа, 2-6 октября 2006 г.); II Международной научно-практической конференции "Актуальные проблемы ботаники и методики преподавания биологии" (Белгород, 24-26 сентября 2007); Всероссийской конференции "Фундаментальные и прикладные проблемы ботаники в начале XXI века" (Петрозаводск, 22-27 сентября 2008 г.); Международной конференции "Systematics 2008" (Геттинген, Германия, 7-11 апреля 2008 г.); Международной научно-практической конференции "Ботанические сады в 21 веке: сохранение биоразнообразия, стратегия развития и инновационные решения" (Белгород, 18-21 мая 2009 г.); 6-м Совещании «Кариология, кариосистематика и молекулярная систематика растений» (Санкт-Петербург, 1-2 декабря 2009 г.); XII Московском совещании по филогении растений (Москва, 2–7 февраля 2010 г.); 2-й Московской международной конференции по проблемам филогенетики и молекулярной эволюции «Молекулярная филогенетика MolPhy-2» (Москва, апрель 2010); конференции «Современные проблемы биологической систематики» (Санкт-Петербург, 18-21 апреля 2011 г.).
Публикации. По материалам диссертации опубликовано 26 работ, в том числе 16 в журналах, рекомендованных ВАК РФ.
Структура и объем диссертации. Основной текст диссертации изложен на 264 страницах и включает введение, 6 глав, заключение, выводы и список литературы, содержащий 312 работ, в том числе 230 – на иностранных языках. В приложения вынесены таблицы, фотографии, рисунки и списки изученных образцов на 38 страницах.
Положения, выносимые на защиту
1) Виды шиповников с нормальным половым процессом являются облигатно перекрестно опыляемыми и самонесовместимыми, морфологически и генетически полиморфными и, как правило, занимают достаточно обширные ареалы.
2) Виды шиповников с половым процессом по типу Caninae являются преимущественно перекрестно опыляемыми, однако способными также и к самоопылению и факультативно апомиктическому развитию плодов. Самоопыление может преобладать в некоторых популяциях, что ведет к уменьшению морфологического и генетического полиморфизма в одних случаях, либо к их резкому возрастанию в других (при межвидовой гибридизации).
3) Шиповники в большинстве случаев достаточно легко вступают в гибридизацию при симпатрических контактах разных видов в природе, однако последствия гибридизации и судьба гибридов могут быть различными. Возможны:
а) интрогрессия генов одного вида в генетический пул другого с образованием в различной степени гибридного потомства хотя бы отчасти промежуточного между родительскими видами по своей морфологии.
б) размножение единичных возникших гибридов путем самоопыления с последующим расщеплением по большинству признаков в последующих поколениях гибридов и резким возрастанием морфологического разнообразия.
в) гибридогенное видообразование.
4) Сетчатая эволюция и неполная сортировка линий делают невозможным традиционный кладистический анализ рода Rosa, независимо от используемого алгоритма и типа маркеров, т.к. дихотомически ветвящиеся древовидные графы неадекватны характеру родственных отношений видов шиповников. Проблема может быть решена путем использования методов построения генеалогий хлоропластных и ядерных гаплотипов и раздельного анализа диплоидов и полиплоидов.
5) Большинство видов Rosa являются молодыми и образуют несколько групп родства, лишь отчасти соответствующих традиционно принимаемому секционному делению рода.
Глава 1. Современное состояние изученности рода Rosa
Систематика рода ведет свое начало от Карла Линнея, который привел в 1м издании Species Plantarum (Linnaeus, 1753) 12 видов роз. Первой системой рода в современном понимании можно считать систему, предложенную О.П. Де Кандолем (De Candolle, 1818). В Prodromus (Seringe, 1825) она получила дальнейшее развитие в обработке Н.Ш. Серинжа и насчитывала 146 видов, разделенных на 4 секции. Видовой состав этих секций еще не вполне соответствовал тому представлению о родстве видов, которое сложилось к концу XIX – началу XX века, но первые камни в его основание были заложены именно тогда. В это же время в систематике шиповников начинает использоваться весь набор морфологических признаков, используемых и ныне. Как результат расширения арсенала используемых признаков, к началу XX в. было описано более 3000 видов и внутривидовых таксонов шиповников и предложено более 10 различных систем их классификации. Подробное и очень критическое рассмотрение этих и ряда других систем рода Rosa содержится в монографии В.Г. Хржановского (1958). Огромный вклад в познание многообразия роз и разработку системы этого рода внес бельгийский родолог Ф. Крепен (F. Crpin). Разработанная им система рода (Crpin, 1869; 1891), фактически, используется до сих пор в переработанном А. Редером (Rehder, 1949) и Ф. Виземанном (Wissemann, 2003) виде.
В нашей стране система Ф. Крепена была в свое время переработана в монографии В.Г. Хржановского (1958), который, однако, несколько иначе понимал родство многих видов и предложил более дробное секционное деление. Новации Хржановского отчасти восприняты в последней обработке восточноевропейских шиповников (Бузунова, 2001). В результате различного понимания числа, объема и родства видов Rosa, таксономические трактовки разных авторов, как прошлого и позапрошлого веков, так и современных, часто оказываются просто не сравнимыми друг с другом (таблица 1).
Исследованиями начала XX века было установлено, что многие виды шиповников являются полиплоидами и, возможно, имеют гибридогенное происхождение. Было установлено, что основное число хромосом в роде Rosa x=7 (Tckholm,1920, 1922; Blackburn, Heslop-Harrison, 1921; Hurst, 1925). Диплоиды, таким образом, имеют 2n=14 хромосом. Полиплоиды от 4x до 10x известны во всех крупных секциях рода (Cinnamomeae, Synstylae, Pimpinellifoliae), тетраплоиды встречаются также в олиготипных восточноазиатских секциях Indicae и Banksianae. Напротив, моно- или олиготипные секции Laevigatae, Bracteatae и подроды Hulthemia, Hesperhodos и Platyrhodon представлены исключительно диплоидами.
Таблица 1. Классификация рода Rosa по Ф. Виземанну и К. Ритц (Wissemann, 2003; Wissemann, Ritz, 2005, 2007) и В.Г. Хржановскому (1958) и И.О. Бузуновой (2001). В скобках приведено число признаваемых для каждой секции видов.
| Подразделения рода Rosa по Виземанну | Подразделения рода Rosa по Хржановскому и Бузуновой |
| I. подрод Hulthemia (1) | I. род Hulthemia (1) |
| II. подрод Rosa (~ 200) | II. род Rosa (~300-500) |
| 1. секция Cinnamomeae (включая Carolinae) (~ 90) | 1. секция Cinnamomeae (>60) 2. секция Carolinae (~5) 3. секция Gymnocarpae (~2) 4. секция Luecanthae (~10) 5. секция Rugosae (~1-3) |
| 2. секция Caninae (~60) | 6. секция Caninae (>60) |
| 3. секция Synstylae (~ 35) | 7. секция Synstylae (> 15) 8. секция Setigerae (1) |
| 4. секция Pimpinellifoliae (~ 15) | 9. секция Pimpinellifoliae (~10) 10. секция Luteae (~4) 11. секция Sericeae (~1) 12. секция Gymnostomae (~1) |
| 5. секция Banksianae (2) | 13. секция Banksianae (~5) |
| 6. секция Bracteatae (2) | 14. секция Bracteatae (2?) |
| 7. секция Indicae (Chinenses) (2) | 15. секция Chinenses (Indicae) (~3) 16. секция Giganteae (~2) |
| 8. секция Laevigatae (1) | 17. секция Laevigatae (1?) |
| 9. секция Rosa (Gallicanae) (1) | 18. секция Gallicanae (~10) |
| III. подрод Platyrhodon (1) | III. род Juzepczukia (3) |
| IV. подрод Hesperhodos (2) | IV. род Hesperhodos (2?) |
Особняком среди других шиповников стоит секция Caninae, представленная исключительно полиплоидами, в том числе и нечетными: 4x, 5x, 6x, 7x и 8x. Большинство видов секции являются пентаплоидами с 2n=5x=35. Исследования мейоза в материнских клетках микро- и мегаспор показали, что отдельные хромосомные наборы ведут себя в мейозе различным образом. Два набора у всех без исключения исследованных видов оказываются гомологичными и их хромосомы нормально конъюгируют в первой профазе мейоза. Остальные наборы (два у тетраплоидов, три у пентаплоидов и т.д.) содержат по 7 хромосом, не имеющих гомологов и не конъюгирующих с другими хромосомами, образуя униваленты. Судьба этих унивалентов различна в ходе микро- и мегаспорогенеза. В микроспорогенезе униваленты большей частью теряются в ходе делений мейоза и жизнеспособная пыльца, как правило, оказывается гаплоидной. В мегаспорогенезе, напротив, все униваленты попадают в яйцеклетку, вместе с одним из наборов бивалентов. Столь аномальный характер поведения хромосом в мейозе привел первых исследователей к убеждению в том, что для всех видов Rosa секции Caninae присущ апомиктический способ размножения (Tckholm,1920, 1922; Blackburn & Heslop-Harrison, 1921; Heslop-Harrison & Blackburn, 1927). Однако более поздние исследования (Gustafsson, 1944; Fagerlind, 1940, 1951) по изучению систем размножения у видов секции Caninae привели исследователей к прямо противоположному выводу о том, что для успешного завязывания семян у шиповников секции Caninae необходимо перекрестное опыление. При этом оказалось, что исходный несбалансированный набор хромосом восстанавливается при оплодотворении редуцированных зародышевых мешков гаплоидной пыльцой. Такая система размножения была названа Ф. Фагерлиндом (Fagerlind, 1940) сбалансированной гетерогамией.
Более поздние гибридизационные эксперименты (Kroon, Zeilinga, 1974; Wissemann, Hellwig, 1997; MacPhail, Kevan, 2007), а также исследования гибридного потомства от скрещивания видов секции Caninae с помощью RAPD (Werlemark, Uggla, Nybom, 1999; Werlemark, 2000; Werlemark, Nybom, 2001) и микросателлитных маркеров (Nybom & al., 2004; Nybom & al., 2006) показали, что некоторое, впрочем, всегда очень небольшое число нередуцированных яйцеклеток все же может развиваться и апомиктически.
Особенности мейоза у представителей секции Caninae ведут к преимущественно матроклинному наследованию большинства морфологических признаков при межвидовых скрещиваниях (Миндлина, 1947; Jiinsk, 1976b; Werlemark, 1999; Werlemark, Nybom, 2001, 2005).
Гипотезы о филогении рода Rosa. Одна из первых гипотез о филогении рода Rosa была предложена английским генетиком Ч. Херстом (Hurst, 1925). Согласно Херсту, первичной для всего рода была вымершая третичная декаплоидная роза, обитавшая в Арктической области, непосредственным потомком которой является современная R. acicularis Lindl., у которой известны тетра-, гекса- и октоплоидные цитотипы. Все остальные виды шиповников, по Херсту, произошли от этого гипотетического арктического вида в процессе расселения к югу и последовательной потери "септетов" хромосом. Таким образом, наиболее молодыми и филогенетически продвинутыми видами, согласно этой гипотезе, являются диплоиды, особенно, распространенные в субтропических регионах.
Гипотеза Херста была крайне критически воспринята уже сразу после своего появления (Cockerell, 1926), как крайне формалистичная и слабо подкрепленная фактическим материалом. Э. Эрлансон (Erlanson, 1938), опираясь на свои собственные данные по розам Северной Америки и работы Ж. Буланже по европейским и азиатским розам выдвинула альтернативную, прямо противоположную гипотезу. Согласно ей, современные виды шиповников возникли более или менее полифилетично от нескольких групп примитивных диплоидов, в процессе расширения их ареалов к северу, что в плейстоценовое время сопровождалось гибридизацией и возникновением полиплоидов.
Совершенно оригинальную филогенетическую гипотезу выдвинул В.Г. Хржановский (1958). В пределах рода, согласно Хржановскому, существует три независимые линии эволюции красно-, бело- и желтоцветковых роз, происходящих от субтропических вечнозеленых роз-лиан, которые в системе Хржановского рассматриваются в ранге подродов.
Использование для реконструкции филогении рода Rosa кладистических методов анализа и молекулярно-генетических данных до настоящего времени не дало полностью удовлетворительных результатов. В реконструкциях с использованием RAPD маркеров (Millan et. al., 1996; Atienza & al., 2005) отдельные образцы в большинстве случаев группировались в соответствии с определениями, сделанными на основании морфологии, однако выше видового уровня группировка образцов уже мало напоминала традиционно принимаемые секции. Использование AFLP маркеров (Koopman & al., 2008) с оценкой филогении методами максимальной экономии и Байеса дало сходные по общей топологии, но различавшиеся в деталях деревья, на которых ни одна из секций, кроме секции Caninae, не образовала монофилетической группы.
Не дало лучшего результата и использование для реконструкции филогении Rosa последовательностей ДНК из различных участков генома, как ядерных (ITS), так и хлоропластных (гена matK, интрона гена trnL, межгенных спейсеров trnL-trnF, psbA-trnH и atpB-rbcL). Полученные в этих работах (Matsumoto et al., 1998, 2000, 2001; Wu et al., 2000; Wissemann, Ritz, 2005; Bruneau et al., 2007) деревья обладали плохим разрешением и низкой бутстреп поддержкой узлов. Ни одна из секций рода не образовала на этих деревьях монофилетической клады, за исключением секции Caninae по данным последовательностей ITS1. Образцы видов, представленных в анализе более чем 1 образцом, во многих случаях не группировались вместе, а попадали в разные клады. Основной причиной тому большинство авторов признает многочисленные гибридизационные события в ходе предшествовавшей эволюции рода Rosa.
В целом, молекулярно-филогенетические исследования рода Rosa, выполненные в последние 10-12 лет разными исследовательскими группами на разном материале и по разным системам маркеров, позволяют прийти к следующим двум выводам. Во-первых, существующая система рода Rosa, основанная на морфологических признаках, не отражает филогенетических связей и родства видов и требует пересмотра. Во-вторых, используемые кладистические алгоритмы анализа молекулярных данных, априори нацеленные на построение дихотомически ветвящихся деревьев, не адекватны сложным сетчатым филогенетическим отношениям и модусам эволюции в роде Rosa, так как не в состоянии учесть гибридизационные события.
Филогеография и изучение природных популяций шиповников. Единственная работа по филогеографии шиповников (Fr et al., 2007) посвящена исследованию центрально- и южноевропейских популяций R. pendulina L. по данным изменчивости хлоропластного региона trnL-trnF. Авторам удалось установить, что расширение ареала R. pendulina в послеледниковое время происходило независимо из двух изолированных друг от друга рефугиумов на юге Альп и Карпат соответственно.
Работы по изучению географической и внутрипопуляционной изменчивости шиповников немногочисленны. Так, работы У. Льюиса по розам Северной Америки (Lewis, 1958a, 1958b, 1959, 1962, 1965) позволили свести в синонимы множество ранее описанных видов и установить природу многих форм, считавшихся гибридами. В дальнейшем, изучение больших популяционных выборок с использованием молекулярных (RAPD, ISSR, AFLP) маркеров и большого числа морфологических признаков (Bruneau et al., 2005; Joly, Bruneau, 2007) позволило убедительно показать, что из 23 видов шиповников, приводившихся А. Ридбергом (Rydberg, 1920) для восточной части Северной Америки реально существуют лишь 4 диплоидных вида: R. foliolosa Nutt., R. palustris Marsh., R. nitida Willd. и R. blanda Ait. (включая R. woodsii Lindl.), и 3 полиплоидных: R. carolina Willd., R. virginiana Herrm. и R. arkansana I.M. Coult.
В Европе внутрипопуляционная и географическая изменчивость была изучена у нескольких видов шиповников секции Caninae (Jrgens et al, 2007; Zimmermann et al., 2010). В работах шведских исследователей (Nybom et al., 1996, 1997) наличие дифференциации по комплексу количественных морфологических признаков было показано для популяций R. canina L., R. dumalis Bechst., R. rubiginosa L., R. sherardii Davies и R. villosa L. на юге Скандинавии. При этом никакой географической дифференциации видовых популяций по морфометрическим признакам на этой территории выявлено не было. Аналогичное исследование шиповников Фландрии (De Cock et al., 2007, 2008), напротив, показало лишь слабую дифференциацию видов секции Caninae по комплексу из 17 "диагностических" признаков. При этом было показано наличие некоторой географической дифференциации по AFLP маркерам, причем образцы из одного местонахождения оказались генетически ближе друг к другу, чем к образцам тех же морфологических видов из удаленных местонахождений. Авторы интерпретировали такой результат, как следствие интрогрессивной гибридизации между симпатрически произрастающими видами.
Глава 2. Концепции вида и их применимость в роде Rosa
Дискуссии о природе вида и концепции вида начались еще в конце XIX века и, временами угасая, не утихают до сих пор (Концепции вида..., 1983; The units of evolution…, 1992; Species concepts…, 2000; Pigliucci, 2003; Вид и видообразование…, 2009). В главе рассматриваются лишь те концепции вида, которые в той или иной мере использовались при изучении рода Rosa, с целью оценить их приложимость к этой группе. Последовательно рассматриваются работы авторов, разрабатывавших систематику рода Rosa с позиций типологической, комаровской, биологической и филогенетической концепций вида и их связь с "видодробительским" и "укрупнительским" направлениями в понимании объема вида у шиповников.
Глава 3. Материал и методы исследования
Изученные материалы. Материал для настоящего исследования собирался автором с 1999 по 2010 г. и включает в себя следующие коллекции:
1) собственные гербарные сборы в природных популяциях шиповников, проводившиеся в европейской части России, на Украине, в Австрии, Германии и Таиланде с 1999 по 2010 гг. и хранящиеся в Гербарии ГБС РАН (MHA
2) гербарные коллекции учреждений Москвы (MHA, MW), Санкт-Петербурга (LE), Киева (KW), Львова (LWS, LWKS), Донецка (Гербарий Донецкого ботанического сада НАН Украины), Волгограда (Гербарий ВГПУ), Лондона (LINN), Берлина (B), Вены (W, WU) и Геттингена (GOET), в которых среди прочего было изучено и большое число типовых образцов;
3) коллекция ДНК шиповников, выделенной из сухих листьев собранных автором или гербарных образцов, включающая более 600 образцов ДНК;
4) данные по последовательностям ДНК из международной базы данных GenBank (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/genbank/).
Изучение систем размножения и гибридизационные эксперименты в природе. Опыты по изучению систем размножения и гибридизационные эксперименты закладывались в природе в 2005, 2006, 2007 и 2008 гг. в популяциях шиповников Московской, Волгоградской и Белгородской областей.
Морфологические признаки. Морфологические признаки растений изучались визуально и под бинокуляром МБС-10, информация о таких признаках, как цвет лепестков отмечалась непосредственно в поле и фиксировалась с помощью цифрового фотоаппарата. Для анализа отбирались, преимущественно, признаки, традиционно используемые для диагностики видов шиповников в таксономических работах и определительных ключах.
Выделение ДНК. ДНК выделяли из листьев, высушенных в силикагеле или отобранных с гербарных образцов СТАВ методом (Doyle, Doyle, 1987) или с использованием набора NucleoSpin Plant (Macherey-Nagel, Германия).
Использованные маркеры и параметры полимеразной цепной реакции (ПЦР). Для исследования внутривидового генетического полиморфизма и процессов гибридизации в симпатрических популяциях шиповников использовались межмикросателлитные участки генома (Inter Simple Sequence Repeats, ISSR), или ISSR маркеры. Для анализа филогенетических отношений видов были использованы последовательности ядерного внутреннего транскрибируемого спейсера рибосомальной ДНК (ITS) и межгенные спейсеры хлоропластной ДНК trnV-ndhC и trnL-trnF. ПЦР проводили в амплификаторе MJ Research PTC-220 DNA Engine Dyad (Biorad Ltd., США).
Секвенирование ДНК проводили с помощью набора реактивов ABI PRISM® BigDye™ Terminator v. 3.1 с последующим анализом продуктов реакции на автоматическом секвенаторе ДНК ABI PRISM 3730 Applied Biosystems на базе ЦКП «Геном», а также на базе ПКЗАО "Синтол" и кабинета молекулярных методов анализа ИПЭЭ РАН.
Статистическая обработка результатов проводилась с использованием компьютерных программ Statistica 6.0 for Windows (StatSoft, Inc., 2001), PAST (Hammer et al., 2001, 2010), Structure 2.2 (Pritchard, Stephens, Donnelly, 2000; Falush, et al., 2007), NewHybrids (Anderson, Thompson, 2002), BioEdit v7.0.5 (Hall, 1999), SplitsTree4 (Huson, 1998; Huson, Bryant, 2006) и TCS (Clement et al., 2000). Для анализа полученных генеалогий гаплотипов использовался метод иерархического анализа клад (Nested Clade Analysis), разработанный А. Темплтоном с соавторами (Templeton et al., 1987; Templeton, Sing, 1993).
Глава 4. Вид у шиповников с нормальным половым процессом.
Морфологическая изменчивость и системы размножения у R. majalis. Rosa majalis s.l. представляет собой морфологически изменчивый вид, распространенный по всей Восточной Европе и Западной Сибири. Экологически этот вид связан с долинами небольших равнинных рек, где на аллювиальных песчаных почвах приречных террас образует обширные по площади локальные популяции. Изменчивости у R. majalis подвержены как количественные, так и качественные признаки, такие как наличие простых и железистых волосков на поверхности листьев, цветоножек и чашелистиков. Существует две основных интерпретации этого морфологического разнообразия. Согласно одной точке зрения, которой придерживается большинство отечественных специалистов по систематике Rosa (Сукачев, 1927; Юзепчук, 1941; Дубовик, 1987; Хржановский, 1958; Бузунова, 2001; Цвелёв, 1988, 2000; Бузунова, Камелин, 2004), эту изменчивость следует интерпретировать таксономически и различать растения, имеющие разные сочетания перечисленных выше признаков, в качестве самостоятельных видов: R. majalis s. str., R. glabrifolia C.A. Mey., R. pratorum Sukacz. и R. gorinkensis Fisch. ex Spreng. (= R. gorenkensis Bess. nom. nud.). Согласно другой точке зрения, идущей от монографии К.А. Мейера (Meyer, 1847; Kltersky, 1968; Henker, 2000; Шанцер, Клинкова, 2000), вся эта изменчивость является внутривидовой, и разновидности R. majalis, различающиеся по опушению листьев и форме плодов, не могут рассматриваться в качестве самостоятельных видов.
Способность R. majalis завязывать плоды в результате самоопыления была многократно исследована экспериментально в условиях ботанических садов и питомников (Fagerlind, 1948; Jiinsk, 1975, 1976) и всегда с отрицательным результатом. Эксперименты по изоляции цветков в природных популяциях этого вида (Шанцер, 2006; Schanzer, Vagina, 2007) также ни в одном случае не дали завязывания плодов, что говорит о ее полной самонесовместимости.
Исследование внутрипопуляционной изменчивости морфологических признаков R. majalis s.l. на территории Восточной Европы позволило установить (Шанцер, Клинкова, 2000), что в пределах одной локальной популяции всегда можно встретить несколько вариантов сочетания простого и железистого опушения листочков, соответствующих всем четырем узко понимаемым видам. При этом никакой корреляции между признаком формы плодов, часто фигурирующим в ключах, как дополнительный к диагностическим признакам опушения, и признаками простого и железистого опушения листьев установить не удалось.
Анализ географической структуры изменчивости по признакам простого и железистого опушения различных частей растений также не выявил какой-либо закономерности в их распространении. Это опровергает распространенные в литературе (Хржановский, 1958; Бузунова, 2001) сведения о приуроченности лишенных опушения форм (R. glabrifolia) к восточной, а железисто опушенных (R. gorinkensis) – к южной и западной частям ареала R. majalis s.l.
Специальный сравнительный анализ изменчивости морфологических признаков был проведен нами для трех географически удаленных друг от друга локальных популяций R. majalis s.l. (Шанцер, Войлокова, 2008) в Московской (долина р. Клязьмы, популяция M) и Волгоградской (долины р. Еруслана и Иловли, популяции S и V) областях.
Результаты анализа выборки по этим морфологическим признакам методом главных координат, представленные на рис. 1А, лишь на первый взгляд подтверждают точку зрения о том, что R. majalis s.str., R. gorinkensis и R. glabrifolia могут рассматриваться, как самостоятельные виды. Исключение из анализа признаков опушения листьев простыми и железистыми волосками делает их неотличимыми друг от друга (рис. 1Б). При этом такие, нередко фигурирующие в ключах признаки, как острота пильчатости края листа, длина и наличие железистого опушения на цветоножках, форма плода и размеры листьев не позволяют даже частично дифференцировать эти виды.
Таким образом, по характеру изменчивости морфологических признаков R. majalis вполне соответствует представлениям о "типичном" перекрестно опыляемом полиморфном виде. Однако сторонники "мелкого" понимания вида рассматривают R. majalis s. str., R. glabrifolia и R. gorinkensis как симпатрические виды, промежуточные формы между которыми являются межвидовыми гибридами. При этом вся структура группы в целом, видимо, понимается ими как "грегарный гетерогамный комплекс" (Камелин, 2004, 2009). Гибридизация привлекается, в том числе, и к объяснению самого происхождения этих видов. Так, согласно Н.Н. Цвелеву (1988, 2000) и И.О. Бузуновой с соавторами (2002), R. gorinkensis возникла в результате интрогрессивной гибридизации между R. majalis s. str. и одним из видов подсекции Vestitae секции Caninae, вероятно, с наиболее широко распространенной R. villosa. Об этом, согласно этим авторам, свидетельствует присутствие у R. gorinkensis мелких желтоватых железок на нижней поверхности листьев.
А Б
Рис. 1. Результаты анализа методом главных координат с использованием дистанции Говера выборок из 3 популяций R. majalis s.l. по 25 морфологическим признакам. Символы на диаграмме разброса соответствуют видовой принадлежности образцов.
Обозначения: черные точки – R. majalis s.str.; ромбы – R. gorinkensis; белые квадраты – R. glabrifolia; черные квадраты – R. pratorum; треугольник – R. cinnamomea L. var. pseudoalpina C.A. Mey.
Для проверки этих двух гипотез те же образцы, что были использованы для морфологического анализа, были изучены в отношении полиморфизма ISSR маркеров (Шанцер, Войлокова, 2008). Для образцов R. majalis s.l. из этих трех популяций было получено 175 ISSR маркеров. Результаты анализа матрицы присутствия/отсутствия ампликонов одинаковой длины представлены на рис. 2. Из диаграммы разброса на рис. 2А видно, что все три популяции R. majalis s.l. разделяются достаточно хорошо. Различение же отдельных видов в группе R. majalis s.l. по результатам ISSR маркирования, напротив, оказывается невозможным: все узко понимаемые виды оказываются практически полностью в пределах изменчивости узко же понимаемой R. majalis (рис. 2Б).
Этот результат, характеризующий различия между изучаемыми растениями по структуре их генома, полностью подтверждает результаты анализа полиморфизма морфологических признаков однозначно свидетельствует в пользу того, что R. majalis представляет собой единый полиморфный вид, изменчивый в отношении характера и степени опушенности листьев отдельных его представителей.
Как уже упоминалось выше, в отечественной литературе распространено мнение, что R. gorinkensis является продуктом интерогрессивной гибридизации между R. majalis и R. villosa (Цвелёв, 1988, 2000; Бузунова и др, 2002).
Анализ последовательностей ITS1, секвенированных из 61 образца R. majalis s.l. показал (рис. 12), что большинство исследованных образцов R. majalis,
А Б
Рис. 2. Результаты анализа методом главных координат с использованием дистанции Жаккара выборок из 3 популяций R. majalis s.l. по 175 ISSR маркерам. Символы на диаграмме разброса соответствуют (А) популяционной принадлежности образцов: черные точки – популяция M; белые квадраты – популяция V; черные квадраты – популяция S; и (Б) – видовой принадлежности образцов (обозначения см. рис. 1).
R. glabrifolia, R. pratorum и R. gorinkensis обладают одним и тем же гаплотипом I1, что говорит об их ближайшем родстве. Данные по генеалогии ITS1 положительно исключают возможность происхождения R. gorinkensis от гибридизации с видом секции Caninae из родства R. villosa. Гаплотипы R. villosa и R. mollis оказываются в нескольких разных кладах, что вполне естественно, учитывая гибридогенное происхождение секции и бипарентальное наследование этих последовательностей. Более того, два гаплотипа, характерных для R. mollis, являются производными от гаплотипа I1, которым обладает большинство исследованных образцов R. majalis s.l. Это свидетельствует не об участии R. mollis в образовании каких-либо видов из родства R. majalis, а, напротив, об участии видов секции Cinnamomeae из этого родства в происхождении R. mollis. В противном случае гаплотипы, общие с какими-либо видами секции Caninae, наблюдались бы у R. gorinkensis, однако этого выявлено не было.
Изменчивость у североамериканских диплоидных видов секции Cinnamomeae. В разделе рассмотрены литературные данные (Lewis, 1962; Lewis, Ertter, 2007; Bruneau et al., 2005) по морфологической и генетической (по RAPD, ISSR и AFLP маркерам) изменчивости широко распространенных и полиморфных североамериканских диплоидов – R. blanda и R. woodsii. Показано, что множество ранее описанных видов (R. subblanda Rydb., R. williamsii Fern., R. johannensis Fern. и R. rousseauiorum Boivin. и др.) являются лишь формами их изменчивости. Полученные указанными авторами результаты сходны с описанными выше нашими данными по изменчивости ISSR маркеров у R. majalis. В обоих случаях выделение "мелких" видов-сегрегатов не находит подтверждения, однако выявляется географическая дифференциация популяций.
Межвидовая гибридизация у диплоидов и полиплоидов. В упомянутых выше исследованиях не было обнаружено случаев современной спонтанной гибридизации между североамериканскими диплоидными видами секции Cinnamomeae. Единственное указание на возможность такой гибридизации было выявлено при анализе гаплотипов гена GADPH (Joly & al., 2006): у одного из образцов R. nitida был обнаружен аллель, характерный для R. blanda. Таким образом, несмотря на то, что существуют веские свидетельства происхождения тетраплоидной R. carolina в результате гибридизации между диплоидными R. blanda и R. palustris, ничто не указывает на то, что диплоиды часто гибридизируют между собой в природе. Сказанное не относится, однако, к близкородственным R. blanda и R. woodsii, гибридизация между которыми активно происходит в области перекрывания их ареалов.
Полиплоидные шиповники секции Cinnamomeae и гомологические ряды изменчивости в роде Rosa. Кроме диплоидов, к секции традиционно относится много полиплоидных, преимущественно тетраплоидных и гексаплоидных, видов. Данные, полученные методом проточной цитометрии (измерение количества ДНК в ядрах клеток) для ряда видов подтвердили наличие нескольких цитотипов (Roberts et al., 2009). Так, у R. acicularis были обнаружены цитотипы 2х, 3х, 4х, 6х, 7х и 8х; у R. davurica – 4х и 6х; у R. beggeriana и R. majalis – 2х и 6х. Вполне вероятно, что такая цитотипическая изменчивость может быть связана как с нарушениями мейоза при автополиплоидизации, так и с межвидовой гибридизацией. Последняя выявлена молекулярно-генетическими методами между всеми североамериканскими полиплоидами секции Cinnamomeae в областях перекрывания их ареалов (Joly et al., 2006; Joly, Bruneau, 2006; Joly, Bruneau, 2007).
Анализ литературных данных по изменчивости морфологических признаков североамериканских полиплоидных видов секции Cinnamomeae (Robertson, 1974; Lewis, Ertter, 2007) и моих собственных по циркумбореальной R. acicularis и европейской R. pendulina, показывает, что изменчивость эта крайне сходна с таковой у диплоидной R. majalis. Результаты сравнительного анализа изменчивости признаков опушения листа простыми и железистыми волосками у диплоидной R. majalis и полиплоидных R. pendulina и R. acicularis (Schanzer, Klinkova, 2005) представлены на рис. 3 по данным изучения 580 гербарных образцов (370, 78 и 132 образцов каждого вида соответственно). Как видно из круговых диаграмм, частоты встречаемости растений с голыми, волосистыми по жилкам и по всей поверхности листьями у R. majalis и R. acicularis очень близки, но сильно отличаются от таковых у R. pendulina. Если у первых двух видов преобладают растения с листьями, опушенными по всей поверхности, то у последнего чаще опушены только жилки листьев. Однако, хотя и с различной частотой, у всех трех видов встречаются все три варианта опушения. Сходным образом варьирует и железистое опушение листьев.
Подобная изменчивость наблюдается и у других видов рода, в том числе и из других секций. В одних случаях она таксономически описана, как в паре R. platyacantha Schrenk (листья без железок) – R. kokanica (Regel) Regel ex Juz. (листья с железками) из секции Pimpinellifoliae, в других – нет. Так, разновидности с голыми или волосистыми по жилкам или всей поверхности листьями встречаются у R. helenae Rehd. et Wils., R. henryi Boulenger, R. luciae Franchet et Rochebrune из секции Synstylae, R. banksiae Ait. и R. cymosa Tratt. из секции Banksianae.
А Б
Рис. 3. Соотношение разных морфотипов по опушению листовой пластинки в популяциях R. acicularis, R. pendulina и R. majalis.
А. Простое опушение: 1 – голые; 2 – опушенные только по жилкам; 3 – густо опушенные по поверхности.
Б. Железистое опушение: 1 – отсутствует; 2 – только по жилкам; 3 – по всей нижней поверхности листовой пластинки.
Из приведенных выше данных следует, что виды у перекрестно опыляемых шиповников с нормальной бипарентальной системой размножения во всех сколько-нибудь детально изученных случаях морфологически и генетически изменчивы. Гомологический характер изменчивости морфологических признаков лишает практику таксономически "узкого" понимания видов в роде Rosa каких-либо биологических оснований.
Глава 5. Вид у гетерогамных шиповников секции Caninae
Современное понимание границ видов в русской и западноевропейской школах. В разделе кратко рассмотрены особенности понимания объема вида в секции Caninae в отечественной и западноевропейской систематике.
Системы размножения и наследование признаков в секции Caninae. Экспериментальные исследования, подробнее рассмотренные в главе 1, показали, что шиповники секции Caninae не являются облигатными апомиктами, а размножаются половым путем. Преимущественно матроклинное наследование признаков у них связано с особой системой размножения – сбалансированной гетерогамией, обеспечивающей, в том числе, и поддержание нечетной полиплоидии. Несмотря на самосовместимость и наличие факультативного апомиксиса, большая часть плодов у них завязывается в результате перекрестного опыления. В разделе рассмотрены результаты экспериментального изучения систем размножения, проведенных в условиях природных популяций шиповников секции Caninae на территории Волгоградской, Белгородской, Луганской областей и Крыма (Schanzer, Vagina, 2007). Полученные результаты свидетельствуют о том, что факультативный апомиксис, наблюдавшийся рядом исследователей в экспериментах в условиях культуры, присутствует и в природных популяциях различных видов секции Caninae. Однако число орешков завязывающихся апомиктически (и далеко не у всех растений) всегда очень невелико. Большее их число может завязаться в результате самоопыления, однако и это значение достоверно и существенно ниже числа орешков, завязывающихся при свободном и ксеногамном опылении.
Структура локальных популяций. Для того чтобы установить, насколько морфологическая изменчивость в популяциях видов секции Caninae связана именно с гибридизацией, нами был исследован ряд симпатрических популяций шиповников из девяти местонахождений в разных частях европейской части России и Украины. По результатам этих исследований удалось установить несколько различных типов взаимодействия видов при симпатрическом произрастании.
Репродуктивная изоляция. Были исследованы симпатрические популяции R. rubiginosa и R. caesia Smith в пологой степной балке близ деревни Александровка Курской области (Шабанова, 2008). Выборка состояла из 22 образцов R. rubiginosa и 16 образцов R. caesia, отобранных случайным образом с отдельно стоящих кустов шиповника. Анализ изменчивости 5 количественных и 15 качественных признаков этих образцов методом главных координат показал, что выборка распадается на две группы без перекрывания (рис. 4), в полном соответствии со сделанными таксономическими определениями. Для этой выборки с помощью шести праймеров были амплифицированы 47 ISSR маркеров. Три маркера оказались диагностическими и 1 характерным для R. rubiginosa. Для R. caesia было выявлено 2 диагностических и 7 характерных маркеров. Ординация матрицы из 47 маркеров и 38 образцов методом главных координат показала полное разделение исследуемых образцов на две неперекрывающиеся группы.
Следует отметить, что, если R. rubiginosa представляет собой легко распознаваемый вид, отличающийся стабильным комплексом морфологических признаков, распространенный от Атлантики до Волги, то природа R. caesia, напротив, совершенно неясна. Образцы из изученной популяции по комплексу морфологических признаков соответствуют R. caesia, хотя у некоторых на нижней стороне листьев присутствуют мелкие железки. Такие образцы при формальном определении по ключу (Бузунова, 2001) определяются, как R. subpomifera Chrshan., хотя по общему габитусу эти растения совершенно не походят на низкорослую R. subpomifera, описанную В.Г. Хржановским с юго-востока Украины. Как будет ясно из дальнейшего изложения, растения морфологически соответствующие R. caesia, могут также происходить в результате гибридизации R. canina x R. majalis. Поэтому, несмотря на то, что изученная популяция выглядит вполне морфологически и генетически стабильной, происхождение ее и механизмы этой стабилизации остаются неясными. Однако, независимо от этого, в настоящий момент обе популяции ведут себя, как два вида, растущие симпатрично в одном и том же местообитании, будучи полностью репродуктивно изолированными друг от друга.
А Б
Рис. 4. Результаты анализа выборки из симпатрических популяций R. caesia и R. rubiginosa методом главных координат (PCoA). Темные кружки – R. caesia; светлые кружки – R. rubiginosa. А – анализ морфологических признаков, дистанция Говера. Б – анализ ISSR маркеров, дистанция Жаккара.
Гибридизация с репродуктивной изоляцией гибридов. В ходе полевых исследований в заповеднике "Хомутовская степь" (Новоазовский район Донецкой области Украины) нами был собран материал по нескольким видам шиповников. Общий объем выборки составил 49 образцов, 47 из которых были изучены молекулярно-генетическими методами. Кроме этого, в Гербариях БИН им. В.Л. Комарова (LE) и ИБ им. Н.Г. Холодного (KW) нами были изучены типовые образцы всех перечисленных выше видов, а также ряд образцов, собранных в "Хомутовской степи" другими коллекторами и определенных О.Н. Дубовик.
Шиповники заповедника "Хомутовская степь" являются классическим объектом исследования советской родологии: здесь работали В.Г. Хржановский, О.Н. Дубовик, В.М. Остапко и многие другие исследователи этого рода. Всего для небольшой по площади территории заповедника В.Н. Хржановским (1958) приводилось 11 видов и два межвидовых гибрида, большая часть которых были оттуда же и описаны. Девять из них относятся к секции Caninae DC. (R. canina L., R. kalmiussica Chrshan. et Laseb., R. litvinovii Chrshan., R. schmalhauseniana Chrshan. var. stepposa Chrshan., R. schmalhauseniana Chrshan. var. leiopedicellata Chrshan., R. subpomifera, R. bordzilowskii Chrshan., R. fedoseevii Chrshan., R. chomutoviensis Chrshan. et Laseb., R. psammophila Chrshan.), а два – к секции Rosa (R. grossheimii Chrshan. и R. subpygmaea Chrshan.). О.Н. Дубовик из заповедника были позднее (Дубовик, 1966) описаны еще 4 вида. В обработке И.О. Бузуновой (2001) для "Флоры Восточной Европы" часть этих названий сведена в синонимы более широко трактуемых видов, часть – признана за самостоятельные таксоны. Согласно трактовке И.О. Бузуновой, на территории заповедника встречаются 8 видов секции Caninae и 2 секции Rosa против 16 видов секции Caninae в соответствии со взглядами украинских ботаников. Проведенное нами изучение шиповников "Хомутовской степи" с позиций популяционного и молекулярно-генетического подходов (Шанцер и др., 2011) представляет собой попытку критического анализа традиционно существующих представлений о видовом богатстве шиповников заповедника и юго-востока Украины в целом.
В морфологический анализ были включены количественные и качественные признаки, традиционно используемые для диагностики входящих в состав выборки видов Rosa. По отобранным таким образом 6 количественным и 9 качественным признакам выборка была проанализирована методом кластерного (UPGMA) анализа. В состав выборки были включены также типовые образцы соответствующих видов, изученные в Гербариях LE и KW. На полученной дендрограмме (рис. 5) все образцы R. rubiginosa и R. bordzilowskii образовали один базальный кластер (RU) вместе с голотипом R. bordzilowskii.
Рис. 5. Дендрограмма сходства 67 образцов (включая 20 типовых) по 15 морфологическим признакам: кластерный анализ методом UPGMA, мера сходства Говера.
Остальные образцы образовали сестринский по отношению к нему кластер, разделенный на 7 иерархически соподчиненных кластеров следующего состава: 1) R. grossheimii и R. talijevii Dubovik, включая голо-, изо- и паратипы обоих видов, за исключением одного из паратипов R. grossheimii; 2) образец R. subpomifera и голотип этого вида; 3) R. krynkensis Ostapko; 4) R. schalhauseniana и R. tesquicola Dubovik, включая голо- и изотипы обоих видов, а также изотип R. krynkensis; 5) R. schistosa Dubovik, включая голо- и изотип, все, кроме двух, образцы, определенные, как R. ucrainica Chrshan. и один из образцов, определенный, как R. canina; 6) два образца R. ucrainica, все R. subpygmaea, голо- и изотипы обоих видов, а также один из паратипов R. grossheimii; 7) R. chomutoviensis, включая голотип, и второй образец, определенный, как R. canina. Полученный результат подтвердил правильность определения большинства образцов. Вместе с тем, бутстреп анализ показал крайне низкую поддержку всех кластеров.
Анализ секвенированных последовательностей межгенного спейсера trnV-ndhC выявил 4 гаплотипа, которым были даны буквенные обозначения: гаплотип A; гаплотип B, отличавшийся от него заменами T/G и G/T в 218 и 292 позициях выравнивания соответственно; гаплотип C, отличавшися от A помимо этих двух замен еще и заменой A/C в 103 позиции; и гаплотип D, отличавшийся от A только дупликацией мотива TTTCTATA в позициях 235-242. Гаплотип A был выявлен у всех образцов R. grossheimii и R. talijevii, а также у одного образца, определенного, как R. ucrainica. Гаплотипы B и C были выявлены у всех образцов, определенных как R. rubiginosa и R. bordzilowskii, за исключением одного образца (rb1), имевшего промежуточную между этими видами морфологию и хлоропластный гаплотип D. Гаплотип D был выявлен у всех остальных образцов.
Рис. 6. Вероятность отнесения исследованных 47 образцов Rosa к одному из классов гибридов по составу ISSR-ампликонов по результатам анализа в программе NewHybrids. Классы гибридов обозначены разной штриховкой столбцов диаграммы: p0 – первый родительский вид, p1 – второй родительский вид, F1 – гибрид первого поколения, F2 – гибрид второго поколения, Bx0 – бэккросс к первому родительскому виду, Bx1 – бэккросс ко второму родительскому виду. По вертикальной оси отложены значения апостериорной вероятности. Прописными латинскими буквами обозначены хлоропластные (trnV-ndhC) гаплотипы образцов.
Анализ 64 информативных межмикросателлитных (ISSR) маркеров методами кластерного анализа (UPGMA) и главных координат не дал четкого разделения групп. Генетическую структуру выборки прояснил только анализ методом Байеса в программах Structure 2.2 и NewHybrids (рис. 6).
При сравнении результатов анализа в программе Structure оказывается, что генетические группы, соответствующие R. rubiginosa и R. grossheimii, регулярно выявляются для всех значений K (заданного числа популяций). Все остальные группы оказываются нестабильными и при увеличении К распадаются на более мелкие. Эти же две группы выявляются программой NewHybrids с высокой апостериорной вероятностью, как родительские виды. Прямой подсчет ISSR маркеров полностью подтверждает полученные в NewHybrids результаты: образцы обоих родительских видов (R. rubiginosa и R. grossheimii) обладают реципрокно встречающимися 8-15 диагностическими и характерными маркерами, в то время как у гибридов всегда наблюдаются маркеры от обоих родительских видов, хотя часто и в разных соотношениях. Так как соотношение маркеров у гибридов третьего и более поздних поколений не отличается от такового у гибридов F1 и F2 (Milne, Abbott, 2008), вероятно, и в нашем случае гибриды представлены в основном гибридами более поздних поколений. В пользу этого свидетельствует состав гаплотипов хлоропластных маркеров. У гибридов встречается либо гаплотип A, указывающий на то, что R. grossheimii выступала в данном случае в качестве материнского растения, либо гаплотип D, отличающийся от последнего только тандемной дупликацией одного восьминуклеотидного участка. Вполне вероятно, что он является непосредственно производным от А, и мутация возникла у гибридного растения, ставшего материнским для всей популяции гибридов, несущих этот гаплотип. Характерно, что среди носителей гаплотипа D наблюдается исключительное морфологическое разнообразие и растения эти по морфологическим признакам можно отнести не только к разным видам, но и к разным секциям рода Rosa. Причиной этого, вероятно, является расщепление в последовательных поколениях гибридов.
Однонаправленная интрогрессивная гибридизация. В большой впадающей в Волгу балке в окрестностях с. Стрельноширокое Волгоградской области нами изучены симпатрично произрастающие популяции нескольких видов шиповников (Schanzer, Vagina, 2007). Наиболее массово в данном местонахождении представлены виды секции Caninae: R. canina и R. caesia, значительно реже на нескольких участках балки попадаются небольшие заросли R. majalis из секции Cinnamomeae. Среди первых, помимо растений, определяемых по морфологическим признакам как R. canina и R. caesia, встречаются и растения с промежуточной морфологией. Среди образцов, вполне однозначно определяемых, как R. majalis, у одной из крупных зарослей наблюдается аномальное развитие железистых шипиков на чашелистиках и гипантиях, что морфологически сближает эти растения с восточноукраинским эндемиком R. donetzica.
Изученная выборка состояла из 38 растений, 13 из которых были по морфологическим признакам отнесены к R. canina, 13 – к R. caesia, 6 растений промежуточных морфологически между ними и 6 растений, отнесенных к R. majalis. Исходя из морфологических признаков растений исследуемой выборки, первоначально была выдвинута гипотеза о гибридизации между двумя видами секции Caninae, в которой диплоидная R. majalis не участвует, хотя и произрастает симпатрично с популяциями канинных шиповников. Однако детальный анализ распределения морфологических признаков и ISSR маркеров позволил прийти к совершенно иным выводам.
Результаты анализа выборки методом главных координат по 15 количественным и качественным морфологическим признакам представлены на рис. 7А. Как видно из диаграммы, R. canina и R. caesia образуют два почти соприкасающихся друг с другом облака, с морфологически промежуточными предположительно "гибридными" образцами, располагающимися между ними или попадающими в пределы облаков родительских видов. R. majalis образует отдельное облако с одним выпадающим образцом.
А Б
Рис. 7. А: Анализ морфологических данных методом главных координат с использованием коэффициента Говера. Б: Анализ ISSR данных методом главных координат с использованием коэффициента Жаккара. Черные кружки – R. majalis; белые кружки – R. cf. donetzica; черные квадраты – R. canina; белые квадраты – предположительные гибриды "R. canina x R. caesia"; труегольники – R. caesia.
Для данной выборки были получены 74 ISSR маркера, анализ которых методом главных координат с использованием дистанции Жаккара (Hammer et al., 2010) представлен на рис. 7Б. Как видно из диаграммы, распределение образцов в плоскости двух первых главных координат оказалось близким к их распределению в анализе морфологических признаков. Это можно было бы считать подтверждением выдвинутой на основании морфологических данных гипотезы, но прямой подсчет ISSR маркеров в 4 группах образцов (R. canina, R. caesia, предположительные гибриды между ними и R. majalis) показал, что более вероятной является иная интерпретация. У образцов R. canina было выявлено 12 характерных маркеров, никогда не встречающихся у образцов R. majalis. У последнего вида было, в свою очередь, выявлено 10 характерных маркеров. В то же время у R. caesia был выявлен только 1 характерный маркер, не встречающийся у двух упомянутых выше видов, причем у единственного образца – остальные образцы R. caesia не имели ни одного характерного маркера. Напротив, в несколько различающихся сочетаниях у них присутствовали все 12 характерных маркеров R. canina и все 10 маркеров R. majalis, хотя у отдельно взятых образцов маркеры R. canina, как правило, преобладали. Такое распределение маркеров позволило выдвинуть иное предположение: R. caesia, а точнее, растения, морфологически соответствующие этому виду, в данном местонахождении представляют собой гибриды R. canina x R. majalis. Для проверки этого предположения был проведен Байесовский анализ данных по изменчивости ISSR маркеров в программе NewHybrids. Результаты анализа представлены на рис 8. Программа однозначно относит образцы R. canina и R. majalis к двум родительским видам с апостериорной вероятностью 95-100%. Исключения составляют два образца, первоначально определенные как R. caesia, но отнесенные программой к R. majalis. Все остальные образцы, первоначально определенные, как R. caesia или вероятные гибриды R. canina x R. caesia были отнесены программой к гибридам F1, F2 или бэккроссам с R. canina с кумулятивной апостериорной вероятностью более 90%.
Рис. 16. Результаты анализа выборки из гибридизирующих симпатрических популяций R. canina и R. majalis в программе NewHybrids.
Из проделанного анализа можно сделать вывод о гибридизации между R. canina и R. majalis с вероятной последующей интрогрессией преимущественно от R. majalis к R. canina. Крайне низкая вероятность выявления бэккроссов указывает на то, что R. majalis выступает исключительно в качестве донора пыльцы.
Разнонаправленная интрогрессия при гибридизации нескольких видов секции Caninae и образование скоплений гибридов. Материал для исследования был собран в балке близ с. Камышное Луганской области Украины. Собранные растения были идентифицированы как R. canina (11 растений), R. corymbifera Borkh. (3), R. dimorpha Stev. ex Bess. (8), R. podolica Tratt. (1), R. subpomifera (2), R. villosa (3). Одно растение не было определено до вида, так как по признаку наличия железистого опушения на верхней стороне листьев было наиболее сходно с R. caryophyllacea Bess., но по остальным приближалось к R. canina.
Анализ выборки, проведенный по 28 морфологическим признакам и 111 информативным ISSR маркерам методами кластерного анализа, главных координат и Байеса показал, что четыре популяции, выявленные в Байесовском анализе, соответствуют четырем видам, ограниченно гибридизирующим друг с другом. При этом гибриды генетически более или менее промежуточны между родительскими видами, а морфологически могут в разной степени уклоняться в сторону того или иного родителя. Ординация результатов Байесова анализа представлена на рис. 9. Как видно из рисунка, гибриды в большинстве случаев оказываются промежуточными по общему составу ISSR ампликонов между родительскими видами, либо уклоняются в сторону одного из них.
Рис. 9. Соотнесение результатов анализа в программах Structure и NewHybrids с ординацией образцов методом главных координат по 111 ISSR маркерам. Условные обозначения: 1 – R. canina; 2 – R. dimorpha; 3 – R. podolica; 4 – R. villosa; 5 – гибриды F2; 6 – бэккроссы; 7 – гибриды неопределенного статуса.
Для гибридов указаны номера образцов. Стрелки показывают направления гибридизации от родительских видов к гибридным образцам. Пунктирные стрелки указывают на образцы, вероятно являющиеся продуктами интрогрессивной гибридизации между R. podolica и R. villosa.
Однако, учитывая, что R. podolica и R. dimorpha представляют собой формы не вполне ясного таксономического статуса, описанные как эндемики с территории Украины, по признакам опушения листьев и характера плодов промежуточные между R. canina и R. villosa, можно выдвинуть две альтернативные гипотезы.
Так, можно предположить, что имеющееся морфологическое разнообразие возникло в результате гибридизации R. canina и R. villosa. В этом случае, выявление отдельных образцов, морфологически соответствующих R. dimorpha и R. podolica, как самостоятельных популяций в программе Structure является артефактом, связанным с присутствием в выборке генетически стабильных гибридных генотипов.
Альтернативно, можно предположить, что все четыре популяции, выявленные в Байесовском анализе, соответствуют четырем видам, ограниченно гибридизирующим друг с другом. При этом гибриды генетически более или менее промежуточны между родительскими видами, а морфологически могут в разной степени уклоняться в сторону того или иного родителя.
Столь парадоксальные и неправдоподобные на первый взгляд результаты имеют свое объяснение. В экспериментах C. Ritz и V. Wissemann (2003) было проанализировано наследование ряда диагностически значимых в систематике Rosa морфологических признаков, изученных у гибридов первого поколения между несколькими видами секции Caninae. Авторами было установлено, что признаки опушения листьев простыми и железистыми волосками наследуются исключительно матроклинно, в то время как признаки плодов – преимущественно патроклинно. При этом многие гибриды оказались морфологически идентичны с одним из родителей или с видами, не участвовавшими в гибридизации. Поэтому не приходится удивляться, что и в изученном нами случае гибриды между разными видами шиповников не являются морфологически промежуточными между родительскими видами.
Комплексный характер наследования морфологических признаков и, видимо, их расщепления в последующих поколениях гибридов и бэккроссов делает невозможной надежную идентификацию гибридов шиповников по морфологическим признакам, по крайней мере, в случае гибридизации более чем двух видов. Исследованный случай на наш взгляд следует рассматривать, как скопление гибридов. Однако распространенность подобных скоплений, их географическая приуроченность и вероятность существования географически протяженных гибридных зон в настоящее время остаются практически неизученными.
Несоответствие морфологической и генетической структуры. В большинстве рассмотренных выше случаев наблюдалось хотя бы частичное соответствие между структурой изучаемой группы, выявляемой по морфологическим признакам и по молекулярным маркерам. Однако во всех случаях, кроме примера с симпатрическими репродуктивно изолированными популяциями, молекулярные маркеры, как правило, обеспечивали лучшее и более логичное разделение выборок на группы, чем морфологические признаки. Однако, возможна и обратная ситуация, когда морфологические признаки достаточно четко разделяют выборку на группы, а молекулярные маркеры – нет. Подобная ситуация наблюдается на территории Подолья в Западной Украине. Здесь было изучено пять локальных популяций (Fedorova et al., 2010), в которых в разных сочетаниях встречались несколько видов секции Caninae, а также R. gallica из секции Rosa и R. spinosissima L. из секции Pimpinellifoliae. Общий объем выборки составил 76 образцов.
Рис. 10. Результаты Байесова анализа в программе Structure: апостериорные вероятности кластеризации 70 образцов Rosa в K групп по составу ISSR маркеров. Внизу диаграммы указаны номера образцов. Над диаграммой указаны буквенные обозначения гаплотипов хлоропластного спейсера trnV-ndhC. Справа указано заданное число популяций (К) и использованная в анализе модель: adm – с генетическим смешением, noadm – без генетического смешения.
Виды секции Caninae были идентифицированы, как R. canina L. (26 образцов), R. subcanina Christ. (13), R. tomentosa Sm. (3), R. caryophyllacea Bess. (2), R. glauca Pourr. (1), R. parviuscula Chrshan. (3), R. porrectidens Chrshan. (2), R. corymbifera Borkh. (2), R. podolica (1), R. jundzillii Bess. (1). Все образцы, включая 16 образцов R. gallica и 3 образца R. spinosissima были изучены по 20 морфологическим признакам. Все присутствующие в выборке виды, выделяемые на основании морфологических признаков, более или менее хорошо разграничены друг от друга и практически однозначно разделяются кластерным анализом. Молекулярные данные, однако, находятся в значительном противоречии с морфологическими. Как хлоропластные (trnV-ndhC), так и ISSR маркеры хорошо разграничивают виды, относящиеся к разным секциям, т.е. R. spinosissima, R. gallica, и шиповники секции Caninae. Однако, они не способны различить виды последней секции. Хлоропластные маркеры позволяют отграничить от остальных собачьих шиповников только образцы R. tomentosa и R. glauca, обладающие гаплотипами, обозначенными, как T и L, но по ISSR маркерам найти никаких отличий не удается. Все три образца R. tomentosa программа NewHybrids относит к тому же родительскому виду, что и образцы R. canina с апостериорными вероятностями 0,96 – 0,99. То же самое относится к единственному изученному клону R. glauca. Также ни один из анализов, проведенных в программе Structure (рис. 10) по данным ISSR маркирования не смог отличить R. tomentosa и R. glauca от остальных видов собачьих шиповников. Все остальные виды, определяемые по морфологическим признакам, как R. subcanina, R. caryophyllacea, R. podolica, R. jundzillii, и R. porrectidens обладают одним и тем же хлоропластным гаплотипом (C) и относятся в анализе в программе NewHybrids к одному родительскому виду с апостериорными вероятностями выше 0,95.
Противоречивость результатов анализа шиповников секции Caninae по морфологическим признакам и ISSR маркерам может вызвать подозрение, что отсутствие разрешения в молекулярном анализе связано просто с недостаточным для надежного разграничения видов количеством полученных маркеров. Такое подозрение возникает, в частности, в связи с тем, что анализ данных в программе Structure делит группу, состоящую из видов секции Caninae, на две части, не совпадающие ни с морфологическим подразделением, ни с распространением хлоропластных гаплотипов L и T, характерных для R. glauca и R. tomentosa. Однако, нанесение этих двух групп на географическую карту (рис. 11) показывает, что они не являются произвольными. Образцы, относящиеся к первой группе, обозначенной черным цветом на круговых диаграммах, концентрируются в северной и западной частях исследованной территории, в то время как образцы второй группы (серый цвет), в основном, сконцентрированы на востоке. Различия в представительстве обеих групп в разных местонахождениях приблизительно пропорциональны расстоянию между ними. Это может указывать на то, что большая часть морфологической изменчивости у шиповников канинной группы является внутривидовой, в то время как изменчивость ISSR маркеров отражает ограниченный расстоянием поток генов между разными местонахождениями. Комплексная и пока еще до конца неясная природа вида у шиповников секции Caninae не позволяет сделать из этих результатов какие-либо окончательные выводы. Тем не менее, при имеющемся уровне разрешения данных, шиповники секции Caninae ведут себя на данной территории, как один вид. Это, в частности, может объяснить тот факт, что некоторые морфотипы, такие как
Рис. 11. Географическое распространение групп образцов секции Caninae (пояснения в тексте). Размер круга соответствует числу изученных из конкретной локальной популяции образцов. Латинскими буквами обозначены популяции.
R. canina, являются обычными, в то время как другие, такие как R. caryophyllacea или R. podolica, редкими, несмотря на то, что они растут в одних и тех же местообитаниях. Подобный характер изменчивости наблюдается в популяциях диплоидной перекрестно опыляемой R. majalis (Шанцер, Войлокова, 2008), где морфотипы с голыми (R. glabrifolia C. A. Mey.) или железистыми (R. gorinkensis Willd.) листьями могут встречаться в разных пропорциях в популяциях во всех остальных отношениях вполне типичной R. majalis.
Глава 6. Филогения рода Rosa
Род Rosa в ископаемом состоянии известен с позднего эоцена (формация Флориссант в штате Колорадо) по остаткам листьев и шипов (Becker, 1963), описанным под названием Rosa hilliae Lesquereux, что указывает на его достаточную древность. Молекулярно-филогенетический анализ семейства Rosaceae (Potter et al., 2007) помещает род Rosa среди базальных таксонов подсемейства Rosoideae. Тем не менее, все сделанные до настоящего времени попытки выявить филогенетические отношения видов этого рода оказались не вполне удачными. Деревья, построенные с помощью различных алгоритмов и по разным маркерам, как ядерным, так и хлоропластным, неизменно оказывались плохо разрешенными и имеющими низкую поддержку большинства внутренних узлов. Причиной этого обычно считают недавнее происхождение большинства современных видов шиповников и широкое распространение межвидовой гибридизации среди них (Wissemann, Ritz, 2005; Bruneau et al., 2007).
Современные методы реконструкции филогений основываются на различных компьютерных алгоритмах, разработанных в рамках кладистики и нумерической систематики. Общим для них всех является конечный продукт – дерево, т.е. древовидный граф, в котором все исследуемые единицы (операциональные кладистические единицы) располагаются на концах ветвей, а внутренние узлы соответствуют гипотетическим предкам или гипотетическим событиям видообразования. При использовании для анализа данных первичной структуры ДНК принято различать "деревья генов" и "деревья таксонов" (Page, Charleston, 1997). Между ними могут быть различные, в том числе и довольно значительные несовпадения, так как в процессе эволюции мутационные изменения, накапливающиеся в ДНК, происходят не одновременно с событиями видообразования (Rosenberg, Nordborg, 2002; Шанцер, 2003). В последние два десятилетия активное развитие получили альтернативные построению деревьев методы построения филогенетических сетей (Posada, Crandall, 2001). Главным отличием сетей от деревьев является то, что исследуемые операциональные единицы (типы последовательностей ДНК, или гаплотипы, или аллели) в сетях могут располагаться не только на концах ветвей, но и во внутренних узлах. Теоретическим обоснованием этих методов служит разрабатываемая с 80х годов ХХ века теория коалесценции (Hein et al., 2005) — область популяционной генетики, математически описывающая процесс исторического происхождения аллелей. Принципиальным отличием этого подхода от традиционных кладистических методов является развитие представлений о возможности одновременного сосуществования в популяциях предковых и производных последовательностей ДНК (гаплотипов). В последнее время методы построения сетей успешно используются для установления видовых границ и реконструкции филогений групп видов и целых родов, в том числе у Rosa (Joly et al., 2006) и Hordeum (Jakob, Blattner, 2006).
Благодаря филогенетическим исследованиям Rosa и других представителей Rosaceae, проведенным за последние 10–15 лет разными группами исследователей в разных странах, был накоплен большой массив данных по последовательностям ДНК, хранящийся в открытом доступе в GenBank и доступный для изучения. Это создает возможность использования всего массива накопленной информации для переоценки существующих представлений о филогении Rosa. В анализ также были включены последовательности ITS1 и хлоропластного участка trnL-trnF, секвенированные в ходе выполнения настоящей работы из 135 образцов 8 видов шиповников.
Генеалогия гаплотипов ядерного ITS1, построенная методом статистической парсимонии, представлена на рис. 12. Всего в анализ была включена 281 последовательность, длина выравнивания составила 250 позиций. Рассчитанный программой предел парсимонии (наибольшее число мутаций, по которым различаются гаплотипы, еще допускающее экономное решение с вероятностью более 95%) был равен 7 и позволил построить сеть, охватывающую все включенные в анализ гаплотипы, за исключением двух: гаплотипа R. abyssinica R. Br. и одного из гаплотипов R. dumalis. Всего программой был рассчитан 191 гаплотип, 70 из которых не были обнаружены среди исследованных образцов и представляли собой гипотетические промежуточные гаплотипы. Из-за большого числа гомоплазий, связанных с множественными параллельными заменами и присутствием неоднозначно читаемых позиций в исходных данных, сеть содержит 11 замкнутых петель, не позволяющих сделать однозначных выводов о генеалогических связях гаплотипов. Эти петли, однако, не мешают проведению иерархического анализа клад (Templeton, Sing, 1993), который позволяет выделить 72 клады 1-го, 25 клад 2-го и 9 клад 3-го уровня, очерчивающих группы близкородственных гаплотипов. Эти клады представляют собой "ядра", включающие центральные гаплотипы и ряд генеалогически близких к ним, различающихся, как правило, единственной или 2-3 мутациями. Результаты анализа позволяют разделить исследованную выборку на 9 больших групп родства.
Группа 1 включает гаплотипы (I1 и производные от него) видов секции Cinnamomeae (R. majalis s.l., R. davurica, R. fedtschenkoana, R. beggeriana) распространенные от Дальнего Востока до Восточной Европы, а также некоторых видов секции Caninae.
Группа 2 включает гаплотипы (I7 и производные от него), распространенные среди североамериканских и восточноазиатских представителей секций Cinnamomeae и Carolinae (диплоиды R. amblyotis, R. rugosa, R. woodsii, R. blanda, R. nitida и R. palustris и тетраплоиды R. carolina, R. virginiana, R. arkansana). В эту группу входят также гаплотипы некоторых видов секции Caninae.
Группа 3 включает гаплотипы, родственные I65 и распространенные среди полиплоидных горных и циркумбореальных видов секций Cinnamomeae и Pimpinellifoliae: R. acicularis, R. pendulina, R. altaica и R. suffulta. От этой группы происходят I69 и производные от него гаплотипы, распространенные среди гималайских и европейско-западноазиатских представителей секций Gallicanae, Caninae и Synstylae: R. alba, R. phoenicia, R. gallica, R. sempervirens, R. moschata, R. canina, R. dumalis и R. villosa.
Группу 4 образуют гаплотипы, родственные I55, и характерные для видов секций Synstylae и Chinenses восточноазиатско-гималайского распространения: R. wichuraiana, R. tunquinensis, R. maximowicziana, R. luciae, R. multiflora, R. chinensis, R. odorata, R. moschata, R. rubus, R. sambucina и R. henryi. Производная от нее группа 5 включает 4 гаплотипа, также характерные для видов секции Synstylae: R. rubus, R. sambucina, R. henryi и R. helenae.
Группа 6 образована гаплотипами, связанными с центральным гаплотипом I79, и включает в себя исключительно гаплотипы видов секции Caninae. Однако в ее основании лежит гаплотип I86, характерный для R. phoenicia из секции Synstylae.
Группа 7 включает в себя два связанных друг с другом "ядра". Одно из них, внутреннее, образовано гаплотипами, производными от I28, распространенными среди восточно- и центральноазиатских видов секций Laevigatae, Banksianae и Pimpinellifoliae: R. x fortuneana, R. laevigata, R. xanthina, R. primula, R. ecae, R. foetida, R. cymosa и R. banksiae. Второе "ядро", с центральным гаплотипом I42, образовано преимущественно гаплотипами, распространенными среди европейско-западноазиатских видов секции Caninae. Однако сам центральный гаплотип I42 встречается также и у гималайско-западноазиатской R. moschata из секции Synstylae, а два производных от него концевых гаплотипа – у R. gallica.
Рис. 12. Генеалогия гаплотипов ITS1 и иерархический анализ клад.
Группа 8 образована гаплотипами, производными от I19. Эта группа тесно связана с группой 1 (их центральные гаплотипы I19 и I1 различаются единственной мутацией) и замыкает большую петлю, в которую объединены все клады 3-го уровня. В группу 8 объединены гаплотипы, распространенные среди западно-китайско-юннаньских и центральноазиатских представителей секции Cinnamomeae: R. willmottiae, R. laxa, R. davidii, R. multibracteata, R. praelucens, R. persetosa и R. sertata.
Последняя группа 9 является наименее выраженной, так как включает множество гипотетических гаплотипов, дедуцированных программой и отсутствующих в исходной матрице. Она объединяет гаплотипы, распространенные среди наиболее филогенетически изолированных в роде Rosa видов – R. stellata (подрод Hesperhodos) и R. persica (подрод Hulthemia), а также один из гаплотипов R. spinosissima, который, впрочем, гораздо ближе к группам 1 и 8, чем к гаплотипам своей группы.
Установить сколько-нибудь однозначно отношения этих групп нельзя из-за петель, вызванных гомоплазиями и неоднозначностью данных. Кроме того, значительный вклад в общую неопределенность вносит вероятное гибридное происхождение полиплоидов. Поэтому такой же анализ был проведен для межгенного спейсера хлоропластной ДНК trnL-trnF, отражающего связи гаплотипов по материнской линии (рис. 13).
Всего в анализ была включена 181 последовательность, длина выравнивания составила 283 позиции. Рассчитанный программой 95% предел парсимонии был равен 7 и позволил построить сеть, охватывающую все включенные в анализ гаплотипы. Всего программой были рассчитаны 48 гаплотипов, 14 из которых не были обнаружены среди исследованных образцов и представляли собой гипотетические промежуточные гаплотипы. Полученная сеть имеет только одну замкнутую петлю, делающую не вполне определенным положение гаплотипа, характерного для R. minutifolia, вида, близкого к R. stellata из подрода Hesperhodos. Так как длина выравнивания была невелика, для сравнения сеть была построена также для всего региона trnL-trnF, включающего часть кодирующей последовательности гена trnL, интрон гена trnL и межгенный спейсер trnL-trnF. Общая длина выравнивания в последнем случае составила 851 позицию, но включала только 85 последовательностей, взятых из GenBank. Топологии обеих сетей оказались практически идентичными, но вторая содержала значительно больше гипотетических промежуточных гаплотипов. Поэтому иерархический анализ был проведен для первой сети, содержавшей значительно больше последовательностей.
Иерархический анализ выделил на кладограмме 19 клад 1-го и 6 клад 2-го уровня, которые в значительной мере совпали по составу с кладами, полученными при анализе ядерных ITS1. Выделенные группы гаплотипов имеют следующий состав.
Группа 1 образована гаплотипами, производными от центрального гаплотипа T3. Она включает в себя исключительно гаплотипы евразиатских видов секции Cinnamomeae: R. majalis s.l., R. donetzica, R. corymbulosa, R. webbiana и 3 из 5 гаплотипов кавказской R. oxyodon.
Рис. 13. Генеалогия гаплотипов trnL-trnF и иерархический анализ клад.
Группа 2 образована гаплотипами, производными от T6, характерные для видов секции Cinnamomeae, распространенных на северо-востоке Азии (R. amblyotis, R. nipponensis и R. rugosa) и на западе Североной Америки (R. bridgesii, R. granulata, R. lesterae, R. spithamea).
В группу 3 входят гаплотипы, производные от центрального гаплотипа T9. Они характерны для центрально- и восточноазиатских видов секции Cinnamomeae и большинства североамериканских видов этой секции, а также секции Carolinae. В эту же группу входят один из 5 гаплотипов центральноевропейской R. pendulina и гаплотип R. koreana, обычно относимой к Pimpinellifoliae. Кроме того, к этой группе относится гаплотип R. andegavensis из секции Caninae.
Группа 4 включает гаплотипы, производные от T14, которые распространены среди китайско-центральноазиатских представителей секций Cinnamomeae (3 из 4 галотипов R. acicularis, 3 из 5 R. pendulina, R. multibracteata, R. bella, R. beggeriana, R. laxa, R. caudata и 2 гаплотипа R. oxyodon) и Pimpinellifoliae (R. primula, R. altaica и R. foetida).
Группа 5 объединяет пять гаплотипов, сходящихся к отсутствующему в выборке гипотетическому промежуточному гаплотипу. Они характерны для восточноазиатских видов секций Banksianae, Bracteatae и подрода Platyrhodon. В эту же группу входит центральноазиатская R. persica, отделенная от остальных ее членов, однако, четырьмя дополнительными промежуточными гаплотипами.
К группе 6 относятся гаплотипы, производные от центральных гаплотипов T28 и T32, образующие три клады первого уровня. Клада, образованная гаплотипами, производными от T28, включает в себя виды секций Caninae, Gallicanae и наиболее западных представителей секции Synstylae (R. arvensis, R. moschata и индийскую R. leschenaultiana). К этой же группе относятся гаплотип североамериканской R. setigera (Synstylae) один из гаплотипов R. pendulina. Клады, производные от гаплотипа T32, включают восточноазиатских представителей секций Synstylae, Chinenses, Laevigatae, один из гаплотипов R. cymosa из секции Banksianae, а также R. xanthina из секции Pimpinellifoliae.
Анализ генеалогий хлоропластных последовательностей matK и atpB-rbcL не противоречит полученным результатам, но имеет гораздо более низкое разрешение.
Так же как и любая кладограмма, сеть изначально является неориентированной. Укоренение ее возможно посредством введения внешней группы, которая в идеале должна включать в себя представителей ближайшего родственного (сестринского) таксона. Род Rosa является одним из базальных таксонов подсемейства Rosoideae (Potter et al., 2007) и сестринским по отношению к трибе Potentillaeae, базальнее него на дереве располагаются клада Colurieaeae, роды Rubus и Filipendula. В работах по филогении Rosa в качестве внешней группы разными авторами использовались представители родов Rubus (Wissemann, Ritz, 2005; Koopman et al., 2008) и Potentilla (Bruneau et al., 2007). Однако во всех случаях результаты анализа оказались неоднозначными. Так, наиболее базальной группой Rosa в разных анализах оказывались R. minutifolia (подрод Hesperhodos), R. persica (подрод Hulthemia), либо клада, состоящая из R. stellata, R. persica, R. laevigata, R. primula, R. foetida и R. ecae.Однако во всех случаях поддержка внутренних узлов и базальных ветвей на этих деревьях оказалась низкой.
Чтобы попытаться выявить наиболее базальную группу видов Rosa, мною был проведен анализ последовательностей ITS1 и trnL-trnF методом NeighborNet, реализованным в программе SplitsTree4, с использованием в качестве внешней группы 31 последовательности видов рода Rubus. Анализ выявил в качестве базальной группы виды подрода Hesperhodos (R. stellata и R. minutiflora). Эти виды известны из двух дизъюнктивных небольших по площади участков ареала на юго-западе Северной Америки. Нельзя исключить, что эта морфологически крайне своеобразная группа является непосредственным производным исходной группы роз. Эти данные указывают также на вероятное североамериканское происхождение этого рода, что не противоречит и палеонтологическим данным.
Если эта гипотеза верна, то группа 2, установленная по данным хлоропластной последовательности trnL-trnF, представляет собой ближайшего потомка первичной группы роз, остатком которой является подрод Hesperhodos. От нее происходят группы 1 (распространившаяся по всей северной Евразии) и 2 (восточная Азия и Северная Америка), представленные видами секции Cinnamomeae. Группа 6 представляет собой одно из наиболее поздних производных в этой генеалогической линии, что говорит об эволюционной молодости не только секции Caninae, но и секций Synstylae, Banksianae, Chinenses и Laevigatae. Последнее свидетельствует о том, что розы-лианы субтропических регионов, рассматривавшиеся В.Г. Хржановским, как остатки наиболее древних представителей рода, напротив, представляют собой молодое образование.
Заключение
Проведенные исследования локальных популяций шиповников позволили установить, что ISSR маркеры являются надежной и воспроизводимой системой маркеров для изучения внутривидового полиморфизма и гибридизации в роде Rosa. Однако интерпретация полученных с их помощью результатов не всегда может быть простой и прямолинейной. При анализе симпатрических популяций видов секции Caninae ординация и кластеризация данных по ISSR маркерам может давать не вполне однозначные и противоречащие морфологическим данным результаты. Однако Байесовы алгоритмы анализа, реализованные в программах Structure2.0 и NewHybrids, даже в таких случаях позволяют вполне надежно документировать процессы гибридизации в природных популяциях шиповников, независимо от уровня плоидности гибридизирующих видов. Особенно перспективным оказывается их совместное применение. Вначале число потенциально гибридизирующих популяций оценивается с помощью моделей, реализованных в программе Structure. Затем, эти же данные подвергаются анализу в рамках модели, заложенной в программе NewHybrids, которая оценивает вероятность разбиения выборки (или ее частей, в соответствии с разделением данных, предложенным в Structure) на дискретные генотипические классы. Применение этого подхода к популяциям шиповников дает возможность различить внутривидовой полиморфизм и полиморфизм, возникающий вследствие гибридизации разных видов при их симпатрических контактах. Разработанный подход позволяет успешно отличать внутривидовую изменчивость от последствий гибридизации разных видов и в других группах растений, в частности, у Lotus (Крамина, Шанцер, 2008) и Hedysarum (Супрун, Шанцер, неопубл. данные).
Полученные результаты свидетельствуют о том, что межвидовая гибридизация у шиповников секции Caninae нередко действительно наблюдается при симпатрических контактах разных видов. Происходит она и в случае такого рода контактов с видами других секций. Однако последствия ее могут быть весьма различными, от интрогрессии до репродуктивной изоляции гибридов. В последнем случае можно наблюдать первые этапы симпатрического гибридогенного видообразования. В настоящее время трудно сказать, насколько стабильными генетически, морфологически и экологически могут быть такие гибридогенные популяции. Немногочисленные имеющиеся данные (Schanzer, 2001) указывают на то, что такие популяции могут быть достаточно эфемерными образованиями, численность которых может резко снижаться при каком-либо изменении условий их существования, вплоть до практически полного исчезновения.
Проведенное исследование генеалогии хлоропластных и ядерных гаплотипов шиповников показало перспективность генеалогических методов анализа для реконструкции филогении рода Rosa. Иерархический анализ полученных сетей гаплотипов дал достаточно логичную картину вероятных групп родства видов рода Rosa, по большей части неплохо согласующуюся с географическими и морфологическими данными. Тот факт, что общие для групп видов гаплотипы являются, за единичными исключениями, внутренними гаплотипами сетей, указывает на неполную сортировку филогенетических линий и позволяет установить группы наиболее близкородственных молодых видов. Полиморфизм ряда полиплоидных видов по хлоропластным гаплотипам, попадающим в разные группы родства, указывает на их вероятное аллополиплоидное происхождение.
Выводы
1) В роде Rosa наблюдаются гомологические ряды изменчивости по признакам опушения листьев простыми и железистыми волосками, опушения и вооружения побегов. Параллельная изменчивость по этим признакам наблюдается у большинства изученных видов секций Cinnamomeae, Synstylae, Banksianae, Laevigatae и Pimpinellifoliae.
2) Rosa majalis представляет собой полиморфный самонесовместимый вид. Внутривидовой полиморфизм у этого вида не связан с интрогрессивной гибридизацией с видами секции Caninae. Расчленение ее на несколько видов по признакам опушения листьев не имеет биологического обоснования.
3) Виды шиповников секции Caninae способны как к перекрестному опылению, так и к самоопылению и факультативному апогамному апомиксису. В условиях симпатрии они способны к гибридизации друг с другом и с видами других секций.
4) Морфологическое разнообразие в популяциях шиповников секции Caninae может возрастать за счет интрогрессии, либо за счет расщепления в самоопыляющихся линиях гибридов, репродуктивно изолированных от родительских видов.
5) Rosa chomutoviensis, R. tesquicola, R. ucrainica, R. subpygmaea, R. krynkensis представляют собой не эндемичные виды юго-востока Украины, а формы, образующиеся при расщеплении в самоопыляющихся линиях гибридов R. rubiginosa x R. grossheimii, возникших в результате единственного гибридизационного события в прошлом.
6) Иерархический анализ генеалогий гаплотипов хлоропластного спейсера trnL-trnF и ядерного ITS1 показал, что вероятнее всего:
а) филогенетические отношения видов рода Rosa парафилетичны из-за неполной сортировки филогенетических линий и сосуществования предковых и дочерних видов в молодых группах;
б) секция Cinnamomeae является наиболее древней группой Rosa, предковой по отношению ко всем остальным секциям;
в) центром происхождения секции Cinnamomeae, вероятнее всего, является Восточная Азия и Западное побережье Северной Америки;
г) Rosa stellata и R. minutifolia (подрод Hesperhodos) являются прямыми потомками древней вымершей группы роз, общей по происхождению с секцией Cinnamomeae. Этот вывод не противоречит палеонтологическим данным о первых находках листьев Rosa в отложениях эоцена Северной Америки;
д) Заселение Северной Америки единственным представителем секции Synstylae (R. setigera) произошло независимо от секции Cinnamomeae и, видимо, из западной части ареала Synstylae.
7) Большинство видов Rosa являются молодыми и образуют 6-9 парафилетических групп родства, лишь отчасти соответствующих традиционно принимаемому секционному делению рода.
8) Секция Synstylae является одной из наиболее эволюционно продвинутых групп Rosa, проникших с запада в горные субтропические районы ЮВ Азии.
9) Секция Caninae не монофилетична и по материнской линии ведет начало от двух групп видов секций Cinnamomeae и Synstylae. В последней из секций диплоиды R. phoenicia и R. moschata являются наиболее вероятными кандидатами на роль диплоидного предка секции Caninae, т.н. "R. protocanina".
Благодарности
Я хочу выразить огромную признательность и благодарность моему учителю профессору А.К. Скворцову, идеи которого послужили отправной точкой этой работы. Я искренне благодарен всем коллегам по Гербарию ГБС им. Н.В. Цицина РАН, в замечательной и теплой атмосфере которого проводились мои исследования. Особую признательность я хочу высказать всем участникам многочисленных экспедиций, в которых удалось собрать уникальный материал, использованный в моей работе – Н.М. Решетниковой, В.И. Золотову, М.В. Костиной, А.В. Федоровой, коллегам из других учреждений С.Р. Майорову и Т.Е. Краминой (МГУ им. М.В. Ломоносова), Г.Ю. Клинковой и Н.А. Супрун (ВГПУ), В.М. Остапко (Донецкий ботанический сад НАН Украины), А.А. Кагало (Институт экологии Карпат НАН Украины), М. Фишеру, Ф. Эрендорферу, М. Кину (Венский университет, Австрия) и А. Мрквичке (Ландестиргартен, Австрия) и многим другим, перечислить которых, к сожалению, не позволяет объем автореферата. Я благодарен А.В. Федоровой и Д.С. Шабановой за неоценимую помощь в лабораторной работе, а И.Г. Мещерскому (ИПЭЭ РАН) – в секвенировании. Особую сердечную признательность я хочу высказать В.К. Бобровой и А.В. Троицкому, научившим меня работе молекулярно-генетическими методами.
Проведенные исследования были частично поддержаны грантами РФФИ (98-04-48891, 07-04-00538, 10-04-00240) и программой фундаментальных исследований Президиума РАН "Биоразнообразие и динамика генофондов".
По теме работы опубликованы следующие статьи:
Статьи в журналах, рекомендуемых ВАК:
Шанцер И.А. Гомологические ряды изменчивости и систематика рода Filipendula Adans. (Rosaceae, Rosoideae) // Бюл. МОИП. Отд. биол. — 1989. — Т. 94. Вып. 5. — С. 111—119.
Шанцер И.А. О географической изменчивости и эволюции Filipendula ulmaria (L.) Maxim. и близких видов. // Бюл. МОИП. Отд. биол. — 1989. — Т.94, вып. 6. — С. 59—69.
Шанцер И. А., Клинкова Г. Ю. Анализ морфологической изменчивости Rosa majalis Herrm. в европейской части России. // Бюл. Главн. бот. сада. — 2000. — Вып. 180. — С. 53—71.
Шанцер И.А. Современное состояние таксономической изученности восточноевропейских шиповников (Rosa L.) // Бюлл. МОИП. Отд. биол. — 2001. — Т.106, вып. 2. — С. 43—48.
Шанцер И.А. Что такое Erysimum leucanthemum (Steph.) B. Fedtch. и E. versicolor (Bieb.) Andrz. (Brassicaceae)? // Бюл. Главн. бот. сада. — 2004. — Вып. 187. — С. 31—38.
Шанцер И.А. Эффективность опыления и семенного размножения в природной популяции коричного шиповника (Rosa majalis Herrm. s.l.) // Бюл. Главн. бот. сада. — 2006. — Вып. 192. — С. 88—94.
Шанцер И.А., Войлокова В.Н.. Сколько видов, родственных Rosa majalis Herrm., растет в европейской части России? // Бот. журн. — 2008. — Т. 93, № 11. — С. 1690—1704.
Шанцер И.А., Кутлунина Н.А. Межвидовая гибридизация у шиповников (Rosa L.) секции Caninae DC. // Изв. РАН. Сер. биол. — 2010. — № 5. — С. 564—573. (Interspecific hybridization in wild roses (Rosa L. sect. Caninae DC.) // Biology Bulletin. — 2010. — Vol. 37, No. 5. — P. 480—488.)
Крамина Т.Е., Шанцер И.А. Анализ спонтанной гибридизации двух диплоидных видов Lotus (Fabaceae) в Волгоградской области // Бот. журн. — 2010. — Т. 95, № 6. — С. 93—106.
Schanzer I.A. Taxonomic revision of the genus Filipendula (Rosaceae) // J. Jap. Bot. — 1994. — Vol. 69, N 5. — P. 290—319.
Schanzer I.A., Ehrendorfer F. Multivariate analysis, systematics, and distribution of Galium sect. Orientigalium (Rubiaceae) in the Caucasus region. // Candollea. — 2002. — Vol. 57, N2. — P. 329—357.
Schanzer I.A. A note on Rosa zalana in N. Burgenland // Neilreichia. — 2001. — №1. — P. 133—136.
Schanzer I.A., Vagina A.V. ISSR (Inter Simple Sequence Repeat) markers reveal natural intersectional hybridization in wild roses [Rosa L., sect. Caninae (DC.) Ser. and sect. Cinnamomeae (DC.) Ser.] // Wulfenia. — 2007. — Vol. 14. — P. 1–14.
De Carvalho D., Ingvarsson P.K., Joseph J., Suter L., Sedivy C., Macaya-Sanz D., Cottrell J., Heinze B., Schanzer I., Lexer C. Admixture facilitates adaptation from standing variation in the European aspen (Populus tremula L.), a widespread forest tree // Mol. Ecol. — 2010. —Vol. 19. — P. 1638–1650.
Fedorova A.V., Schanzer I.A., Kagalo A.A. Local differentiation and hybridization in populations of wild roses in W Ukraine // Wulfenia. — 2010. — Vol.17. — P. 99-115.
В печати:
Шанцер И.А., Вагина А.В., Остапко В.М. Критическое исследование шиповников (Rosa L.) заповедника "Хомутовская степь" // Бюлл. МОИП. Отд. биол. — 2010. — Т. 116, вып. 2, в печати.
Статьи в сборниках:
Шанцер И.А. Шиповники (Rosa L.) Восточной Европы (проблемы систематики) // Теоретические и прикладные исследования в ботанике и методике преподавания биологии. Матер. междун. научно-практической конф., 21–23 сентября 2005 г. — Белгород, 2005. — С. 32—36.
Шанцер И.А., Вагина А.В. Межвидовая гибридизация в популяции шиповников (Rosa L. sect. Caninae) в Волгоградской области // Особь и популяция – стратегии жизни. Матер. докладов IX Всероссийского семинара. 2–6 октября 2006 г. Республика Башкортостан, г. Уфа. — Ч. 2. — Уфа: Изд. дом "Вилли Окслер", 2006. — С. 401-407.
Шанцер И.А. Сколько видов в роде Rosa L.? // Актуальные проблемы ботаники и методики преподавания биологии: Материалы II Международной научно-практической конференции. Белгород, 24–26 сентября 2007 г. — Белгород, 2007. — С.28-32.
Шанцер И.А. Гибридизация и сетчатая эволюция в роде Rosa // Материалы всероссийской конференции (Петрозаводск, 22–27 сентября 2008 г.). — Ч. 3. — Петрозаводск: Карельский научный центр РАН, 2008. — С. 145—146.
Шанцер И.А. Внутривидовой полиморфизм и гибридизация в роде Rosa L. // Ботанические сады в 21 веке: сохранение биоразнообразия, стратегия развития и инновационные решения: матер. междунар. научно-практич. конф., Белгород, 18–21 мая 2009 г. — Белгород: Политерра, 2009. — С. 104—108.
Шанцер И.А. Филогеография и проблема вида // Кариология и молекулярная систематика. Сборник научных работ участников VI совещания по кариологии, кариосистематике и молекулярной филогении растений. — СПб: БИН РАН, 2009. — С. 111—114.
Вагина А.В., Шанцер И.А. Межвидовая гибридизация шиповников при совместном произрастании в заповеднике Хомутовская Степь // XII Московское совещание по филогении растений, посвященное 250-летию со дня рождения Георга-Франца Гофмана. Материалы (Москва, 2–7 февраля 2010 г.). — М: Товарищество научных изданий КМК. — 2010. — С. 106—109.
Шанцер И.А. Методы и возможности филогеографии // XII Московское совещание по филогении растений, посвященное 250-летию со дня рождения Георга-Франца Гофмана. Материалы (Москва, 2–7 февраля 2010 г.). — М: Товарищество научных изданий КМК. — 2010. — С. 67—70.
Тезисы:
Шанцер И.А. О несовпадении "филогении" молекул и филогении таксонов // XI Международное совещание по филогении растений. Тезисы докладов (Москва, 28–31 января 2003 г.). — М: Изд. Центра охраны дикой природы, 2003. — С. 109-111.
Schanzer I.A., Voilokova V.N., Vagina A.V., Kutlunina N.A. Intraspecific polymorphism, hybridization and reticulate evolution in roses: how to tell the difference? // Systematics 2008. Programme and Abstracts. Ed. by S.R. Gradstein et al. Goettingen, 7—11 April 2008. — Goettingen: Universitaetsverlag, 2008. — P. 127.
Schanzer I.A., Klinkova G.Y. Intraspecific variability of European Rosa (sect. Cinnamomeae) and delimitation of the species // XVII International Botanical Congress, Vienna, Austria, Europe. 17–23 July 2005. Abstracts. — Vienna, 2005. — P. 438.
Schanzer, I.A. Gene trees vs. species trees in reconstructing complex relationships: the case of Rosa // Molecular phylogenetics: contributions to the 2nd Moscow International conference "Molecular Phylogenetics" (Moscow, Russia, May 18–21, 2010) / [Compiled by A. Troitsky, L. Rusin, and V. Alioshin]. — М: Torus Press, 2010. — P. 65.
