Популяционная структура и принципы охраны вишни степной (cerasus fruticosa pall, rosaceae) на южном урале
На правах рукописи
Юсупова Алия Азатовна
Популяционная структура и принципы охраны вишни степной (Cerasus fruticosa Pall, Rosaceae) на Южном Урале
Специальности:
03.02.01 – Ботаника, 03.02.08 – Экология (биологические науки)
Автореферат
диссертации на соискание ученой степени
кандидата биологических наук
Оренбург – 2012
Диссертационная работа выполнена на кафедре экологии Сибайского института ФГБОУ ВПО «Башкирский государственный университет»
| Научный руководитель: | Доктор биологических наук, доцент Редькина Нина Николаевна |
| Научный консультант: | Доктор биологических наук, профессор Янбаев Юлай Аглямович |
| Официальные оппоненты: | Доктор биологических наук, профессор- Плаксина Тамара Ивановна Доктор биологических наук, профессор- – К Кулагин Андрей Алексеевич |
| Ведущая организация: | Учреждение Российской академии наук Институт биологии Уфимского научного центра РАН |
Защита диссертации состоится «28» мая 2012 г. в 12:00 часов на заседании диссертационного совета Д 212.180.02 при Федеральном государственном бюджетном образовательном учреждении высшего профессионального образования «Оренбургский государственный педагогический университет» по адресу: 460014, г.Оренбург, ул. Советская, 19.
С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке ФГБОУ ВПО «Оренбургского государственного педагогического университета»
Тел/факс: 8(3532)772452; E-mail: [email protected].
Автореферат разослан «27» апреля 2012 г. и размещен на официальном сайте http://www.ospu.ru
Ученый секретарь
диссертационного совета Мушинская Н.И.
ВВЕДЕНИЕ
Актуальность темы. В последние десятилетия из-за увеличения антропогенного давления на растительные сообщества и экосистемы, возникла серьезная угроза утраты биологического разнообразия. Особенно актуальной является проблема для генетических ресурсов диких сородичей культурных растений, так как их потенциальные возможности в селекции плодовых и ягодных культур мало реализованы. В последнее время большое внимание уделяется изучению их генофонда в условиях in situ в целях сохранения генетической изменчивости, которая является одним из важнейших факторов, определяющих адаптивные свойства (Алтухов, 1995) и способность организмов к наибольшему использованию ресурсов среды и фитоценотических условий. Развитие современных молекулярно-генетических методов позволило поднять эти исследования на качественно новый уровень (Политов, 2007).
Культивируемые сорта вишни являются популярными пищевыми и лекарственными растениями. По этой причине актуальным является сохранение генофонда их дикорастущих сородичей, являющегося источником дальнейших селекционных работ, многоцелевого использования формового разнообразия природных популяций. В настоящее время эта научная проблема активно изучается за рубежом (Mariette et al., 1997). К сожалению, у широко распространенной на Южном Урале и имеющей в регионе большую средообразующую роль вишни степной Cerasus fruticosa Pall. (Rosaceae) популяционная структура и факторы, ее определяющие, до сих пор не исследованы.
Цель исследований - с применением молекулярно-генетических маркеров изучить на Южном Урале популяционное разнообразие и межпопуляционную дифференциацию C. fruticosa.
Задачи исследований:
1. Выявить полиморфные изоферментные системы, являющиеся информативными для популяционных исследований C. fruticosa;
2. Исследовать полиморфизм популяций с применением аллозимных и микросателлитных локусов.
3. Охарактеризовать пространственную дифференциацию популяций, выявить экологические факторы, определяющие своебразие их структур;
4. Предложить меры по сохранению популяций C. fruticosa в Башкирском Зауралье.
Научная новизна работы. Изучен полиморфизм изоферментных локусов, информативных для описания популяционной структуры C. fruticosa. Проведена оценка популяционного разнообразия вида с применением микросателлитных локусов. Установлено, что C. fruticosa в пределах региона исследований обладает сравнительно низким уровнем популяционного разнообразия. Популяции характеризуются относительно высокой межпопуляционной дифференциацией, обусловленной разным составом и встречаемостью клонов. Наибольшее клоновое разнообразие выявлено в экологических условиях, благоприятствующих территориальному распространению за счет семенного возобновления.
Практическая значимость работы. Результаты исследований и практические рекомендации предлагаются для использования в системах Министерства природных ресурсов и экологии РФ и Федерального агентства лесного хозяйства РФ, научными учреждениями, высшими учебными заведениями в их деятельности, в т.ч. для разработки практических мер по сохранению и рациональному использованию генофонда C. fruticosa на Южном Урале, для создания генетических резерватов и др. Теоретические и практические результаты диссертационной работы могут быть рекомендованы для повышения уровня подготовки бакалавров по направлениям «Биология», «Экология» и др., а также магистров и научно-педагогических кадров высшей квалификации.
Организация исследований. Работа выполнена диссертантом в 2006-2012 г., в т.ч. в качестве соискателя кафедры экологии Сибайского института ФГБОУ ВПО «Башкирский государственный университет» (СИ БашГУ). Диссертационная работа выполнена в рамках плановых тем научно-исследовательских работ СИ БашГУ, а также по Программе сотрудничества в сфере аграрных исследований между ФРГ и РФ (2007-2008, 2009-2011 и 2012-2013 гг., проект № 3/07 «Oekologisch-genetische Untersuchungen im Hinblick auf Biodiversitaet und Monitoring») и Федеральной целевой программе «Научные и научно-педагогические кадры инновационной России» на 2009-2013 годы (Госконтракт № 02.741.11.2233. от 11 мая 2010 г.).
Апробация работы. Основные результаты диссертации докладывались и обсуждались на региональных и всероссийских научных конференциях «Неделя науки» (Сибай, 2006, 2007, 2008, 2009, 2010, 2011, 2012),: VI Международной научно-практической конференции «Природноресурсный потенциал, экология и устойчивое развитие регионов России» (Пенза, 2008); Всероссийской научно-практической конференции «Мониторинг природных экосистем» (Пенза, 2008); II международной научно-практической конференции «Проблемы биологии, экологии, географии, образования: история и современность» (Санкт-Петербург, 2008); Всероссийской научно-практической конференции «Актуальные проблемы дендроэкологии и адаптации растений», посвященной 80-летию со дня рождения профессора Ю.З. Кулагина (Уфа, 2009), Международной конференции с элементами научной школы для молодежи «ЕС – Россия: 7-я Рамочная программа в области биотехнологии, сельского, лесного, рыбного хозяйства и пищи» (Уфа, 2010).
Личный вклад автора состоит в разработке программы исследований согласно поставленным задачам работы, в выборе объектов и методов, в проведении полевых и лабораторных исследований, в обработке и интерпретации полученных результатов, в их сопоставлении с литературными данными, в подготовке рукописей диссертации и ее автореферата, личной апробации полученных результатов. Подготовка публикаций осуществлена самостоятельно или при активном участии автора диссертационной работы, результаты имеющихся совместных исследований опубликованы.
Публикации. Основные результаты диссертации опубликованы в 8 печатных работах, в том числе в 2 статьях в изданиях, рекомендованных ВАК.
Структура и объем работы. Диссертация состоит из введения, _ глав, заключения и выводов, списка литературы, включающего _ наименований источников, в том числе _ - зарубежных авторов. Основной текст изложен на _ страницах, включает _ таблиц и _ рисунков.
Глава 2. Регион, объекты и методы исследований
Регион проведения исследований охватывает лесостепную (Предуралье), степную (Зауралье, юг Зилаирского плато) и горно-лесную (низко- и среднегорья южно-уральских хребтов) зоны Южного Урала (Попов, 1980) – основную часть ареала C. fruticosa. В диссертации по работам (Крашенинников, 1939; Колесников, 1969; Горчаковский, 1972; Кадильников, Тайчинов, 1973; Попов, 1980; Мукатанов 1986 и др.) приведено описание природно-климатических условий и растительности региона, показано высокое разнообразие экосистем с участием C. fruticosa. Приведено описание биоэкологических свойств вида и состояния вищарников на Южном Урале.
В пределах всей исследованной части ареала C. fruticosa в разных растительных зонах и экологических условиях были заложены 20 пробных площадей (рис. 1), представляющие вишарники северо-западной и южной частей Башкортостана (Дуванский и Зианчуринский районы, соответственно), из Башкирского Зауралья (Учалинский, Абзелиловский, Баймакский, Хайбуллинский, Зианчуринский районы), а также примыкающей к региону западной части Челябинской области (Уйский район).
В двух местообитаниях у вишен были изучены морфологические признаки Вр (высота растения, см), Чмд (число междоузлий, шт), Сдм (средняя длина междоузлий, см), Двп (длина вторичного побега см), Члп (число листьев на вторичном побеге, шт), Длп (длина листовой пластинки, см), Шлп (ширина листовой пластинки, см), Дчл (длина черешка листа, см).
В каждой из выборок для лабораторного анализа случайным образом были отобраны в среднем по 32 растения генеративного возраста, с которых были собраны растительные образцы (почки). Для анализа изоферментов использована методика (Янбаев, 2002). Для их экстракции использован 0,1 М трис-HCl (рН 8,0) буфер, содержащий 17 % сахарозы, 0,1 % 2-меркаптоэтанола, 0,05 % диэтилдитиокарбомата натрия. Навеску очищенных от чешуй почек весом в 200 мг растирали в фарфоровой ступке с добавлением 1 мл охлажденного экстрагирующего буфера. Для связывания полифенолов перед этим добавляли около 200 мг нерастворимого поливинилпирролидона Polyclar AT. Гомогенат центрифугировали в течение 20 минут при 15-17 тыс. об/мин в холодильнике. Разделение аллозимов осуществлено с использованием полиакриламидного гель-электрофореза в 7,5 %-ном щелочном геле (Ornstein, 1964; Davis, 1964). Гистохимическое выявление ферментативной активности в гелях проведено по стандартным методикам
Рис. 1. Расположение исследованных выборок C. fruticosa
(Корочкин и др., 1977). Обозначение ферментов и локусов осуществлено согласно одной из номенклатур (Prakash et al., 1969).
Исследована изменчивость следующих ферментов:аспартатаминотрансферазы (AAT, номенклатурный код 2.6.1.1.), глутаматдегидрогеназы (GDH 1.4.1.2.), диафоразы (DIA, E.C. 1.6.4.3.) лейцинаминопептидазы (LAP, E.C. 3.4.11.13.4.11.2.), малатдегидрогеназы (MDH, E.C. 1.1.1.37.), НАДНдегидрогеназы (NADHDH, E.C. 1.6.99.2.), формиатдегидрогеназы (FDH, E.C. 1.2.1.2.), шикиматдегидрогеназы (SKDH, 1.1.1.25.), кислой фосфатазы (APH, 3.1.3.2.) и неспецифических эстераз (EST, E.C. 3.1.1.1…). Для интерпретации генетического контроля ферментов проведена дешифровка спектров изоферментов – анализ пространственной разобщенности зон активности в гелях, образования гибридных изоферментов у гетерозигот и т.д., осуществлялось статистическое тестирование различий выявленной и теоретически ожидаемой численности фенотипов. Выдвинутые гипотезы о механизмах генетического контроля электрофоретических вариантов ферментов сверялись с данными других исследователей генофонда вишен (Mariette et al., 1997).
Для определения генетической изменчивости популяций использованы показатели, вычисляемые компьютерной программой BIOSYS-1 (Swofford, Selander, 1981): общее число генотипов и их частота, число генотипов на локус 
, общее число аллелей и их частота, число аллелей на локус 
, доля полиморфных локусов 
, наблюдаемая и ожидаемая гетерозиготность (
и 
, соответственно), параметр межпопуляционной подразделенности 
-статистики Райта (Wright, 1969), генетическое расстояние М. Нея 
(Nei, 1972). Для определения статистической достоверности различий выборок по частотам аллелей и генотипов, различий наблюдаемых и теоретически ожидаемых по правилу Харди-Вайнберга частот генотипов, использованы тесты 
и 
, а также, если это было необходимо по статистическим причинам, при объединение генотипов в отдельные классы (Животовский, 1981). При этом применена программа GSЕD (Gillet, 1998). С ее помощью также определялись параметры внутрипопуляционного разнообразия 
, потенциального гаметического разнообразия 
, популяционной дифференциации 
, генетическое расстояние Грегориуса 
(Gregorius, 1974, 1978). С применением этой программы определялись многолокусные генотипы отдельных особей.
Исследования микросателлитных локусов вишни степной проведены по Программе сотрудничества в сфере аграрных исследований между ФРГ и РФ на 2009-2011 гг. (проект № 3/07 «Oekologisch-genetische Untersuchungen im Hinblick auf Biodiversitaet und Monitoring», руководитель д.б.н., проф. Ю.А. Янбаев) в лабораториях Института лесной генетики и селекции Федерального исследовательского центра сельскохозяйственных земель, лесоводства и рыбоводства Германии. С использованием ДНК-маркеров осуществлен анализ клонового разнообразия C. fruticosa. Изучение микросателлитов проводился по следующей методике. ДНК из растительного материала выделялся согласно методике (Dumolin et al., 1995). Для его количественного определения использован спектрометрический метод (биофотометр Eppendorf, Германия). Раствор разбавлялся до стандартной концентрации 10 ng/µL. Амплификация произведена для 8 микросателлитных локусов, описанных в литературе (Schueler et al., 2003; Testolin et al. 2000; Dirlewanger et al. 2002). Для локусов UDP98_411 (HEX), UDP98412 (HEX), UDP96005 (TET), BPPCT_040 (FAM)) полимеразная цепная реакция (ПНР) осуществлялась с использованием 2,5 µL буфера 10XPCR, 3 µL MgCl2 (DNA-Cloning-Service, Германия), 1 µL смеси dNTP (Carl Roth and Co KG, Германия), 0,2 µL Taq полимеразы (DNA-Cloning-Service) и по 0,2 µL каждого праймера (Eurofins MWG Operon, Германия, концентрация 20 µL), исключая праймеры UDP98412-F (HEX) и UDP98412-R, для которых использованы 1,2 и 5 µL ДНК-матрицы, соответственно. Общий объем для ПЦР-реакции составил 25 µL. Амплификация осуществлялась на термоциклере Biometra с первоначальной денатурацией за 4 минуты при 94°С, в 30 циклов за 25 секунд при 94°С, 25 секунд при 60°С, 45 секунд при 72°С и в конце - за 45 минут при 60°С. Для UDP96__001 (FAM), UDP98_021 (HEX), UDP98410 (TET), BPPCT_034 (HEX) использованы: 0,5 µL UDP96_001-F (FAM) и UDP96_001-R, 0,3 µL UDP98_021-F (HEX) и UDP98 021-R, 0,8 µL UDP98 410-F (TET) и UDP98 410-R, 0,2 µL BPPCT_034-F.(HEX) и BPPCT_034-R. Количество остальных ПЦР-реагентов были теми же, что и для первой группы праймеров. ПЦР-реакция была такой же, но состояла из 25 циклов вместо 30, а температура отжига была 56°С вместо 60°С. Фрагменты анализировались на генетическом анализаторе Megabace (Amersham Biosciences, Великобритания) и обрабатывались с применением программы MegaBace Fragment Profiler vl.2 (Amersham Biosciences, Великобритания).
Статистическая обработка данных анализа аллозимных и микросателлитных локусов проведена с использованием также других параметров, процедур и методов (Животовский, 1983, 1990). Статистический анализ различных других вариационных рядов выполнены при помощи программы “STATISTICA 6.0” (версия 6.0.) и MS EXCEL.
Глава 3. Полиморфизм популяций C. fruticosa
на Южном Урале
Установлено, что исследованных 10 ферментов электрофоретически инвариантными являются зоны гистохимического окрашивания AAT-1, GDH-1, FDH-1, APH-1, DIA-1, DIA-2, MDH-1, MDH-2, NADHDH-1, EST-3, EST-4, SKDH-2, LAP-2 и LAP-3. Предположено, что каждая из них контролируется соответствующими мономорфными локусами. С учетом приведенных данных доля полиморфных локусов у C. fruticosa составляет 
=0,23, что ниже величины показателя, обнаруженного у видов со смешанным (семенным и вегетативным) размножением (Hamrick, Godt, 1989) и близко к значению, обнаруженного для родственных вишне степной видов. Видимо, сравнительно низкий генетический полиморфизм характерен для всего рода.
Изоферментный анализ позволил выявить изменчивость лишь полиморфных локусов Lap-1, Skd-1, Est-1 и Est-2. Белковые спектры растений формировались, как это характерно для диплоидных видов – у каждой особи выявлялось не более 2 аллозимов, а гистохимическая активность обоих изоферментов гетерозиготных локусов была одинаковой, без эффекта дозы генов (Левитес, 1986). Правильность интерпретации изменчивости ферментов подтверждена как анализом литературных данных, так и тем, что лишь в 9 % от теоретически возможных 36 случаев установлены статистически достоверные различия наблюдаемых и ожидаемых по правилу Харди-Вайнберга распределений генотипов (в 9 популяциях). В 8 случаях из них (88,9 %) такие нарушения вызваны экцессом гетерозигот. У C. fruticosa наиболее вероятными причинами этого феномена являются особенности клоновой структуры некоторых популяций. В крайних случаях наблюдается фиксированная гетерозиготность – две выборки состоят только из гетерозигот Est-11/2 или преимущественно из таких генотипов.
Во всех изученных вишарниках в полиморфных локусах нами обнаружены 10 аллелей. Для Lap-1, Skdh-1, Est-1 и Est-2 в каждом локусе выявлен аллель, наиболее распространенный во всех 20 популяциях. В то же время обнаружен довольно большой разброс их частот: от 0,750 до 1,000 (Lap-13, в среднем 0,963
0,014), от 0,667 до 1,000 (Skdh-12, 0,928
0,020), от 0,469 до 1,000 (Est2, 0,606
0,026) и от 0,917 до 1,000 (Est-21, 0,985
0,007). Лишь один локус имел сопоставимые частоты двух своих аллозимов. В 19 из 20 выборок частота аллеля Est-11 изменялась от 0,313 до 0,531, но в одном местообитании он отсутствовал (в среднем для всех выборок 0,394
0,026)). Таким образом, различия в аллельном составе наблюдались не только в отношении относительно редких, как это наблюдается в популяциях перекрестноопыляющихся растений (Hamrick et al., 1992), но и частых аллелей. Аллель, редкий в одних выборках, в других мог превышать (и намного) установленный порог «редкости» в 5 %. Аллозимы, соответствующие 5 %-ному критерию, выявлены лишь в одном (Lap-14, в среднем 0,002
0,001) и двух (Lap-11, 0,001
0,001) местообитаниях. Аллель Lap-12, отсутствующий в 12 выборках, в восьми других изменялся по частоте в пределах 0,031-0,250 (в среднем 0,034
0,013). Аллозим Skdh-11 не представлен 6 местообитаниях, но в 14 из них имеет частоты 0,019-0,250 (0,072
0,020). То же обнаружено для Est-22 (0,021-0,115, 0,015
0,007) - от отсутствует в 15 вишарниках. По этим причинам гетерогенность аллельных частот оказалась высоко достоверной (
< 0,001) статистически. Более детальные сведения об изменчивости полиморфных локусов (
) отдельных выборок и частоте гетерозигот (
) дает таблица 1. В Est-1 в выборках 1 и 16 обнаружена фиксированная гетерозиготность. В других вишарниках в 45 из 46 случаев (97,8 %) установлено превышение значений 
над 
, что свидетельствует о всеобщей распространенности данного явления в популяциях C. fruticosa.
Нами проведен корреляционный анализ для выявления возможной связи частот аллелей и генотипов выборок с расстояниями между ними. Установлено, что такая связь отсутствует – популяционная структура исследованного вида построена по типу «мозаики». То же результат показал анализ изменения частот аллозимов по градиенту «север-юг» (на рис. 1 видно, что размещение пробных площадей близко к направлениям меридианов).
По аллельному разнообразию отличаются не только популяции C. fruticosa (см. Главу 4), но имеются также высокие внутрипопуляционные генотипические различия отдельных особей. По всем изученным полиморфным изоферментнымм локусам показано, что в среднем на одну особь приходится в среднем 5,01
0,039 аллозимов с изменением от 4 до 7.
Об относительно высоких различиях между особями свидетельствуют и результаты исследований с применением ДНК-маркеров. В частности, в изученной популяции (использованы только уникальные многолокусные генотипы) у C. fruticosa в 8 микросателлитных локусах выявлено 5,25±1,26 аллелей на локус (таблица 1). Отличия двух типов маркеров выражено в том, что микросателлиты еще в большей степени продемонстрировали указанные выше различия особей в аллельном разнообразии. Микросателлиты подтвердили заключение, полученное по аллозимным локусам, что для C. fruticosa характерно в целом относительно невысокое генетическое разнообразие, по сравнению, например, с Prunus avium L.. Для последнего вида амплификация тех же праймеров выявила 11,37±2,04 аллелей (изменения от
Таблица 1
Гетерозиготность выборок C. fruticosa
| Выборки | Lap-1 | Skd-1 | Est-1 | Est-2 | ||||
 |  |  |  |  |  |  |  | |
| 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 | 0 0 0 0 0 0,101 0 0,117 0,190 0,061 0,375 0,177 0,109 0,144 0 0 0 0 0 0 | 0 0 0 0 0 0,107 0 0,125 0,208 0,063 0,500 0,192 0,115 0,154 0 0 0 0 0 0 | 0,191 0 0 0 0,444 0,069 0,080 0,278 0,153 0,144 0,074 0,204 0 0,038 0 0 0,153 0,153 0,375 0 | 0,214 0 0 0 0,667 0,071 0,083 0,333 0,167 0,156 0,077 0,231 0 0,038 0 0 0,167 0,167 0,500 0 | 0,500 0,494 0,494 0,480 0,430 0,423 0,457 0,430 0,457 0,498 0,473 0,464 0,497 0,497 0 0,500 0,486 0,500 0,444 0,500 | 1,000 0,889 0,889 0,800 0,542 0,607 0,708 0,625 0,708 0,688 0,769 0,731 0,846 0,615 0 1,000 0,833 1,000 0,667 1,000 | 0 0 0 0 0,153 0,035 0,041 0,117 0 0 0 0 0 0,204 0 0 0 0 0 0 | 0 0 0 0 0,167 0,036 0,042 0,125 0 0 0 0 0 0,231 0 0 0 0 0 0 |
Таблица 2
Аллельное разнообразие микросателлитных локусов C. fruticosa
| Локус | Размер (bр) |  |  (на особь) |
| UDP98 411 UDP98 412 ВРРСТ 040 UDP96 005 UDP96 001 UDP98 021 UDP98 410 ВРРСТ 034 | 244-274 93-95 125-143 107 111-117 104-140 127-167 217-253 | 5 2 5 1 2 7 11 9 | 2,70 1,05 1,95 1,00 1,11 2,06 2,69 1,94 |
3 до 18 (Jolivet, Degen, личное сообщение). Сравнительно низкая генетическая изменчивость вишни степной увеличивает актуальность выявления полиморфных клонов и местообитаний со сравнительно богатым генофондом.
Глава 4. Межпопуляционная подразделенность
C. fruticosa на южном урале
Представление о разнообразии отдельных популяций C. fruticosa дает таблица 2., из которой видно, что параметры отдельных выборок значительно варьируют, вплоть до полного отсутствия изменчивости особей (выборка № 15). По этой причине доля в целом изменчивых полиморфных локусов изменяется от 0 до 100 %. Более детальные сведения, подтверждающие этот феномен, приведены в таблице 1.
В целом в регионе вишарники обладают относительно близким составои и частотами аллелей. Доминируют пары, обладающие небольшими расстояниями расстояния Нея (рис. 2; линией показаны теоретически иожидаемые соответствующие данные при нормальном распределении признака). В то же время выявляются относительно сильно дифференцированные пары местообитаний c 
>0,003. Генетическое расстояние Нея в среднем составляет 
=0,015
0.001. В парах выборок доминируют расстояния до 0,010 (56,3 %), в пределах
=0,011-0,020 и 0,021-0,030 (18,4 и 10,5 %%, соответственно). Межпопуляционная компонента изменчивости при включении в анализ всех обследованных генотипов 
=0,087, с изменениями по отдельным локусам от 0,066 до 0,134.
Для исключения влияния клонового состава на оценку аллозимного разнообразия на популяционном уровне нами в каждой популяции при помощи программы GSED определены уникальные (не повторяющиеся в каждой выборке) многолокусные генотипы. При этом выявляются высокие различия вишарников по их встречаемости (рис. 3). В среднем для каждой выборки выявлены 4,35
0,61 разных клонов с изменениями от 1 до 9. В отдельных местообитаниях, даже обладающих относительно высокими средними показателями полиморфизма, доминировал один многолокусный генотип. В других они были распределены более равномерно. Ни в одной популяции, несмотря на то, что растения отбирались не ближе 20 м друг от друга, не выявлены случаи генетической уникальности каждой особи. Параметр общей популяционной дифференциации 
, изменяющийся от 0 (мономорфность выборки) до 1,0 (в ней нет ни одного общего генотипа), составил 0,175±0,012, варьируя от 0 до 0,262 (коэффициент вариации 35,26 %). Это доказывает большую роль вегетативного размножения в формировании популяционной структуры C. fruticosa на Южном Урале. Относительно высокая доля клонов в составе популяций не является следствием низкого разрешения электрофоретического анализа изоферментов. В популяции, для изучения которой были использованы аллозимы (см. выше), при помощи анализа микросателлитных локусов обнаружено, что из 20 изученных особей, сравнительно равномерно рассеянных на площади более 1 гектара, одинаковым многолокусным генотипом по 8 микросателлитным локусам (42 аллеля) обладали 10 % растений.
Изученные нами популяционные параметры отдельных выборок C.
Таблица 3.
Популяционные параметры разнообразия клонового в выборках C. fruticosa
| Выборки |  |  |  |  |  |
| 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 | 1,5 0,3 1,3±0,3 1,3±0,3 1,3±0,3 1,8±0,3 2,0±0,0 1,5±0,3 2,0±0,0 2,0±0,4 1,8±0,3 1,8±0,3 2,0±0,4 1,5±0,3 2,3±0,3 1,0±0,0 1,3±0,3 1,5±0,3 1,5±0,3 1,5±0,3 1,3±0,3 | 50,0 25,0 25,0 25,0 75,0 100,0 50,0 100,0 75,0 75,0 75,0 75,0 50,0 100,0 0 25,0 50,0 50,0 50,0 25,0 | 0,375 0,239 0,125±0,125 0,125±0,125 0,125±0,125 0,313±0,108 0,417±0,144 0,250±0,160 0,344±0,060 0,292±0,125 0,208±0,080 0,350±0,150 0,292±0,105 0,125±0,072 0,281±0,060 0,000±0,000 0,250±0,250 0,250±0,160 0,375±0,239 0,250±0,144 0,250±0,250 | 0,292 0,172 0,125±0,125 0,125±0,125 0,125±0,125 0,296±0,102 0,326±0,075 0,217±0,132 0,298±0,040 0,254±0,104 0,239±0,103 0,283±0,113 0,258±0,089 0,196±0,128 0,304±0,084 0,000±0,000 0,250±0,250 0,217±0,132 0,292±0,172 0,214±0,124 0,250±0,250 | -0,404 -0,875 -0,875 -0,875 -0,633 -0,366 -0,618 -0,522 -0,577 -0,941 -0,458 -0,591 -1,443 -0,800 0 -0,750 -0,618 -0,404 -0,606 -0,750 |
Рис. 2. Распределение попарных значений расстояния Нея 
между парами выборок C. fruticosa
Рис. 3.4.3. Клональное разнообразие выборок C. fruticosa
fruticosa значительно варьируют, вплоть до полного отсутствия изменчивости в в целом полиморфных локусах. Это доказывает относительную информативность использованных нами полиморфных изоферментных систем в выявлении популяций с наиболее богатым генофондом. По литературным данным, именно такие объекты обладают наибольшей ценностью для выделения в качестве объекта охраны в природных местообитаниях, создания архива разных клонов в условиях культуры и выявления внутривидовой изменчивости, перспективной для селекции.
Глава 5. Популяционное разнообразие и дифференциация вишарников из разных
экологических условий
Установлено, что популяции C. fruticosa, расположенные в местообитаниях, различающихся по экологическим условиям, существенно дифференцированы по составу и частотам разных аллелей. Наибольшее клоновое разнообразие выявлено в местообитаниях на большей высоте над уровнем моря (в среднем 500 м), занимающих каменистые почвы на скалах крутосклонов и вершин гор и хребтов. Видимо, в этих условиях затруднено вегетативное расселение растений и возобновление осуществляется преимущественно семенным способом. Для этой группы выборок (обозначена I), при учете только многолокусных уникальных генотипов и полиморфных локусов, получены показатели сравнительно большие значения популяционного разнообразия (табл. 4), генотипический состав в ней богаче - 
= 1,95±0,08 (изменения в пределах 1,0-2,5, коэффициент вариации 13,2) против 
=1,21±0,08 (1,0-1,5, 18,5 %) у сравниваемой группы. Для сравнения: для всей совокупности двадцати выборок 
=1,59, 
=1,6±0,1 (1,0-2,3, 20,7 %), 
=56,2±0,06 % (0-100, 51,7 %), 
=0,25±0,02 (0-0,34, 29,0 %), 
=0,17±0,02 (0-0,26, 34,1 %), 
=1,13±0,12 (1,0-3,72, 25,9 %), 
=0,17±0,01 (0-0,26, 35,3 %), В условиях с большой мощностью почвенного слоя на более низких (в среднем 353 м) высотах над уровнем моря формируются более однородные и менее разнообразные популяционные структуры (табл. 4, группа II). Различия большинства параметров таблицы 4 статистически высоко достоверны, в т.ч.: 
(
<0,001), 
(
<0,001), 
(
=0,026), 
(
=0,004), 
(
=0,009), 
(
=0,013). Лишь ожидаемая гетерозиготность (
) различалась в сравнительно небольшой степени (
=0,115). Нами с использованием восьми морфологических признаков (см. выше) проведено сравнение изменчивости в двух случайно отобранных вишарниках – представителях изученных двух «экологических» групп местообитаний. Однако статистически достоверных различий между ними не выявлено.
Таким образом, в отношении уровня популяционного разнообразия местообитания C. fruticosa неравноценны. При отборе объектов для охраны in situ и использования растений в условиях ex situ приоритетными должны выступать местообитания в горных условиях, где экологические условия способствуют семенному возобновлению. Учитывая полученные нами данные и сравнительно высокие объемы популяций C. fruticosa в пределах южно-уральской части ареала, не представляется необходимым принятие срочных и масштабных мер по охране их генофонда в природных условиях. В то же время важной является проблема выявления уникальных местообитаний C. fruticosa с высокими клоновым разнообразием для организации их охраны in situ. Для обеспечения комплексности и большей эффективности природопользования эту деятельность целесообразно осуществлять в комплексе с охраной редких и исчезающих видов растений в экосистемах Южного Урала, обеспечивающих формирование и поддержание высокого популяционного разнообразия вида. Актуальным является использование выявленного клонового разнообразия популяций C. fruticosa для сохранения в виде архива клонов и применения в селекции генетических ресурсов вида ex situ.
Таблица 4
Популяционное разнообразие и дифференциация экологических групп
C. fruticosa
| Параметр | Группа I | Группа II | ||||
 |  |  , % |  |  |  , % | |
 | 1,90±0,07 | 1,50-2,30 | 11,0 | 1,34±0,07 | 1,0-1,5 | 13,5 |
 | 80,0±5,0 | 50,0-100 | 19,7 | 32,1±7,1 | 0-50,0 | 58,8 |
 | 0,27±0,02 | 0,20-0,34 | 18,5 | 0,22±0,04 | 0-0,29 | 46,3 |
 | 0,20±0,01 | 0,15-0,26 | 19,8 | 0,14±0,03 | 0-0,22 | 51,1 |
 | 1,25±0,12 | 0-1,31 | 31,6 | 1,15±0,12 | 1,0-1,2 | 6,9 |
 | 2,76±0,17 | 2,09-3,72 | 19,5 | 2,06±0,17 | 1,0-3,72 | 27,7 |
 | 0,20±0,01 | 0,15-0,26 | 19,8 | 0,14±0,01 | 0-0,22 | 51,1 |
Примечания: 
- средняя и ее ошибка, 
- пределы изменения признака, 
- коэффициент вариации.
Выводы
1. C. fruticosa характеризуется на видовом уровне относительно невысокой изменчивостью аллозимных и микросателлитных локусов. Электрофоретически инвариантными являются изоферменты аспартатаминотрансферазы (зона активности AAT-1), глутаматдегидрогеназы (GDH-1), формиатдегидрогеназы (FDH-1), кислой фосфатазы (APH-1), диафоразы (DIA-1 и DIA-2), малатдегидрогеназы (MDH-1, MDH-2), NADHDH-дегидрогеназы (NADHDH-1), неспецифических эстераз (EST-3, EST-4), шикиматдегидрогеназы (SKDH-2), лейцинаминопептидазы (LAP-2 и LAP-3). Для изучения изменчивости и дифференциации популяций вида информативными являются не только использованные микросателлитные локусы, но и полиморфные аллозимные локусы Lap-1, Skd-1, Est-1 и Est-2.
2. По частотам аллелей полиморфных локусов Lap-1, Skd-1, Est-1 и Est-2 южно-уральские популяции C. fruticosa существенно отличаются. Причиной этого феномена являются различия местообитаний по составу и встречаемости клонов – от высокого генотипического разнообразия особей вплоть до доминирования лишь одного из генотипов.
3. Популяционная структура исследованного вида построена по типу «мозаики», клинальная изменчивость частот аллозимов и генотипов отсутствует. Межпопуляционная компонента изменчивости для полиморфных аллозимных локусов характеризуется относительно невысоким уровнем 
=0.087. Большинство популяций при учете лишь уникальных многолокусных генотипов относительно слабо дифференцированы (в среднем генетическое расстояние 
=0.015
0.001). В то же время часть популяций сравнительно высоко подразделена - до уровня 
=0.078.
4. Популяции C. fruticosa, расположенные в местообитаниях, различающихся по экологическим условиям, существенно дифференцированы по составу и встречаемости разных аллелей и клонов. Наибольшее, статистически достоверно отличающееся, генотипическое разнообразие выявлено на вершинах гор и хребтов - в местообитаниях, обеспечивающих большую эффективность семенного возобновления.
5. Для C. fruticosa в пределах южно-уральской части ее ареала нет необходимости принятия срочных и масштабных мер по охране генофонда популяций in situ. Важными являются проблемы выявления местообитаний C. fruticosa с высокими клоновым разнообразием для организации их сохранения in situ в комплексе с охраной редких и исчезающих видов растений в экосистемах Южного Урала, обеспечивающих формирование и поддержание высокого популяционного разнообразия вида, а также создание и использование архива клонов в условиях ex situ.
СПИСОК РАБОТ, ОПУБЛИКОВАННЫХ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ
1. Редькина Н.Н., Сагинбаева А.А. Опыт работ по сохранению генофонда рода Prunus L. в Европе // Науч. докл. регион. конф. «Неделя науки-2006». – Сибай, 2007. – С. 78-79.
2. Сагинбаева А.А. Низкий уровень изменчивости вишни степной у вишни степной (Cerasus fructicosa Pall., семейство Rosaceae) // Науч. докл. регион. конф. «Неделя науки-2007». – Сибай, 2007. – С. 38-45.
3. Юсупова А.А. Аллозимная изменчивость неспецифических эстераз у вишни степной (Cerasus fructicosa Mill, Rosaceae) // Сб. статей VI науч.-практ. конф. «Природноресурсный потенциал, экология и устойчивое развитие регионов России» (Пенза, 2008). – Пенза, 2008. – С. 307-309.
4. Юсупова А.А. Изучение биоразнообразия вишни степной Cerasus fructicosa Pall (семейство Rosaceae) в Башкирском Зауралье // Мат. II междунар. научно-практ. конф. «Проблемы биологии, экологии, географии, образования: история и современность». - Санкт-Петербург, 2008. – С. 155-156.
5. Юсупова А.А. Межпопуляционные различия вишни степной Cerasus fructicosa Pall (Rosaceae) по частотам аллозимов // Мат. Всерос. научно-практ. кон. «Мониторинг природных экосистем». - Пенза, 2008. – С. 196-198.
6. Юсупова А.А., Редькина Н.Н., Муллагулов Р.Ю. Характеристика генофонда вишни степной на Южном Урале // Аграрная Россия (специальный выпуск «Актуальные проблемы дендроэкологии и адаптации растений», посвященный 80-летию со дня рождения профессора Ю.З. Кулагина). – 2009. – С. 145-147.
7. Янбаев Ю.А., Редькина Н.Н., Юсупова А.А., Муллагулов Р.Ю. Генетическое разнообразие Cerasus fructicosa на Южном Урале // Вестник Оренбургского государственного университета. – 2009. - № 6. – С. 469-470.
8. Муллагулов Р.Ю., Юсупова А.А., Акилов Р.З. и др. О различиях охраняемых видов растений по уровню генетического разнообразия на видовом и популяционном уровнях // Материалы международной конференции с элементами научной школы для молодежи «ЕС – Россия: 7-я Рамочная программа в области биотехнологии, сельского, лесного, рыбного хозяйства и пищи» в рамках Федеральной целевой программы «Научные и научно-педагогические кадры инновационной России» на 2009-2013 годы (г. Уфа, 29 сентября - 5 октября 2010 г.).– Уфа: Изд-во БГАУ, 2010.– С. 304-306.
