Оценка состояния ценопопуляций некоторых редких видов растений пермского края с использованием молекулярно-генетических методов

На правах рукописи

БЕЛЬТЮКОВА НАДЕЖДА НИКОЛАЕВНА

ОЦЕНКА СОСТОЯНИЯ ценопопуляций НЕКОТОРЫХ РЕДКИХ ВИДОВ РАСТЕНИЙ ПЕРМСКОГО КРАЯ с использованием молекулярно-генетических методов

03.00.05 – ботаника

03.00.15 – генетика

Автореферат

диссертации на соискание ученой степени

кандидата биологических наук

Пермь – 2010

Работа выполнена в ГОУ ВПО «Пермский государственный университет»

Научный руководитель: кандидат биологических наук, доцент

Боронникова Светлана Витальевна

Официальные оппоненты: доктор биологических наук, старший

научный сотрудник

Гаврилова Вера Алексеевна

доктор биологических наук, профессор

Ишбирдин Айрат Римович

Ведущая организация: Уральский государственный университет

им. А.М. Горького

Защита диссертации состоится 15 апреля 2010 г. в 13.30 часов на заседании диссертационного совета Д 212.189.02 при Пермском государственном университете по адресу: 614990, г. Пермь, ул. Букирева, 15.

Адрес сайта: http://www.psu.ru

Факс: (342) 237-16-11

E-mail: [email protected]

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Пермского государственного университета.

Автореферат разослан 11 марта 2010 г.

Ученый секретарь

диссертационного совета

Д 212.189.02,

доктор биологических наук, доцент Л.В. Новоселова

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность проблемы

Проблема сохранения биоразнообразия стала наиболее актуальной в последнее время в связи с усиливающимся воздействием человека на природу (Вахрамеева, 1988; Национальная стратегия…, 2001; Глобальная стратегия…, 2002). Особое внимание уделяется сохранению биоразнообразия растений и исследованиям, проводимым на популяционном уровне. Ценопопуляции являются реальной формой существования видов растений, они имеют сложный состав и специфическую функциональную структуру (Злобин, 1989). В связи с этим важна комплексная оценка состояния ценопопуляций редких видов растений с учетом в совокупности ценопопуляционных характеристик и параметров генетического разнообразия, которые позволяют прогнозировать перспективы их существования и развития.

Цель и задачи исследования

Цель работы – оценка состояния ценопопуляций некоторых редких видов растений Пермского края с учетом параметров генетического разнообразия, внутри- и межпопуляционной дифференциации и ценопопуляционных характеристик, таких как показатели численности и возрастной спектр.

Для достижения цели были поставлены следующие задачи:

1) определить общую, репродуктивную и эффективную численность 20 ценопопуляций трех (Adonis vernalis L., Adonis sibirica Patrin ex Ledeb., Digitalis grandiflora Mill.) редких реликтовых видов растений Пермского края;

2) изучить возрастной спектр избранных ценопопуляций A. vernalis, A. sibirica и D. grandiflora;

3) определить семенную продуктивность у особей разных возрастных групп генеративного периода трех редких видов растений;

4) проанализировать генетическое разнообразие и степень межпопуляционной дифференциации в ценопопуляциях A. vernalis, A. sibirica, D. grandiflora;

5) провести молекулярно-генетическую идентификацию ценопопуляции адониса волжского (Adonis wolgensis Stev.);

6) провести комплексную оценку состояния изученных ценопопуляций трех редких видов растений Пермского края на основе показателей численности, возрастного спектра ценопопуляций и параметров генетического разнообразия;

7) разработать рекомендации по сохранению изученных ценопопуляций трех редких видов растений Пермского края.

Положения, выносимые на защиту

1. Изученные ценопопуляции трех редких видов растений характеризуются как полночленными, так и неполночленными возрастными спектрами нормального типа, широким диапазоном основных индексов возрастной структуры, а также, согласно классификации «дельта-омега», молодыми, переходными, зрелыми и стареющими типами ценопопуляций.

2. Оценка генетического разнообразия редких видов растений возможна методом молекулярного маркирования с выявлением полиморфизма структурных элементов геномов, фланкированных тандемными повторами, такими как микросателлиты (ISSR-PCR маркеры) и ретротранспозоны (IRAP-PCR маркеры), которые позволяют выявить основные показатели генетического разнообразия и дифференциации ценопопуляций.

3. В изученных ценопопуляциях A. vernalis c полночленным возрастным спектром параметры генетического разнообразия коррелируют с показателем возрастности ().

4. Для объективной оценки состояния ценопопуляций изученных редких видов растений необходим учет показателей численности, индексов возрастной структуры, параметров генетического разнообразия, что позволяет в комплексе дать наиболее полную оценку состояния ценопопуляций, прогнозировать перспективы их существования и рекомендовать меры их охраны.

Научная новизна полученных результатов

Впервые в Пермском крае проведено комплексное исследование 20 ценопопуляций трех редких реликтовых видов растений (A. vernalis, A. sibirica, D. grandiflora), с учетом общей, репродуктивной, эффективной численности, возрастного спектра, уровня генетического разнообразия, межпопуляционной дифференциации. Оценка генетического разнообразия проведена с использованием ISSR- и IRAP-маркеров, основанных на тандемных повторах, широко представленных в геномах растений. Проанализирована связь показателей численности и возрастной структуры исследованных ценопопуляций с показателями генетического разнообразия. Впервые проведена молекулярно-генетическая идентификация и штрихкодирование ценопопуляции A. wolgensis в качестве апробации одного из подходов при решении проблемы сохранения генетической компоненты биоразнообразия. Предложен комплексный подход оценки состояния ценопопуляций с учетом изученных параметров. На основании полученных данных предложены научно-обоснованные меры охраны ценопопуляций с учетом их состояний.

Практическая значимость и реализация результатов исследований

Научные выводы работы и рекомендации применяются для мониторинга состояния ценопопуляций редких видов растений Пермского края и могут быть использованы при интродукции с целью сохранения уникальных ценопопуляций редких видов растений, при выделении особо охраняемых природных территорий, а также при регламентировании хозяйственной деятельности человека. Результаты исследований используются при преподавании учебных дисциплин и специальных курсов студентам на каф. ботаники ГОУ ВПО «Уральский государственный университет им. А.М. Горького» и на каф. ботаники и генетики растений ГОУ ВПО «Пермский государственный университет».

Связь работы с научными программами

Диссертационная работа выполнена при частичной финансовой поддержке инновационного образовательного проекта «Образование». Часть исследований, представленная в диссертационной работе, проводилась в связи с тематикой гранта РФФИ р_урал_а № 07-04-96032 «Динамика генетического разнообразия и структуры популяционных систем ресурсных растений Пермского края при антропогенных воздействиях» (2007-2009 гг.) и гранта РФФИ р_урал_а №07-04-96016 «Влияние нефтяных загрязнений почв на популяции микроорганизмов и растений Пермского края» (2007-2009 гг.).

Личный вклад автора

Автором лично проведены выбор молекулярных маркеров и методов молекулярно-генетического анализа, полевые и лабораторные исследования 20 ценопопуляций редких видов растений Пермского края, обработка, анализ, обобщение и интерпретация результатов, а также написание и оформление диссертации. Предложена методика оценки состояния ценопопуляций с учетом параметров численности, возрастного спектра и показателей их генетической изменчивости. Полученные результаты опубликованы совместно с соавторами в 14 печатных работах.

Апробация работы

Основные результаты исследований были представлены на студенческой научной конференции «Фундаментальные и прикладные исследования в биологии и экологии» (Пермь, 2005); IY Международной научной конференции «Биотехнология – охране окружающей среды» (Москва, 2006); Международной конференции «Генетика в России и мире, посвященная 40-летию Института общей генетики им. Н.И. Вавилова РАН» (Москва, 2006); на Всероссийской молодежной научно-практической конференции ботаников «Перспективы развития и проблемы современной ботаники» (Новосибирск, 2007); на Пятом Московском международном конгрессе «Биотехнология: состояние и перспективы развития» (Москва, 2009), где исследования автора в конкурсе на лучшую научно-исследовательскую работу заняли третье место; на Втором Всероссийском с международным участием конгрессе студентов и аспирантов-биологов «Симбиоз Россия 2009» (Пермь, 2009); in 13th annual Simposium for Biology Students of Europe (Kazan, 2009); на региональной с международным участием научной конференции, посвященной памяти П.Л. Горчаковского «Ботанические исследования на Урале» (Пермь, 2009).

Публикации

По теме диссертации опубликовано 14 научных работ, в их числе 3 статьи в ведущих рецензируемых журналах из перечня ВАК и 11 статей в других журналах и материалах конференций.

Структура и объем работы

Диссертационная работа состоит из введения, шести глав, выводов, списка литературы и приложения. Работа изложена на 232 страницах машинописного текста, содержит 70 таблиц, 50 рисунков. Список литературы включает 221 источник, в том числе 38 на иностранных языках.

Благодарности

Автор выражает благодарность за помощь в подготовке диссертационной работы научному руководителю к.б.н., доц. каф. ботаники и генетики растений ПГУ С.В. Боронниковой; сотрудникам каф. ботаники и генетики ПГУ; за освоение современных методов молекулярно-генетического анализа д.б.н. проф. каф. генетики МГУ имени М.В. Ломоносова С.А. Гостимскому, с.н.с. этой же каф. к.б.н. З.Г. Кокаевой; за помощь в статистической обработке материала с использованием компьютерных технологий доктору биол. наук проф. каф. зоологии позвоночных и экологии ПГУ С.А. Мандрице; к.б.н. с.н.с. Института экологии растений и животных (ИЭРиЖ) УрО РАН Л.М. Морозовой за предоставление образцов растительного материала A. wolgensis и соавторам по публикациям.

Основное СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ

Объекты и методы исследований

Объектами исследований избраны ценопопуляции (ЦП) трех редких, видов растений, распространенных в Пермском крае: Adonis vernalis L. и Adonis sibirica Patrin ex Ledeb. (сем. Ranunculaceae), Digitalis grandiflora Mill. (сем. Scrophulariaceae) (Горчаковский, Шурова, 1982; Красная книга Пермского края, 2008). Данные виды являются реликтами (Белковская, Овеснов, 1988; Камелин и др., 1999); имеют декоративное, лекарственное значение (Дикорастущие…, 2001).

Исследованы 12 ЦП A. vernalis, расположенные в Кунгурской островной лесостепи на территории Кунгурского (Av2), Кишертского (Av11), Ординского (Av5, Av6, Av8, Av9), Уинского (Av7) и Октябрьского (Av1, Av3, Av4, Av10, Av12) районов; три ЦП A. sibirica из разных частей Пермского края: первая ЦП (As1) расположена в центральной части Пермского края в Добрянском районе, вторая (As2) находится в Кишертском районе в юго-западной части края, а третья (As3) – в Ильинском районе на севере Пермского края. Изученные ЦП D. grandiflora находятся в Кишертском (Dg1), Кунгурском (Dg2) и Октябрьском (Dg3, Dg4, Dg5) районах. Исследованные 20 ЦП трех редких видов растений изолированы друг от друга, и каждая из них располагается в пределах отдельного фитоценоза. Расстояние между ЦП составляет от 20 до 174 км.

Исследования проводились с 2004 по 2010 гг. Проведен подсчет общей (Nt), репродуктивной (Nr), эффективной (Nе) численности (Голубев, Молчанов, 1978; Денисова и др., 1986; Вахрамеева, 1991), изучена возрастная структура ЦП с определением индексов восстановления (IВ) (на основании подхода Л.А. Жуковой (1987) с модификацией Н.В. Глотова (1998)), замещения (Iз) (Жукова, 1987), старения (IС) (Глотов, 1998), возрастности () (Уранов, 1975) и эффективности ЦП () (Животовский, 2001). Проведено определение типов и классификаций ЦП (Работнов, 1950; Злобин, 1989; Животовский, 2001). Показатели семенной продуктивности (Работнов, 1960; Вайнагий, 1973, 1974) трех изученных редких видов растений определялись у особей разных возрастных состояний. Степень антропогенного воздействия определялась по рекомендациям, разработанным С.В. Боронниковой (2008).

Для анализа молекулярно-генетического полиморфизма ДНК были собраны листья с 30 случайно выбранных особей генеративного периода в каждой ЦП на расстоянии от 30 до 50 м друг от друга. Для выделения ДНК использовали методику A.M. Торрес и др. (Torres et al., 1993). Концентрация всех проб ДНК была выровнена в пределах 5 нг/мкл. Выделено 360 проб ДНК A. vernalis, 90 проб ДНК A. sibirica, 150 проб ДНК D. grandiflora, а также 50 проб A. wolgensis. Сбор листьев A. wolgensis проведен в Гайском районе Оренбургской области. Выявление генетического полиморфизма ДНК проводили ISSR- (Inter Simple Sequence Repeats, Zietkiewicz et al., 1994) и IRAP- (Inter-Retrotransposon Amplified Polymorphism, Kalendar et al., 1999) методами с применением полимеразной цепной реакции (ПЦР). Было апробировано 15 ISSR- и 30-IRAP – праймеров, из которых были выявлены наиболее эффективные. Анализ полиморфизма ДНК был проведен по 286 ISSR-маркерам и по 333 IRAP-маркерам у трех редких реликтовых видов растений Пермского края. Для идентификации ЦП A. wolgensis были проанализированы 86 ISSR-маркеров и 93 IRAP-маркера. Учитывали только четкие воспроизводимые в повторных экспериментах фрагменты ДНК, полиморфизм по интенсивности в расчет не брали. Компьютерный анализ молекулярно-генетического полиморфизма ДНК проведен с помощью программ POPGENE 1.31 (Yeh et al., 1999) и специализированного макроса GenAlEx6 (Peakall, Smouse, 2006) для MS EXCEL. В качестве показателей генетического разнообразия определялись число и доля полиморфных (Р95) (Williams et al., 1990) и редких (R) фрагментов ДНК (Peakall, Smouse, 2006), ожидаемая гетерозиготность (Нe) (Nei, 1987). Индекс разнообразия Шеннона рассчитывали для каждой популяции (H0), среднее значение для популяций (Hpop) и для суммарной выборки (Hsp). На основе этих значений определяли долю внутри- и межпопуляционного разнообразия (Schannon, Weaver, 1949; Lewontin, 1972; Chalmers et al., 1992; Артюкова и др., 2004). Оценку отклонения наблюдаемых распределений генотипов от ожидаемых при равновесии Харди-Вайнберга проводили с использованием теста (Хедрик, 2003).

Для описания генетической структуры и дифференциации ЦП использовали: общее генное разнообразие в суммарной выборке (HT), среднее выборочное генное разнообразие по всем локусам (HS), показатель подразделенности популяций (GST) (Nei, 1975). Определено генетическое расстояние между популяциями (D) (Nei, 1978; Nei, Li, 1979). С помощью компьютерных программ TREECON 1.3b и POPGENE 1.31 невзвешенным парно-групповым методом (UPGMA - unweighed pair-group method using arithmetic average) были построены дендрограммы, отражающие степень родства исследуемых ЦП по ISSR- и IRAP-спектрам. Статистическая обработка выполнена при помощи компьютерных программ STATISTICA 6.0 и MS EXCEL (Плохинский, 1970; Животовский, 1983, 1991; Лакин, 1990).

РЕЗУЛЬТАТЫ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ

1. Численность и возрастная структура ценопопуляций трех редких видов растений Пермского края

Общая численность изученных ЦП A. vernalis варьирует от 39 до 562, репродуктивная от 37 до 400, а эффективная – от 8 до 234 особей. ЦП A. vernalis по показателям численности разделились на 2 группы. К группе с низкими показателями численности относятся ЦП Av3, Av6, Av7, Av8, Av10 с общей численностью от 39 (Av7) до 184 особей (Av6). В группу ЦП с высокими показателями численности включены Av1, Av2, Av4, Av5, Av9, Av11, Av12, у которых общая численность варьирует от 248 (Av2) до 562 особей (Av1). Базовый возрастной спектр ЦП A. vernalis Пермского края полночленный, нормального типа, с преобладанием средневозрастных генеративных особей (рис. 1). Три из изученных ЦП A. vernalis имеют неполночленный возрастной спектр (Av3, Av7, Av10).

Рис. 1. Базовый возрастной спектр

ЦП A. vernalis.

Индекс восстановления в ЦП A. vernalis варьирует от 0% до 44,49%, индекс замещения – от 0% до 66,45%, индекс старения – от 4,26% до 28,80%. Индекс эффективности изменяется от 0,57 до 0,82, индекс возрастности – от 0,34 до 0,60. Доля особей генеративного периода в ЦП A. vernalis более постоянна, чем доли особей других возрастных периодов; при этом доля особей молодых и средневозрастных групп генеративного периода более постоянна, чем доли особей всех других возрастных групп. По классификации «дельта-омега» Л.А. Животовского (2001) Av3 и Av7 отнесены к стареющим, Av1, Av5, Av1, Av12 – к зрелым, а Av2, Av4, Av6, Av8 Av9, Av10 – к переходным ЦП.

Общая численность изученных ЦП A. sibirica изменяется в пределах от 22 до 257, репродуктивная от 8 до 136, а эффективная – от 8 до 89 особей. ЦП A. sibirica, расположенная около пос. Полазна Добрянского района (As1), характеризуется минимальными показателями численности, неполночленным возрастным спектром инвазионного типа (Тихомирова, Боронникова, 2006; Тихомирова и др., 2007). Возрастные спектры двух других ЦП (As2, As3) – полночленные, нормального типа. По классификации «дельта-омега» все ЦП отнесены к молодым. Индекс восстановления в ЦП A. sibirica варьирует от 38,46% до 86,36%, индекс замещения – от 33,33% до 69,07%, индекс старения – от 0% до 10,16%. Индекс эффективности варьирует от 0,33 до 0,59, индекс возрастности – от 0,10 до 0,37.

Общая численность изученных ЦП D. grandiflora варьирует от 56 до 487, репродуктивная от 42 до 256, а эффективная – от 40 до 239 особей. Базовый возрастной спектр ЦП D. grandiflora полночленный, нормального типа; преобладают молодые генеративные особи (g1). Индекс восстановления в ЦП D. grandiflora варьирует от 17,39% до 35,46%, индекс замещения – от 16,67% до 43,00%, индекс старения – от 11,16% до 18,32%. Индекс эффективности варьирует от 0,57 до 0,63, индекс возрастности – от 0,41 до 0,49. По классификации «дельта-омега» все ЦП D. grandiflora отнесены к переходным.

2. Семенная продуктивность некоторых редких видов растений

2.1. Семенная продуктивность двух видов рода Adonis

Установлено, что показатели семенной продуктивности особей A. vernalis и A. sibirica в Пермском крае невысоки. В отдельные годы отмечено полное отсутствие плодов на особях. В изученных нами ЦП созревания достигают, в основном, плоды средневозрастных генеративных особей (), поэтому мы считаем, что именно эта возрастная группа вносит основной вклад в семенное размножение ЦП A. vernalis и A. sibirica.

Среднее число завязей в цветке A. vernalis равно 61,50, в цветке A. sibirica – 38,32. Число семян на плод у A. vernalis составило 31,10, у A. sibirica – 16,43. Процент семинификации (ПС) A. vernalis – 50,56%, ПС A. sibirica – 42,87%. Число цветков и плодов на особь выше у A. vernalis (3,50 шт. и 1,30 шт. соответственно), по сравнению с A. sibirica (1,48 шт. и 1,02 шт. соответственно). Процент плодоцветения (ПП) на особь у A. vernalis составил 37,14%, у A. sibirica – 68,92%. Потенциальная семенная продуктивность (ПСП) A. vernalis равна 215,25, A. sibirica – 56,71 семяпочкам. У A. vernalis формируется в среднем 40,43 полноценных семян на особь, у A. sibirica – 16,75. Итоговый показатель семенной продуктивности (Кспр) A. vernalis и A. sibirica невысок и равен 18,78% и 29,55% соответственно.

2.2. Семенная продуктивность D. grandiflora

Число семяпочек на завязь выше у молодых (g1) и средневозрастных генеративных особей (g2) D. grandiflora. В среднем на завязь D. grandiflora мы насчитали 337,8 семяпочек. Число семян на плод также достоверно выше у особей g1 и g2 – 264,5 и 278,6 на плод соответственно. В среднем на плод формируется 258,3 полноценных семян. ПС в среднем составил 76,4%, а у g2 – 77,9%. Среднее число цветков на особь составило 22,8 шт., плодов – 7,1 шт. ПП выше у g2 (38,8%) и в среднем составил 31,1%. Показатели потенциальной и фактической семенной продуктивности в расчете на особь увеличиваются от g1 к g3, однако Кспр D. grandiflora выше у g2 (30,2%). В среднем, Кспр равен 23,8%. На одну особь формируется 1833,9 полноценных семян. Этот показатель максимален у особей g3 – 2408,6 семян, однако эффективность семенного размножения выше у особей g2 (Тихомирова, 2005; Боронникова, Тихомирова, 2009). Таким образом, у D. grandiflora показатели семенной продуктивности выше у особей g2 и g3.

3. Анализ генетического разнообразия исследованных ценопопуляций редких видов растений

3.1. Генетическое разнообразие и межпопуляционная дифференциация ценопопуляций A. vernalis, A. sibirica, D. grandiflora

В ЦП A. vernalis отмечены высокие показатели генетического разнообразия (Р95=0,899; He=0,298, Hpop=0,281). Доля полиморфных фрагментов ДНК (Р95) в ЦП A. vernalis варьировала от 0,349 до 0,624, ожидаемая гетерозиготность (He) – от 0,113 до 0,241, индекс разнообразия Шеннона (H0) – от 0,178 до 0,363.

Показано, что ЦП A. vernalis, расположенные в северной части островной Кунгурской лесостепи (Av1, Av2, Av3, Av7, Av10, Av11, Av12), характеризуются более низкими показателями генетического разнообразия (P95=0,596; Hpop=0,194), большей долей выявленных редких фрагментов ДНК (R=0,211) и большей степенью межпопуляционной дифференциации (Gst=0,461) по сравнению с ЦП (Av4, Av5, Av6, Av8, Av9), расположенными в ее южной части (P95=0,834; Hpop=0,351; R=0,137; Gst=0,241).

Отмечено, что выборка из ЦП A. vernalis с относительно высокими показателями численности (Nt=435,7; Nr=358,2; Ne=195,0) характеризуется достоверно более высокими показателями генетического разнообразия (P95=0,779; Hрор=0,304) по сравнению с выборкой из ЦП A. vernalis с низкой общей (Nt=97,6), репродуктивной (Nr=92,3) и эффективной (Ne=46,3) численностью (P95=0,651; Hрор=0,249). Деление ЦП A. vernalis на группы по численности не совпадает с делением ЦП на северные и южные. Степень межпопуляционной дифференциации между 12 ЦП A. vernalis составила 0,428.

В изученных ЦП A. sibirica отмечены высокие показатели генетического разнообразия (Р95=0,892; He=0,333; Hpop=0,292). Самые низкие показатели генетического разнообразия среди изученных ЦП A. sibirica отмечены в As1 (Р95=0,351; He=0,145; H0=0,199), а самые высокие в As3 (Р95=0,811; He=0,294; H0=0,425). Степень межпопуляционной дифференциации между ЦП A. sibirica равна 0,357. Изученные ЦП D. grandiflora характеризуются, в целом, высокими показателями генетического разнообразия (Р95=0,828; He=0,272; Hpop=0,300). Среди ЦП D. grandiflora самые низкие показатели генетического разнообразия отмечены в Dg3 (Р95=0,505; He=0,181; H0=0,288), а самые высокие – в Dg1 (Р95=0,664; He=0,209; H0=0,315). Степень межпопуляционной дифференциации в ЦП D. grandiflora составила 0,269. В ЦП D. grandiflora обнаружена достоверная положительная корреляционная связь между общей (r=0,992; p=0,001) и репродуктивной численностью (r=0,988; p=0,001) и значениями индекса Шеннона (H0); между общей (r=0,932; p=0,021), репродуктивной (r=0,944; p=0,015) численностью и значениями ожидаемой гетерозиготности (Hе); а также между общей (r=0,762; p=0,013) и репродуктивной (r=0,739; p=0,055) численностью и долей полиморфных фрагментов ДНК (P95).

3.2. Молекулярно-генетическая идентификация A. wolgensis

Одним из подходов к оптимизации сохранения биоразнообразия на видовом и популяционном уровнях является молекулярно-генетическая идентификация видов и популяций (Боронникова, 2008). Были проанализированы ISSR- и IRAP-спектры трех видов рода Adonis (A. vernalis, A. sibirica, A. wolgensis).

Для идентификации были выявлены четкие мономорфные и полиморфные фрагменты ДНК, присутствующие в спектрах электрофореза как всех ЦП 3-х видов, так и у отдельных выборок. Были подтверждены родовые и видовые фрагменты ДНК для A. vernalis, A. sibirica и впервые выявлены 4 мономорфных и 14 полиморфных идентификационных фрагментов ДНК ЦП A. wolgensis (рис. 2). Результаты идентификации трех видов рода Adonis представлены в виде молекулярно-генетической формулы и штрихкода в соответствии с технологией молекулярно-генетической идентификации и паспортизации популяций редких видов растений, разработанной С.В. Боронниковой (2008).

Рис. 2. Специфические сочетания фрагментов ДНК в полилокусных спектрах трех видов рода Adonis: Av - A. vernalis, As - A. sibirica, Aw - A. wolgensis, М – маркер молекулярного веса; М1 – номер праймера.

Выявленные четко воспроизводимые мономорфные и полиморфные фрагменты ДНК можно использовать для идентификации природных популяций и лекарственного сырья изученных видов.

4. Комплексный анализ и оценка состояния изученных ценопопуляций некоторых редких видов растений

В ЦП A. vernalis с полночленным возрастным спектром нормального типа была выявлена достоверная положительная корреляционная связь между индексом возрастности () и показателями генетического разнообразия (P95 (r=0,739; p=0,023), He (r=0,627; p=0,049), H0 (r=0,654; p=0,050).

Для комплексной оценки состояния изученных ЦП трех редких видов растений нами была разработана 5-ти балльная система оценки по 12 критериям (табл. 2), учитывалась степень антропогенного воздействия (ан.в.), оказываемого на ценопопуляцию: слабая (5баллов), средняя (3балла), сильная (1балл).

Таблица 2.

Шкала оценки состояния ценопопуляций A. vernalis

Критерии	Баллы
	1	2	3	4	5
Nt, шт.	<91	92-196	197-301	302-405	>406
Nr, шт.	<73	74-146	147-219	220-291	>292
Nе, шт.	<30	31-76	77-121	122-166	>167
IВ, %	<2,53	2,54-7,59	7,60-12,65	12,66-17,71	>17,72
Iз, %	<6,64	6,65-19,93	19,94-33,22	33,23-46,51	>46,52
IС, %	>21,46	16,56-21,45	11,66-16,55	6,76-11,65	<6,75
	<0,366	0,367-0,418	0,419-0,470	0,471-0,522	>0,523
	<0,595	0,596-0,645	0,646-0,695	0,696-0,745	>0,746
P95	<0,377	0,378-0,431	0,432-0,485	0,486-0,539	>0,540
He	<0,123	0,124-0,149	0,150-0,175	0,176-0,201	>0,202
Н0	<0,198	0,199-0,234	0,235-0,270	0,271-0,306	>0,307

Примечание: Nt – общая численность, Nr – репродуктивная численность, Nе – эффективная численность, IВ – индекс восстановления, Iз – индекс замещения, IС - индекс старения, – индекс возрастности, – индекс эффективности, P95 – доля полиморфных фрагментов ДНК, He – ожидаемая гетерозиготность, Н0 – индекс разнообразия Шеннона.

В сумме, ЦП по нашей шкале оценки состояния может набрать от 12 до 60 баллов. Состояние ЦП, набравшей 46-60 баллов, мы оцениваем как стабильное, 29-45 – как относительно стабильное, 12-28 баллов – как нестабильное состояние.

Изученные ЦП трех редких видов растений, состояние которых нами определено как стабильное, характеризуются следующими параметрами: общая численность (Nt) – более 257 особей; эффективная численность (Ne) – более 77 особей; индекс восстановления (Iв) – от 16,5% до 44,3%; индекс старения (Ic) – от 5,3% до 15,2%; индекс возрастности () – от 0,34 до 0,50; доля полиморфных фрагментов ДНК (P95) – более 0,58; ожидаемая гетерозиготность (He) – более 0,20; индекс Шеннона (Н0) – более 0,31.

Относительно стабильное состояние отмечено в ЦП с основными параметрами: общая численность (Nt) – более 124 особей; эффективная численность (Ne) – более 65 особей; индекс восстановления (Iв) – от 8,5% до 30,9%; индекс старения (Ic) – от 4,8% до 28,8%; индекс возрастности () – от 0,37 до 0,47; доля полиморфных фрагментов ДНК (P95) – более 0,44; ожидаемая гетерозиготность (He) – более 0,14; индекс Шеннона (Н0) – более 0,28.

ЦП, состояние которых было определено как нестабильное, имеют общую численность (Nt) от 22 до 248 особей, эффективную численность (Ne) – менее 65 особей, индекс восстановления (Iв) – от 0% до 86,4%, индекс старения (Ic) – от 0% до 18,0%, индекс возрастности () – от 0,10 до 0,56, долю полиморфных фрагментов ДНК (P95) – менее 0,50, ожидаемую гетерозиготность (He) – менее 0,18; индекс Шеннона (Н0) – менее 0,28.

Для применения данного подхода для каждого отдельного редкого вида растений необходимо построение новых вариационных рядов с учетом его биологических особенностей. Построение необходимо проводить по совокупности максимально возможного массива данных в каждом параметре, это позволит более точно провести анализ состояния каждой ЦП.

Сумма набранных баллов в ЦП A. vernalis колебалась от 24 (Av10) до 54 (Av9), в ЦП A. sibirica – от 20 (As1) до 50 (As3), в ЦП D. grandiflora – от 21 (Dg3) до 49 (Dg1). К ЦП со стабильным состоянием были отнесены только две ЦП A. vernalis (Av5, Av9) (рис. 3), одна ЦП A. sibirica (As3) и одна ЦП D. grandiflora (Dg1). Относительно стабильное состояние отмечено в шести ЦП A. vernalis (Av1, Av4, Av6, Av8, Av11, Av12), одной ЦП A. sibirica (As2), трех ЦП D. grandiflora (Dg2, Dg4, Dg5). В нестабильном состоянии находятся четыре ЦП A. vernalis (Av2, Av3, Av7, Av10), одна ЦП A. sibirica (As1) и одна ЦП D. grandiflora (Dg3).

Av5 Av6 Av7

Рис. 3. Лепестковые диаграммы, иллюстрирующие стабильное (Av5), относительно стабильное (Av6) и нестабильное (Av7) состояние ЦП A. vernalis.

На основании комплекса полученных данных для сохранения природных ЦП трех редких реликтовых видов растений Пермского края мы рекомендуем следующие меры охраны и мониторинга:

1) сохранение естественных мест обитания, регламентирование хозяйственной деятельности человека, предусматривающее снижение рекреационной нагрузки;

2) соблюдение режима охраны, предусмотренного для ООПТ, какими являются историко-природный комплекс «Спасская гора» и УНБ «Предуралье»;

3) особое внимание необходимо уделять ЦП A. vernalis, расположенным в северной части островной Кунгурской лесостепи, что связано с большей их уникальностью, изолированностью друг от друга при низком уровне генетического разнообразия;

4) установка информационных щитов со сведениями о редких и охраняемых видах растений, распространенных на прилегающей территории;

5) для сохранения изученных ЦП, находящихся в нестабильном состоянии необходим запрет самовольного изъятия щебня на склоне около дер. Ишимово Октябрьского района, где расположены две изученные ценопопуляции (Av6, Dg3), пересмотр границ ООПТ «Лунежские горы», близко расположенной к As1, проведение интродукционных мероприятий;

6) в каждой ЦП с относительно стабильным состоянием первостепенное внимание необходимо уделять параметрам, имеющим низкие баллы в предложенной шкале оценки: показателям численности – в Av1, Av6, Av8, Dg5; индексам возрастной структуры – в Av6, Dg2, Dg4, As2; показателям генетического разнообразия в – Av11, Av12, Dg5;

7) проведение мониторинговых исследований во всех изученных ЦП с учетом показателей численности, возрастного спектра и генетического разнообразия с целью выявления на начальных этапах их снижения и предотвращения ухудшения состояния данных ЦП, изучение влияния лимитирующих факторов.

Выводы

1. Установлено, что двадцать изученных ценопопуляций трех редких видов растений Пермского края (A. vernalis, A. sibirica, D. grandiflora) характеризуются широко варьирующими показателями численности. В исследованных ценопопуляциях A. vernalis общая численность (Nt) изменяется от 39 до 562 особей, репродуктивная (Nr) – от 37 до 400, а эффективная (Ne) – от 8 до 234 особей, в ценопопуляциях D. grandiflora Nt – от 56 до 487, Nr – от 42 до 256, Ne – от 40 до 239 особей. В ценопопуляциях A. sibirica параметры численности ниже (Nt – от 22 до 257, Nr – от 8 до 136, а Ne – от 8 до 89).
2. Показано, что возрастной спектр у 15 ценопопуляций трех изученных редких видов растений полночленный, нормального типа, у четырех – неполночленный нормального типа и у одной ценопопуляции – неполночленный инвазионного типа. По классификации «дельта-омега», три ценопопуляции отнесены к молодым, одиннадцать – к переходным, четыре – к зрелым, две – к стареющим ценопопуляциям.
3. Индексы возрастных спектров изученных ценопопуляций трех редких видов растений варьируют в широких пределах: индекс восстановления (Iв) – от 0 до 44,49%, индекс возрастности () – от 0,10 до 0,56, индекс старения (Ic) – от 0 до 28,80%, индекс эффективности () – от 0,33 до 0,82, индекс замещения (Iз) – от 0 до 69,07%. Основной показатель возрастного спектра – индекс возрастности () варьирует у A. sibirica – от 0,10 до 0,37, у D. grandiflora – от 0,41 до 0,49, у A. vernalis – от 0,34 до 0,60.
4. Установлено, что изученные виды характеризуются низкой семенной продуктивностью: Кспр A. vernalis равен 18,78%, A. sibirica – 29,55%, D. grandiflora – 23,81%. Показано, что основной вклад в семенное размножение A. vernalis (40,4 полноценных семян на особь) и A. sibirica (16,7 полноценных семян на особь) вносят средневозрастные генеративные особи (g2), а у D. grandiflora – средневозрастные и старые генеративные особи (у g2 – 2089,5 и у g3 – 2408,6), что свидетельствует о превалировании в семенном размножении изученных видов именно этих возрастных состояний.
5. Установлено, что ценопопуляции трех изученных редких видов растений в целом характеризуются высокими показателями генетического разнообразия: A. vernalis (Р95=0,899; He=0,298; Hpop=0,281); A. sibirica (Р95=0,892; He=0,333; Hpop=0,292); D. grandiflora (Р95=0,828; He=0,272; Hpop=0,300). Показано, что A. vernalis характеризуется высоким уровнем межпопуляционной дифференциации (=0,428). Величина параметра ниже у A. sibirica (=0,357) и у D. grandiflora (=0,269).
6. Выявлено, что ценопопуляции A. vernalis, расположенные в северной части островной Кунгурской лесостепи, характеризуются более низкими показателями генетического разнообразия (P95=0,596; Hpop=0,194), большей долей выявленных редких фрагментов ДНК (R=0,211) и большей степенью межпопуляционной дифференциации (Gst=0,461) по сравнению с ценопопуляциями, расположенными в южной части Кунгурской островной лесостепи (P95=0,834; Hpop=0,351; R=0,137; Gst=0,241).
7. В ценопопуляциях A. vernalis с полночленным возрастным спектром отмечена достоверная положительная корреляционная связь между показателем возрастности () и основными показателями генетического разнообразия, такими как доля полиморфных фрагментов ДНК (r=0,74; p=0,02), ожидаемая гетерозиготность (r=0,63; p=0,05) и индекс разнообразия Шеннона (r=0,65; p=0,05).

8. С целью оптимизации сохранения биоразнообразия на популяционном уровне апробирована методика молекулярно-генетической идентификации на примере ценопопуляции A. wolgensis; выявлены 4 мономорфных и 14 полиморфных идентификационных фрагментов ДНК, подтверждены родовые и впервые идентифицированы видовые фрагменты ДНК этого вида.

9. На основании комплексного анализа дана оценка состояния и рекомендованы меры охраны изученных ценопопуляций трех редких видов растений Пермского края: в стабильном состоянии находятся 17% ценопопуляций A. vernalis, 33% – A. sibirica и 20% – D. grandiflora; в относительно стабильном состоянии – 50% ценопопуляций A. vernalis, 33% – A. sibirica и 60% – D. grandiflora; а в нестабильном состоянии – 33% ценопопуляций A. vernalis, 33% – A. sibirica и 20% – D. grandiflora.

Список публикаций по теме диссертации

Статьи в научных журналах, рекомендованных ВАК РФ

1. Боронникова С.В., Тихомирова (Бельтюкова) Н.Н. Анализ генетической изменчивости популяций 2-х редких лекарственных видов рода Adonis с использованием ISSR-маркеров // Известия ТСХА. 2008. №1. С. 86–91.

2. Боронникова С.В., Тихомирова (Бельтюкова) Н.Н. Семенная продуктивность редкого лекарственного вида Digitalis grandiflora Mill. в Пермском крае // Раст. ресурсы. 2009. №2. С. 17–22.

3. Бельтюкова Н.Н., Боронникова С.В., Кариева Л.Г. Исследование генетического полиморфизма лекарственного вида Digitalis grandiflora Mill. с использованием анализа ретротранспозонов // Аграрная Россия. 2009. №4. С. 20–23.

Публикации в других изданиях

1. Тихомирова (Бельтюкова) Н.Н. Изучение ценопопуляций Digitalis grandiflora Mill. в УНБ «Предуралье» // Фундаментальные и прикладные исследования в биологии и экологии: материалы студенческой научной конференции / Перм. ун-т. Пермь. 2005. С. 26–28.
2. Кокаева З.Г., Боронникова С.В., Тихомирова (Бельтюкова) Н.Н., Дрибноходова О.П. Анализ генетического разнообразия популяционных систем редких и ресурсных видов растений // IY Международная научная конференция «Биотехнология – охране окружающей среды». Доклады МОИП Москва. 2006. C. 122.
3. Боронникова С.В., Тихомирова (Бельтюкова) Н.Н. Структура ценопопуляций и семенная продуктивность Digitalis grandiflora Mill. в Предуралье // Бюлл. бот. сада Саратовского гос. ун-та. Материалы Всеросс. науч. конф. «Ботанические исследования в Поволжье и на Урале», посвященная 50-летию Ботанического сада СГУ им Н.Г. Чернышевского. Саратов: изд-во «Научная книга». 2006. Вып. 5. С. 77–82.
4. Тихомирова (Бельтюкова) Н.Н., Боронникова С.В. ДНК-полиморфизм и демографические характеристики популяций некоторых редких видов растений Предуралья // Международная конференции «Генетика в России и мире, посвященная 40-летию Института общей генетики им. Н.И.Вавилова РАН». Москва. 2006. С. 200.
5. Тихомирова (Бельтюкова) Н.Н., Боронникова Н.Н., Кокаева З.Г., Гостимский С.А. Популяционные характеристики и ДНК-полиморфизм Adonis sibirica Patrin ex Ledeb. в Пермском крае // Перспективы развития и проблемы современной ботаники: материалы I (III) Всероссийской молодежной научно-практической конференции ботаников в Новосибирске. Новосибирск. 2007. С. 233–235.
6. Боронникова С.В., Мандрица С.А., Кокаева З.Г., Суслонов А.В., Шибанова Н.Л., Тихомирова (Бельтюкова) Н.Н., Дрибноходова О.П. Динамика генетического разнообразия и структуры популяционных систем ресурсных растений Пермского края при антропогенных воздействиях // Региональный конкурс РФФИ-Урал. Результаты научных исследований, полученные за 2007 г. Пермь: ПНЦ УрО РАН, 2008. Ч. 2. С. 60–65.
7. Тихомирова (Бельтюкова) Н.Н., Боронникова С.В. Анализ геномов лекарственных растений с использованием молекулярных маркеров // Материалы Пятого Московского международного конгресса. М.: ЗАО «Экспо-биохим-технологии», РХТУ им. Д.И. Менделееева. 2009. Часть 1. С. 213–214.
8. Кокаева Л.Ю., Кокаева З.Г., Боронникова С.В., Тихомирова (Бельтюкова) Н.Н., Кокаев Ю.И. Исследование генетического полиморфизма некоторых видов лекарственных растений // Материалы Пятого Московского международного конгресса. М.: ЗАО «Экспо-биохим-технологии», РХТУ им. Д.И. Менделееева, 2009 Часть 1. С. 323–324.
9. Тихомирова (Бельтюкова) Н.Н. Исследование ценопопуляций Adonis vernalis L. в Пермском крае // Симбиоз Россия 2009: материалы II Всерос. с международным участием конгресса студентов и аспирантов-биологов / Перм. гос. ун-тет. Пермь. 2009. С. 247–248.
10. Beltukova N.N., Boronnikova S.V. The research of rare and decorative plant genomes with use of molecular markers // Abstract of the 13th annual Simposium for Biology Students of Europe — Kazan 2009 / Edited by Tatiana V. Baltina. Kazan: printed Kazan State University. 2009. P. 42.
11. Бельтюкова Н.Н., Бойкова А.А., Боронникова С.В. Популяционные характеристики Adonis vernalis L. в Пермском крае // Ботанические исследования на Урале: материалы регион. с междунар. участием науч. конф., посвящ. памяти П.Л. Горчаковского / отв. ред. С.А. Овеснов. Перм. гос. ун-т. Пермь. 2009. С. 36–39.

Подписано в печать 9.03.2010. Формат 60х84 1/16

Усл. печ. л. 1. Тираж 100 экз. Заказ 70.

Типография Пермского университета. 614990, г. Пермь, ул. Букирева, 15