Глутатионовая система и интенсивность свободнорадикального окисления в сердце при сочетании хронической алкогольной интоксикации и сахарного диабета

На правах рукописи

БЫКОВ

Денис Евгеньевич

ГЛУТАТИОНОВАЯ СИСТЕМА И ИНТЕНСИВНОСТЬ СВОБОДНОРАДИКАЛЬНОГО ОКИСЛЕНИЯ В СЕРДЦЕ ПРИ СОЧЕТАНИИ ХРОНИЧЕСКОЙ АЛКОГОЛЬНОЙ ИНТОКСИКАЦИИ И САХАРНОГО ДИАБЕТА

03.01.04 – биохимия

Автореферат

диссертации на соискание ученой степени

кандидата медицинских наук

Челябинск – 2010

Работа выполнена в Государственном образовательном учреждении высшего профессионального образования «Омская государственная медицинская академия Федерального агентства по здравоохранению и социальному развитию»

Научный руководитель: доктор медицинских наук, профессор

Высокогорский Валерий Евгеньевич

Официальные оппоненты: доктор биологических наук, профессор

Цейликман Вадим Эдуардович

доктор медицинских наук, профессор

Мещанинов Виктор Николаевич

Ведущая организация:   Государственное образовательное учреждение высшего профессионального образования «Тюменская государственная медицинская академия Федерального агентства по здравоохранению и социальному развитию» 

Защита состоится "____" ____________ 2010 г. в ________ часов на заседании диссертационного совета Д 208.117.02 при ГОУ ВПО «Челябинская государственная медицинская академия Федерального агентства по здравоохранению и социальному развитию» (454092, г. Челябинск, ул. Воровского, 64).

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Челябинской государственной медицинской академии

Автореферат разослан "____" ____________ 2010 г.

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность исследования

Общеизвестно, что сердечно-сосудистые заболевания стоят на первом месте среди причин смертности в большинстве стран мира: от общего количества смертей на их долю приходится от 40 до 60 % (Wright J. R. et al., 2006; Обрезан А. Г. с соавт., 2008). Причем, этот показатель выше среди лиц, злоупотребляющих алкоголем (Давыдов М. И. с соавт., 2007). Как показывают исследования, около 30% умерших (преимущественно мужчин в возрасте до 60 лет) имели алкогольное поражение сердца (Моисеев В. С., 2003; Мухин Н.А. с соавт., 2004). Однако потребление небольших количеств алкоголя, ассоциируются с меньшим риском смерти от ишемической болезни сердца (Sinkiewicz W. Et al., 2009). Так, Djouss L. et al. (2009) отмечено снижение уровня окисленных липопротеинов низкой плотности и повышение антиоксидантной активности плазмы крови. Вместе с тем, прямое антиоксидантное действие этанола нивелируется высокой продукцией свободных радикалов, образующихся в процессе его окисления, истощением антиокислительных резервов, что приводит к развитию окислительного стресса (Панченко Л. Ф. с соавт., 1998).

Поражение сердечно-сосудистой системы является основной причиной снижения трудоспособности и сокращения продолжительности жизни больных сахарным диабетом типа 2 (Wright J. R. et al., 2006; Обрезан А. Г. с соавт., 2008). При сахарном диабете гиперпродукция свободных радикалов также является одним из важных факторов поражения сердца. При этом, ключевое значение имеет феномен глюкозотоксичности, обусловленный, в частности, неферментативными реакциями аутоокисления глюкозы и гликирования белков (Brownlee M., 2005). Данные процессы способствуют окислительной модификации протеинов, участвуют в формировании конечных продуктов гликирования, а также принимают участие в развитии окислительного стресса, свойственного сахарному диабету (Балаболкин М. И. 2008; Wright J. R. et al., 2006).

В предупреждении окислительного стресса в сердце одна из ведущих ролей принадлежит глутатионовой системе (Кулинский В. И. и соавт., 2009), что обусловлено синергизмом работы глутатион-зависимых энзимов, участием в регенерации ряда низкомолекулярных антиоксидантов и способностью восстановленного глутатиона путем прямого взаимодействия нейтрализовать активные кислородные интермедиаты. Снижение концентрации восстановленного глутатиона в ткани сердца как при длительном употреблении этанола, так и при сахарном диабете взаимосвязано с интенсивностью процессов СРО (Lee H.C. et al., 2006; Кулинский Н. И. с соавт., 2009). Изменения в активности GSH-зависимых ферментов, таких как глутатионпероксидаза и глутатион-S-трансфераза также отмечены при сахарном диабете (Lee H.C. et al., 2006; Ghibu S. et al., 2009).

По данным Сидоров П. И. с соавт. (2002) хроническая алкогольная интоксикация сопутствует сахарному диабету, по крайней мере, у 8,3% больных.

Несмотря на то, что окислительный стресс развивается как при алкогольной интоксикации, так и при сахарном диабете, имеется разнонаправленность метаболических сдвигов, выражающаяся, при сахарном диабете – гипергликемией, а при хронической алкоголизации – гипогликемией. Так, увеличенная при сахарном диабете в сердце активность одного из основных энзимов пентозного шунта – глюкозо-6-фосфатдегидрогезы способствует повышению образования НАДФН, который используется НАДФН-оксидазой как кофактор, что увеличивает продукцию супероксид-аниона и уменьшает долю синтеза восстановленного глутатиона (Gupte S.A., 2008). Являющийся конкурентным ингибитором глюкозо-6-фосфатдегидрогеназы и фосфоглюконатдегидрогеназы, образующийся избыток НАДФН, при хронической алкоголизации, уменьшает активность данного пути окисления глюкозы, что нарушает механизмы рециклирования глутатиона (Conklin D. et al., 2006; Magni G. et al., 2008). В связи с этим, можно предположить, что активация свободнорадикальных процессов вследствие хронической алкогольной интоксикации может изменить характер метаболических нарушений в сердце при сахарном диабете.

Цель исследования

Установить особенности нарушений и патогенетическую роль нарушений метаболизма глутатиона и свободнорадикальных процессов в сердце при сочетании сахарного диабета с хронической алкогольной интоксикацией.

Задачи исследования

1. Оценить интенсивность процессов свободнорадикального окисления в плазме крови и сердце при сочетании хронической алкогольной интоксикации с экспериментальным сахарным диабетом.
2. Изучить в сердце уровень восстановленного глутатиона при различных вариантах сочетания хронической алкогольной интоксикации с сахарным диабетом.
3. Определить активность ферментов системы обмена глутатиона в сердце при сочетании с хронической алкоголизации с экспериментальным сахарным диабетом.
4. Выяснить активность процессов химической модификации белков окислительного и неокислительного характера в сердце при сочетании сахарного диабета с хронической алкогольной интоксикацией.

Научная новизна

Новыми являются данные о роли системы глутатиона в антиоксидантной защите сердца при сочетании хронической алкогольной интоксикации и сахарного диабета. Доказано значительное повышение интенсивности свободнорадикального окисления в сердце при сочетании хронической алкогольной интоксикации и сахарного диабета, в сравнении с соответствующими сдвигами при сахарном диабете вне алкоголизации и с изменениями при изолированном хроническом воздействии алкоголя. Обнаружена отрицательная корреляционная взаимосвязь процессов химической модификации белков окислительного и неокислительного характера с активностью глутатионпероксидазы в сердце при сочетании хронической алкогольной интоксикации и сахарного диабета.

Теоретическая и практическая значимость

Результаты исследований расширяют представления о роли интенсивности процессов свободнорадикального окисления и антиоксидантной защиты сердца при сочетании хронической алкогольной интоксикации и сахарного диабета. Исследование уточняет особенности участия глутатионовой системы в интенсификации свободнорадикальных процессов в сердце при сочетании хронической алкогольной интоксикации с сахарным диабетом.

Практический интерес представляют полученные данные об интенсивности свободнорадикального окисления и состоянии антиокислительной глутатионовой системы в сердце могут служить теоретической основой для поиска мишеней метаболической коррекции.

Внедрение результатов исследования

Результаты проведенного исследования используются в учебном процессе на кафедрах Омской государственной медицинской академии: биохимии и лабораторной медицины; психиатрии, наркологии и клинической психологии, а также курсах додипломного и последипломного образования по клинической биохимии и лабораторной диагностике.

Апробация работы

Материалы исследования представлены на V межрегиональной научной конференции «Актуальные вопросы наркологии» (Омск, 2003), на III конференции молодых ученых России «Фундаментальные науки и прогресс клинической медицины» (Москва, 2004), на межрегиональной научной конференции, посвященной 85-летию Самарского государственного медицинского университета (Самара, 2005), на IV съезде Российского общества биохимиков и молекулярных биологов СО РАН (Новосибирск, 2008), на совместном заседании кафедры биохимии и лабораторной медицины с курсом клинической лабораторной диагностики ПДО; кафедры психиатрии, наркологии и клинической психологии, кафедры общей и биоорганической химии ОмГМА.

Основные положения, выносимые на защиту:

1. При сочетании хронической алкогольной интоксикации и сахарного диабета в сердце отмечается выраженная интенсификация процессов свободнорадикального окисления.
2. При хронической алкогольной интоксикации в сочетании с сахарным диабетом в сердце значительно уменьшается уровень восстановленного глутатиона и нарушаются глутатион-зависимые механизмы антиокислительной защиты сердца.
3. Неэффективное функционирование глутатионовой антиоксидантной системы в сердце взаимосвязано с процессами окислительной и неокислительной модификации белков.

Публикации

По теме диссертации опубликовано 8 печатных работ, из них 2 – в изданиях, рекомендованных ВАК Минобрнауки РФ.

Объем и структура диссертации

Диссертация изложена на 148 страницах машинописного текста и состоит из введения, обзора литературы, главы описания материалов и методов исследования, глав результатов собственных исследований, обсуждения полученных результатов, выводов. Работа содержит 13 таблиц, 5 рисунков. Список цитированной литературы включает 436 источников, в том числе 41 – на русском языке.

В работе использовали плазму крови и ткань сердца половозрелых белых беспородных крыс-самцов массой 220-240 г. Исследования проводили с учетом положений о соблюдении принципов гуманного обращения с экспериментальными животными в соответсвии с требованиями приказов: № 1179 МЗ СССР от 10.10.1983 г. и № 267 МЗ РФ от 19.06.2003 г., а также с положениями регламента Европейской Конвенции (Страсбург, 1986). По завершении эксперимента крыс подвергали эвтаназии путем цервикальной дислокации.

Для формирования алкогольной интоксикации использовали модель предложенную (Cascales C. et al., 1983), согласно которой в качестве единственного источника жидкости давали этанол в концентрации 150 мл/л в течение 2-х месяцев (группа АII, n=23) и 4-х месяцев (группа АIII, n=21). С целью оценки постинтоксикационных эффектов этанола моделировали алкогольную интоксикацию в течение 2-х месяцев с последующей 2-х месячной отменой алкоголя (группа АI, n=21). Суточное потребление алкоголя (в пересчёте на абсолютный этанол) составляло 5,35±0,27 млкг-1.

Сахарный диабет (группа СД, n=20) у животных моделировали по методике предложенной (Zhang F. et al., 2003). Согласно экспериментальной модели животных содержали на специальной диете с высоким содержанием жира (зоостеролов) в течение двух месяцев, после однократно вводили раствор стрептозотоцина приготовленный на 0,05 М цитратном буфере (рН=4,5) в дозе 15 мг/кг массы тела. Интактным животным (группа КГ, n=25) вводили аналогичный объем 0,05 М цитратного буфера (рН=4,5). Для подтверждения формирования сахарного диабета у животных определяли на вторые сутки после введения стрептозотоцина уровень глюкозы крови натощак.

Учитывая зависимость течения сахарного диабета от формы потребления алкоголя (Сидоров П.И. с соавт., 2002) также индивидуально-типологические паттерны поведения в критических ситуациях (Василюк Ф. Е., 1995; Сирота Н. А. с соавт., 2003), использовали различные варианты сочетания сахарного диабета и хронической алкогольной интоксикации. Были созданы экспериментальные условия, при которых алкоголизацию крыс осуществляли в 2-х месячном периоде, который прекращали после введения стрептозотоцина (группа СД-АI, n=20). Для выяснения характера воздействия алкоголя на изучаемые процессы при уже сформированном сахарном диабете моделировали 2-х месячную интоксикацию этанолом на вторые сутки после введения стрептозотоцина (группа СД-АII, n=23). Также моделировали сочетание, при котором хроническая алкогольная интоксикация в течение 2-х месяцев проводилась до возникновения сахарного диабета и продолжающаяся в последующие 2 месяца после его начала (группа СД-АIII, n=22). При хронической алкоголизации на всех этапах течения сахарного диабета использовали методику пролонгированной алкоголизации. Учитывая развитие при сахарном диабете полидипсии, концентрация этанола в водном растворе была уменьшена в 3 раза. Всех животных содержали на стандартном сухом твердом корме. Питание и жидкость были доступны ad libitum. Для биохимических исследований использовали супернатант гомогенатов сердца и плазму крови.

Определение тотальной окислительной способности (TOC), тотальной антиоксидантной способности (TAC) и эндогенной пероксидазной активности (ЭПA) плазмы крови использовали коммерческие стандартные наборы (Labor Diagnostica Nord Gmbh & Co. KG, Nordhom Germany).

Для характеристики интенсивности процессов СРО в гомогенатах сердца исследовали уровень низкомолекулярных карбонильных продуктов свободнорадикального окисления (НКП) по методу (Н. О. Стальная и соавт. 1977) и карбонильной модификации белков (Е. Е. Дубининой с соавт., 1995, в модификации Рагино Ю. И. с соавт., 2007). Содержание НКП выражали в мкмольг-1 ткани, а карбонильных производных белков в нмоль.г-1 ткани сердца. Степень гликирования тканевых белков в гомогенатах сердца оценивали по уровню -кетоаминов, при помощи тест-системы Randox® (Великобритания).

Определение активности глутатионредуктазы (ГР; КФ 1.6.4.2) проводили по методу Carlberg I. (1985). Активность глутатионпероксидазы (ГПО; КФ 1.11.1.9) определяли по методу D.E. Pagliaetal. (1967) в модификации Д.В. Черданцева (2002). Глутатион-S-транферазную активность (Г-S-ТФ) в гомогенатах сердца измеряли по скорости образования глутатион-S-конъюгатов между восстановленным глутатионом и 1-хлор-2,4-динитробензолом (Habig W.H., 1974). Содержание восстановленного глутатиона (GSH) в гомогенатах сердца определяли по реакции с 5, 5/- дитиобис-2-нитробензойной кислотой методом Sedlak J. et al. (1968). Содержание белка в гомогенатах сердца определяли по методу О. Н. Lowry et al. (1951). Спектрофотометрические и фотоколориметрические методы исследования проводили на спектрофотометре «UNICO 2802SUV/VIS», оснащенном проточной кюветой и термоконтроллером на Пельтье-элементах.

Статистическую обработку полученных данных осуществляли с применением пакета статистических программ SPSS 11.5 (SPSS Inc., США). Результаты представлены как min–Me(LQ-HQ)–max, где min – наименьшее значение, Me – медиана, LQ – 25-й квантиль, HQ – 75-й квантиль, max – наибольшее значение. Численность выборок обозначена n. Для графического представления данных использовали столбчатые диаграммы и диаграммы типа «box-plots». Различия между значениями показателей в сравниваемых группах оценивали с помощью непараметрического U-критерия Манна-Уитни. Нулевой считали гипотезу о совпадении медианных значений двух независимых выборок. Взаимосвязь между отдельными показателями выявляли с помощью корреляционного анализа по Спирмену (r). Сила корреляционной связи оценивалась по предложенным рекомендациям (Платонов А.Е., 2000). Критическим уровнем значимости при проверке статистических гипотез принимали p=0,05.

Обнаруженное нами повышение уровня тотальной окислительной способности (ТОС) в плазме крови (рис. 1) особей, испытавших 2-х и 4-х месячную алкогольную интоксикацию (группы АII и АIII, соответственно), на 70,3 % (pU0<0,001) и 77,8 % (pU0<0,001), соответственно, отражает активацию свободнорадикальных процессов в организме в целом. Как ответную реакцию антиокислительных система плазмы крови на активацию процессов свободнорадикального окисления можно рассматривать увеличение у особой данной группы уровня тотальной антиоксидантной способности (ТАС) плазмы крови.

В отличие от особей с изолированной 2-х и 4-х месячной алкоголизации, у представителей со с стрептозотоцин-индуцированным сахарным диабетом, как изолированном (группа СД), так и в сочетании с хронической алкоголизацией (группы СД, СД-АI, СД-АII и СД-АIII), в плазме крови статистически значимого изменения уровня ТОС не выявлено. Однако обнаружено увеличение ТАС, соответственно, в 5,7 (pU0=0,001), в 8,7 (pU0<0,001), в 4,9 (pU0=0,002) и в 9,2 (pU0=0,002) раза и повышение эндогенной пероксидазной активности (ЭПА) плазмы крови (рис. 1), что может отражать ответ антиокислительных систем крови на системный оксидативный стресс в тканях, характерный для сахарного диабета (Ghibu S. et al., 2009). Отсутствие повышения уровня ТОС в плазме крови у представителей данных групп, вероятно, можно рассматривать как компенсированный эффект увеличения мощности антиокислительных механизмов защиты, а высокий уровень ЭПА может свидетельствовать о пероксидазном механизме нейтрализации органических гидроперекисей. В данном случае повышение ЭПА можно рассматривать как особенность проявления интенсификации СРО при сахарном диабете, связанное с усилением процессов гликирования (Al-Kafaji G. et al., 2010). По данным Арцукевич А. Н. с соавт., (2000) уровень ЭПА плазмы крови является информативными и чувствительными показателями стабильности мембран клеток в отношении процессов липопероксидации. В условиях моделирования 2-х месячной алкогольной интоксикации с последующей 2-х месячной отменой этанола (группа АI), не выявлено статистически значимых изменений уровня ТОС, ТАС и ЭПА, по отношению к КГ. Вероятно, по истечении 2-х месяцев после отмены этанола, происходит системная нормализация интенсивности свободнорадикальных процессов, исходя из отсутствия реакции со стороны ТОС, ТАС и ЭПА плазмы крови.

Рисунок 1.Медианы уровня тотальной окислительной способности (ТОС, экв. Н2О2 ммоль •л –1), тотальной антиоксидантной способности (ТАС, экв. Trolox ммоль•л –1) и эндогенной пероксидазной активности (ЭПА, Ед•л –1) в плазме крови при хронической алкогольной интоксикации. Примечание. Статистически значимые отличия по сравнению с контрольной группой обозначены: “*” – p<0,05; “**” – p<0,01; “***” – p<0,001 (U – тест Манна-Уитни).

Таким образом, при изолированном течении сахарного диабета, а также при его сочетании с хронической алкоголизацией в плазме крови превалируют нерадикальные процессы разложения пероксидов над радикально-цепными механизмами. Вместе с тем, повышение ТАС в плазме крови, также может быть связано с достаточно мощными антиокислительными механизмами в тканях. Анализ результатов показателей интенсивности процессов свободнорадикального окисления в плазме крови показал, что изменения свободнорадикальных процессов при хронической алкоголизации на фоне сахарного диабета существенно отличаются от проявлений, обнаруженных при изолированном течении хронической интоксикации этанолом. Об этом может свидетельствовать, тот факт, что компенсаторное повышение ТАС препятствует повышению активности радикал-генерирующих процессов в плазме крови.

Уровень низкомолекулярных карбонильных производных (НКП), отражающий интенсивность процессов окислительной модификации липидов, в сердце существенно повышен, в сравнении с контрольной группой во всех подопытных группах, за исключением группы АI, в которой исследования показателей проведено через 2 месячный интервал после 2 месячной алкоголизации (рис.2). Увеличение содержания НКП наблюдалось на одном уровне как при 2-х, 4-х месячной алкоголизации (группы АII и АIII), соответственно, в 4,3 (pU0<0,001) и в 4,5 (pU0<0,001) раза, так и при сахарном диабете (группа СД) и при сахарном диабете после предшествующей алкоголизации (СД-АI), соответственно, в 4,9 (pU0<0,001) и 3,8 (pU0<0,001) раза. Значительно в большей степени увеличивается содержание НКП только у особей с сочетанием хронической алкоголизации и сформированного стрептозотоцин-индуцированного сахарного диабета (группа СД-АII), в 6,2 раза (pU0<0,001), и при воздействии хронической алкогольной интоксикации в течение 2-х месяцев до возникновения сахарного диабета и продолжающейся в последующие 2 месяца после его начала (группа СД-АIII), в 8 раз (pU0<0,001), в сравнении с КГ. При этом, у этих особей (группы СД-АII и СД-АIII) выявлено статистически значимое увеличение содержания в сердце НКП, в сравнении с группой СД, на 30 % (pUсд=0,012) и 57,6 % (pUсд<0,001), соответственно. Эти данные свидетельствует о характерном развитии окислительного стресса в сердце, как при хронической алкоголизации, так и при сахарном диабете.

Таким образом, исходя из анализа полученных данных, интенсивность свободнорадикального окисления в сердце значительно повышена при сочетании сахарного диабета и хронической алкогольной интоксикации, в сравнении с соответствующими сдвигами при сахарном диабете вне алкоголизации и с изменениями при изолированном хроническом воздействии алкоголя. Анализ литературы показывает, что длительное потребление алкоголя, вызывает снижение антиокислительных резервов тканей, что проявляется, главным образом, в снижении активности антиперекисных механизмов антиоксидантной защиты (Wasilewski M. et al., 2005), а также в уменьшении содержания восстановленного глутатиона (Saravanan R. et al., 2006).

Рисунок 2. Содержание низкомолекулярных карбонильных продуктов свободнорадикального окисления (НКП) в сердце при сочетании хронической алкогольной интоксикации и экспериментального сахарного диабета. Примечание. Статистически значимые отличия по сравнению с контрольной группой обозначены: “*” – p<0,05; “**” – p<0,01; “***” – p<0,001; по сравнению с группой СД: “” – p<0,05; “” – p<0,01; “” – p<0,001(U – тест Манна-Уитни).

В нашем исследование обнаружено, статистически значимое, по отношению к КГ, уменьшение уровня восстановленного глутатиона (табл. 1), как в группах с изолированным течением алкогольной интоксикации на 48 % (pU0<0,001) и 33% (pU0<0,001), для групп АII и АIII, соответственно, так и в группе СД – на 47 % (pU0<0,001). В большой степени уменьшение уровня GSH, в сравнении с КГ, выявлено в группах СД-АI, СД-АII и СД-АIII на 53 % (pU0<0,001), 65 % (pU0<0,001) и 69 % (pU0<0,001), соответственно. В группах СД-АII и СД-АIII содержание GSH было статистически значимо ниже, чем у представителей с изолированным стрептозотоцин-индуцированным сахарным диабетом, соответственно, на 34 % (pUсд=0,003) и 41 % (pUсд<0,001).

Из представленных данных видно, что как при изолированном течении хронической алкоголизации и сахарном диабете, так и при их различных вариантах сочетания наблюдается уменьшение основного компонента глутатионовой антиоксидантной системы, принимающей наиболее значительное участие в антиокислительной защите сердца (Кулинский В. И. с соавт., 2009; Berndt C. et al., 2007). Выраженное снижение уровня восстановленного глутатиона в группах СД-АI, СД-АII и СД-АIII, вероятно, связано с более интенсивной продукцией активных кислородных интермедиатов при сочетании хронической алкоголизации и сахарного диабета, а также нарушением работы ферментативного звена глутатионовой системе, которое может проявляться в потребление восстановленного глутатиона в процессе работы глутатион-зависимых ферментов и также подавлении механизмов его рециклирования (Кулинский В. И. с соавт., 2009). Подобные изменения описаны в литературе при изолированном течении хронической алкогольной интоксикации (Saravanan R. et al., 2006) и сахарного диабета (Bravi M.C. et al., 2006). Это согласуется с обнаруженным высоким уровнем низкомолекулярных карбонильных продуктов СРО в сердце представителей групп, сочетания алкогольной интоксикации и сформированным СД (СД-АII и СД-АIII). По данным корреляционного анализа содержание НКП взаимосвязано со снижением концентрации восстановленного глутатиона. В группах СД-АII и СД-АIII отмечается очень высокая отрицательная взаимосвязь (табл. 2) между уровнем восстановленного глутатиона и содержанием НКП, в группах изолированного течения хронической алкоголизации и сахарного диабета, также отмечается наличие отрицательной корреляции, но средней силы. Взаимосвязь изучаемых показателей наиболее сильно проявляется при сочетании хронической алкоголизации со сформированным сахарным диабетом. Таким образом, при сочетании хронической алкогольной интоксикации с сахарным диабетом отмечается более выраженное уменьшение уровня восстановленного глутатиона в сердце.

При анализе активности глутатионпероксидазы в сердце нами выявлено статистически значимое снижение по отношению не только к КГ, но и к группе СД, вне зависимости от типа сочетания хронической алкоголизации и сахарного диабета. У представителей групп СД-АI, СД-АII и СД-АIII активность глутатионпероксидазы в сердце была ниже, в сравнении с КГ и СД, соответственно, на 31 % (pU0<0,001) и 49 % (pU0<0,001), 33 % (pU0<0,001) и 50 % (pU0<0,001) и, 36 % (pU0<0,001) и 53 % (pU0<0,001). Вместе с тем, при изолированном течении хронической алкоголизации и сахарного диабета отмечалось разнонаправленное изменение активности глутатионпероксидазы. По отношению к КГ, группах АII и АIII активность ГПО в сердце была, соответственно, на 49 % (pU0<0,001) и 51 % (pU0<0,001) ниже, а в группе СД обнаружено повышение активности ГПО на 35 % (pU0<0,001).

Сохраняющееся снижение активности в группах СД-АI, СД-АII и СД-АIII можно рассматривать как проявление дефицита антиперекисных механизмов защиты сердца, характерного для хронической алкогольной интоксикации (Albano E., 2006; Saravanan R. et al., 2006). ГПО один из ведущих антиокислительных энзимов, участвующий в защите клеток сердца от СРО (Cohen G., 1985; Flohe L., 1989; Nair S. et al., 1990), совместно с глутатион-S-трансферазой принимает участие в восстановлении гидропероксидов, тем самым, предупреждая появление их вторичных метаболитов (Кулинский В. И. с соавт., 2009).

При исследовании активности глутатион-S-трансферазы и глутатионредуктазы были получены следующие результаты (рис. 4): активность Г-S-ТФ в сердце особей, по отношению к КГ, увеличена только у представителей групп СД-АI и СД-АII, соответственно, на 20 % (pU0=0,019) и 23 % (pU0=0,005). Активность ГР повышена на 50 % (pU0<0,001) и 36 % (pU0<0,001), соответственно, в группах СД-АII и СД-АIII,. В группе СД-АI активность глутатионредуктазы была на 41 % (pU0<0,001) ниже, чем в КГ.

Рисунок 3. Активность глутатионпероксидазы (ГПО, мкмоль GSH •мин-1•мг-1 белка) в сердце при сочетании сахарного диабета и хронической алкогольной интоксикации. Примечание. Обозначения – см. рис. 2.

Рисунок 4. Активность глутатион-S-трансферазы (Г-S-ТФ, мкмоль GS-ХДНБ•мин-1•мг-1 белка) и глутатионредуктазы (ГР, мкмоль НАДФН •мин-1•мг-1 белка) в сердце при сочетании хронической алкогольной интоксикации и сахарного диабета. Примечание. Обозначения – см. рис. 2.

При сравнении изучаемых показателей с группой СД выявлено статистически значимое повышение активности ГР на 12 % (pUсд<0,001) лишь в группе СД-AIII.

В сердце особей с экспериментальным стрептозотоцин-индуцированным сахарным диабетом нами установлено увеличение содержания КПБ на 20% (pU0=0,003), по сравнению с КГ (рис.5). У особей групп СД-АII и СД-AIII был выявленный более высокий уровень гликированных белков в сравнении с группой СД. Вероятно, хроническая алкогольная интоксикация на фоне сформированного сахарного диабета воздействует на процессы образования конечных продуктов гликирования.

При сравнительном анализе изменений в сердце исследуемых показателей свободнорадикального окисления, у особей с изолированным течением сахарного диабета (группа СД) и хронической алкоголизации (группы AI, AII, и AIII,) обнаружено (рис. 2, 5), что увеличение содержания в сердце НКП у животных данных групп практически одинаково, а уровень КПБ повышен, лишь у больных сахарным диабетом особей.

Высокий уровень КПБ в сердце у животных со стрептозотоцин-индуцированным сахарным диабетом, вероятно, свидетельствует о зависимости образования АФК от скорости гликирования протеинов. Подобное химическое преобразование белковых молекул, снижает их антирадикальную устойчивость и делает более подверженными окислительной модификации (Wolff S.P. et al., 1986; Stadtman E. R. et al., 2005; Hawkins C.L. et al., 2009).

Рисунок 5. Уровень карбонильных производных белков (КПБ) в гомогенатах сердца при сочетании экспериментального сахарного диабета и хронической алкогольной интоксикации. Примечание. Обозначения – см. рис. 2.

Статистически значимое увеличение содержания -кетоаминов в сердце у особей групп СД-АII и СД-АII в сравнении с СД (табл. 3). может говорить об интенсификации процессов неферментативного гликирования белков при сочетании хронической алкогольной интоксикации и сахарного диабета.

Как показал корреляционный анализ в группах СД, СД-АI, СД-АII и СД-АII имеется сильная отрицательная взаимосвязи между содержанием в сердце -кетоаминов и активностью глутатионпероксидазы, в группах СД-АI, СД-АII и СД-АIII, соответственно, r = -0,724 (p<0,01) r = -0,722 (p=0,01), r = -0,726 (p<0,01) и r = -0,744 (p<0,01).

Интенсификация образования конечных продуктов гликирования, в свою очередь, может снижать антирадикальную устойчивость белковых молекул, что способствует окислительной модификации белков, как за счет действия АФК, так и путем локального металлкатализируемого окисления протеинов (Дубинина Е. Е. с соавт., 1993, 2002; Stadtman E. R. et al., 2003). Результатом данных процессов является усиление генерации АФК и радикальных дериватов, усугубляющих течение свободнорадикального окисления и угнетающих активность ферментов антиоксидантной защиты. Можно предположить, что одной из причин обнаруженных нами изменений активности ферментов является окислительная модификация белков, а также процессы гликирования. Проведенный корреляционный анализ показывает наличие сильной отрицательной взаимосвязи между активностью глутатионпероксидазы и содержанием карбонильных производных белков, в группах СД-АI, СД-АII и СД-АIII, соответственно, r = -0,761 (p=0,01), r = -0,821 (p<0,01) и r = -0,801.

Таким образом, причиной обнаруженного увеличения низкомолекулярных карбонильных продуктов свободнорадикального окисления и карбонильной модификации белков может быть уменьшение активности антиперекисных энзимов, что создает условия для накопления пероксидных соединений. Низкая активность глутатионпероксидазы и глутатион-S-трансферазы может приводить к нарушению утилизации липоперекисей и усиливать, тем самым, повреждающее действие свободных радикалов в сердце при сочетании сахарного диабета и хронической алкогольной интоксикации.

При сочетании хронической алкогольной интоксикации и сахарного диабета в сердце отмечается более выраженная интенсификация процессов свободнорадикального окисления, чем при изолированном течении хронической алкоголизации и сахарного диабета. Подобные изменения могут быть обусловлены значительным уменьшением уровня восстановленного глутатиона и снижение эффективности ферментативных глутатион-зависимых механизмов антиокислительной защиты сердца при хронической алкогольной интоксикации в сочетании с сахарным диабетом. При этом отмечается разнонаправленность изменений активности глутатионпероксидазы, глутатионредуктазы и глутатион-S-трансферазы. Однако высокая активность в сердце данных энзимов сопровождается низкими значениями уровня восстановленного глутатиона и увеличением содержания низкомолекулярных карбонильных продуктов свободнорадикального окисления и карбонильных производных белков, что, вероятно, свидетельствует о неэффективности напряжения антиокислительной глутатионовой системы. Отсутствие компенсации функционирования в сердце глутатионовой антиоксидантной системы взаимосвязано с процессами окислительной и неокислительной модификации белков. Об этом может свидетельствовать сильная отрицательная корреляционная связь между низкой активностью глутатионпероксидазы и интенсификацией процессов химической модификации белков в сердце.

Полученные результаты показывают, что в представленных вариантах сочетания хронической алкогольной интоксикации и экспериментального сахарного диабета отмечается более выраженное проявление окислительного стресса в сердце. Это обусловлено, вероятно, не только простой суммацией эффектов сахарного диабета и хронической алкоголизации, а качественными изменениями функционирования антиокислительной глутатионовой системы, возникающими при их сочетании и характеризующимися: более выраженным снижением уровня восстановленного глутатиона, значительным угнетением активности глутатионпероксидазы, недостаточно эффективным повышением активности глутатион-S-трансферазы и глутатионредуктазы, а также гиперактивацией процессов гликирования и окислительной модификации белков.

Выводы:

1. Интенсивность свободнорадикального окисления в сердце значительно повышена при сочетании сахарного диабета и хронической алкогольной интоксикации, в сравнении с соответствующими сдвигами при сахарном диабете вне алкоголизации и с изменениями при изолированном хроническом воздействии алкоголя.
2. Более выраженное уменьшение уровня восстановленного глутатиона в сердце отмечается при сочетании хронической алкогольной интоксикации и сахарного диабета.
3. При сочетании хронической алкоголизации со сформированным сахарным диабетом выявлено снижение активности глутатионпероксидазы, сопровождающееся изменением активности глутатионредуктазы и глутатион-S-трансферазы.
4. Изменение активности ферментов обмена глутатиона при сочетании хронической алкоголизации с сахарным диабетом может быть обусловлено активацией процессов химической модификации протеинов, что проявляется ростом содержания в сердце -кетоаминов и карбонильных производных белков.
5. При сочетании хронической алкогольной интоксикации и сформированного сахарного диабета имеется сильная отрицательная корреляционная связь между активностью глутатионпероксидазы и интенсификацией процессов химической модификации белков в сердце.
6. При сочетании хронической алкогольной интоксикации и сформированного сахарного диабета в сердце обнаружено более выраженное повышение уровня продуктов гликирования и карбонильной модификации протеинов, чем при изолированном моделировании сахарного диабета и хронической алкоголизации.

1. Индутный, А.В. Патохимические проявления кардинальных осложнений у больных сахарным диабетом, злоупотребляющих алкоголем / А.В. Индутный, Л.Ф. Панченко, В.Е. Высокогорский, Д.Е. Быков // Вопросы биологической, медицинской и фармацевтической химии. – 2008. – № 3. – С. 42-45.
2. Индутный, А.В. Манифестация и патохимические предпосылки повреждения миокарда при сочетании хронической интоксикации алкоголем и сахарного диабета / А.В. Индутный, В.Е. Высокогорский, Д.Е. Быков // Наркология. – 2009. – № 2. – С. 57-61.

Статьи, опубликованные в других изданиях

1. Индутная, Л. Н. Активность свободно-радикальных процессов у больных сахарным диабетом типа 2, злоупотребляющих алкоголем / Л.Н. Индутная, Д. Е. Быков, А. В. Индутный, Е. С. Ефременко, А. К. Качур // Актуальные вопросы наркологии: сборник трудов V межрегиональной научно-практической конференции. – Омск, 2004. – С. 38-39.
2. Быков, Д. Е. Особенности модификации белков сыворотки крови у больных сахарным диабетом при злоупотреблении алкоголем // Д. Е. Быков, А. К. Качур / Тезисы докладов 74-й научной студенческой конференции : под ред. В.В. Шаповаловой. – Омск, 2005. – С. 7-8.
3. Индутный, А. В. Активность свободнорадикальных процессов у больных сахарным диабетом, злоупотребляющих алкоголем / А. В. Индутный, В. Е. Высокогорский, Д. Е. Быков, Г.А. Лопухов // Межрегиональная научно-практическая конференция «Новая идеология в единстве фундаментальной и клинической медицины» : сб. научн. тр. – Самара, 2005. – С. 158-162.
4. Высокогорский, В. Е. Карбонильная модификация белков и активность антиокислительных ферментов в сердце при сочетании сахарного диабета с хронической алкогольной интоксикацией / В. Е. Высокогорский, А. В. Индутный, Д. Е. Быков // IV съезд биохимиков и молекулярных биологов СО РАН, Российское общество биохимиков и молекулярных биологов: сб. научн. тр. – Новосибирск, – 2008. С. 563.
5. Быков, Д. Е. Уровень глутатиона и интенсивность свободнорадикального окисления в сердце при сочетании хронической алкогольной интоксикации и сахарного диабета / Д. Е. Быков // Омская биологическая школа : сб. научн. тр. – Омск, 2009. С. 5-6.
6. Быков, Д. Е. Активность ферментов обмена глутатиона и интенсивность свободнорадикального окисления в сердце при сочетании хронической алкогольной интоксикации и сахарного диабета / Д. Е. Быков // Омская биологическая школа : сб. научн. тр. – Омск, 2009. С. 7-8.

На правах рукописи

БЫКОВ

Денис Евгеньевич

ГЛУТАТИОНОВАЯ СИСТЕМА И ИНТЕНСИВНОСТ СВОБОДНОРАДИКАЛЬНОГО ОКИСЛЕНИЯ В СЕРДЦЕ ПРИ СОЧЕТАНИИ ХРОНИЧЕСКОЙ АЛКОГОЛЬНОЙ ИНТОКСИКАЦИИСАХАРНОГО ДИАБЕТА

03.01.04 – биохимия

Автореферат

диссертации на соискание ученой степени

кандидата медицинских наук

Челябинск – 2010

Подписано в печать.

Формат 60х84 1/16. Бумага офсетная. Отпечатано на ризографе.

Усл. печ. л. 2,0. Тираж 100 экз.

Типография ОмГМА, 644043, г. Омск, ул. Ленина, 12.