Получение инсулин – продуцирующи х клет ок из мультипотентных стромальных клеток человека
На правах рукописи
ФЕДЮНИНА ИРИНА АЛЕКСАНДРОВНА
Получение инсулин – продуцирующих клеток из мультипотентных стромальных клеток человека
03.02.07 – Генетика
АВТОРЕФЕРАТ
диссертации на соискание ученой степени
кандидата биологических наук
Москва – 2011
Работа выполнена в лаборатории генетики стволовых клеток Учреждения Российской академии медицинских наук Медико-генетическом научном центре РАМН
| Научный руководитель – | доктор биологических наук, профессор, Гольдштейн Дмитрий Вадимович |
| Официальные оппоненты – | доктор биологических наук, Климов Евгений Александрович доктор биологических наук, профессор, Поляков Александр Владимирович |
| Ведущая организация – | Московский Государственный Университет имени М.В. Ломоносова |
Защита состоится « 04 » апреля 2011г. в ______ часов на заседании Диссертационного ученого совета Д 001.016.01 при Учреждении Российской академии медицинских наук Медико-генетическом научном центре РАМН (115478, Москва, ул. Москворечье,1)
С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Учреждения Российской академии медицинских наук Медико-генетического научного центра РАМН по адресу: 115478, Москва, ул. Москворечье, д.1.
Автореферат разослан «______»___________________ 2011 г.
Учёный секретарь диссертационного совета Д 001.016.01
по защите докторских и кандидатских диссертаций,
доктор медицинских наук, профессор Зинченко Р.А.
Актуальность темы
Распространение диабета в мире постепенно достигает эпидемических масштабов. Согласно прогнозам, в течение следующих 25 лет произойдет увеличение количества больных диабетом почти в два раза (до 300 миллионов человек). Сегодня более 5 миллионов человек по всему миру больны диабетом первого типа (наиболее жесткая форма заболевания), 395 тысяч из них – дети. Сахарный диабет 1 типа (СД 1) характеризуется разрушением - клеток путем аутоиммунной атаки. Недостатки современных методов лечения СД 1 – инсулинотерапии и трансплантации ткани поджелудочной железы (ПЖ) - стимулируют развитие и совершенствование клеточной терапии, в частности, поиск новых альтернативных источников - клеток.
В связи с этим, в последние годы стали активно разрабатываться и изучаться новые методы регенерационной терапии, предусматривающие выделение и ex vivo предифференцировку эмбриональных и взрослых стволовых клеток. Эти клетки обладают более высоким пролиферативным потенциалом, чем зрелые дифференцированные островки ПЖ и поэтому могут оказаться хорошим материалом для получения достаточных количеств функционально-активной массы - клеток.
Дифференцировка в инсулин-продуцирующие клетки должна включать индукцию регуляции секреции, которая подразумевает накопление инсулина в клетках и быстрое выделение его в ответ на различные физиологические сигналы. Чтобы достичь этого, в клетках должен быть активирован комплекс панкреатических генов, очень сходный с таковым в нормальных - клетках. Получение просто продуцирующих инсулин клеток, без обратной связи и какого-либо контроля его секреции не дает никаких преимуществ по сравнению с простыми методами введения инсулина. Мультипотентные стромальные клетки (МСК) взрослого организма привлекают внимание исследователей и практических врачей по следующим причинам: они наилучшим образом подходят для аутологичной трансплантации; высокая скорость пролиферации позволяет нарастить достаточное количество клеток для трансплантации; обладают способностью к дифференцировке в разные клеточные линии.
Существует предположение, что для эффективной направленной дифференцировки в инсулин – продуцирующие клетки, необходима экспрессия клетками нестина (Lee S., 2000), т.к. показано, что нестин-экспрессирующие клетки, изолированные из человеческих или крысиных островков поджелудочной железы могут дифференцироваться в эндокринные и экзокринные клетки in vitro (Zulewski H., 2001; Blyszczuk P., 2003; Zhang L., 2005). И авторы многих работ для получения таких клеток используют стадию селекции нестин-экспрессирующих клеток, описанную ранее для генерации нейронов (Blyszczuk P., 2003). До сих пор остается неясным, является ли необходимой экспрессия нестина для эффективной трансдифференцировки в инсулин-продуцирующие клетки.
В настоящее время активно развивается тема о происхождении МСК из предшественников перицитов, имеющих фенотип CD146+CD31- и обладающих более широким спектром дифференцировки по сравнению со стандартно пассированными МСК. Работ по получению инсулин-продуцирующих клеток из популяций данного фенотипа не обнаружено. Опубликовано несколько первых исследований, демонстрирующих возможность использования МСК из костного мозга в качестве источника получения инсулин-продуцирующих клеток, в том числе аутологичных (Karnieli O., 2007; Li Y., 2007). Эффективная трансдифференцировка МСК из жировой ткани и сосудов пупочного канатика в инсулин-продуцирующие клетки в литературе не описана.
Цель исследования
Получение инсулин-продуцирующих клеток из мультипотентных стромальных клеток жировой ткани и пупочного канатика человека.
Задачи исследования
- Выделить и охарактеризовать популяции МСК из сосудистой стенки пупочного канатика и жировой ткани.
- Подобрать метод доставки гена, кодирующего транскрипционный фактор Pdx1, играющий ключевую роль в дифференцировании клеток поджелудочной железы.
- Оптимизировать условия трансфекции, культивирования и состав дифференцировочной среды.
- Трансфицировать МСК из пупочного канатика и жировой ткани геном Pdx1 и проанализировать транскрипцию ключевых генов панкреатической дифференцировки: NGN3, NeuroD, MafA, Insulin.
- Показать способность полученных инсулин-продуцирующих клеток изменять уровень секреции инсулина в ответ на изменение концентрации глюкозы (тест на толерантность) к глюкозе.
- Проанализировать экспрессию нестина в полученных популяциях МСК и проследить корреляцию между уровнем экспрессии нестина и способностью к эффективной дифференцировке в функционально-активные инсулин - продуцирующие клетки.
Научная новизна и практическая значимость
Впервые показано, что эффективная дифференцировка в функционально-активные инсулин - продуцирующие клетки преимущественно происходит в CD146+CD31- популяциях МСК жировой ткани и пупочного канатика человека.
Подобраны оптимальные условия трансфекции (необходимая концентрация аденовирусной конструкции, время сорбции, а так же эффективность трансфекции) CD146+CD31- и CD146-CD31- популяций МСК из жировой ткани и пупочного канатика человека.
Подобраны условия культивирования трансфицированных клеток, а так же состав дифференцировочной среды. Показано, что добавление этапа культивирования в дифференцировочной среде CMRL-1066 с добавлением ретиноевой кислоты приводит к увеличению транскрипции инсулина в 7 раз в трансфицированных CD146+ популяциях МСК по сравнению с культивированием в базовой среде DMEM.
В результате проведенного исследования установлено, что транскрипция инсулина сохраняется в трансфицированных клетках in vitro в течение 21 дня и достигает максимального уровня на 14 день культивирования.
Показано, что полученные инсулин-продуцирующие клетки из CD146+CD31- популяций МСК из жировой ткани и пупочного канатика человека обладают толерантностью к глюкозе.
Проведен анализ зависимости эффективности дифференцировки в инсулин-продуцирующие клетки от способности клеток экспрессировать нестин. Корреляция не обнаружена. CD146+CD31- популяции МСК из жировой ткани, в которых нестин не экспрессировался эффективно дифференцировались в функционально-активные инсулин - продуцирующие клетки. В то время как трансфекция CD146-CD31- популяций МСК из пупочного канатика, в которых наблюдали экспрессию нестина на высоком уровне, к активации транскрипции инсулина не приводила.
В настоящей работе впервые разработан метод получения функционально-активных инсулин-продуцирующих клеток из CD146+CD31- популяций МСК из жировой ткани и пупочного канатика человека путем транзиентной трансфекции геном Pdx1.
Положения, выносимые на защиту
- Популяции МСК из пупочного канатика и жировой ткани периваскулярного фенотипа, несущие на поверхности маркер CD146 эффективно дифференцируются в функционально-активные инсулин-продуцирующие клетки путем транзиентной трансфекции геном Pdx1. Трансфекция популяций МСК, не имеющих маркер CD146, к эффективной дифференцировке в панкреатическом направлении не приводит.
- Показано, что культивирование в дифференцировочной среде CMRL-1066 с добавлением ретиноевой кислоты приводит к значительному увеличению транскрипции гена Insulin в трансфицированных CD146+CD31- популяциях МСК по сравнению с культивированием в базовой среде DMEM. Транскрипция гена Insulin сохраняется в трансфицированных клетках in vitro в течение 21 дня и достигает максимального уровня на 14 день культивирования.
- Полученные инсулин-продуцирующие клетки из CD146+CD31- популяций МСК из жировой ткани и пупочного канатика человека обладают толерантностью к глюкозе.
- В процессе анализа зависимости эффективности дифференцировки в инсулин-продуцирующие клетки от способности клеток экспрессировать нестин корреляция не обнаружена. CD146+CD31- популяции МСК из жировой ткани, в которых нестин не экспрессировался эффективно дифференцировались в функционально-активные инсулин - продуцирующие клетки. В то время как трансфекция CD146-CD31- популяций МСК из пупочного канатика, в которых наблюдалась экспрессия нестина на высоком уровне, к активации транскрипции Insulin не приводила.
Апробация работы
Материалы диссертационной работы доложены на Всероссийской научной школе-конференции для молодежи по аутологичным стволовым клеткам (Москва, 2009); VI Съезде Российского общества медицинских генетиков (Ростов на Дону, 2010); Всероссийской научной школе-конференции для молодежи по стволовым клеткам и регенеративной медицине (Москва, 2010).
Личный вклад автора в проведение исследования
Автором подобрана и проработана отечественная и зарубежная литература по теме диссертации. Все эксперименты и непосредственный их анализ выполнен лично. Протоколы исследования разработаны автором. Публикации работы, а также описание исследования выполнены автором самостоятельно.
Публикации
Результаты диссертационной работы отражены в 6-ти печатных работах: 3-х статьях и 3-х тезисах. Три статьи опубликованы в рецензируемых научных журналах, рекомендованных ВАК МОН РФ соискателям ученой степени кандидата биологических наук.
Внедрение результатов работы
Результаты исследования внедрены в курс лекций «Соединительные ткани» кафедры гистологии и эмбриологии РГМУ и в работу МГНЦ РАМН.
Объем и структура работы
Диссертация состоит из введения, обзора литературы, описания материалов и методов исследования, результатов и их обсуждения, выводов и списка литературы. Текст изложен на 109 стр. машинописного текста, иллюстрирован 4 таблицами и 26 рисунками. Библиографический указатель включает 163 источника отечественной и зарубежной литературы.
СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ
Материалы исследования
Получение культуры клеток
Стромально-васкулярную фракцию жировой ткани получали из липоаспирата 10 здоровых доноров на основании добровольного согласия. Возраст доноров составил 39±13,97 лет. Жировую ткань дезагрегировали с помощью коллагеназы 1 (1мг/мл) типа («ПанЭко», Россия) и диспазы (200 мг/мл) («ПанЭко», Россия) в течение часа при 37оС, постоянно встряхивая пробирку. Пупочные канатики получали от здоровых рожениц (8 образцов) на основании их добровольного согласия. Из пупочного канатика выделяли сосуды, измельчали их с помощью ножниц, затем дезагрегировали смесью ферментов диспазы (200 мг/мл) и коллагеназы 1 типа (1мг/мл).
Полученные суспензии центрифугировали 10 минут при 1100 об./мин, супернатант отбирали. Клеточный осадок ресуспендировали в небольшом объеме среды DMEM/F12 («ПанЭко», Россия). Клетки культивировали в среде DMEM/F12 (1:1) с добавлением 10% эмбриональной телячьей сыворотки («ПанЭко», Россия), 2 mM L-глутамина («ПанЭко», Россия), 10 нг/мл рекомбинантного основного фактора роста фибробластов (ФРФ-2) («Prospec»), гепарина 8 Е/мл («BRAUN», Испания), амикацина 100мг/л («Красфарма», Россия). Клетки высевали на пластиковые чашки Петри (Corning) диаметром 90 мм, затем помещали в СО2-инкубатор (37 С, 5% СО2) и инкубировали до достижения 70% конфлюентности, затем снимали раствором трипсина и рассевали в новую посуду в плотности 1500-2000 клеток\см2.
Выделение CD146+ популяции клеток
Часть клеток культивировали согласно опубликованному ранее оригинальному протоколу получения CD146+ популяций клеток, имеющих периваскулярный фенотип (Ржанинова А., 2010). Для этого клетки высаживали на среду DMEM/F12 (1:1) с добавлением 10% эмбриональной телячьей сыворотки, 2 mM L-глутамина, 10 нг/мл ФРФ-2, гепарина 8 Е/мл, амикацина 100мг/л с добавлением рекомбинантного человеческого инсулина, который растворяли в 1М соляной кислоте и использовали в конечной концентрации 5нг/мл. После 3-х дневной инкубации неприкрепившиеся клетки переносили на новые чашки, ростовую среду полностью заменяли. Клетки культивировали до достижения 70% конфлюентности, затем снимали раствором трипсина и рассевали в новую посуду в плотности 1500-2000 клеток/см2.
В течение 2-3 пассажей преимущественно выделялась фибробластоподобная популяция клеток. Но рост этих клеток ингибировался присутствующим в среде инсулином. Через несколько недель (2-4) после посева культур на среду с инсулином наблюдали участки плотного роста мелких эпетелиоподобных клеток, отличающихся по морфологии от основной популяции (рис.1).
Эти клетки характеризовались высокой митотической активностью в присутствии инсулина и ФРФ-2. Колонии мелких эпителиоподобных клеток были выделены механически и культивированы отдельно в присутствии инсулина. Культура характеризовалась очень быстрым ростом: время удвоения составляло не более 18 часов, в то время как популяции, культивируемые параллельно по стандартному протоколу (CD146), удваивались за 32-45 часов.
