Цитохром р450 зависимые монооксигеназы и иммунный ответ при иммобилизационном стрессе у гипертензивных крыс
На правах рукописи
Козочкин Денис Александрович
ЦИТОХРОМ Р450 ЗАВИСИМЫЕ МОНООКСИГЕНАЗЫ И ИММУННЫЙ ОТВЕТ ПРИ ИММОБИЛИЗАЦИОННОМ СТРЕССЕ У ГИПЕРТЕНЗИВНЫХ КРЫС
03.00.04 – биохимия
14.00.36 - аллергология и иммунология
Автореферат
диссертации на соискание ученой степени
кандидата медицинских наук
Челябинск – 2009
Работа выполнена в Государственном Образовательном Учреждении Высшего Профессионального образования «Челябинская государственная медицинская академия Федерального агентства по здравоохранению и социальному развитию Российской Федерации»
НАУЧНЫЕ РУКОВОДИТЕЛИ:
доктор биологических наук, профессор Цейликман Вадим Эдуардович
доктор биологических наук, профессор Маркель Аркадий Львович
ОФИЦИАЛЬНЫЕ ОППОНЕНТЫ:
доктор медицинских наук, профессор Высокогорский Валерий Евгеньевич
доктор медицинских наук, профессор Телешева Лариса Федоровна
ВЕДУЩАЯ ОРГАНИЗАЦИЯ:
Государственное Образовательное Учреждение Высшего Профессионального образования «Российский Государственный Медицинский Университет Федерального агентства по здравоохранению и социальному развитию»
Защита состоится «____» ____________ 2009 г. в ___ часов на заседании диссертационного совета Д 208.117.02 при ГОУ ВПО «Челябинская государственная медицинская академия Федерального агентства по здравоохранению и социальному развитию Российской Федерации» (454092, г. Челябинск, ул. Воровского, 64).
С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке ГОУ ВПО «Челябинская государственная медицинская академия Федерального агентства по здравоохранению и социальному развитию Российской Федерации» (454092, г. Челябинск, ул. Воровского, 64).
Автореферат разослан «____» ______________ 2009 г.
Ученый секретарь
диссертационного совета
доктор медицинских наук Тишевская Наталья Викторовна
ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ
Актуальность исследования: Гипертоническая болезнь (ГБ) занимает весомую позицию в структуре основных заболеваний неинфекционной природы, сокращающей продолжительность жизни. Кроме того, артериальная гипертензия связана с такими заболеваниями как ишемическая болезнь сердца, атеросклероз, сахарный диабет и является облигатным компонентом метаболического Х-синдрома. Стресс присутствует среди патогенетических звеньев ГБ центрального генеза и способствует формированию, устойчивых во времени, нарушений регуляций артериального давления (Маркель А.Л., 1986 ). Прежде всего, это связано с увеличением порога чувствительности гипоталамуса к ингибиторному действию циркулирующих глюкокортикоидов, что создаёт определённое напряжение в функционировании длинной петли отрицательной обратной связи и провоцирует «аллостатическую перегрузку» кортикостероидами (Науменко Е.В., Маслова Л.Н., Маркель А.Л., 1988). В подобной ситуации правомерно ожидать усиление биохимических механизмов, обеспечивающих терминальную биотрансформацию глюкокортикоидов, позволяющую хотя бы частично смягчить «эндокринный прессинг» стрессорных гормонов.
Система цитохром Р450-зависимых монооксигеназ обеспечивает поддержание гомеостаза, как на уровне клетки, так и на уровне организма за счёт выполнения двух основных функций: защиты организма от чужеродных низкомолекулярных соединений - ксенобиотиков и биотрансформации эндогенных липофильных молекул – эндобиотиков (С.В. Сибиряк, С.А. Сергеева.,1998). С помощью изоформ цитохрома Р450 осуществляется биосинтез и катаболизм холестерина, стероидных гормонов, так называемых «цитохромных» метаболитов арахидоновой кислоты, обладающих вазотропным действием (Wuttke H, Rau T, Heide R,. 2002., Д.С. Сибиряк., 2005). По этой причине как у пациентов с ГБ, так и у гипертензивных крыс отмечены изменения активности изоформ цитохрома Р450, принимающих участие в реакциях инактивации глюкокортикоидов (CYP3A) и вовлечённых в метаболизм арахидоновой кислоты (CYP1A1, CYP1A2, CYP2B1, CYP4A). Важно отметить, что среди цитохромных метаболитов арахидоновой кислоты присутствуют факторы (20-HETE) обладающие прессорным действием. Более того, именно они вовлечены в развитие глюкокортикоид-индуцированной гипертензии (Gebremedhin et all., 2000)
У пациентов ГБ и у гипертензивных крыс отмечено повышение содержания провоспалительных цитокинов, для которых характерна способность активировать гипоталамо-гипофизарно-адреналовую систему, что в условиях гипертензии приводит к дополнительному увеличению мощности стресс-реализующих систем. Необходимо отметить, что при рассмотрении проблем касающихся неимунной функции иммунной системы от внимания исследователей нередко ускользает ещё один важный аспект. Речь идёт о взаимосвязи иммунной системы с системой цитохром Р450-зависимых монооксигеназ. Известно, что содержание цитохрома Р450 и его монооксигеназные активности снижаются при развитии бактериальной и вирусной инфекциях, иммунизации различными антигенами, а также в условиях фармакологической иммуностимуляции. Этот эффект опосредован провоспалительными цитокинами (И.А. Волчегорский, И.И. Долгушин, О.Л. Колесников., В.Э.Цейликман., 1998). Депремирующее воздействие на цитохром Р450 - зависимые монооксигеназы оказывают IL-1, IL-2, IL-11, TNF и т.д. Таким образом, регуляторное влияние иммунной системы на эндокринный и метаболический статус может реализоваться через систему цитохром Р450-зависимых монооксигеназ. Этот путь становится особенно значимым при ГБ, характеризующейся дополнительной активацией стресс-реализующих систем. Экспериментальной моделью, позволяющей охарактеризовать роль наследственности и стрессорных воздействий в развитии ГБ, является линия гипертензивных крыс НИСАГ (Наследственная индуцированная стрессом артериальная гипертензия), полученная в Институте цитологии и генетики СО РАН А. Л. Маркелем. В ходе многолетних исследований у этой линии изучено состояние основных стресс-реализующих систем, сердечно-сосудистой и выделительной системы. Однако остаётся неизученными состояние цитохром Р450 - зависимых монооксигеназ и иммунный статус в пределах иммунохимической функциональной системы гомеостаза у гипертензивных крыс.
Цель исследования:
Изучить состояние иммунохимической функциональной системы гомеостаза у гипертензивных крыс линии НИСАГ в условиях хронического стресса
Задачи исследования:
- Провести сопоставление по активности цитохром Р450 зависимых монооксигеназ, содержанию циркулирующего кортикостерона, IL-1, IL-6, количества кариоцитов и особенностей клеточного цикла в иммунных органах у нестрессированных нормотензивных и гипертензивных крыс.
- Изучить способность иммуностимулятора пирогенала влиять на уровень артериального давления у крыс линии НИСАГ.
- Изучить влияние ежедневных иммобилизаций на активность цитохром Р450-зависимых монооксигеназ в печени и в почках гипертензивных крыс.
- Исследовать влияние различных режимов хронического иммобилизационного стресса на чувствительность гипертензивных крыс к иммунизации.
- Изучить влияние редко чередующихся иммобилизаций на активность цитохром Р450-зависимых монооксигеназ в печени гипертензивных крыс
- Изучить влияние редко чередующихся иммобилизаций на чувствительность иммунных органов и печени к действию глюкокортикоидного препарата триамцинолона ацетонида.
Научная новизна
Впервые у гипертензивных крыс линии НИСАГ определены особенности цитохром Р450-зависимого монооксигенирования, состояния иммунных органов и чувствительности к провоспалительным факторам. Установлено, что у нестрессированных крыс линии НИСАГ по сравнению с нестрессированными крысами Вистар в печени повышена активность изоформ CYP1А1 и CYP3A и снижена активность изоформы CYP2В1/2, а в почках увеличен уровень CYP2В1/2-зависимого монооксигенирования. Впервые обнаружена способность пирогенала снижать уровень артериального давления у гипертензивных крыс линии НИСАГ. Установлено, что после завершения ежедневных и редко чередующихся иммобилизаций у гипертензивных крыс по сравнению с нормотензивными снижен уровень клеточного иммунного ответа и повышен уровень цитохром Р450-зависимого монооксигенирования. Обнаружен более высокий уровень провоспалительных цитокинов в сыворотке стрессированных и нестрессированных гипертензивных крыс. При редко чередующихся иммобилизациях отмечено повышение чувствительности лимфоидных органов к гипоплазирующему действию глюкокортикоидного препарата триамциналона ацетонида и повышение эффективности его антивоспалительного действия по отношению к печени.
Теоретическое и практическое значение.
Выполненное исследование позволяет охарактеризовать особенности реакции цитохром Р450-зависимых монооксигеназ и системы иммунобиологического надзора у стрессированных гипертензивных крыс с позиции концепции иммунохимической функциональной системы гомеостаза и адаптационных стратегий. Практическое значение определяется участием изученных изоформ в метаболизме антигипертензивных препаратов. Поэтому результаты, касающиеся модифицирующего влияния хронического стресса на систему цитохром Р450-зависимых монооксигеназ, целесообразно учитывать при использовании в терапии антигипертензивныхи препаратов.
Положения, выносимые на защиту:
- У нестрессированных и стрессированных крыс линии НИСАГ активность цитохром Р450-зависимых монооксигеназ имеет органоспецифичный характер.
- У стрессированных крыс линии НИСАГ вне зависимости от режима стрессирования снижена интенсивность ГЗТ-реакции и повышен уровень цитохром Р450-зависимого монооксигенирования
- При редко чередующихся иммобилизациях у крыс линии НИСАГ повышение содержания циркулирующего кортикостерона ассоциировано с повышением чувствительности иммунных органов к гипоплазирующему действию глюкокортикоидного препарата и повышению эффективности антивоспалительного гепатотропного действия экзогенного глюкокортикоида.
Апробация работы
Основные положения работы изложены и представлены на 12th International Congress of Immunology (Montreal, Canada, 2004); Межрегиональной научно – практической конференции «IV конференция иммунологов Урала» (Челябинск, 2005); Международном молодежном медицинском конгрессе «Санкт- Петербургские научные чтения» (Санкт – Петербург, 2005); International society for adaptive medicine VIII Word congress (Moscow, Russia, 2006); IV съезде российского общества биохимиков и молекулярных биологов (Новосибирск, 2008).
Публикации
По теме диссертации опубликовано 14 печатных работ, из них 3 – в рецензируемых журналах по перечню ВАК Минобразования РФ.
Объем и структура диссертации
Диссертация изложена на 130 страницах машинописного текста и состоит из введения, обзора литературы, описания материалов и методов, трех глав собственных исследований, обсуждения результатов, выводов. Библиографический указатель включает 245 источника: 145 – на русском языке и 100 – на иностранном. Работа содержит 14 таблиц, 9 рисунков.
МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ
Исследования проведены на 230 половозрелых крысах-самцах массой 200 - 260 г линий Вистар и НИСАГ из популяции вивария Института цитологии и генетики СО РАН. Крысы линии НИСАГ (наследственная индуцированная стрессом артериальная гипертензия) селекционированы на патологию в виде повышения артериального давления на эмоциональный стресс из аутбредных крыс Вистар, и отличаются от них по ряду физиологических и поведенческих признаков.
Животных содержали в условиях лабораторного вивария в стандартных пластмассовых клетках при питании натуральным кормом в количестве, соответствующем суточным нормам. За 24 часа до эксперимента животным прекращали подачу пищи при неограниченном доступе к воде. Эксперименты проведены в соответствии с этическими нормами и рекомендациями по гуманизации работы с лабораторными животными (Кополадзе Р. А., 1998), отраженными в “Европейской конвенции по защите позвоночных животных, используемых для экспериментальных и других научных целей” (Страсбург, 1985). Эвтаназию грызунов осуществляли цервикальной дислокацией под эфирным наркозом.
Хронический стресс воспроизводился часовыми иммобилизациями, которые осуществлялись путём фиксации животного за конечности на спине (Волчегорский И. А. и соавт., 2000). Были использованы два режима повторных стрессорных воздействий.
Первый режим повторных стрессорных воздействий воспроизводили одночасовыми иммобилизациями, с интервалом 72 часа между отдельными стрессорными эпизодами (редко - чередующиеся иммобилизации - РЧИМ). Всего животные четырежды подвергались 1 часовому иммобилизационному стрессу. Увеличение временного интервала между отдельными стрессорными эпизодами затрудняет развитие габитуации и каждое новое воздействие на животное содержит определённый элемент внезапности. Поэтому данный режим иммобилизационного стресса гомологичен «стрессу повседневной жизни». Второй режим воспроизводился путём ежедневных часовых иммобилизаций (ЕИМ) в течение 3 суток. Согласно полученным ранее данным, при таком способе моделирования хронического стресса доминирует толерантная стратегия адаптации (Волчегорский И. А. и соавт., 1998 Цейликман В.Э., 1998).
С целью моделирования стрессорной активации ГГАС подкожно вводили пролонгированный глюкокортикоидный препарат триамцинолона ацетонид (кеналог, Veb Berlin Chemie, Германия) в дозе 2 мг/кг, предварительно суспендированный в 0,9% растворе NaCl (Волчегорский И. А., 1993; Волчегорский И. А. и соавт., 2000). Животные другой группы получали эквиобъёмное количество 0,9% NaCl. Еще две группы крыс получали аналогичные инъекции без предварительного стрессирования и через тот же промежуток времен. Инъекции осуществляли через 24 часа после завершения периодических воздействий. Через 96 ч с момента подкожного введения триамцинолона ацетонида или 0,9% NaCl крыс забивали под эфирным наркозом, путём цервикальной дислокации. Чувствительность к глюкокортикоидам оценивали по степени кеналог-индуцированного снижения массы вилочковой железы (Волчегорский И. А. и соавт., 2000).
Моделирование асептического воспаления.
Асептическое воспаление изучали на модели формалинового отека, который индуцировали субплантарным введением в правую заднюю конечность 0,1 мл 3% раствора формалина. Онкометрию осуществляли через 24 часа после введения 3% формалина. Индекс реакции вычислялся по среднему проценту увеличения объема воспаленной лапы по отношению к здоровой.
Измерение артериального давления.
Артериальное давление у крыс измеряли сфигмографическим методом на хвосте. Давление в манжетке и пульсовые колебания регистрировались на полифизиографе «Biocomb-5» с помощью соответствующих датчиков давления «Statham P23» и «Elema Schonender ЕМТ-510». Для измерения контрольных величин животным давали кратковременный эфирный наркоз, чтобы избежать влияния эмоционального стресса, непосредственно связанного с процедурой измерения.
Биохимические методы исследования.
Содержание продуктов перекисного окисления липидов оценивали спектрофотометрически в липидном экстракте исследуемых тканей по методике Волчегорского И.А. и др. (1989).
В гомогенатах тканей определяли активность моноаминоксидазы (МАО, аминкислородоксидоредуктазы (дезаминирующей, флавинсодержащей), К.Ф. 1.4.3.4.). Применяли модифицированный метод Волчегорского И. А. и др. (1991).
Для оценки монооксигеназных активностей в печени[1] использовалась субмитохондриальная фракция -12000g-гомогенаты (S12-фракция), которые адекватно заменяют очищенные микросомы (Pelkonen O. е.a.,1974).
Флюориметрическим методом (Pocl R., Foutus J., 1978) определяли 7-этоксирезоруфин-О-деэтилазную активность (ЭРОД-активность; CYP1A1 – зависимое монооксигенирование) и активность дебензилирования 7 - дибензилоксирезоруфина (БРОД-активность; CYP2В1/2-зависимое монооксигенирование). Для определения CYP3A-зависимого монооксигенирования осуществляли деметилирование эритромицина (Wrighton S. et al., 1985). Для определения CYP2C-зависимого монооксигенирования осуществляли определение дибензилфлюоресцеиндебензилазной (ДБФД) активности. Содержание циркулирующих цитокинов определяли иммуноферментными методами анализа с использованием наборов BIOSORCE (Бельгия). Уровень кортикостерона в сыворотке оценивали флюориметрическим микрометодом (Балашов Ю. Г., 1990).
Морфологические и морфометрические исследования[2] .
Проводились морфологические исследования печени и почек крыс. Срезы органов окрашивали гематоксилином и эозином для гистологических исследований. Объёмную плотность клеток определяли при помощи окулярной стереометрической сетки. Микроскопические исследования проводили при увеличении 420, 945. Отёк и некроз определяли по методу Автандилов Г.Г., 1989.
Гематологические методы.
Изучение периферической крови проводилось общепринятыми методами (Гольдберг Е.Д., Дыгай А.М., 1992) и заключалось в подсчете эритроцитов и лейкоцитов в камере Горяева. Лейкоцитарную формулу изучали в мазках, окрашенных по Романовскому-Гимзе (проводился подсчет не менее чем 200 клеток). Мазки периферической крови, также как мазки-отпечатки костного мозга и селезёнки, перед окраской фиксировали метанолом.
Иммунологические методы.
Животных иммунизировали тимусзависимым антигеном – аллогенными эритроцитами барана (ЭБ). Животных сначала иммунизировали внутрибрюшинно эритроцитами в объёме 0,5 мл, а через 4 дня проводили повторную иммунизацию эритроцитами под апоневроз стопы. Под апоневроз контрольной стопы вводили такой же объём физиологического раствора. В качестве сенсибилизирующей дозы использовали 1108 эритроцитов, а в качестве разрешающей 5107 эритроцитов. Выраженность реакции ГЗТ оценивали волюмометрически через 24 часа после разрешающей иммунизации антигена.
Исследование функционального состояния фагоцитов.
НСТ-тест – проводили по методу Стюарта в модификации Нагоева Б. С. (1987). Активность НСТ-теста выражали в виде процентной доли диформазан - положительных клеток, интенсивность (в условных единицах) рассчитывали по формуле G. Astaldl и L.Verga (1957).
О гуморальном иммунном ответе судили по уровню антителообразующих клеток в селезенке крыс, иммунизированных эритроцитами (Jerne N. K., Nordin A. A., 1963).
Для оценки соотношения между темпами апоптоза и пролиферации ядросодержащие клетки в тимусе, костном мозге и селезёнке окрашивали йодистым пропидием (Sigma, USA) и подвергали проточной цитометрии (проточный цитофлюориметр «Facs Calibur Becton Dickinson», USA). Содержание циркулирующих цитокинов определяли иммуноферментным методом на планшетном фотометре «Multiskan Plus» (Labsystems) с использованием коммерческих наборов BIOSORCE (Бельгия).
Статистическая обработка результатов.
Данные обрабатывались общепринятыми методами статистического анализа медицинских данных (Реброва О.Ю., 2003; Лакин Г.Ф., 1990) и выражались в виде среднеарифметической (М) и её стандартной ошибки (m). О достоверности различий средних величин судили по критериям непараметрической статистики (Гублер Е.В., Генкин А.А., 1969): Манна-Уитни (U). О различиях в распределении судили по критериям Колмогорова-Смирнова () и Вальда-Вольфовица (WW), Ньюмана-Келса (ANOVA). Достоверность качественных различий выявляли при помощи точного критерия Фишера (ТКФ). Применялись только односторонние критерии, различия считали значимыми при Р < 0,05. Статистические взаимосвязи изучали при помощи непараметрического корреляционного анализа, выполняя расчёт коэффициентов корреляции рангов по Спирмену (rs) и Кенделлу (rk). Для обработки результатов исследований использовали пакет прикладных программ “Statistica 6.0 for Windows”.
РЕЗУЛЬТАТЫ СОБСТВЕННЫХ ИССЛЕДОВАНИЙ
И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ
1. Особенности цитохром Р450-зависимых монооксигеназ и системы иммунобиологического надзора у нестрессированных крыс Вистар и НИСАГ.
Установлено, что гипертензивные крысы характеризовались сниженным уровнем кортикостерона (Вистар 46,03±1,5 пг/мл, n=10; НИСАГ 31,74±3,4 пг/мл, n=9, р=0,034 WW) и повышенным уровнем циркулирующего IL-6 (рисунок 1), это хорошо согласуется с данными других исследователей (Черкасова О.П., 2006; Шорин Ю.П., 1990).
Рисунок 1
Содержание циркулирующего интерлейкина-6, интерлейкина-1 у нормотензивных и гипертензивных крыс
Примечание: * - статистически значимые отличия между группами Вистар и НИСАГ, р<0,05 U
U-критерий Манна-Уитни.
Скорее всего, соотношение глюкокортикоиды/провоспалительные цитокины может выступать в роли индекса, характеризующего баланс между стрессорной и воспалительной реактивностью. В пользу этого говорит факт снижения уровня артериального давления у гипертензивных крыс в ответ на введение неспецифического иммуностимулятора пирогенала в дозе 6,25мкг/кг на 15 мм.рт.ст. («НИСАГ+0,9% NaСl» 161±2,3 мм.рт.ст., n=9, «НИСАГ+пирогенал» 149,7±4,1 мм.рт.ст., n=9, р <0,05 U).
Вполне возможно, что позитивный эффект пирогенала реализуется благодаря активации цитокинзависимой индуцибельной NO-синтазы.
У крыс НИСАГ отмечен более высокий уровень воспалительной реактивности по сравнению с нормотензивными крысами, что проявлялось в более отчетливом развитии отёка стопы после введения формалина (Вистар 11,3±0,9 n=6; НИСАГ 14,2±0,7 n=6 р=0,034 WW). Это может быть связано с сенситизацией гипертензивных крыс к действию минералокортикоидов и/или вазопрессина.
Характерной особенностью гипертензивных крыс является повышенный уровень активности изоформ цитохрома Р450 CYP1A1 и CYP3A (рисунок 2). Особый интерес представляют данные касающиеся активности изоформы CYP2B1/2: в печени происходит снижение активности при одновременном увеличении активности CYP2B1/2 в почках гипертензивных крыс (рисунок 2). Разнонаправленные изменения активности в печени и почках CYP2B1/2 ассоциируются с отмеченным ранее (О.П. Черкасова.,2006) оппозитным характером активности фермента 11-стероиддегидрогеназы, регулирующей уровень активных глюкокортикоидов.
Рисунок 2
Монооксигеназная активность изоформ CYP1A1, CYP2B1/2, CYP3A
у нормотензивных и гипертензивных крыс в печени и почках
ПЕЧЕНЬ ПОЧКИ
Примечание: приведены данные по монооксигеназным реакциям, отражающим активность изоформ CYP1A1(ЭРОД-активность), CYP2B1/2 (БРОД-активность) и CYP3A(ЭРНД-активность). * - статистически значимые отличия. Данные обработаны с использованием критериев Вальда-Вольфовитца, Колмогорова- Смирнова и Манна-Уитни, р<0,05
Повышение активности печёночной МАО-Б у крыс линии НИСАГ (Вистар 27,37±5,12 нМ/орган/мин, n=10; НИСАГ 78,07±20,16 нМ/орган/мин, n=10 р<0,05 U) также может быть связано, со снижением содержания кортикостерона, поскольку известно, что глюкокортикоиды угнетают активность этого фермента.
Благодаря десенситизации к провоспалительным цитокинам у гипертензивных крыс не сформировался более высокий уровень иммуно-воспалительного процесса по реакции ГЗТ, чем у нормотензивных крыс (Вистар 4,75±0,36 см3, n=8; НИСАГ 4,25±0,59 см3, n=8). Сниженным уровнем кортикостерона можно объяснить более низкие темпы апоптоза в тимусе гипертензивных крыс (Вистар 1,41±0,02 % апоптотических тимоцитов, n=10; НИСАГ 0,64±0,05 % апоптотических тимоцитов, n=10, р <0,05 U).
2. Особенности воспалительной и стрессорной реактивности у нормотензивных и гипертензивных крыс при ежедневных иммобилизациях (ЕИМ) и редкочередующихся иммобилизациях (РЧИМ).
Изменения воспалительной реактивности после завершения ежедневных иммобилизаций соответствовали правилу исходного состояния Вальдера-Лейтеса (1968). У гипертензивных крыс отмечено постстрессорное снижение выраженности отёчности лапы, а у крыс Вистар тот же самый стресс привёл к увеличению выраженности отёчности лап в ответ на введение формалина (таблица 1).
Установлено, что ЕИМ у крыс линии Вистар увеличили интенсивность реакции ГЗТ, что свидетельствует о стимуляции клеточного звена иммунитета (Вистар Контроль 4,75±0,36 см3, n=8; Вистар ЕИМ 6,0±0,23 см3, n=8 р<0,05 WW). Полученный результат также свидетельствует о постстрессорном повышении чувствительности к флогогенным факторам, так как реакцию ГЗТ принято рассматривать как проявление иммунно-воспалительного процесса (Волчегорский И.А., Долгушин И.И. и соавт., 2000). Для стрессированных крыс линии НИСАГ отмечена тенденция к снижению интенсивности ГЗТ-реакции не достигшая статистически значимой величины (таблица 1).
Таблица 1
Выраженность ГЗТ реакции и отёка стопы при введении формалина у нормотензивных и гипертензивных крыс.
| Группа | ГЗТ, см3 n=8 | Формалиновый отек, Индекс реакции n=8 |
| Вистар Контроль | 4,75±0,36 | 11,3±0,9 |
| НИСАГ Контроль | 4,25±0,59 | 14,2±0,7** |
| Вистар ЕИМ | 6,0±0,23* | 12,5±0,3* |
| НИСАГ ЕИМ | 2,8±0,31** | 13,7±0,5* |
| Вистар РЧИМ | 2,75±0,4 | 13,4±0,3 |
| НИСАГ РЧИМ | 2,12±0,31** | 16,6±0,4 |
* - внутрилинейные статистически значимые отличия. **-межлинейные статистически значимые отличия. Данные обработаны с использованием критерия Вальда-Вольфовитца; р<0,05
Таким образом, у крыс при ЕИМ по уровню ГЗТ реакции наблюдались межлинейные различия, характеризующиеся более низкой выраженностью ГЗТ реакции у крыс НИСАГ.
У стрессированных крыс линии НИСАГ содержание сывороточного IL-6 превышало на 12 % уровень, характерный для нормотензивных крыс (ЕИМ Вистар 41,07±22,7 пг/мл, n=7; ЕИМ НИСАГ 46,42±25, n=7 р=0,038 WW). В тоже время, для IL-1 не было зарегистрировано подобных различий (ЕИМ Вистар 50,62 ±7,3 пг/мл, n=7; ЕИМ НИСАГ 39,2±20,6, n=7).
Факт повышенного содержания провоспалительных цитокинов при одновременном снижении воспалительной реактивности у гипертензивных животных даёт основание предполагать наличие десенситизации к провоспалительным цитокинам у гипертензивных крыс.
Через сутки после завершения ЕИМ у крыс Вистар отмечалась супрессия CYP1A1-и СYP2B1/2-зависимого монооксигенирования. У крыс линии НИСАГ, через 24 часа после завершения ЕИМ подавлялась только ЭРНД активность (CYP3A-зависимое моноксигенирование). У остальных исследованных изоформ цитохрома Р450 уровень монооксигеназной активности не претерпел статистически значимых изменений. Таким образом, у крыс с более низким уровнем стрессорной реактивности ЕИМ вызвал более значительную супрессию цитохром Р-450-зависимых монооксигеназ. Поэтому у стрессированных крыс линии НИСАГ уровень CYP1A1-зависимой ЭРОД активности, а так же СYP3А - зависимой ЭРНД активности был гораздо выше чем у стрессированных крыс линии Вистар (Рисунок 3).
Рисунок 3
Монооксигеназная активность изоформ CYP1A1, CYP2B1/2, CYP2С и CYP3А в печени у нормотензивных и гипертензивных крыс через сутки после завершения повторных иммобилизаций
Примечание: В этой таблице приведены данные по монооксигеназным реакциям,отражающим активность изоформ CYP1A1(ЭРОД), CYP2B1/2 (БРОД) и активность изоформ CYP2С (ДБФ) и CYP3A (ЭРНД) * - внутрилинейные различия # межлинейные различия р<0,05 U-критерий Манна-Уитни
У крыс линии НИСАГ после завершения ЕИМ наблюдалось повышение уровня IL-6, что не привело к супрессии изоформ CYP1A1 и CYP2B1/2 в печени. Зато снизилась активность изоформы CYP3A(рисунок 3)., играющей ключевую роль терминальной биотрансформации глюкокортикоидных гормонов в печени (Stresser D., 2000)
По видимому, в условиях ежедневных иммобилизаций супрессия CYP3А-зависимого монооксигенирования даёт возможность поддерживать в течение длительного времени необходимый уровень функционально активных форм глюкокортикоидных гормонов.
В условиях доминирования толерантной стратегии у крыс с более высоким уровнем стрессорной реактивности, наблюдались провоспалительные гепатотропные эффекты, но гораздо масштабней протекал воспалительный процесс в почках. Между тем у нормотензивных животных не обнаружено наличие подобных тенденций. Важно отметить, что по данным литературы у гипертензивных и нормотензивных животных отмечены различия по активности 11- оксистероиддегидрогеназы, которая при участии НАДФН восстанавливает 11 дегидрокортикостерон у крыс в активный кортикостерон (О.П. Черкасова., 2006). В результате этого в органе пополняется фонд кортикостероидов, что создаёт условия для индукции CYP3A. Особенностью почечной изоформы данного фермента является её солокализацией с минералокортикоидными рецепторами, что позволяет предупредить связывание с ними глюкокортикоидов. По-видимому, при ЕИМ у гипертензивных крыс по сравнению с нормотензивными наблюдается десенситизация почек к действию глюкокортикоидных гормонов. Возможно, что за счёт активации почечной изоформы 11-оксистероиддегидрогеназы повышается чувствительность почек к действию минералокортикоидов, что служит аддитивным фактором в развитии артериальной гипертензии у линии НИСАГ.
На фоне ограничения глюкокортикоидных эффектов возможно повышение чувствительности почек к действию провоспалительных цитокинов. В пользу этого свидетельствует угнетение уровня CYP2B1/2 –зависимого монооксигенирования в почках. Согласно данным литературы введение цитокинового препарата беталейкина также сопровождалось угнетением активности изоформы CYP2B1/2 (Сибиряк С.В. и соавт., 2006).
В почках межлинейные различия по уровню цитохром Р450-зависимых монооксигеназ имели следующий характер: у крыс Вистар ежедневные иммобилизации не сопровождались супрессией цитохром Р450-зависимых монооксигеназ, напротив, у линии НИСАГ отмечено снижение выраженности CYP1A1-зависимого монооксигенирования (р=0,007 U). Изложенное свидетельствует о перепрограммировании экспрессии этих изоформ в почках у стрессированных животных.
Примечательно, что если у крыс Вистар ЕИМ сопровождались снижением содержания митотически активных тимоцитов ( Контроль Вистар 12,62±2,53 %, n=8; ЕИМ Вистар, 8,1±1,74, n=7 р=0,038 WW), то у гипертензивных крыс не наблюдалось статистически достоверных изменений этого показателя (Контроль НИСАГ 9,38±1,6 %, n=8; ЕИМ НИСАГ 8,76±1,54%, n=7). Кроме того, предупреждение постстрессорной гипоплазии иммунных органов у крыс линии НИСАГ может осуществляться более высокому уровню IL-6.
Установлено, что при РЧИМ только у стрессированных крыс линии НИСАГ наблюдалась тенденция к снижению интенсивности реакции ГЗТ, не достигнувшая статистически значимых величин (таблица 1). У крыс Вистар значение данного показателя при РЧИМ не претерпело заметных изменений по сравнению с контролем (таблица 1). Тем не менее, у стрессированных гипертензивных крыс по сравнению со стрессированными нормотензивными крысами отмечено статистически значимое снижение реакции ГЗТ (P=0,02 U) (таблица 1). Наблюдаемые межлинейные различия по уровню ГЗТ реакции можно объяснить более высоким уровнем циркулирующего кортикостерона у крыс линии НИСАГ. (РЧИМ Вистар 25,61±2,27 нмоль/л, n=8; РЧИМ НИСАГ 39,84±3,4 нмоль/л, n=7, р=0,02 WW).
После завершения повторных иммобилизаций у крыс Вистар не обнаружено статистически значимых изменений в содержании IL-1 (Контроль Вистар 47,36±7,1 пг/мл, n=5; РЧИМ Вистар 50,62 ±7,3 пг/мл, n=7). РЧИМ у гипертензивных крыс вызвал увеличение содержания IL-1 по сравнению с контрольными животными (Контроль Нисаг 15,34±2,35 пг/мл n=5; РЧИМ НИСАГ 27,41±4,2 пг/мл, n=7, р=0,049U) при неизменном уровне IL-6 (Контроль Нисаг 15,55±9,05пг/мл n=5; РЧИМ НИСАГ 20,05±8,35 пг/мл, n=7, р=0,049U).
Через 24 часа после завершения РЧИМ, у стрессированных крыс линии НИСАГ по сравнению со стрессированными крысами Вистар отмечен более высокий уровень CYP1A1-зависимого монооксигенирования.
Через 120 часов после завершения РЧИМ у крыс Вистар в 3 раза повысилась ЭРОД-активность. У крыс линии НИСАГ наблюдался четырёхкратный прирост ЭРОД-активности при одновременном повышении в 1,8 раза БРОД-активности. В результате более высоких темпов прироста ЭРОД-активности, у стрессированных гипертензивных крыс уровень CYP1A1-зависимого монооксигенирования был выше, чем у стрессированных нормотензивных крыс (рисунок 4).
Сопоставление данных по состоянию цитохром Р-450-зависимых монооксигеназ и уровнем циркулирующих цитокинов в зависимости от уровня стрессорной реактивности позволило выявить интересную закономерность – животные с наиболее высоким уровнем циркулирующего IL-1 имеют более высокий уровень ЭРОД-активности. Вероятно, при стрессорных воздействиях с доминирующей резистентной стратегией, также наблюдается десенситизация цитохром Р-450-зависимых монооксигеназ к депремирующему действию цитокинов. Между тем, данные корреляционного анализа свидетельствуют о причастности цитохром – Р450-зависимых монооксигеназ к развитию некробиотических поражений печени. Так для стрессированных гипертензивных крыс характерна положительная корреляционная связь между уровнем некротического поражения печени и БРОД-активностью
(r perason=0,81; n=7, p<0,05).
Рисунок 4
Монооксигеназная активность изоформ CYP1A1, CYP2B1/2, CYP3A у нормотензивных и гипертензивных крыс через 24 и 120 часов после завершения повторных иммобилизаций
Примечание: В этой таблице приведены данные по монооксигеназным реакциям,отражающим активность изоформ CYP1A1(ЭРОД), CYP2B1/2 (БРОД) активность изоформ * - внутрилинейные различия # межлинейные различия р<0,05 U-критерий Манна-Уитни.
3. Влияние экзогенного глюкокортикортикоида и редкочередующихся иммобилизаций на цитохром Р450-зависимые монооксигеназы печени и чувствительность органов системы крови.
В результате исследований установлено протекторное действие четырёхкратного иммобилизационного стресса на триамцинолон – зависимую гипоплазию вилочковой железы у нормотензивных крыс (таблица 2). При этом наблюдалось увеличение количества митотически активных тимоцитов с явной тенденцией к снижению уровня апоптоза, у крыс линии НИСАГ не наблюдалось такого защитного действия. Кроме того, в ответ на постстрессорное введение триамциналона ацетонида у гипертензивных крыс отмечено более заметное угнетение пролиферации тимоцитов (таблица 2)
Так, в группе «стресс+ТА» у крыс линии НИСАГ, количество митотически активных тимоцитов снижено по сравнению с аналогичной группой крыс Вистар. Вследствие этого, предварительные стрессорные воздействия привели к развитию у гипертензивных крыс более выраженной глюкокортикоид-зависимой гипоплазии вилочковой железы по сравнению с нормотензивными крысами.
Таблица 2.
Влияние триамцинолон ацетонида на уровень апоптоза и на содержание покоящихся и пролиферирующих тимоцитов у стрессированных нормотензивных и гипертензивных крыс
| Группы | ПИК М1 СУБ G0/G1 | ПИК М2 G0/G1 | ПИК М3 G2 +S+ M | |
| 1 | Контроль Вистар, n=12 | 36,45±5,92 | 41,32±8,06 | 9,76±1,9 |
| 2 | Стресс Вистар, n=9 | 40,1±5,95 | 31,6±4,25 | 10,75±1,7 |
| 3 | Триамцинолона ацетонид (ТА) Вистар, n=8 | 71,77±8,49 Р1,3=0,025 U | 16,3±5,15 Р1,3=0,025 U | 3,01±1,12 Р1,3=0,01 U |
| 4 | Стресс + ТА Вистар, n=12 | 55,84±1,6 | 17,9±2,5 Р3,4<0,05 | 5,66±1,07 Р3,4=0,03 U |
| 5 | Контроль НИСАГ, n=8 | 27,83±5,13 | 42,25±6,2 | 12,6±1,44 |
| 6 | Стресс НИСАГ, n=8 | 20,18±5,17 | 44,5±4,34 | 13,19±2,0 |
| 7 | Триамцинолона ацетонид НИСАГ, n=10 | 74,5±6,71 Р5,7=0,014 U | 12,09±3,8 Р5,7=0,014 U | 2,5±1,0 Р5,7=0,01U |
| 8 | Стресс+ ТА НИСАГ, n=10 | 59,2±9,12 Р4,8=0,014 WW | 17,3±6,07 Р7,8<0,05 | 3,6±1,05 Р4,8=0,04 |
Примечание:Р2,4 достоверность различий между 2 и 4 группами ; индекс указывает номер групп различия между которыми достоверны р<0,05
Аналогичная ситуация наблюдалась и селезёнке, где для предварительно стрессированных нормотензивных крыс характерно протекторное действие по отношению к глюкокортикоид – зависимой гипоплазии органа.
У крыс Вистар предварительные стрессорные воздействия полностью предупреждают вызванную ТА убыль ядросодержащих клеток в органе. Напротив, у крыс линии НИСАГ этот же режим хронического стресса усугубил выраженность триамцинолон-зависмой гипоплазии селезёнки. В итоге у стрессированных крыс Вистар после введения глюкокортикоидного препарата уровень лимфоидных клеток в селезёнке в 3 раза превысил уровень лимфоцитов группы «стресс+ТА» линии НИСАГ (р=0,032 U).
В костном мозге крыс Вистар усугублялось триамцинолон-зависимое угнетение грануломоноцитопоэза. Так для животных получавших глюкокортикоидный препарат после завершения стрессорных воздействий характерно двухкратное снижение уровня малодифференцированных клеток грануло-моноцитарного ряда по сравнению с нестрессированными животными (группа «ТА») (р=0,025U). Вместе с тем, общее количество ядросодержащих клеток в костном мозге у стрессированных и нестрессированных крыс Вистар через 96 часов после введения ТА не отличалось достоверно друг от друга.
Таким образом, данный режим повторных стрессорных воздействий у крыс с повышенной стрессорной реактивностью потенциировал глюкокортикоид-зависимое снижение уровня лейкоцитарных клеток, являющихся потенциальными эффекторами воспалительной реакции, что ограничивает формирование лейкоцитарного пула во внутренних органах и снижает выраженность повреждений воспалительного генеза.
У нестрессированных крыс Вистар, введение глюкокортикоидного препарата привело к пятикратному возрастанию уровня некротического поражения печени при одновременном увеличении в количества лимфоцитов в органе (таблица 3).
Таким образом, у крыс Вистар гепатотропные эффекты глюкокортикоидного препарата приобрели провоспалительную направленность.
Предварительное стрессорное воздействие у животных группы «стресс+ТА» по сравнению с группой «ТА» снизило площадь некроза при статистически недостоверной тенденции к снижению содержания лимфоцитов (таблица 2).
Таким образом, в этой серии экспериментов, предварительный стресс привёл к инверсии провоспалительного эффекта глюкокортикоидного препарата в антивоспалительный.
Через 96 часов после введения глюкокортикоидного препарата у нестрессированных крыс НИСАГ наблюдалось снижение количества гепатоцитов при одновременном увеличении площади некроза (таблица 2) по сравнению с контрольными животными линии НИСАГ.
При анализе межлинейных различий у животных на введение глюкокортикоидного препарата обнаружено более высокое содержание гепатоцитов у крыс Вистар. Необходимо отметить, что у контрольных гипертензивных крыс содержание гепатоцитов больше, чем у крыс Вистар. Таким образом, у животных с повышенным уровнем стрессорной реактивности введение глюкокортикоидного препарата привело к развитию более выраженных гепатодеструктивных эффектов
У гипертензивных крыс предварительные стрессорные воздействия смягчили выраженность гепатодеструктивных эффектов ТА. Так у животных группы «стресс+ТА» по сравнению с группой «ТА» увеличилось количество гепатоцитов на 10%, снизилась площадь некроза
Таблица 3
Модифицирующее влияние триамцинолона ацетонида на некоторые гистологические характеристики печени у гипертензивных крыс
| Группы | Объёмная плотность гепатоцитов (Ед/мм2) | Объёмная плотность нейтрофилов (Ед/мм2) | Объёмная плотность макрофагов (Ед/мм2) | Объёмная плотность лимфоцитов (Ед/мм2) | Объёмная плотность некроза (%) | Объёмная плотность стромы (%) | |
| 1 | Контроль Вистар, n=8 | 961,6±55,71 Р1,4=0,014 U | 0,95±0,95 | 2,37±0,9 | 17,05±2,71 | 2,67±1,45 | 0±0 |
| 2 | Триамцинолона ацетонид ( ТА) Вистар, n=8 | 872,71±50,12 | 0,76±0,76 | 3,8±1,2 | 61,5±22,2 Р1,2=0,033 U | 13,6±3,5 Р1,2=0,043 U | 0±0 |
| 3 | Стресс+ТА Вистар,n=10 | 911,35±50,9 | 0,76±0,76 | 6,08±1,53 | 22,3±8,3 | 5,6±1,6 Р2,3=0,041 NK | 1,6±1,6 |
| 4 | Контроль НИСАГ, n=8 | 1000,0±44,22 Р4,6=0,029 WW | 0±0 | 3,8±2,1 | 17,05±3,92 | 0±0 | 1,33±1,33 Р4,6=0,039 WW |
| 5 | Триамцинолона ацетонид НИСАГ,n=8 | 847,0±11,68 Р2,5=0,024 U | 0±0 | 6,6±0,95 | 23,68±1,96 | 16,5±2,66 | 0,8±0,8 |
| 6 | Стресс+ ТА НИСАГ,n=10 | 996,2±21,58 Р5,6=0,006 U | 0±0 | 2,71±0,7 | 12,47±1,07 | 1,33±0,8 Р5,6=0,029 U | 0,88±0,88 Р5,6=0,015 U |
| 7 | Стресс Вистар, n=9 | 966±16,98 Р1,7=0,0446 U | 2,52±0,52 Р1,7=0,004 WW | 1,9±0,9 Р1,7=0,0027 WW | 17,07±5,4 | 2,66±1,33 | 0±0 |
| 8 | Стресс НИСАГ, n=8 | 1023±16,4 Р7,8=0,022 U | 0 ±0 Р7,8=0,009 WW | 2,17±0,76 Р7,8=0,009WW Р4,8=0,032 WW | 12,46±2,9 | 5,14±1,14 | 0±0 |
Примечание Р1,2- достоверность различий между 1 и 2 группой; индекс указывает номер групп различия между которыми достоверны, р<0,05; U-критерий Манна-Уитни; WW-критерий Вальда-Вольфовица
.
Анализ межлинейных различий по группе «стресс+ТА» показал, что у гипертензивных крыс по сравнению с нормотензивными меньше уровень некротических поражений органа.
Таким образом, у стрессированных крыс линии НИСАГ дополнительное введение глюкокортикоидного препарата привело к развитию более выраженных гепатопротекторных эффектов по сравнению с крысами Вистар.
ВЫВОДЫ
1. У нестрессированных крыс линии НИСАГ по сравнению с нестрессированными крысами Вистар снижено содержание кортикостерона и повышена активность изоформы CYP3A, осуществляющей биотрансформацию глюкокортикоидов в печени. Сниженный уровень кортикостерона у гипертензивных крыс ассоциирован, с повышением воспалительной реактивности, со способностью неспецифического иммуностимулятора пирогенала корригировать уровень артериального давления, а также с увеличением активности печёночной МАО-Б и со снижением уровня апоптоза тимоцитов.
2. У нестрессированных крыс линии НИСАГ по сравнению с нестрессированными крысами Вистар повышено содержание циркулирующего IL-6, ассоциированного со снижением уровня CYP2B1/2–зависимого монооксигенирования и увеличением уровня CYP1A1-зависимого монооксигенирования в печени и увеличением активности изоформы CYP2B1/2 в почках.
3. У крыс линии НИСАГ после завершения ежедневных иммобилизаций по сравнению со стрессированными крысами Вистар снижен уровень CYP2B1/2–зависимого монооксигенирования в почках и повышен уровень CYP1A1 и CYP2B1/2–зависимого монооксигенирования в печени. Угнетение CYP1А1–зависимого монооксигенирования в почках ассоциировано с развитием провоспалительных сдвигов в органе.
4. У крыс линии НИСАГ после завершения ежедневных иммобилизаций по сравнению со стрессированными крысами Вистар повышена концентрация циркулирующего IL-6 и снижена интенсивность ГЗТ-реакции.
5. У крыс линии НИСАГ после завершения редко чередующихся иммобилизаций повышена концентрация циркулирующего IL-1, и повышен уровень CYP1A1- и CYP2B1/2–зависимого монооксигенирования в печени.
6. У крыс линии НИСАГ после завершения редко чередующихся иммобилизаций повышена чувствительность лимфоидных органов к гипоплазирующему действию глюкокортикоидного препарата и повышена эффективность его антивоспалительного действия по отношению к печени. Сенситизирующее действие к глюкокортикоидам ассоциировано со снижением выраженности иммуно-воспалительного процесса, проявляющимся в уменьшении интенсивности реакции ГЗТ.
СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ
АГ - артериальная гипертензия
БРОД - деметилирование эритромицина
ГБ - гипертоническая болезнь
ГГАС - гипотоламо-гипофизарно-адреналовая система
ГЗТ - гиперчувствительность замедленного типа
ДБФ- дибензилфлюоресцеиндебензилазная активность
НИСАГ - наследственно индуцированная стрессом артериальная гипертензия
ЕИМ - ежедневные часовые иммобилизации
МАО – моноаминооксидаза – Б (КФ 1.4.3.4.)
НСТ - нитросиний тетразолий
РЧИМ- редкочередующиеся иммобилизации
ТА- триамцинолона ацетонид
ЭРОД - 7-этоксирезоруфин-О-деэтилазная активность
ЭРНД - эритромицин-N-деметилазная активность
IL-1 - интерлейкин 1
IL-6 - интерлейкин 6
TNF - туморнекротический фактор
CYP – цитохром Р450
U – критерий Манна-Уитни
- критерий Колмогорова-Смирнова
WW – критерий Вальда-Вольфовица
СПИСОК ОПУБЛИКОВАННЫХ НАУЧНЫХ РАБОТ
1. Сибиряк, С.В. Влияние повторных иммобилизаций на выраженность апоптоза и оксидативного стресса в тимусе у крыс / С.В. Сибиряк, В.Э. Цейликман, Н.В. Бубнов, Д.А. Козочкин // Материалы III конференции иммунологов Урала «Иммунология Урала». - Челябинск, 2003. - N1 (3). - C. 87.
2. Цейликман, В.Э. механизмах развития повышенной чувствительности тимуса к гипоплазирующему действию глюкокортикоидов в условиях гипокинетического и иммобилизационного стресса / Т.А. Филимонова, С.В. Сибиряк, А.И Синицкий, Д.А. Сысаков, Д.А. Козочкин // Объединённый иммунологический форум: тез. докл. - Екатеринбург, 2004. - C. 10.
3. Tseilikman, V.E. Stress-Induced Hypersensitization of Thymus to Glucocorticoid Drug / V.E. Tseilikman, T.A. Filimonova, S.V. Sibiryak, D.A. Kozochkin, A.I. Sinitskii, D.A. Sisakov // 12th International Congress of Immunology. - Montreal, Canada, 2004. – Р. 18 - 23.
4. Цейликман, О.Б. О механизмах развития инволюции тимуса при различных режимах повторных стрессорных воздействий / О.Б. Цейликман, С.В. Сибиряк, И.А. Волчегорский, А.И. Синицкий, Д.А. Козочкин, Н.В. Бубнов, Д.А Сысаков // Вестник Уральской медицинской академической науки. – Челябинск, 2004. - № 2. - С. 62 - 66.
5. Козочкин, Д.А. Повышенная устойчивость к гипоксии и усиление иммунореактивности при ежедневных иммобилизациях/ И.А. Лаптева, А.Б. Горностаева, Д.А. Козочкин, Т.Г. Тимофеева, А.И. Синицкий, Н.В. Бубнов // Материалы IV конференции иммунологов Урала «Иммунология Урала». - Челябинск, 2005. - N1 (4). - C.19.
6. Цейликман, В.Э. Активность цитохром Р-450 зависимых монооксигеназ после введения экзогенного глюкокортикоида у крыс с повышенной стрессорной реактивностью / В.Э. Цейликман, С.В. Сибиряк, А.Л. Маркель, Д.А. Козочкин, Н.В. Бубнов, А.И. Синицкий // Новая идеология в единстве фундаментальной и клинической медицины: материалы межрегиональной научно-практической конференции, посвященной 85-летию Самарского государственного медицинского университета. – Самара, 2005. - С. 452 - 454.
7. Козочкин, Д.А. Изучение ПОЛ и морфологических показателей в почках у нормо- и гипертензивных крыс при анксиогенном стрессе / Д.А. Козочкин, Н.В. Бубнов // Материалы III итоговой научно-практической конференции молодых учёных ЧелГМА. – Челябинск, 2005. – С. 92 - 94
8. Козочкин, Д.А. Сравнительный анализ показателей функциональной активности фагоцитарных клеток у нормо- и гипертензивных крыс при стрессе / Д.А. Козочкин // «Санкт-Петербургские научные чтения»: тезисы международного молодёжного медицинского конгресса. - Санкт-Петербург, 2005. - С. 98.
9. Козочкин, Д.А. Влияние повторных часовых иммобилизаций на лейкоцитарную формулу крови у нормо- и гипертензивных крыс/ Д.А Козочкин, А.И. Синицкий, Н.В. Бубнов, Д.А. Сысаков, М.И. Нестеров, В.С. Абашкин // 59 научно-практическая конференция «Молодые исследователи биологии и медицины»: тез. докл. – Челябинск, 2005 - C. 53.
10. Цейликман, В.Э. Особенности иммунотропных эффектов хронического стресса у нормотензивных и гипертензивных крыс / В.Э. Цейликман, А.Л. Маркель, Д.А. Козочкин, А.И Синицкий, И.И. Григорьев, Н.В.Бубнов, Е.А.Лавин // Медицинская иммунология 8(2-3):2006 Материалы X всероссийского научного форума с международным участием «Дни иммунологии в Санкт - Петербурге», Санкт – Петербург, 2006 - С. 187
11. Tseilikman,V.E. Hypersensitization to glycocortikoids and desensition to pro-inlammatory cytokines as the signs of resistant strategy of adaptation protective effect on the liver under the stress condition/ V.E. Tseilikman, O.B. Tseilikman, A.L. Markel, D.A. Sisakov, D.A. Kozochkin, E.A.Lavin // International society for adaptive medicine VIII Word congress, June21-24 2006, Moscow Russia P.140-141.
12. Волчегорский, И.А. Антиглюкокортикоидное, адренонегативное и антигипертензивное действие пирогенала / И.А. Волчегорский, В.Э. Цейликман, Л.M. Рассохина, Д.А. Козочкин, Я.А. Вохминцев, Ф.Б. Крюков, A.Л. Маркель // Патологическая физиология и экспериментальная терапия. – 2007. - № 2. - С. 19 - 20.
13. Цейликман, В.Э. Соотношение между окислением белков и липопероксидацией у крыс с приобретенной интолерантностью к гипоксии / В.Э. Цейликман, О.Б Цейликман, А.И. Синицкий, Е.А. Лавин, Д.А. Козочкин, А.В. Борисенков // IV съезд российского общества биохимиков и молекулярных биологов. - Новосибирск, 2008. - C. 436
14. Цейликман, В.Э. Влияние повторных стрессорных воздействий на иммунную реактивность и монооксигеназную активность печени нормотензивных и гипертензивных крыс / В.Э. Цейликман, А.Л. Маркелъ, О.Б. Цейликман, С.В. Сибиряк, А.И. Синицкий, Д.А. Козочкин, Д.А. Сысаков, А.С. Симбирцев // Российский физиологический журнал им. Сеченова. – 2008. – т. 94, № 5. - С. 576 - 579.
Козочкин Денис Александрович
ЦИТОХРОМ Р450 ЗАВИСИМЫЕ МОНООКСИГЕНАЗЫ И ИММУННЫЙ ОТВЕТ ПРИ ИММОБИЛИЗАЦИОННОМ СТРЕССЕ У ГИПЕРТЕНЗИВНЫХ КРЫС
03.00.04 – биохимия
14.00.36 - аллергология и иммунология
Автореферат
диссертации на соискание ученой степени
кандидата медицинских наук
Челябинск – 2009
[1] совместно с профессором С.В.Сибиряком и Д.А.Сысаковым
[2] -совместно с профессором О.Б.Цейликман
