Хромосомные аберрации, микроядра и апоптоз в лимфоцитах при радиационных воздействиях и других патологических состояниях

На правах рукописи

КОЛЮБАЕВА

Светлана Николаевна

Хромосомные аберрации, микроядра и апоптоз в лимфоцитах

при радиационных воздействиях и других патологических

состояниях

03.01.01 – радиобиология

АВТОРЕФЕРАТ

диссертации на соискание ученой степени

доктора биологических наук

Обнинск, 2010

Работа выполнена в Федеральном государственном образовательном учреждении высшего профессионального образования «Военно-медицинская академия им. С.М. Кирова» МО РФ.

Научный консультант: доктор медицинских наук, профессор

Гребенюк Александр Николаевич

Официальные оппоненты: доктор биологических наук, профессор

Коноплянников Анатолий Георгиевич

доктор биологических наук, профессор

Кравцов Вячеслав Юрьевич

доктор биологических наук

Осипов Андреян Николаевич

Ведущая организация: Биологический факультет Московского государственного университета им. М.В. Ломоносова

Защита состоится «____» ___________ 2010 года в 11.00 часов на заседании диссертационного совета Д 001.011.01 при Учреждении Российской академии медицинских наук - Медицинский радиологический научный центр РАМН по адресу:

249036, Калужская область, г. Обнинск, ул. Королева, д. 4.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Медицинского радиологического научного центра РАМН.

Автореферат разослан «____» _________ 2010 г.

Ученый секретарь

диссертационного совета Палыга Г.Ф.

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность работы. Лимфоциты периферической крови циркулируют во всех тканях организма, являясь носителями многих физиологических функций. Облучение, химические вещества экзогенной и эндогенной природы, вирусы воздействуют на геном, вызывая повреждения. В ответ клетки вовлекают три процесса: задержку клеточного цикла, репарацию ДНК и гибель [Imyanitov et al., 2005]. Для того, чтобы правильно оценить действие повреждающих агентов, и в частности, облучения, используют цитогенетические методы, благодаря довольно точным и повторяющимся результатам [Amundson et al., 2001; Mettler and Voelz, 2002; Leonard et al., 2005; Sevan’kaev et al., 2005; Levy et al., 2007]. Однако широко используемый в целях радиационной диагностики метод определения числа дицентрических хромосом имеет ряд недостатков [Edwards et al., 2005; Lamadrid et al., 2007]. При облучении в малых дозах он информативен только при анализе большого числа метафаз [Voisin, 2001, 2004]. В отдаленные сроки часть дицентрических хромосом элиминируется, снижая тем самым реальную дозу облучения [Рубинович и соавт., 2006; Wang et al.,2007]. Кроме того, после облучения, вирусных инфекций, а также с возрастом происходит уменьшение размера теломер, что увеличивает число теломерных ассоциаций и приводит к числу ложноположительных случаев [Stewenius et al., 2005; Sguara et al., 2006; Castella et al., 2007; MKacher et al., 2007]. Флуоресцентная in situ гибридизация - один из наиболее точных методов для обнаружения облученности организма. Он лишен ряда недостатков предыдущих методов, так как позволяет регистрировать стабильные аберрации, которые сохраняются в течение длительного периода [Sorokine-Durm et al., 2000; Camaparoto et al., 2003]. Кроме того, метод может быть использован для выявления микротранслокаций [Bauchinger et al., 2001; Tucker, 2001; Pouget et al., 2004; Durante et al., 2004; Edwards et al., 2005; Szeles et al., 2006]. Как правило, для определения факта облученности используют библиотеку генов нескольких хромосом с последующим пересчетом выявленных повреждений на весь геном [Lucas et al., 1993]. Однако такой пересчет не всегда бывает адекватным, так как хромосомы имеют разную радиочувствительность за счет длины теломер, экспрессии генов, наличия общих ломких сайтов и т. д. [Martin-Subero et al., 2002; Narath et al., 2005; Lamadrid et al., 2007]. Все эти проблемы можно решить при использовании мультиколорного FISH [Braselman et al., 2005]. Однако высокая стоимость метода и большая трудоемкость не могут способствовать широкому внедрению метода в практику [Pouzoulet et al., 2007].

В последние годы благодаря своей простоте достаточно широкое распространение, наряду с методом анализа хромосомных аберраций (ХА), получил метод анализа микроядер (МЯ) [Fenech, 1997, 2000, 2006; Miller et al., 2007]. В течение ряда лет дискутируется вопрос об эквивалентности этих двух методов для биологической дозиметрии [Bhat and Rao, 2003; Edwards et al., 2004; Fenech, 2006; Hatayoglu and Orta, 2007]. Оба показателя имеют в определенном диапазоне доз линейную или линейно-квадратичную зависимость. При этом спонтанный уровень МЯ выше, и по своей чувствительности к радиации этот метод несколько уступает методу анализа ХА. Возможно, причина кроется в механизме формирования МЯ [Tanaka et al., 2000; Norppa and Falck, 2003; Thomas et al., 2003; Fenech, 2007].

Известно, что структура и количество хромосом должны оставаться постоянными в течение жизни, поэтому многие изменения, возникшие в результате повреждающих воздействий, элиминируются из организма. Некоторые остаются в течение многих лет, формируя состояние генетической нестабильности [Paz-y-Mino et al., 2001; Kawamura et al., 2004; Rossner et al., 2005]. Изменения в геноме лимфоцитов могут происходить при физиологическом старении [Blasco, 2005; Gerdes et al., 2005; Zijno et al., 2007] и старении, вызванном воздействием различных агентов, в том числе и радиацией [Любимова и Воробцова, 2007; Krishnaja and Sharma, 2006; Suzuki et al., 2007]. Наличие генетических перестроек в геноме опухолей является хорошо доказанным фактом. В настоящее время установлено, что 90% всех опухолей человека имеют цитогенетические повреждения. Однако до сих пор не ясно, являются ли эти повреждения причиной или следствием формирования опухоли. Имеются данные о том, что неправильное расположение генетической информации может привести к серьезным нарушениям в состоянии здоровья человека, даже если ни один из участков хромосом не утерян [Tefferi et al., 2005; Kreskova et al., 2007].

Цель исследования: в клинико-экспериментальных исследованиях оценить повреждения генома лимфоцитов при развитии патологических состояний, вызванных воздействием радиации в сравнении с другими повреждающими факторами.

Основные задачи исследования:

1. Изучить частоту хромосомных аберраций (ХА) и микроядер (МЯ) в лимфоцитах периферической крови после облучения in vitro.
2. Выявить зависимость индукции апоптотических лимфоцитов при облучении проб крови человека in vitro и лабораторных животных in vivo.
3. Выявить дозовую зависимость стабильных ХА у человека и обезьян методом флуоресцентной in situ гибридизации (FISH).
4. Исследовать влияние облучения на уровень ХА и МЯ у больных с нарушением тиреоидного гомеостаза.
5. Провести сравнительный анализ ХА и МЯ у участников ликвидации последствий аварии на Чернобыльской АЭС
6. Исследовать цитогенетические изменения у детей, рожденных у участников ликвидации последствий аварии на Чернобыльской АЭС
7. Определить характер повреждений генома лимфоцитов у больных с хроническим гепатитом С.
8. Установить особенности формирования хромосомных повреждений у лиц, участвующих в ликвидации химического оружия.
9. Изучить распределение ХА в лимфоцитах периферической крови больных с различными формами лимфом.

Основные положения, выносимые на защиту:

1. Исследование генома лимфоцитов периферической крови при различных патологических состояниях, вызванных действием радиации, вирусов, химических веществ, при условии нарушения тиреоидного гомеостаза, при лимфомах выявляет развитие сходных изменений цитогенетического статуса лимфоцитов, проявляющихся в формировании ХА и МЯ. Характер и выраженность цитогенетических проявлений экстремальных воздействий на лимфоциты определяются видом действующего фактора, его дозой, временем воздействия, а также степенью нарушения гомеостаза организма.
2. Сравнение дозовых зависимостей радиационно-индуцированных ХА и МЯ, аппроксимирующихся линейно-квадратичными уравнениями, выявляет их различия по линейной и квадратичной компонентам. Количество повреждений в хромосомах не зависит от длины хромосомы. Образование МЯ нельзя однозначно ассоциировать с ацентрическими фрагментами.
3. Лимфоциты периферической крови (ЛПК) аккумулируют полученные в результате действия облучения и других вредных факторов повреждения в виде стабильных ХА и сохраняют их в течение ряда лет. Если такие повреждения образуют клон, они становятся потенциальным источником образования гемобластозов и могут быть выявлены с помощью цитогенетических методов.

Научная новизна. При сравнительном исследовании двух цитогенетических методов на большой группе участников ликвидации в разные сроки после аварии на ЧАЭС, в том числе в течение первого месяца после воздействия, впервые установлено, что:

а) микроядерный тест с использованием цитокалазина В позволяет оценивать поглощенную дозу облучения с погрешностью, эквивалентной определению ее по уровню ХА, начиная с дозы 0,1 Гр;

б) наличие двуядерных лимфоцитов с двумя и более МЯ позволяет регистрировать дозу облучения, начиная с дозы 0,25 Гр;

в) отсутствие корреляции между дозовой зависимостью числа МЯ и частоты ХА не позволяет отождествлять МЯ с ацентрическими фрагментами;

г) МЯ, образованные в процессе митоза и в процессе апоптоза, не отличаются по морфологическим критериям, выявленным на световом и электронно-микроскопическом уровне исследования.

При сравнительном исследовании кривой доза-эффект, полученной методом FISH для ЛПК обезьян и человека, установлено, что для корректного определения дозы облучения необходимо использовать не менее трех ДНК-зондов для целых хромосом. Гибридизация хромосом 1, 4 и 13 человека с хромосомами 1, 4 и 16 обезьян позволяет использовать их для определения дозы облучения in vivo.

Установлено, что радиация вызывает зависимое от дозы увеличение суммарного числа МЯ и ХА, при этом число дицентрических хромосом более чем в два раза ниже числа МЯ при соответствующих дозах облучения. Полученные результаты позволяют расширить представления о механизме формирования МЯ. Длительный прием трийодтироксина приводит к достоверному увеличению числа ХА. Показано, что у пациентов с хроническим вирусным гепатитом С появляются маркерные хромосомы и клональные разрывы.

Практическая значимость работы заключается в получении новых фактов о закономерностях процесса апоптотической гибели лимфоидных клеток в нормальных физиологических условиях и при лучевом воздействии, на основе которых разработан метод быстрой диагностики лучевых повреждений. Предложенный метод анализа апоптотических (или аномальных) ядер имеет ряд преимуществ перед анализом частоты МЯ, так как экономит время за счет отсутствия культивирования и может быть применен при аварийных ситуациях для сортировки больших групп людей на облученных и необлученных. Впервые использованы ЛПК с целью диагностики цитогенетических повреждений при лимфомах и доказана их диагностическая значимость для клинических исследований.

Апробация работы. Результаты исследования доложены на Всесоюзной конференции “Радиобиологические последствия аварии на ЧАЭС” (Минск, 1991), 2-м радиобиологическом съезде (Киев, 1993), (25-th Annual Meeting of EEMS (Стокгольм, 1995), New Activities of WHO Collaborating (Монпелье, 1996), интернациональной конференции по радиационной биологии “Повреждения ДНК, репарация и канцерогенез” (Индия, 1998), Всесоюзной конференции “Морфологические, иммунологические и молекулярно-биологические аспекты идентификации гемобластозов и родственных заболеваний” (Адлер, 1999), международной конференции по цитогенетике опухолей (Париж, 2001), Российско-голландской научной конференции “Диагностика и лечение лимфом” (СПб., 2002), международной конференции “Гемобластозы: диагностика и лечение” (СПб., 2003), научной конференции “Биологическая защита” (СПб., 2006), международной конференции “Фундаментальные и прикладные проблемы медицины и биологии в экспериментах на обезьянах” (Адлер, 2007), 4-й Российской конференции по фундаментальной онкологии (СПб., 2008),

Диссертация апробирована на совместном совещании кафедр военной токсикологии и медицинской защиты, военно-полевой терапии, клинической биохимии, НИО отдела передовых медико-биологических технологий НИЦ Военно-медицинской академии им. С.М. Кирова, Научно-исследовательского испытательного центра (медико-биологической защиты) ГНИИИ военной медицины МО РФ 29 января 2008 г. (протокол № 10).

Реализация результатов исследования. Результаты исследования внедрены в учебную, научную и лечебно-диагностическую работу кафедры и клиники Военно-медицинской академии и ФГУ «НИИ онкологии им. Н.Н. Петрова Росмедтехнологий». На основании полученных данных выпущены методические рекомендации “Использование микроядерного теста для индикации пострадиационных эффектов у человека” (М: Минздрав, 1993), “Диагностическая значимость цитогенетических повреждений при лимфомах” (СПб.: ВМедА, 2000), “Диагностическая значимость цитогенетических показателей при миелопролиферативных заболеваниях” (СПб.: ВМедА, 2000), сделаны 3 рационализаторских предложения, получено авторское свидетельство на изобретение № 310946.

Личный вклад автора. Автором лично выполнены цитогенетические исследования для построения дозовых кривых для МЯ и ХА, для стабильных ХА, выявленных методом FISH, и цитогенетические исследования больных со злокачественными лимфомами, статистическая обработка, обобщение результатов исследований.

Публикации. По теме диссертации опубликовано 60 печатных работ, из них 21 статья в журналах, рекомендованных ВАК.

Структура и объем диссертации. Диссертация изложена на 261 странице машинописного текста и состоит из введения, обзора литературы, описания материалов и методов исследования, 7 разделов собственных исследований и обсуждения результатов, заключения, выводов, практических рекомендаций, списка литературы из 501 источника (в том числе 49 источников на русском языке и 452 источника на иностранных языках). Работа включает 22 таблицы и 27 рисунков.

Материалы и методы исследования

Работа выполнена на крови, полученной от 91 донора, от 118 участников ликвидации последствий аварии на ЧАЭС, от 14 детей, рожденных участниками ликвидации последствий аварии и их 18 родителей, от 83 пациентов с различной патологией щитовидной железы, получавших заместительную гормональную терапию трийодтироксином, от 20 пациентов с хроническим вирусным гепатитом С, от 7 лиц, имевших длительный контакт с нервно-паралитическими веществами (фосфорорганические вещества), от 101 пациента с неходжкинскими лимфомами. Кроме того, при исследовании пациентов с хроническим лимфоцитарным лейкозом параллельно с ЛПК анализировали клетки костного мозга, полученные во время стернальной пункции. С целью сопоставления полученных при исследованиях in vitro результатов были проведены эксперименты с облучением in vivo 10 обезьян-самцов Macaca mulatta (Monkey rhesus) и 120 беспородных крыс-самцов.

Для решения вопроса об информативности цитогенетических методов для оценки повреждений в геноме лимфоцитов было проведено сопоставление анализа ХА и МЯ на одних и тех же объектах. Кровь доноров для построения кривой доза-эффект облучали в диапазоне доз от 0,1 до 5 Гр и культивировали в течение 52 ч в случае анализа ХА и 72 ч в случае анализа клеток с МЯ. Для сравнения этих показателей при облучении in vivo были изучены участники ликвидации последствий аварии на ЧАЭС, а также пациенты с различной патологией щитовидной железы. Для исследования действия вируса хронического гепатита С и фосфорорганических соединений лимфоциты подвергали ФГА стимуляции в течение 72 ч, затем фиксировали и окрашивали методом дифференциальной окраски хромосом (Макгрегор и Варли, 1986).

Для исследования информативной значимости метода флуоресцентной in situ гибридизации (FISH) (Lucas et al, 1993) для построения кривой доза-эффект использовали кровь доноров и обезьян. Обезьян изучали с целью проведения сравнения данных, полученных при облучении in vivo и in vitro, а также для сопоставления кривых доза-эффект для человека и обезьян. Биотинилированные ДНК-пробы, специфичные к хромосомам 1, 4 и 13, получали с помощью ник-трансляции Hind III библиотек pBs-1, pBs-4, pBs-13 (Vysis, TechGen, France). Денатурацию зондов (библиотека генов хромосом 1, 4 и 13) осуществляли нагреванием смеси, находящейся в пластиковых пробирках, при температуре +80°С в течение 8 мин. Смесь (ДНК-зонд, Соt1 ДНК, среда для гибридизации) готовилась в пропорции 2:1:7. Денатурацию ДНК на стеклах производили помещением их на 3 мин в смесь, состоящую из 42 мл деионизированного формальдегида, 6 мл 20хSSC с рН=5,3 и 12 мл стерильной дистиллированной воды (+70°С) с последующим быстрым охлаждением в 2хSSC при +4°С с промывкой в трех порциях 70, 85 и 100% этанола при 0°С.

Стекла нагревали на термостатированном столике в течение 15 мин при +56°С, затем наносили на них денатурированные зонды, накрывали покровным стеклом и помещали их на ночь в термостат при температуре +37°C. После инкубации стекла промывали в растворе формальдегида и двух порциях 2хSSC. Насыщение производили в 0,1% растворе NP 40 в течение 20 мин при +37°С.

Детекцию гибридизационного сигнала осуществляли с помощью комплекса авидин–FITC (fluorescein isothiocyanate conjugated), помещая его на стекло на 45 мин, затем проводили три промывки в 4хSSC с добавлением 0,1% NP 40. Антитела к авидиновому комплексу помещали на стекла на 30 мин при температуре +37°С, после чего стекла промывали в 4хSSC с добавлением 0,1% NP 40. Маркирование осуществляли в течение 45 мин при +37°С, помещая на стекла антитела дигоксигенина, коньюгированные с FITC. Затем проводили дополнительное окрашивание препаратов помещением на стекла 400 мкл DAPI.

Для метода анализа клеток с аномальными ядрами крыс облучали в дозах 4,3 Гр (ЛД0/30), 8,3 Гр (ЛД 50/30) и 12,1 Гр (ЛД100/30). Забор крови производили из сердца под эфирным наркозом. Препараты готовили как для анализа ХА. Для сопоставления морфологических изменений в стимулированных культурах на электронном и световом уровнях клетки фиксировали смесью 2,5% раствора глютаральдегида и 1,6% раствора формалина в 0,2 М фосфатном буфере с рН 7.4 и затем дополнительно фиксировали 1% раствором тетрооксида осмия в том же буфере и заливали в аралдит. Ультратонкие срезы контрастировали уранил-ацетатом и цитратом свинца, просматривали на электронном микроскопе JEM-100B. Для анализа использовали серийные срезы.

Для определения риска появления гемобластозов у детей, рожденных участниками ликвидации последствий аварии на ЧАЭС, повреждения в лимфоцитах исследовали с помощью МЯ теста, ХА, в том числе с использованием метода дифференциальной окраски хромосом, а также тестирующего -облучения проб крови в дозе 1,5 Гр. Для выявления цитогенетических повреждений при неходжкинских лимфомах, в том числе и при хроническом лимфоцитарном лейкозе, использовали периферическую кровь, подвергнутую стимуляции митогенами для лимфоцитов B- и T-клеточного происхождения. Изменения числа и структуры хромосом определяли с учетом номенклатуры (ISCN, 2005).

В работе использовали методы вариационной статистики с оценкой значимости различий показателей с помощью t-критерия Стьюдента и точного критерия Фишера, а также дисперсионный и корреляционный анализ. Линейно-квадратичные функции, аппроксимирующие дозовые зависимости, вычисляли по методу “наименьших квадратов”:

• строили систему из N алгебраических уравнений, описывающих квадрат отклонения показателя от линейно-квадратичной функции, аппроксимирующей данную зависимость (N – число исследованных доз);
• приравнивали к нулю первую, вторую и третью производную полученной функции (квадрата отклонения);
• получали систему из трех уравнений с численными коэффициентами и тремя неизвестными, являющимися коэффициентами искомой линейно-квадратичной зависимости. Решая полученную систему уравнений, вычисляли неизвестные коэффициенты и определяли аппроксимирующую функцию.

Результаты собственных исследований и их обсуждение

Сравнительный анализ дозовых зависимостей числа хромосомных

аберраций и микроядер в лимфоцитах периферической крови

Зависимость числа ХА и МЯ от дозы -облучения представлена на рис. 1. Сравнение этих кривых показывает сходный характер зависимости от дозы облучения числа МЯ и суммарного числа аберраций.

Полученная дозовая зависимость для МЯ показателя аппроксимируется линейно-квадратичной функцией

Y=0,029+0,111D+0,011D 2,

где Y – количество МЯ на одну двуядерную клетку, ‰;

D – доза облучения, Гр.

Рисунок 1 – Кривая доза-эффект для нескольких цитогенетических показателей

По оси абсцисс – доза облучения, Гр

По оси ординат – число повреждений на клетку (ХА, %, МЯ, ‰)

– общее число хромосомных аберраций; – микроядра – дицентрики – фрагменты

В таблице 1 дано распределение МЯ на клетку в зависимости от дозы облучения. Как следует из полученных данных, критерием облученности может служить наличие трех и более МЯ в одной двуядерной клетке. Интересно отметить скачок в количестве клеток с несколькими МЯ, соответствующий переходу от 0,75 Гр к 1 Гр. Суммарный процент МЯ при этом возрастает монотонно, однако количество клеток с четырьмя МЯ увеличивается в 2 раза, а с тремя МЯ – в 8 раз. По-видимому, это связано с изменением мощности дозы облучения ( в 2 раза), предусмотренным калибровочным протоколом данного эксперимента, что также отмечается другими авторами [Bonassi et al., 2001; Varga et al., 2004; Bonassi et al., 2005]. Возможно, что распределение МЯ на клетку может иметь также значение для диагностики неравномерности облучения, так как происходит нарушение процентного соотношения общего количества МЯ и клеток с несколькими МЯ, что аналогично анализу распределения на клетку ХА.

Дозовая зависимость индукции тотальных аберраций описывается функцией:

Y=0,047 + 0,100D + 0,014D2,

где Y – общее число аберраций, %; D – доза облучения, Гр.

Сопоставление дозовых зависимостей индукции МЯ и общего числа ХА демонстрирует их практическую эквивалентность в данных экспериментальных условиях. Однако наблюдается несколько более высокий спонтанный уровень повреждений на клетку по критерию МЯ, а также незначительно меньший коэффициент при квадратичном члене в уравнении дозовой кривой, что соответствует данным [Savage,1988]. Показатель МЯ при дозах от 0 до 1 Гр статистически достоверно (p<0,005) отличается от ХА и может быть использован для определения дозы облучения для больших групп людей, как более простой по сравнению с анализом числа дицентриков метод, не требующий использования высококвалифицированного персонала.

Таблица 1 – Изменение числа клеток с микроядрами в культуре
ФГА-стимулированных лимфоцитов в зависимости от дозы облучения in vitro (культивирование в присутствии цитокалазина В)

Доза, Гр	Число МЯ на 1000 клеток	Число клеток с МЯ на 1000 клеток	Распределение клеток в зависимости от числа МЯ ( на 1000 клеток)
			0	1	2	3	4 и более
0	24,8±5,4	23,0±3,6	977,0	21,2±4,8	1,8±0,1	-	-
0,10	50,6±5,4	34,6±3,3	965,8	30,4±2,8	2,6±0,5	1,0±0,6	02±0,2
0,25	62,4±7,0	52,2±5,6	947,8	45,4±5,0	5,8±1,3	0,6±0,4	0,4±0,2
0,50	86,2±7,7	75,2±6,6	930,0	61,4±4,6	8,0±1,6	0,4±0,2	0,2±0,2
0,75	105,4±11,0	94,0±7,0	905,8	84,4±4,8	8,6±1,4	0,8±0,3	0,4±0,2
1,00	147,6±11,8	123,6±10,2	878,2	103,0±5,9	14,0±3,2	4,0±0,5	0,8±0,2
1,50	222,0±23,6	179,2±16,8	821,2	142,8±8,0	30,8±3,6	4,2±0,8	1,0±0,5
2,00	290,6±30,8	234,8±20,0	763,6	184,0±9,1	39,4±4,3	10,8±1,9	2,2±0,2
3,00	450,6±32,8	325,0±19,2	674,0	231,4±10,0	67,6±6,4	21,6±2,1	4,6±0,6
4,00	692,8±41,2	465,8±16,2	534,2	299,8±9,3	117,0±10,0	38,8±4,6	10,2±1,0
5,00	844,8±87,2	505,2±39,4	495,2	272,8±10,9	148,6±13,0	160,2±8,1	23,1 ±4,0

Что касается зависимости числа дицентриков и ацентрических фрагментов, то количество их при всех исследованных дозах в два раза ниже, чем в кривой для МЯ. Отличия эти не позволяют отождествлять МЯ только с ацентрическими фрагментами. Более того, культивирование ФГА-стимулированных лимфоцитов, облученных in vitro в больших дозах, приводит к увеличению числа МЯ с одновременным снижением митотического индекса. Кроме того, происходит задержка митозов на 1 ч при повышении дозы облучения на 1 Гр, т.е. количество митозов снижается с увеличением дозы облучения, а количество МЯ растет.

Для того, чтобы выявить морфологические особенности формирования МЯ в ФГА-стимулированных культурах лимфоцитов периферической крови после гамма-облучения in vitro, было проведено сопоставление серийных срезов в электронном микроскопе с морфологией клеток на световом уровне. На рис. 2 представлены электронно-микроскопические срезы, демонстрирующие формирование апоптотических структур, морфологически неотличимых от МЯ, образованных при делении клеточного ядра во время митоза.

Таким образом, апоптотический механизм формирования МЯ в ФГА-стимулированных культурах вносит вклад в суммарный МЯ показатель при облучении. Этот феномен был использован для быстрого определения факта облученности. Беспородных крыс облучали в дозах 4,3 Гр (ЛД0/30), 8,3 Гр (ЛД50/30) и 12,1 (ЛД100/30) и спустя 4 и 8 час (пик интерфазной гибели) в периферической крови подсчитывали клетки с аномальными ядрами (табл. 2).

Рисунок 2 – Разные стадии фрагментации ядра лимфоцитов на 4-е сутки после ФГА стимуляции и облучения

Увеличение: А – 5000х; Б, В – 8000х; Г – 10000х

Таблица 2 – Количество клеток с аномальными ядрами в периферической крови крыс у контрольных животных и после -облучения, ‰.

Доза облучения, Гр	Время после облучения, часы
	4	8
Контроль	5,91 ± 0,95*
4,3 (ЛД0/30 )	9,84 ± 2,30	20,70 ± 3,30
8,3 (ЛД50/30)	23,15 ± 2,50	20,75 ± 2,20*
12,1 (ЛД100/30)	27,80 ± 7,20*	37,85 ± 12,80*

*- статистически достоверные отличия (р=0,005, n =40).

Значительное увеличение количества клеток с аномальными ядрами вызывала доза облучения 12,1 Гр (ЛД100/30), при этом отмечалось нарастание частоты клеток с полным распадом ядра, для которого характерно наличие в цитоплазме свободно лежащих глыбок хроматина разного размера (рис. 3).

Рисунок 3 – Лимфоциты периферической крови с аномальными ядрами у крыс, подвергнутых -облучению в дозе 12,1 Гр (ЛД100/30).

а – лимфоцит с сохраненным основным ядром и несколькими микроядрами

б – лимфоцит, в котором ядро представлено группой хроматиновых глыбок разного размера. Увеличение х 1000

Использование FISH-метода для диагностики радиационных поражений

у человека и обезьян

Для того, чтобы сопоставить данные, полученные при облучении in vitro и in vivo на одном и том же материале, были использованы обезьяны, облученные 6 и 7 лет до начала настоящего исследования. Для построения дозовой зависимости использовали периферическую кровь от 5 обезьян, которую облучали in vitro. Так как до настоящего времени библиотека генов обезьян не получена, в работе использовали библиотеку генов 1 и 4 хромосом человека, как это было проведено в работе [Lucas еt al., 1993], для гибридизации с хромосомами как Mасаса mulatta, так и человека. Кроме того, в качестве третьей хромосомы была использована библиотека генов хромосомы человека 13, которая, как показано в настоящем исследовании, гибридизируется без дополнительной кросс-гибридизации с 16 хромосомой обезьяны. Это выявлено при сравнительном анализе одних и тех же метафазных пластинок, окрашенных с использованием G-banding и FISH. Полученные результаты гибридизации позволили использовать ДНК-зонды человека для построения кривой доза-эффект для обезьян.

На рис. 4 представлена дозовая кривая стабильных аберраций, полученных при -облучении лимфоцитов периферической крови обезьян в дозах от 0,5 до 5 Гр. При сравнении ее с кривой доза-эффект стабильных ХА в лимфоцитах человека, построенной при использовании тех же доз облучения и тех же ДНК-зондов, наблюдается подобная линейно-квадратичная зависимость. Что касается кривой доза-эффект у человека, то таких данных достаточно много [Granach et al., 1996; Edwards et al., 2007], и они вполне согласуются с полученными в этой работе. Как следует из кривой, достоверные отличия при определении дозы облучения наблюдаются, начиная с дозы 1 Гр, что также отмечено и в работе [Галстян и др., 2004].

Рисунок 4 – Кривая доза-эффект облученных in vitro лимфоцитов периферической крови обезьян и человека при использовании метода флуоресцентной in situ гибридизации

По оси абсцисс – доза облучения, Гр

По оси ординат – число аберраций на клетку, %

В таблице 3 представлены результаты проведенного нами анализа частоты ХА у обезьян. При сравнении частоты аберраций в хромосомах 1 и 4 видно, что нет прямой зависимости числа аберраций от размера хромосомы. Так, при анализе повреждений этих двух хромосом установлено, что при дозах 3 и 4 Гр количество аберраций в хромосоме 4 существенно выше, несмотря на более короткую ее длину. Это позволяет сделать вывод о том, что не правомерно использовать для установления дозы облучения два и тем более один ДНК-зонд. Кроме того, сравнивая частоту транслокаций в разных хромосомах при дозе 0,5 Гр, становится очевидным, что для получения статистически достоверных результатов необходимо анализировать не менее 1000 метафаз.

Таблица 3 – Частота стабильных хромосомных аберраций в лимфоцитах периферической крови обезьян Macaca mulatta при различных дозах

-облучения in vitro при мощности дозы 0,5 Гр/мин, абсолютные значения.

Доза облучения, Гр	Число клеток	Частота транслокаций в 1 хромосоме	Частота транслокаций в 4 хромосоме	Частота транслокаций в 13 хромосоме	Частота транслокаций в 1/4 хромосомах	Частота транслокаций в 4/13 хромосомах	Частота транслокаций в 1/13 хромосомах
0	3065	1	2	0	0	0	0
0,5	1145	2	5	0	0	0	0
0,75	1200	8	9	0	0	0	0
1	924	7	13	5	0	0	0
2	1237	32	40	7	3	1	0
3	806	35	51	24	2	0	0
4	667	44	88	15	0	0	0
5	438	50	63	25	4	2	0

Сумма длин хромосом, исследованных у обезьян, составляет 16,93% от общей длины их генома [Dutrillaux et al., 1979]. Используя формулу, предложенную Lucas [Lucas et al.,1993], можно определить дозу, которую получили обезьяны, облученные несколько лет назад in vivo. Эта доза равнялась 3 и 1,8 Гр, так как частота аберраций на клетку у этих обезьян составляла 0,49 (подсчитано в 1900 метафазах) и 0,18 (подсчитано в 337 метафазах), соответственно. Сравнение полученных обезьянами доз при облучении in vivo с дозами, полученными при использовании анализа числа транслокаций методом FISH, обнаруживает сходство только с облучением в дозе 2 Гр на линейном ускорителе. Что касается облучения рентгеновскими лучами в дозе 5 Гр, то доза, подсчитанная с помощью FISH метода, в 1,67 раза ниже. Не исключено, что выявленная разница объясняется особенностями различных видов ионизирующего излучения. Однако более вероятно, что с повышением дозы облучения увеличивается количество нестабильных клеток, то есть клеток, содержащих дицентрики, кольца и фрагменты, которые элиминируются со временем и снижают число клеток как с нестабильными, так и стабильными аберрациями. Сходные результаты получены в работе [Gregoire et al., 2006] с M. fascicularis при облучении в дозах 2 и 4 Гр. Таким образом, кривая доза-эффект, построенная при облучении лимфоцитов периферической крови in vitro c применением техники FISH, может быть использована для определения дозы облученных in vivo обезьян.

Определение факта облученности участников ликвидации последствий аварии на ЧАЭС методом хромосомного и микроядерного анализа

Все обследованные лица работали в 1986-1987 гг. в 30-км зоне атомной станции и были изучены с помощью двух методов анализа – хромосомных аберраций и микроядер. Первая группа состояла из 17 человек, которые были исследованы через 1 месяц после Чернобыльской аварии. Вторую группу составляли 50 человек, и они были обследованы в 1990-1993 гг., т.е. через 4-7 лет после аварии. Третья группа (51 человек) была изучена в 1995 году, т.е. спустя 9 лет после аварии. В качестве контроля служили 50 здоровых доноров.

Результаты анализа, представленные в таблице 4, свидетельствуют о том, что в 1986 году у ликвидаторов наблюдался высокий уровень общего числа ХА, в основном, за счет ацентрических фрагментов. Число дицентрических хромосом составило 0,12%, при этом в контроле они не были выявлены совсем. Во второй группе наблюдался подъем числа дицентриков, в то время как общий уровень аберраций уменьшился более чем в два раза. Такой эффект отмечается также в работе [Stoilov et al., 1999] при исследовании лимфоцитов периферической крови.

Тестирующее облучение в дозе 1,5 Гр привело к увеличению как частоты дицентриков, так и общего числа аберраций у участников ликвидации последствий аварии, но эффект был менее выражен, чем в контрольной группе доноров. Stoilov et al. [1999] считают, что адаптация лимфоцитов периферической крови к облучению тесно связана с уменьшением чувствительности к образованию разрывов в ДНК. В третьей группе ликвидаторов число дицентриков возросло в 2,45 раза по сравнению с предыдущей группой при незначительном подъеме общего числа ХА.

Данные, касающиеся частоты МЯ, выявленных во второй и третьей группах исследуемых, представлены в таблице 5. Полученные в этих исследованиях результаты коррелируют с данными по ХА. Так, уровень МЯ во второй группе близок к уровню контрольной группы. Однако лимфоциты, содержащие 3, 4 и более МЯ, выявляются только у участников ликвидации последствий аварии. В таблице 1 было показано, что появление клеток с несколькими МЯ представляет собой специфичный радиационный эффект, зависящий от дозы облучения.

В третьей группе ликвидаторов наблюдается повышение общего уровня МЯ. Однако тестирующее облучение in vitro выявило уменьшение частоты МЯ по сравнению с ответом на облучение в группе здоровых доноров. Это полностью коррелирует с данными по хромосомному анализу.

Полученные результаты напоминают адаптивный ответ, описанный ранее [Аклеев и соавт., 2004], где показано, что при исследовании двух групп населения при почти равных спонтанных уровнях МЯ группы отличаются по чувствительности к острому облучению. Был сделан вывод, что предварительное облучение играет роль в развитии радиочувствительности и адаптивного ответа у хронически облученных людей. Это подтверждается и данными Пелевиной и соавт. [2007], изучавшими адаптивный ответ у пилотов и космонавтов. Степень адаптивного ответа уменьшается в третьей группе ликвидаторов, демонстрируя увеличение радиочувствительности хромосомного аппарата. Подобную реакцию наблюдали Joksic и Petrovic [2004] при тестирующем облучении 2 Гр в двух группах рабочих радиационного завода, отличающихся по содержанию дицентриков в лимфоцитах периферической крови. По-видимому, наличие определенного количества дицентриков в лимфоцитах периферической крови рабочих уже нельзя рассматривать как действие низких доз радиации, учитывая, что среднее время работы на заводе составляло около 15 лет. В пользу этого свидетельствуют и данные [Севанькаев и др., 2005], в которых отмечено многократное превышение уровня аберраций у работников ядерно-химических предприятий.

Таблица 4 – Общее число хромосомных аберраций (%) и их распределение в лимфоцитах периферической крови у участников ликвидации последствий аварии на ЧАЭС

Группа		Общее число	Дицент-рики	Фрагменты		Обмены
Кол-во, срок исследо-вания	Условия исследования			Одиноч- ные	Парные
Доноры, n=50	Базовый уровень	3,30±0,09	0	2,57±0,10	0,72±0,30	0,12±0,05
	Тестирующее облучение в дозе 1,5 Гр	20,50±2,01	8,30±2,00	4,5±1,21	6,66±1,20	0,19±0,04
Участники ликвидации последствий аварии на ЧАЭС
1 месяц после аварии, n=50*	Базовый уровень	9,90±1,370	0,12±0,09	3,75±0,51	6,00±0,68	0,12±0,09
4-7 лет после аварии, n=50**	Базовый уровень	3,90±0,29	0,20±0,07	3,10±0,27	0,70±0,12	0,10±0,03
	Тестирующее облучение в дозе 1,5 Гр	15,86±3,06	4,00±0,91	7,03±1,03	4,20±1,17	0,11±0,03
9 лет после аварии n=51***	Базовый уровень	4,50 ±0,35	0,54±0,09	2,25±0,17	1,21±0,15	0,034±0,012

* – находились в районе Чернобыля от 1 дня до 1 месяца;

** – находились в районе Чернобыля от 3 до 6 месяцев;

*** – находились в районе Чернобыля от 6 до 12 месяцев.

Основной смысл результатов этого этапа исследования состоит в следующем:

• наблюдается консервация цитогенетических повреждений в стволовых клетках в течение длительного периода;
• снижается уровень неспецифических повреждений и увеличивается уровень специфических повреждений (дицентриков) в исследуемом периоде;
• изменяется радиочувствительность хромосом у участников ликвидации последствий аварии на ЧАЭС в ответ на дополнительное облучение.

Таблица 5 – Содержание микроядер в лимфоцитах периферической крови у участников ликвидации последствий аварии на ЧАЭС, ‰.

Группа		Общее число МЯ	Распределение клеток в зависимости от содержания числа МЯ
Кол-во, срок исследования	Условия исследования		1	2	3	4 и более
Доноры, n=50	Базовый уровень	24,8±4,6	21,2±4,8	1,8±0,1	0	0
	Тестирующее облучение, 1,5 Гр	222,0±23,6	142,8±8,0	30,8±3,6	4, 2±0,8	1,0±0,5
Участники ликвидации последствий аварии на ЧАЭС
4-7 лет после аварии, n=50	Базовый уровень	25,5±3,1	19,8±2,0	1,5±0,4	0,4±1,1	0,2±0,1
	Тестирующее облучение, 1,5 Гр	101,8±7,6	77,3±5,2	11,4±1,9	0,8±0,5	0,4±0,2
9 лет после аварии, n=50	Базовый уровень	50,0±3,3	43,3±2,3	5,4±0,6	0,8±0,2	0,4±0,1
	Тестирующее облучение, 1,5 Гр	148,8±11,3	111,5±7,5	14,2±2,0	2,2±0,6	0,5±0,2

Интерпретировать однозначно полученные результаты трудно. Два фактора может быть взято в рассмотрение: консервация радиационных повреждений в стволовых клетках и различная радиочувствительность субпопуляций в лимфопоэтической системе. Имеющиеся в литературе данные экспериментально вызванных ситуаций [Kodama et al., 2005; Fucic et al., 2007] не могут быть использованы для интерпретации по той причине, что в них отсутствует компонент внутреннего облучения тяжелыми металлами, который имеет место при аварии в Чернобыле. Обобщая результаты, полученные методом хромосомного и микроядерного анализа, следует еще раз подчеркнуть, что они имеют общую направленность, хотя и существенно различаются. Основная причина этих различий лежит в том, что МЯ являются морфологическим проявлением различных процессов, которые представляют собой цепь последовательных событий на молекулярном уровне. Соотношение же МЯ митотического и апоптотического происхождения не является линейным и резко меняется при увеличении доз воздействия.

Влияние облучения на уровень хромосомных аберраций и микроядер у больных с нарушением тиреоидного гомеостаза

При цитогенетическом исследовании лиц, эвакуированных через месяц после аварии на ЧАЭС, обнаружено, что существенное увеличение суммарного числа аберрантных клеток происходит за счет нестабильных аберраций – ацентрических фрагментов. Можно предположить, что обнаруженный эффект определяется стрессорной реакцией, которая вызывает изменение гормонального статуса организма. Известно, что изменение гормонального баланса при гипотиреозе, тиреоидите и раке щитовидной железы может быть причиной повреждения как генетического аппарата лимфоидной клетки, так и ее мембран [Fenech, 2002]. В свою очередь состояние гормонального баланса организма зависит от его реакции на воздействие внешней среды. В связи с этим было проведено исследование пациентов двумя методами: хромосомным и микроядерным анализом.

Из сопоставления рисунков 5 и 6 следует, что в группе больных, леченных гормональными препаратами, тестирующее облучение изменяло соотношение типов регистрируемых аберраций: если в контроле уровень дицентриков в группе, леченной гормонами, превышал базовый уровень дицентриков в группе доноров, то после облучения наблюдалась противоположная картина.

Рисунок 5 – Частота хромосомных аберраций в лимфоцитах периферической крови больных, получавших заместительную гормональную терапию, и доноров, %.

Рисунок 6 – Частота хромосомных

аберраций в лимфоцитах периферической крови тех же больных, получавших заместительную терапию трийодтироксином, и доноров,%.

Поскольку общий уровень ХА в этой группе больных при облучении был близок к донорскому, по-видимому, имело место перераспределение ХА по типам: уменьшение числа радиационно-специфичных дицентриков и парных фрагментов при увеличении числа одиночных фрагментов. При этом соотношение ацентрических фрагментов и дицентриков до гормонального лечения равнялось 2,5, после гормонального лечения 2,9, в то время как в группе доноров – 1,7. Сходная динамика соотношений этих показателей получена в работе [Levy et al., 2007].

Сопоставление данных может свидетельствовать о воздействии наряду с радиационным гормонального фактора на формирование спектра аберраций [Speigh et al., 1968]. Изменение частоты МЯ в группе больных, леченных трийодтиронином (рис. 7 и 8), в сравнении с донорами в контроле и при облучении, имеют характер, сходный с изменениями количества дицентриков. При этом следует отметить, что соотношение дицентрических хромосом при тестирующем облучении и числа дицентриков при базовом уровне существенно ниже при гормональном лечении, в то время как соотношение одиночных фрагментов не различалось во всех исследуемых группах.

Рисунок 7 – Частота микроядер в лимфоцитах периферической крови тех же больных, получавших заместительную терапию трийодтироксином и доноров, ‰.

Сопоставление данных хромосомного и микроядерного анализа демонстрирует большую радиационную специфичность по тесту ХА на фоне гормональной терапии в отношении общего числа аберраций, что отмечается в ряде работ, выполненных с дозами, не превышающими 1 Гр [Рубанович и соавт., 2006]. При облучении крови больных in vitro процент общего числа ХА был близок к донорскому во всех группах. В то же время, соответствующий суммарный уровень МЯ оказался ниже донорского, т.е. реакция, аналогичная адаптивному ответу при предварительном облучении малыми дозами, регистрируется только по МЯ тесту [Mukaida еt al., 2007]. Возможно, в лимфоцитах больных нарушены механизмы, которые приводят к адаптивному ответу по показателю ХА [Maluf and Erdtmann, 2001]. Однако такая потеря адаптивного ответа может быть идентична описанному [Joksic and Petrovic, 2004], когда имел место высокий уровень дицентриков до повторного тестирующего облучения.

Рисунок 8 – Частота микроядер в лимфоцитах периферической крови тех же больных, получавших заместительную терапию трийодтироксином и доноров после тестирующего облучения in vitro в дозе 1 Гр, ‰.

Таким образом, при расхождении в оценке поглощенной дозы у пациентов с нарушениями функции щитовидной железы для получения более достоверных данных о повреждении генома лимфоцитов двумя методами следует ориентироваться на уровень общего числа ХА.

Определение канцерогенного риска у детей, рожденных у лиц, пострадавших от Чернобыльской аварии

Рак является второй наиболее частой причиной смертности во многих развитых странах. Число этих заболеваний возрастает с каждым годом, что связано, в первую очередь, с воздействием мутагенов различной природы, в том числе радиации [Kaatsch et al., 2008]. В ряде случаев, когда необходимо определить риск развития гемобластозов, в том числе после длительного воздействия мутагенов, может быть применен метод дифференциальной окраски хромосом, дающий общее представление об их структуре.

В настоящем фрагменте работы было проведено цитогенетическое исследование лимфоцитов периферической крови детей, рожденных у родителей - участников ликвидации последствий аварии на Чернобыльской АЭС после 1986 года. Было исследовано 32 человека, из которых 18 родителей и 14 детей. Мать, отец, или оба родителя работали в течение длительного времени (более 1 года) в 30 км зоне от Чернобыльской атомной станции. Дети исследовались в возрасте от нескольких недель до 18 лет. Цитогенетический анализ состоял в подсчете ХА и МЯ в периферической крови, а также в подсчете количества полиплоидных клеток.

В результате проведенных исследований установлено, что средний уровень ХА у женщин составил 2,65% (контрольный уровень – 1,93, p < 0,05), при этом дицентриков – 0,19%, 1,78% одиночных и 0,56 % парных фрагментов. Из 14 исследованных семей участников ликвидации аварии в пяти семьях у детей имелись хромосомные аномалии.

Девочка 5,5 лет (№ 1, табл. 6) имела дополнительный материал в р-плече хромосомы 13, что коррелирует с наличием дицентриков (0, 5%) и высоким уровнем полиплоидных клеток. Родители этой девочки были участниками ликвидации аварии, при этом только у матери выявлено наличие дицентриков, которые составили 0,3%.

У мальчика 7 лет (№ 2, табл. 6) была обнаружена клональная транслокация между хромосомами 1 и 3, t(1;3)(р36;q21), которая составила 2,5% в исследуемой популяции клеток и соответствовала острому миелобластному лейкозу М1. При этом у матери выявлен уровень суммарных ХА, равный контрольному значению, при этом дицентрики составляли 0, 5% повреждений.

У другого ребенка (девочка, 5 лет, № 3, табл. 6) выявлен дополнительный материал на р-плече хромосомы 21, сопровождаемый высоким уровнем ХА и полиплоидных клеток, число которых было самым высоким в изучаемой группе (4%). У матери – повышенный уровень ХА, 0, 5% которых составляли дицентрики.

У мальчика 11 лет (№ 4, табл. 6) (отец “ликвидатор“, основная работа была связана с радионуклидами) в анализируемых клетках был обнаружен дополнительный материал в 21р и в 14р. Кроме того, была выявлена клональная транслокация между хромосомами 6 и 12 t(6;12)(q23;p13), характерная для острого лимфобластного лейкоза, а также еще одна клональная транслокация между хромосомами 4 и 9 t(4;9)(p;p),+del(2)(q). При этом количество суммарных ХА у этого ребенка составило 4%. При цитогенетическом анализе лимфоцитов у отца (42 года) не было выявлено отличий от контрольного уровня.

У девочки 9 лет (№ 5, табл. 6) обнаружена клональная делеция в q плече хромосомы 11 - del (11)(q31). У отца количество ХА более чем в 3 раза превышало контрольный уровень, при этом количество дицентриков было самым высоким в группе. В целом из 14 обследованных детей у пяти отмечены стабильные клональные аномалии хромосомного аппарата, которые коррелируют с высоким суммарным уровнем ХА (в трех случаях) и радиационно-специфичными маркерами (в одном случае). Кроме того, у четырех родителей исследуемых детей были выявлены специфичные для облучения ХА. Из анализа ХА очевидно, что приобретенные детьми хромосомные аномалии не могли наследоваться через половые клетки, так как их носителями являются не все клетки организма, а только единичные, представляющие собой клон. Одним из возможных объяснений наличия этих повреждений лежит в основе явления трансмиссии, т.е. передачи геномной нестабильности от облученных клеток к необлученным [Mukaida et al., 2007].

Таким образом, цитогенетический анализ с помощью метода дифференциально окрашенных хромосом выявил группу детей, у которых обнаружены маркерные хромосомы, имеющие клональный характер происхождения и представляющие собой клетки, которые могут служить потенциальным источником опухоли. Такие дети должны быть отнесены в группу повышенного канцерогенного риска, так как имеют не только высокий уровень нестабильности хромосом [Fenech, 2002; Neri et al., 2003], но и клональные повреждения, относящиеся к категории гемобластозов.

Таблица 6 – Цитогенетический анализ лимфоцитов периферической крови участников ликвидации аварии на ЧАЭС и их детей

N	Обследуе-мые, Возраст, г	Хромосомный анализ, %, рутинная окраска хромосом					ПП %	Хромосомный анализ, дифференциальная окраска
		ДС	ОФ	ПФ	АК	Суммарное количество
1	Мать,31	0,3	2,5	1,0	0	3,8	0	-
	Отец, 30	0	2,5	0,5	0	3,0	0	-
	Дочь, 5,5	0,5	1,0	0	0	1,5	2	46,XX [40] 46,ХХ,13р+ [10]
2	Мать,39	0,5	0,7	0	0	1,2	0	-
	Сын,7	0	1,0	0,5	0	1,5	0,4	46,ХУ[195] 46,XY,t(1;3)(p36;q21),13р+, 21р+[5]
3	Мать,37	0,5	2,5	0,5	0	3,5	0	-
	Дочь,5	0	1,5	1,5	0	3,0	4	46,ХХ [40] 46,ХХ,21р+[10]
4	Отец,42	0	1,0	1,0	1,0	3,0	0	46,ХY [42] 46,XY,21p+[44]
	Сын,11	0	3,0	1,0	0	4,0	0,2	46,XY [96] 46,XY,t(6;12)(q23;p13) [2] 46,XY,t(4;9), del (2)(q) [2]
5	Мать,30	0	1,5	1,0	0,5	3,0	0,5	-
	Отец,34	0,9	3,6	3,1	0	7,6	1,6	46,XY [18] 46,XY,fra (2)(q) [1] 46,XY,fra(8)(q) [1]
	Дочь, 9	0	3,5	2,1	1,4	7,0	1,1	46,XX [98] 46,XX, del(11)(q31) [2]

ДС - дицентрические хромосомы; АК- ацентрические кольца и другие аберрации;

ПК - полиплоидные клетки; ОФ - одиночные фрагменты; ПФ – парные фрагменты; [ ] - количество клеток с выявленным кариотипом.

Исследование хромосомных изменений

у больных хроническим вирусным гепатитом С.

По данным ВОЗ [WHO, 2008] в мире насчитывается более 2 млрд человек, инфицированных вирусом гепатита В (ГВ) и около 350 млн носителей вируса гепатита С (ГС). Такая распространенность инфицирования заставляет при определении дозы облучения принимать во внимание и действие вирусов ГВ и ГС. При этом данные о влиянии этих инфекций, в особенности вирусов ГС, на хромосомный аппарат лимфоцитов почти отсутствуют. Важной особенностью, вызванной инфекцией вирусного ГС, является чрезвычайная способность вируса к длительной персистенции в организме хозяина [Толоконская и соавт., 2001]. Несмотря на наличие вирус-специфического иммунного ответа, у большинства инфицированных он не приводит к элиминации вируса и не защищает от реинфекции. В настоящее время показано, что вирус ГС обладает способностью к репликации не только в печени, но и во многих других органах, что очень важно в сравнении с гепатитом В, репликация которого происходит в основном в печени [Бушуева и соавт., 2005; Laskus et al., 2000; Castillo et al., 2005]. Однако несмотря на многочисленные исследования в этой области, до сих пор нет однозначного ответа о влиянии вируса ГС на тяжесть заболевания. Многие авторы рассматривают вирусный ГС как тяжелую форму гепатита с крайне неблагоприятным прогнозом, другие смотрят на эту проблему более оптимистично [Непомнящих и соавт., 2006].

Исследования генома лимфоидных клеток при вирусных ГС единичны, и касаются изменений в хромосомах, которые выявлены рутинным методом окраски. Учитывая это, мы провели цитогенетическое исследование лимфоцитов периферической крови пациентов с хроническим вирусным ГС.

В таблице 7 представлены хромосомные повреждения в ЛПК пациентов с ХВГ-С. Из таблицы следует, что среднее число поврежденных клеток у этих больных в четыре с лишним раза превышает их число у доноров. Наиболее частыми повреждениями при вирусных инфекциях являлись парные разрывы, которые составляли более половины всех повреждений. Вторую половину составляли транслокации, маркерные хромосомы, трисомии.

Таблица 7 – Среднее содержание аберрантных клеток в лимфоцитах периферической крови у больных с хроническим вирусным гепатитом С, %.

Количество аберрантных клеток у доноров	Количество аберрантных клеток у больных с ХВГС
2,3±0,4 (n=16)	9,4±1,0 (n=20)

Примечание: транслокации и инверсии считались как два нарушения, т.к. для их образования разрывы происходили в двух места.

Для определения частоты поврежденности хромосомы независимо от ее длины был введен критерий W (количество повреждений на единицу длины хромосомы). Из полученных данных следует, что критерий W для 1-ой хромосомы превышал более чем в 8 раз аналогичный показатель для других хромосом. В таблице 8 представлены наиболее часто повреждаемые участки хромосом. По-видимому, дальнейшее исследование лимфоидных клеток и тканей при ХВГ-С и отягощающих его инфекциях и токсических факторов, без которых эта инфекция встречается чрезвычайно редко, будет полезным для исследования механизмов действия всех этих факторов не только на лимфоидные клетки, но и на организм в целом.

Таблица 8 – Частота встречаемости повреждений в группе пациентов с ХВГ-С

Поврежденный участок	Встречаемость (количество человек)
1q31-32	7
9q21-22	6
2q32-34	5
7q22	5
3q24	5
Fis 1	5
2q11-13	4
6p12-13	4
2p12-13	4
4q13	4
1q23-25	3
8q21-23	3
9q13	3

Исследование хромосомных изменений у лиц, имевших длительный

контакт с отравляющими веществами нервно-паралитического действия.

У лиц, длительно контактировавших с фосфорорганическими отравляющими веществами, также, как и в предыдущей группе, наиболее частыми повреждениями являлись парные фрагменты, при этом суммарный процент повреждений колебался от 6,5 до 24,9. Наиболее частое количество повреждений наблюдалось во 2-й хромосоме, доля их составляла 2,54% от общего числа. Наиболее часто повреждаемые локусы 2q21-24 (6 раз) и 2q31-32(8 раз). В 6-ой хромосоме доля повреждений составляла 2,31%. При этом, наиболее часто повреждался локус 6q16 (11 раз).

Рисунок 9 – Количество клеток с хромосомными нарушениями в лимфоцитах лиц, участвовавших в ликвидации химического оружия, %

По оси абсцисс – обследуемые лица: с 1 по 7 – пациенты, 8 – доноры (средний уровень получен от 19 доноров)

По оси ординат – количество поврежденных клеток, %

Как следует из рис. 9, уровень поврежденных клеток колебался от 6,5 до 24%, при этом не выявлено корреляции между этим показателем и временем контакта с токсическими веществами, что, по-видимому, обусловлено, в основном, генетической предрасположенностью и иммунным статусом. Средний уровень поврежденных клеток у пациентов составил 13,9±4,3%, что в 12 раз превышало средний уровень, наблюдаемый у доноров (2,3±0,4).

На рис. 10 представлена частота поврежденных хромосом, из которой следует, что наиболее часто повреждаются 2 и 6 хромосомы, затем 1, 3, 5, 4, 8, 12, 9. Полученные результаты свидетельствуют о том, что фосфорорганические вещества избирательно воздействуют на хромосомы, а количество повреждений не коррелирует с их длиной. Причина может заключаться в числе активных генов, расположенных в хромосомах, как полагают [Braselman et al., 2004; Pouzoulet E. et al., 2007].

Обращает на себя внимание тот факт, что, несмотря на длительный контакт с химическими веществами (до 21 года), у обследуемого контингента лиц не выявлено стабильных аберраций в виде транслокаций или делеций, которые могли бы образовывать клоны.

Наиболее часто повреждаемая у обследуемых лиц хромосома 6, как известно, содержит в q-плече несколько генов-супрессоров опухоли, и, следовательно, потеря содержащих их участков могла бы привести к инициации процесса канцерогенеза. Каких-либо других, кроме заболеваний головного мозга и сердечно-сосудистой системы, у наблюдаемого контингента лиц не выявлено. Однако на основании полученных данных делать выводы об отсутствии кластогенного эффекта у исследованных токсикантов преждевременно. Вероятно, объяснение кроется в механизме действия фосфорорганических веществ, который носит строго направленный характер. Возможно, что используемый метод дифференциальной окраски хромосом не достаточно чувствителен для этих целей, и микроделеции, микроинверсии или микротранслокации не могут быть выявлены этим методом. Однако выяснение этого вопроса требует специального изучения и сравнения с действием химических препаратов другой природы.

Рисунок 10 – Частота поврежденных хромосом в лимфоцитах лиц, контактировавших с фосфорорганическими отравляющими веществами, %.

По оси абсцисс – номера хромосом и половые хромосомы Х и Y.

По оси ординат – хромосомные аберрации, %

Диагностическая значимость цитогенетических показателей

в лимфоцитах периферической крови и костном мозге больных

с различными формами неходжкинских лимфом.

Лимфомы являются одним из наиболее часто встречающихся заболеваний крови у лиц, пострадавших от ядерной бомбардировки в Хиросиме и Нагасаки. Однако их этиологию в большинстве случаев определить трудно.

Как правило, для цитогенетического анализа лимфом используются клетки лимфатических узлов. Однако этот материал мало доступен, а в случае удачного получения материала клетки должны быть помещены в культуру в течение 1 ч после экстирпации лимфоузла, что также не всегда может быть исполнено. Учитывая способность опухолевых лимфомных клеток к диссеминации в периферическую кровь уже на первых стадиях заболевания [Sotomayor et al., 2007], а также результаты наших предыдущих исследований канцерогенного риска у детей, в настоящем фрагменте работы проводилось изучение диагностической значимости цитогенетических показателей при культивировании ЛПК больных с неходжкинскими лимфомами. Для этого было проведено параллельное исследование клеток костного мозга и периферической крови с использованием митогенов для лимфоцитов T- и B-клеточного происхождения у 16 больных с различными формами лимфом.

Как следует из анализа наших данных, только в одном случае материал костного мозга оказался информативным (6,25%), во всех остальных случаях изменений в кариотипе выявлено не было. Наиболее часто встречались повреждения в хромосоме 3, при этом частота клеток с этими нарушениями колебалась от 1 до 10%. Более частым структурным повреждением являлись делеции части или целого p-плеча. Это нарушение отмечается в литературе как специфичное для лимфом [Jaffe et al., 2001]. Более того, выявлена клональная транслокация между хромосомами 2 и 3 у больного с экзонодальной лимфомой головного мозга (рис. 11 и 12).

Рисунок 11 – Метафазная пластинка из культуры ФГА-стимулированных лимфоцитов периферической крови больного с лимфомой центральной нервной системы. Стрелками указаны места перестроек хромосом.

Рисунок 12 – Кариотип
той же пластинки: 46, ХХ,
t(2;3)(q24;q25)

В литературе имеются единичные случаи генетического исследования лимфом центральной нервной системы, в том числе с использованием проточного флуориметра при анализе большого количества клеток [Miozzo et al., 2005]. Следует отметить высокий уровень диссеминации опухолевых клеток – 4%. При этом исследование костного мозга не было информативно.

Рисунок 13 – Изменение структуры хромосом (суммарное значение по периферической крови и костному мозгу), выявленное при цитогенетическом исследовании неходжкинских лимфом.

По оси ординат – номер хромосомы, по оси абсцисс – число повреждений, %

На рис. 13 представлены данные структурных нарушений в хромосомах лимфоцитов периферической крови и костного мозга (101 больной). Наиболее часто клональные повреждения наблюдаются в хромосомах 1, 3, 6 (более 10%). Число неклональных нарушений практически на порядок превышает клональ-ные. При этом наиболее существенное количество наблюдается в хромосомах 1, 3, 6 и 7, число этих нарушений велико и в хромосомах 2, 4, 5, 9, 12, 17, X. Более высокий уровень неклональных нарушений по сравнению с клональными, возможно, обусловлен низкой способностью опухоли к диссеминации, и требует большего числа анализируемых клеток.

На рис. 14 представлена диаграмма распределения ХА при неходжинских лимфомах. Для построения диаграммы использованы результаты цитогенети-ческого анализа лимфоцитов периферической крови 75 больных с различными формами лимфом.

Из диаграммы видно, что большая часть повреждений при этом

заболевании наблюдается при различных нарушениях в хромосоме 3, составляющих 51% от общего количества выявленных повреждений. В два раза реже встречаются нарушения в хромосоме 1. Остальные нарушения составляют

не более 5-10% случаев.

Рисунок 14 – Основные цитогенетические повреждения, встречающиеся при неходжкинских лимфомах.

На рис. 15 представлена диаграмма частоты встречаемости вторичных (или дополнительных) аберраций, выявленных при злокачественных лимфомах. Из диаграммы следует, что наиболее частыми вторичными аберрациями в нашем материале являются трисомии по различным хромосомам, а также делеции хромосомы 6q. Выявленные изменения соответствуют описанным в литературе [Jaffe et al., 2001], за исключением характерной для фолликулярных лимфом t(14;18). Возможно, это связано с эндемическими особенностями нашей страны, так как в единственной работе, в которой исследовали цитогенетические показатели при лимфомах в России [Fleischman et al.,1989], эта аномалия также не выявлена.

Рисунок 15 – Частота встречаемости вторичных хромосомных аберраций при злокачественных лимфомах, %.

Таким образом, можно заключить, что анализ клеток костного мозга не информативен на ранних стадиях заболевания при использовании метода G-banding. При этом анализ ЛПК является информативным при лимфомах на всех стадиях, особенно в случаях с экзонодальными заболеваниям. Распределение повреждений соответствует описанным в литературе при анализе материала, полученного из лимфатических узлов.

В Ы В О Д Ы

1. Воздействие радиации in vitro приводит к увеличению суммарного числа микроядер и хромосомных аберраций в лимфоцитах периферической крови, динамика образования которых имеет сходную зависимость от дозы облучения. Отсутствие клеток, содержащих более 3-х микроядер в контроле, и формирование их при облучении, уже начиная с дозы 0,5 Гр, позволяет использовать этот показатель для определения радиационных повреждений.
2. Анализ клеток с аномальными (апоптотическими) ядрами дает возможность выявлять повреждения при больших дозах радиационного воздействия через 6-8 ч после облучения организма, т.е. времени, соответствующему пику интерфазной гибели клеток.
3. Микроядра имеют различные механизмы происхождения, однако наибольшая часть их формируется во время митоза и апоптоза. Соотношение вклада этих двух механизмов в формирование микроядер зависит от величины повреждающего воздействия на клетки.
4. Число повреждений на хромосому не зависит от ее длины, поэтому метод флуоресцентной in situ гибридизации (FISH) должен применяться для биодозиметрии с использованием ДНК-зондов не менее чем для трех хромосом.
5. Выявлена прямая зависимость между радиационно-специфичными повреждениями, обнаруженными в лимфоцитах родителей – участников ликвидации последствий аварии на ЧАЭС, и маркерными хромосомами у детей, специфичными для гемобластозов.
6. Облучение в дозе 1 Гр при условии нарушения тиреоидного гомеостаза в 1,5 раза увеличивает число микроядер по сравнению с контролем, при этом суммарное число хромосомных аберраций не изменяется.
7. При оценке степени облучения необходимо учитывать мутагенные свойства вируса гепатита С, которые проявляются в формировании парных разрывов в сайтах 1q31-32, 9q21-22, 2q32-34, 7q22, и появлении маркерных хромосом.
8. Особенностью формирования хромосомных повреждений в лимфоцитах периферической крови у лиц, длительно контактировавших с фосфорорганическими отравляющими веществами, является образование ломких сайтов и парных фрагментов, при этом изученные вещества не обладают канцерогенным эффектом.
9. Спектр распределения хромосомных аберраций в периферической крови при лимфомах соответствует таковому в клетках лимфатических узлов. Особенностью фолликулярных лимфом у больных в Северо-Западном регионе России является отсутствие транслокации (14;18), наиболее специфичной для этой группы заболеваний в США и странах западной Европы.

Практические рекомендации

1. Для корректной оценки радиационных поражений лаборатории, занимающиеся биологической дозиметрией, должны иметь собственную калибровочную кривую для всех методов, используемых в этой лаборатории.
2. В случае потенциальной опасности сверхнормативного облучения людей необходимо использовать микроядерный тест для всех лиц, которые находились в зоне аварии. Оценка дозы по этому критерию должна определяться только с учетом данных тщательно собранного анамнеза, так как различные предшествующие воздействия – вирусы, химические вещества, а также радиация, могут изменять истинную дозу облучения.
3. Лица, у которых выявлен уровень МЯ, соответствующий дозе более 1 Гр по калибровочной кривой, должны быть обследованы вторично для определения числа дицентриков, желательно с использованием метода дифференциальной окраски хромосом во избежание артефактов. При радиационном воздействии в высоких дозах и необходимости немедленного обследования людей для оценки поглощенной дозы можно использовать показатель аномальных клеток в лимфоцитах периферической крови.
4. В тех случаях, когда необходимо подтвердить или выявить факт облученности организма в отдаленные сроки после воздействия, необходимо использовать метод FISH, при использовании не менее трех ДНК-зондов.
5. Лица с выявленными в результате радиационного воздействия стабильными рекуррентными хромосомными повреждениями в лимфоцитах, которые можно рассматривать как онкомаркерные, должны быть отнесены к группе канцерогенного риска и регулярно проходить диспансерное обследование.
6. При обследовании пациентов с эндо- и экстранодальными лимфомами для цитогенетических исследований следует использовать лимфоциты периферической крови, стимулированные Т- и B-клеточными митогенами.
7. Цитогенетический метод исследования лимфоцитов периферической крови может быть использован для многократных исследований пациентов с лимфопролиферативными заболеваниями с целью дифференциального диагноза, прогноза лечения и определения минимальной остаточной болезни.

Список основных публикаций по теме диссертации.

Публикации в изданиях, рекомендованных ВАК МОиН РФ.

1. Колюбаева С.Н. К механизму образования микроядер в ФГА-стимулированных лимфоцитах периферической крови человека / С.Н. Колюбаева, Л.В. Щедрина, Р.П. Степанов [и др.] // Цитология. – 1986. – Т. 28, № 26. – С. 227-231.
2. Колюбаева С.Н. Исследование механизма гибели тимоцитов при воздействии сверхвысоких доз гамма-облучения / С.Н. Колюбаева, Н.Б. Звонароева, А.С. Сейлиев [и др.] // Радиобиология. – 1987. – Т. 27, вып. 3. – С. 319-324.
3. Колюбаева С.Н. Электронно-микроскопический анализ пострадиационной гибели тимоцитов и лимфоцитов периферической крови / С.Н. Колюбаева, В.Е. Комар, Р.П. Степанов [и др.] // Радиобиология. – 1988.– Т. 28, вып. 2.– С. 189-194.
4. Колюбаева С.Н. Сравнительное исследование микроядерного теста и хромосомных аберраций в лимфоцитах человека / С.Н. Колюбаева, Б.И. Прокопчук, В.В. Ракецкая [и др.] // Радиобиология. – 1989. – Т. 29, вып. 5. – С. 611-614.
5. Колюбаева С.Н. Анализ лимфоцитов с аномальными ядрами в периферической крови крыс, подвегнутых -облучению / С.Н. Колюбаева, Л.В. Мясникова, В.Е. Комар // Радиобиология.– 1990. – Т. 30, вып. 1. – С. 124-127.
6. Воробцова И.Е. Цитогенетическая характеристика детей, пострадавших в результате аварии на Чернобыльской АЭС / И.Е. Воробцова, С.Н. Колюбаева, М.В. Воробьева [и др.] // Медицинская радиология.– 1993. – Т. 38, № 10. – С. 25-28.
7. Соболь К.В. Снижение повреждающего действия -облучения на лимфоциты человека при постлучевой обработке препаратом MD1 / К.В Соболь, С.Н. Колюбаева, В.Е. Комар // Радиац. биология. Радиоэкология. – 1994. – Т. 34, вып. 2. – С. 143-147.
8. Колюбаева С.Н. Исследование радиационных повреждений в лимфоцитах человека методом микроядерного и хромосомного анализа / С.Н. Колюбаева, В.В. Ракецкая, Е.А. Борисова [и др.] // Радиац. биология. Радиоэкология. – 1995. – Т. 35, вып. 2. – С. 150-156.
9. Ракецкая В.В. Цитогенетическое исследование больных с нарушением тиреоидного гомеостата / Ракецкая В.В., Т.П. Евтушенко, О.В. Дубко, С.Н. Колюбаева [и др.] // Радиац. биология. Радиоэкология. –1995. –Т.35, вып.2.–С.157-161
10. Новик А.А. Характеристика некоторых цитогенетических показателей при неходжкинских лимфомах / А.А. Новик, В.Я. Мельниченко, С.Н. Колюбаева [и др.] // Гематология и трансфузиология. – 2000. – Т. 45, № 3. – С. 49-52.
11. Акимов В.Н. Особенности изменений кариотипа лимфоцитов периферической крови больных хроническим вирусным гепатитом С / В.Н. Акимов, С.С. Бацков, С.Н. Колюбаева [и др.] // Мед. академический журнал. – 2004. – Т. 5, № 1. – С. 64-69
12. Михайловская О.В. Изучение взаимосвязи между ломкостью хромосом и лимфопролиферативными заболеваниями / О.В. Михайловская. С.Н. Колюбаева, Н.А. Викторова [и др.] // Цитология. – 2005. – Т. 47, № 1. – С. 83-88.
13. Бацков С.С. К вопросу об особенностях и взаимосвязи изменений кариотипа лимфоцитов периферической крови и иммунного статуса у больных хроническим вирусным гепатитом С / С.С. Бацков, С.Н. Колюбаева, В.Н. Акимов [и др.] // Рос. журн. гастроэнторологии, гепатологии и колопроктологии. – 2005. – № 2. – С. 51-56.
14. Колюбаева С.Н. Цитогенетическая характеристика больных с хроническим лимфоцитарным лейкозом / С.Н. Колюбаева, В.О. Саржевский, А.А. Титова, О.Р. Краснова [и др.] // Медицинский академический журнал. – 2006. – Т. 6, № 3. – С.109-114.
15. Богданов А.Н. Цитогенетическое исследование злокачественных лимфом / А.Н. Богданов, В.О. Саржевский, С.Н. Колюбаева [и др.] // Вестник СПб. Университета. – 2008. – Серия 11. – Вып. 3. – С. 126-131.
16. Богданов А.Н. Случай острого лимфобластного лейкоза с t(9;22) и несколькими дополнительными перестройками / А.Н. Богданов, В.О. Саржевский., С.Н. Колюбаева [и др.] // Гематология и трансфузиология. – 2008. – Т. 53, № 3. – С. 35-38.
17. Богданов А.Н. Значение цитогенетических исследований в диагностике злокачественных лимфом / А.Н. Богданов, В.О. Саржевский, С.Н. Колюбаева [и др.] // Вопросы онкологии. – 2008. – Т. 54, № 2. – С. 6-8.
18. Колюбаева С.Н. Новые подходы к оценке риска гемобластозов у лиц, подвергшихся действию радиации // Вестник Рос. Воен.-мед. акад. – 2008. – Т. 23, № 3. – С. 36-38.
19. Колюбаева С.Н. Использование цитогенетических методов в радиационной медицине // Вестник Рос. Воен.-мед. акад. – 2008. – Т. 23, № 3. – С. 179-180.
20. Сосюкин А.Е. Анализ повреждений хромосом в лимфоцитах периферической крови у лиц, занятых на работах с токсическими веществами, относящимися к химическому оружию / А.Е. Сосюкин, С.Н. Колюбаева, А.В. Язенок [и др.] // Вестник Рос. Воен.-мед. акад. – 2008. – Т. 23, № 3. – С. 169-170.
21. Колюбаева С.Н. Сравнительный анализ стабильных хромосомных аберраций, выявленных методом флуоресцентной in situ гибридизацией у человека и обезьян при облучении in vitro лимфоцитов крови / С.Н. Колюбаева, А.В. Киссель, А.Н. Гребенюк // Вестник Рос. Воен.-мед. акад. – 2008. – Т. 21, № 1. – С. 138-141.

Методические рекомендации, авторское свидетельство

22. Колюбаева С.Н. Использование микроядерного теста для индикации пострадиационныъх эффектов у человека: Методические рекомендации / С.Н. Колюбаева, В.В. Ракецкая, Л.В. Мясникова [и др.]. – М: Минздрав РФ, 1991. – 12 с.
23. Колюбаева С.Н. Использование микроядерного теста при малых дозах / С.Н. Колюбаева, В.В. Гущ, Б.И. Макеев // Авторское свидетельство № 310946. – 1990 г.
24. Новик А.А. Значимость цитогенетических исследований при диагностике неходжкинских лимфом: Методические рекомендации / А.А. Новик, В.Я. Мельниченко, С.Н. Колюбаева [и др.]. – СПб.: ВМедА, 2000. – 16 с.
25. Новик А.А. Значимость цитогенетичяеских показателей при миелопластическом синдроме: Методические рекомендации / А.А. Новик, В.Я. Мельниченко, С.Н. Колюбаева [и др.]. – СПб.: ВМедА, 2000. – 14 с.

Прочие публикации

26. Koliubaeva S.N. Cytogenetic studies of Chernobyl victims / I.E. Vorobtsova, S.N. Koliubaeva, V.E. Komar // 25th Annual Meeting EEMS. – Stockholm, 1993. – P. 12-14.
27. Koliubaeva S.N. Micronuclei of apoptotic origin / S.N. Koliubaeva, V.V. Raketskaija, V.E. Komar // Joint Meeting European Society Radiation Biology.–Amsterdam,1994.–P. 41
28. Koliubaeva S.N. Correlation between chromosome aberration and micronuclei / S.N. Koliubaeva, V.V. Raketskaija, V.E. Komar // Joint Meeting European Society Radiation Biology. – Amsterdam, 1994. – P. 40.
29. Ilyinskikh N. Results of interlaboratory research on definition of radiation doses, received by the local population as a result of failure on Siberian chemical plant on April 6,
30. 1993 / N. Ilyinskikh, T.T. Natarajan, I. Suskov, S.N. Kolioubaeva // 25th Annual Meeting of EEMS. – Amsterdam, 1995. – Рoster 9-7. – P. 279
31. Kolioubaeva S.N. New activities of WHO collaborating Centre for Medical Radiation Pathology. Estimation of leukemia risk in children born from Chernobyl accident victims / S.N. Kolioubaeva [et al.] // Montpelie, 1996. – P. 76-77.
32. Kolioubaeva S. Special Features of Radiation Effect Manifestation in Chernobyl victims revealed by cytogenetics methods in different stages of the accident / / S. Kolioubaeva, V. Raketskaya, L. Miasnikova [et al.] // Internat. conf. «One decade after Chernobyl: Summing up the consequences of the accident». – Vienna, 1997. – P. 11-13.
33. Гребенюк А.Н. Показатели цитогенетической нестабильности у женщин участниц ликвидации последствий аварии на Чернобыльской АЭС и их детей / А.Н Гребенюк., В.Ф Беженарь, С.Н. Колюбаева // Междунар. конгресс “Эколого-социальные вопросы защиты и охраны здоровья молодого поколения на пути в ХХI век”.– СПб., 1998.– С. 148-150
34. Sorokine-Durm I. FISH-painting applied to late overexposure dose reconstruction: interest of non- human primate study / I. Sorokine-Durm, S. Kolioubaeva, V. Durand [et al.] // Intern. conf. “Diagnosis and Treatment of Radiation Injury”. – Rotterdam, 1998. – Р. 63.
35. Sorokine-Durm I. Reconstruction of irradiation dose as measured by chromosomes painting / I. Sorokine-Durm, S. Kolioubaeva, V. Durand [et al.] // Radioprotection. – 1998. – Vol. 43. – P. 193-195.
36. Колюбаева С.Н. Характеристика некоторых цитогенетических показателей в диагностике злокачественных лимфом / С.Н. Колюбаева, Л.В. Мясников, Н.А. Абиссова [и др.] // Рос. симпоз. ”Морфологические, иммунологические и молекулярно-биологические аспекты идентификации гемобластозов и родственных заболеваний”. – Сочи, 1999. – С. 29.
37. Гребенюк А.Н. Цитогенетическая оценка воздействия факторов Чернобыльской аварии на женщин и детей / А.Н. Гребенюк, С.Н. Колюбаева, В.Ф Беженарь. [и др.] // Междунар. конф. “Пробл. радиац. генетики на рубеже веков”.– М., 2000.– С.231-232
38. Novik A.A. The significance of some cytological indexes in diagnostics of malignant lymphomas / A.A. Novik, Y. Melnichenko, S. Kolioubaeva [et al.] // 11th Intern. Congress on Anti-Cancer Treatment. – Paris, 2001. – P. 51.
39. Новик А.А. Анализ цитогенетических изменений в различных прогностических группах больных агрессивными неходжкинскими лимфомами / А.А. Новик, С.Н. Колюбаева, В.О. Саржевский [и др.] // Материалы российско-голландской конференции. – СПб., 2002. – С. 219-220.
40. Колюбаева С.Н. Использование FISH метода для выявления облученности обезьян / С.Н. Колюбаева // Материалы международной научной конф. ”Фундаментальные и прикладные проблемы медицины и биологии в опытах на обезьянах”. – Сочи-Адлер: Наука Кубани, 2007. – С. 256-261.