Развитие основных проводящих систем мам иллярных тел в процессе перинатального онтогенеза у крыс
На правах рукописи
АЛПЕЕВА
ЕЛЕНА ВИКТОРОВНА
Развитие основных проводящих систем мамиллярных тел в процессе перинатального онтогенеза у крыс
03.00.30 – биология развития, эмбриология
АВТОРЕФЕРАТ
диссертации на соискание ученой степени
кандидата биологических наук
Москва 2009
Работа выполнена в Группе оптических методов исследования Учреждения Российской академии наук Института биологии развития им. Н.К. Кольцова РАН
Научный руководитель: кандидат биологических наук
МАКАРЕНКО Ирина Георгиевна
Официальные оппоненты: доктор биологических наук
АЛЕКСАНДРОВА Мария Анатольевна
доктор медицинских наук, профессор, чл.-корр. РАМН
БОГОЛЕПОВА Ирина Николаевна
Ведущая организация: кафедра эмбриологии биологического факультета Московского государственного университета им. М.В. Ломоносова.
Защита диссертации состоится « 09 » декабря 2009 г. в 14.00 часов на заседании диссертационного совета Д 002.238.01 в Учреждении Российской академии наук Институте биологии развития им. Н.К. Кольцова РАН по адресу:
119334, Москва, ул. Вавилова, д. 26.
Сайт: http://idbras.comcor.ru/; e-mail: [email protected].
С диссертацией и авторефератом можно ознакомиться в библиотеке и на сайте Учреждения Российской академии наук Института биологии развития им. Н.К. Кольцова РАН.
Автореферат разослан « 06 » ноября 2009 года.
Ученый секретарь диссертационного совета,
кандидат биологических наук Абрамова Е.Б.
ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ
Актуальность проблемы. Многообразие внутримозговых связей лежит в основе сложной интегративной деятельности мозга взрослых животных и человека. Со времен Камилло Гольджи и Сантьяго Рамон-и-Кахаля изучение внутримозговых связей является одной из основных задач нейроанатомии, решение которой дает информацию, необходимую для понимания функций нервной системы, исследования ее формирования и пластичности. Хотя у взрослых млекопитающих внутримозговые связи хорошо изучены, данные об их развитии, особенно в период эмбриогенеза, достаточно редки и фрагментарны. Один из наиболее важных нерешенных вопросов в исследовании развития мозга касается механизмов формирования специфической пространственной структуры внутримозговых связей. Таким образом, исследование ранних этапов развития проводящих систем мозга, когда они еще не достигли сложности, характерной для взрослых животных, представляет большой интерес и может существенно расширить наши представления о формировании нервной системы.
На протяжении многих лет основными подходами к исследованию внутримозговых связей у позвоночных животных являлись методы антероградной дегенерации, авторадиографии и прижизненного транспорта различных маркеров, которые вводятся в мозг стереотаксически. Особенности данных методов не позволяют использовать их для выявления связей в мозгу эмбрионов и ранних постнатальных животных. В последние два десятилетия применение в качестве маркеров флуоресцентных липофильных диалкилкарбоцианиновых (DiI и его производные) и диалкиламиностириловых (DiA и его производные) красителей, которые могут использоваться при работе с фиксированной тканью мозга и не требуют стереотаксического введения in vivo, впервые дало возможность изучать развитие внутримозговых связей, начиная с самых ранних, эмбриональных стадий их формирования (Godement et al., 1987; Vercelli et al., 2000).
Мамиллярные тела (МТ) являются специфической структурой заднего гипоталамуса в мозгу млекопитающих. Известно, что мощные аксональные тракты, соединяющие мамиллярные тела с другими структурами мозга, представляют собой важнейшие проводящие пути, необходимые для функционирования лимбической системы. Значение МТ как важного компонента лимбической системы, вовлеченного в процессы реализации эмоционально-поведенческих реакций и краткосрочной памяти, а также наличие у них топографически организованных афферентных и эфферентных связей с другими отделами мозга делают их интересным объектом для изучения развития внутримозговых связей в процессе перинатального онтогенеза.
Цель и задачи исследования. Целью настоящего исследования явилось изучение формирования основных проводящих систем МТ (мамилло-тегментального и мамилло-таламического трактов, мамиллярной ножки и свода) в процессе перинатального онтогенеза у крыс с помощью метода антероградного и ретроградного распространения липофильных красителей по мембранам нейронов.
Были поставлены следующие задачи:
1. Оценить возможность применения липофильных маркеров 1,1'-диоктадецил-3,3,3',3'-тетраметилиндокарбоцианина перхлората (DiI) и 4-(4-дигексадециламиностирил)-N-метилпиридин йодида (DiA) для мечения развивающихся связей МТ и выявить особенности их использования на разных стадиях развития.
2. С помощью данного метода выявить и описать последовательность формирования и характер развития компактных проекционных систем МТ:
- мамилло-тегментального тракта (эфферентного пути из МТ к ядрам среднего мозга)
- мамилло-таламического тракта (эфферентного пути из МТ к ядрам переднего таламуса)
- мамиллярной ножки (афферентного пути к МТ из тегментальных ядер среднего мозга)
- свода (афферентного пути к МТ из гиппокампа)
3. Описать формирование иннервации ядер переднего таламуса аксонами нейронов мамиллярных ядер.
Научная новизна и практическая значимость работы. В работе было впервые последовательно описано развитие основных проводящих систем, связывающих МТ гипоталамуса с тегментальной областью среднего мозга, развитие мамилло-таламического тракта и формирование иннервации ядер переднего таламуса его аксонами с помощью метода транспорта длинноцепочечных липофильных красителей.
Работа является редким на сегодняшний день фундаментальным морфологическим исследованием развития внутримозговых связей и имеет большую ценность для понимания сложного процесса формирования структуры мозга.
Результаты данной работы могут быть использованы для дальнейшего исследования работы генов и различных факторов, участвующих в формировании волоконных систем МТ, а также изучения патологии их развития. Также настоящее исследование можно использовать в курсах биологии развития и нейроморфологии, читаемых на биологических факультетах и в медицинских вузах.
Апробация работы. Результаты диссертационной работы были представлены на XII международной конференции молодых ученых «Ломоносов-2005» (г. Москва, 2005 г.); международном симпозиуме 5th International Symposium on Experimental and Clinical Neurobiology (The High Tatras, Slovak Republic, 2005); V Международной конференции по функциональной нейроморфологии «Колосовские чтения – 2006» (г. Санкт-Петербург, 2006 г.); ХХ съезде Физиологического общества им. И.П. Павлова (г. Москва, 2007 г.); международном симпозиуме 6th International Symposium on Experimental and Clinical Neurobiology (Kosice, Slovak Republic, 2008) и на конференциях молодых ученых Института биологии развития им. Н.К. Кольцова РАН (г. Москва, 2006, 2007 гг.).
Публикации. По материалам диссертации опубликовано 15 печатных работ, из них статей в журналах, соответствующих Перечню ВАК – 2, тезисов докладов и материалов конференций – 13.
Структура и объем работы. Диссертационная работа изложена на
страницах, содержит 38 рисунков, 4 таблицы и состоит из следующих разделов: введения, обзора литературы, материалов и методов, результатов исследования, обсуждения результатов, выводов, списка литературы, включающего
цитируемых источника, и приложения.
МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ
Объект исследования. Работа выполнена на крысах Вистар. Для получения датированной беременности самок помещали на ночь в клетку с фертильными половозрелыми самцами и на следующее утро выявляли сперматозоиды в мазке, взятом из влагалища. При этом день обнаружения спермы считали нулевым днем беременности и нулевым днем эмбрионального развития (Э0), а день рождения крысят – нулевым днем их постнатального развития (П0). Для исследования использовали плодов крыс и постнатальных животных на разных сроках развития, всего 68 животных.
Извлечение и фиксация мозга. Животных наркотизировали (самок – перед извлечением плодов из матки, крысят и взрослых крыс – перед перфузией) введением внутрибрюшинно раствора нембутала в физиологическом растворе из расчета 4 мг нембутала на 100 г веса животного. Плодов и постнатальных крыс перфузировали через левый желудочек сердца сначала физиологическим раствором, а затем 4% раствором параформальдегида на 0,1 М фосфатном буфере с рН 7,2–7,4 (ПФА). После этого животных декапитировали, мозг извлекали из черепа и помещали в ПФА на срок от 20 ч до нескольких недель при комнатной температуре. Для проведения иммунофлуоресцентных экспериментов мозг оставляли в фиксаторе не более чем на 12–20 ч.
Наложение кристаллов липофильных маркеров. В качестве маркеров использовали липофильные красители 1,1'-диоктадецил-3,3,3',3'-тетраметилиндокарбоцианина перхлората (DiI, «Molecular Probes», INC, США) и/или 4-(4-дигексадециламиностирил)-N-метилпиридин йодида (DiA, «Molecular Probes», INC, США). Нанесение кристаллов маркеров осуществляли под бинокулярной лупой с помощью стеклянного микроэлектрода в область МТ и покрышки среднего мозга. В зависимости от поставленной задачи использовали целый мозг (DiI и DiA вносили в проколы вентральной поверхности мозга) или на мозг, разделенный вдоль по средней линии (DiI помещали на срез МТ или среднего мозга).
В качестве контроля использовались случаи с нанесением DiI на медиобазальный гипоталамус ростральнее МТ.
Мозг с маркерами хранили в ПФА в темноте при комнатной температуре 6–12 месяцев, в течение которых происходила диффузия молекул липофильного маркера в липидном слое мембран нейронов в ретроградном и антероградном направлениях. В нескольких случаях мозг хранили в темноте при температуре +37°C, а срок хранения был сокращен до 1–2 месяцев.
Обработка мозга с нанесенным маркером. Перед резкой мозга места введения маркеров в МТ и средний мозг, выявляемые по окрашиванию ткани мозга вокруг проколов в малиновый (DiI) или желтый (DiA) цвет, фотографировали с помощью цифровой видеокамеры, присоединенной к бинокулярной лупе, для предварительной качественной оценки локализации места введения маркеров.
Серии коронарных или сагиттальных срезов мозга толщиной 80–100 мкм готовили при помощи вибратома (Vibratome Series 1000, «TPI», США) в 0,02 М фосфатном буфере, содержащем 0,9% NaCl (ФСБ). Срезы помещали на стекла Super Frost Plus («Assistant», Германия) или стекла с желатиновой подложкой, и заключали под покровные стекла в мовиол («Calbiochem», Германия). Готовые препараты хранили в темноте при температуре +4оС.
Анализ препаратов проводили с помощью фотомикроскопа Leica DM RXA2 (Германия), оснащенного системой фильтров для выявления оранжево-красной родаминовой флуоресценции, характерной для DiI, и желто-зеленой флуоресцеиновой флуоресценции, характерной для DiA. После оценки распределения кристаллов маркера в месте введения с использованием ультрафиолетового фильтра, серии срезов последовательно просматривали, описывая локализацию окрашенных DiI и DiA нервных волокон и нейронов. Фотосъемку препаратов проводили с помощью цифровой фотокамеры Olympus DP70 (Япония) и компьютерных программ DP controller и DP manager. Для детализации морфологических картин избранные участки срезов также сканировали с помощью конфокального микроскопа Leica SP на базе микроскопа DMIRBE (Германия) и обрабатывали с помощью программы Leica LCS.
Иммунофлуоресцентное выявление синапсина (Synapsin-I). Для данного исследования были использованы крысята в возрасте П5. После перфузии и инкубации в ПФА в течение 12–20 ч мозг тщательно промывали 0,01 М ФСБ. Коронарные вибратомные срезы мозга на уровне переднего таламуса толщиной 100 мкм помещали в 0,01 М ФСБ с добавлением 0,1% азида натрия и хранили при температуре +4°C. Свободноплавающие срезы сначала инкубировали в 0,01 М ФСБ, содержащем 0,5% Tritоn X-100 и 5% бычьего сывороточного альбумина (БСА), в течение 30 мин при комнатной температуре. Затем их инкубировали с поликлональными антителами кролика, полученными против Synapsin-I («Sigma», США), в разведении 1:100 на 0,01 М ФСБ, содержащем 0,25% Triton X-100 и 1% БСА, в течение 3-х суток при температуре +4°C. После 3-х промывок по 10 мин 0,01 М ФСБ срезы инкубировали с вторичными козьими антителами, полученными против кроличьих антител и конъюгированными с флуорофором Alexa-488 («Molecular Probes», США), в разведении 1:800 на 0,01 М ФСБ в течение 2 ч при комнатной температуре. Затем срезы промывали 0,01 М ФСБ в течение 30 мин при комнатной температуре, помещали на предметные стекла Super Frost Plus («Assistant», Германия) и заключали под покровные стекла в среду для заключения мовиол («Calbiochem», Германия). Сканирование с помощью конфокального микроскопа Leica SP на базе микроскопа DMIRBE (Германия) проводили, используя объективы х40 и х63.
Срезы, инкубировавшиеся при тех же условиях в 0,01 М ФСБ без добавления первичных или вторичных антител (иммуноцитохимический контроль), продемонстрировали полное отсутствие мечения в переднем таламусе.
Обработка полученных изображений. Обработку и монтаж цифровых изображений для иллюстрации полученных результатов осуществляли при помощи компьютерной программы Photoshop 7.0 («Adobe», США). Идентификацию отделов и ядер мозга проводили с использованием атласов развивающегося мозга (Altman & Bayer, 1986; Paxinos et al., 1991) и мозга взрослой крысы (Paxinos & Watson, 1997).
РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ
Распределение липофильных маркеров в местах нанесения.
Первостепенное значение для анализа полученных результатов в каждом случае играло точное определение места нанесения маркера, которое выявляли по локализации прокола ткани и не растворившихся за время инкубации кристаллов маркера, а также оценка зоны распространения красителей внутри МТ и в окружающих областях. Препараты просматривали с использованием как специфичных фильтров для визуализации DiI и DiA, так и ультрафиолетового фильтра (Рис. 1 а), в котором хорошо видна структура мозга, кристаллы и зона распространения маркеров и отсутствует яркое свечение меченых волокон и тел нейронов, затрудняющее точное определение места нанесения при использовании специфичных фильтров (Рис. 1 б, в).
Введение маркера на стадиях Э14,5–Э17 в каудальную область развивающегося гипоталамуса, где находится закладка МТ, обычно выявляло на коронарных срезах крупный пучок меченых волокон, идущий дорзально от места введения (Рис. 1 а, б). На сагиттальных срезах обнаруживалось, что он следует каудально в средний мозг (Рис. 1 в). Данный пучок представлял собой мамилло-тегментальный тракт, и его окрашивание служило показателем того, что маркер при нанесении попал в закладку МТ.
На стадиях Э14,5–Э18 волоконная капсула МТ еще не сформирована, и после введения в закладку МТ краситель обычно распространяется дополнительно в соседние области заднего гипоталамуса и среднего мозга (Рис. 1 в). На более поздних стадиях (начиная с Э19,5–Э21) сформировавшаяся капсула значительно ограничивает подобное распространение маркера при его точном введении внутрь МТ. В тех случаях, когда при введении маркера в МТ повреждалась передняя, дорзальная или латеральная часть капсулы, помимо мечения самих МТ, мамилло-тегментального и мамилло-таламического трактов, наблюдалось мечение дополнительных ядер и волоконных систем (например, мечение мамилло-тектального тракта, образованного аксонами премамиллярного ядра гипоталамуса). И наоборот, если при нанесении на целый мозг маркер не попадал в МТ, а оказывался ростральнее, капсула препятствовала его проникновению внутрь МТ, и мечение исследуемых трактов не наблюдалось. Такие случаи служили положительным контролем.
Поскольку липофильные маркеры распространяются по мембранам нейронов как в антероградном, так и в ретроградном направлении, исследование связей МТ с различными структурами мозга можно проводить, вводя маркер как в сами МТ, так и в области мозга, которые с ними связаны. На Э14,5, Э19,5 и П0 наложения DiI были сделаны на тегментальную область среднего мозга (Рис. 2 а, б). На сагиттальных срезах мамилло-тегментальный тракт прослеживался от места нанесения красителя к МТ, в которых выявлялись многочисленные меченые тела нейронов (Рис. 2 в, г). На Э19,5 и П0 мечеными оказывались также волокна мамилло-таламического тракта (Рис. 2 г).
Развитие связей МТ со структурами среднего мозга.
Проводящие пути мамиллярных тел подробно изучены у взрослых млекопитающих. Главной эфферентной системой МТ является основной мамиллярный тракт, который выходит из МТ в ростродорзальном направлении и на небольшом расстоянии от границы МТ разделяется на мамилло-тегментальный и мамилло-таламический тракты (Cajal, 1895, 1911; Sherlock, 1975). Аксоны в составе мамилло-тегментального тракта следуют в тегментальные ядра среднего мозга и ядра моста (Guillery, 1957; Cruce, 1977). Мамиллярная ножка, которая образована волокнами ядер среднего мозга (Guillery, 1956; Petrovicky, 1973), иннервирующими нейроны мамиллярных ядер, является одной из основных афферентных систем МТ.
Сведений о развитии мамилло-тегментального тракта крайне мало, а информация о развитии мамиллярной ножки вообще не встречается. Первые представления о том, что мамилло-тегментальный тракт начинает развиваться очень рано (Э13), были получены в результате анализа препаратов мозга, окрашенных с помощью гематоксилин-эозина и по Нисслю (Coggeshall, 1964). В двух современных работах (Easter et al., 1993; Mastick & Easter, 1996), в которых при исследовании образования первых аксональных трактов и регионализации головного мозга мышей в ходе эмбрионального развития были использованы нейрон-специфичный -тубулин III класса и липофильные маркеры, имеется упоминание о том, что мамилло-тегментальный тракт впервые выявляется у мышей на Э10–Э10,5, что соответствует примерно Э12–Э12,5 у крыс. Прижизненные маркеры для изучения постнатального развития данной системы не использовались.
Наше исследование не только подтвердило ранние сроки образования мамилло-тегментального тракта, показало, что уже на Э14,5 его формируют именно аксоны нейронов МТ, но и продемонстрировало изменения данного тракта в ходе эмбрионального и постнатального развития.
Рис. 1. Места введения DiI в закладку МТ и выходящие из МТ меченые волокна мамилло-тегментального тракта на коронарном срезе мозга на Э15 (а, б) и на сагиттальном срезе мозга на Э14,5 (в), полученные при использовании разных флуоресцентных фильтров*. Стрелками указаны кристаллы DiI в области закладки МТ; 3 – 3-й желудочек мозга; МТ – мамиллярное тело; мте – мамилло-тегментальный тракт. Масштаб: 200 мкм.
* Здесь и далее микрофотографии, полученные с использованием ультрафиолетового фильтра, обозначены «УФ»; отсутствие дополнительных указаний означает, что микрофотография получена с использованием родаминового фильтра для выявления флуоресценции DiI.
На Э14,5–Э15 введение DiI в закладку МТ выявляет волокна мамилло-тегментального тракта, которые на сагиттальных срезах идут непосредственно от вентральной поверхности заднего гипоталамуса и собраны в отдельные толстые пучки. Эти пучки сближаются на некотором расстоянии от своего начала и разделяются на более мелкие, которые достаточно плотно прилегают друг к другу и следует каудально, повторяя изгиб мозга (Рис. 1 в). Волокна мамилло-тегментального тракта пронизывают вентральную область среднего мозга, занимая половину его объема, и граничат с его вентральной поверхностью (Рис. 1 в). На коронарных срезах меченый мамилло-тегментальный тракт проходит медиально вдоль средней линии мозга. Меченые нейроны, иннервирующие МТ, в среднем мозгу не обнаруживаются.
В случаях введения маркера в тегментальную область среднего мозга на Э14,5 на сагиттальных срезах мамилло-тегментальный тракт прослеживается от места введения к закладке МТ, где выявляются многочисленные нейроны (Рис. 2 а), которые собраны в группы вокруг формируемых ими пучков аксонов.
На Э16–Э17 при введении маркера в закладку МТ мамилло-тегментальный тракт выявляется на сагиттальных срезах в виде мощной системы собранных в мелкие пучки волокон, которые следуют каудально и практически достигают ростральной границы продолговатого мозга.
На Э18–Э19,5 мамилло-тегментальный тракт становится менее компактным, благодаря тому, что составляющие его пучки волокон приобретают волнообразные изгибы и отдаляются друг от друга (Рис. 3). Кроме того, при введении DiI в МТ на сагиттальных срезах в тегментальной области среднего мозга в толще мамилло-тегментального тракта выявляются тонкие волокна, расположенные перпендикулярно пучкам волокон тракта и, вероятно, представляющие собой формирующуюся иннервацию тегментальных ядер (Рис. 3 а).
Рис. 2. Микрофотографии сагиттальных срезов мозга при нанесении DiI на тегментальную область среднего мозга (стрелки) на Э14,5 (а) и на Э19,5 (б–г). Выявляются мамилло-тегментальный (а, г) и мамилло-таламический (г) тракты и ретроградно меченые нейроны МТ (а, в, г). Фрагмент среза (г) с изображением МТ после сканирования при помощи конфокального микроскопа (в). Мта – мамилло-таламический тракт; ом – основной мамиллярный тракт; остальные обозначения см. на рис.1. Масштаб: а, б, г – 200 мкм; в – 80 мкм.
На Э20 – Э21 при введении красителей в МТ в месте выявляемой на предыдущих стадиях зоны иннервации в вентральной тегментальной области среднего мозга впервые обнаруживается небольшая группа меченых нейронов (Рис. 3 б). Также на данных сроках впервые обнаруживается система аксонов, именуемая мамиллярной ножкой. Она состоит из небольшого числа волокон, идущих от тегментальных нейронов к вентральной поверхности среднего мозга, а затем вдоль нее к МТ.
Рис. 3. Выявление мамилло-тегментального тракта, развивающейся иннервации тегментальных ядер (стрелки) и нейронов тегментальной области среднего мозга на сагиттальных срезах после введения DiI в МТ. Т – тегментальная область среднего мозга; остальные обозначения см. на предыдущих рис. Масштаб: 200 мкм.
На П0 – П1,5 дистальная часть мамилло-тегментального тракта становится еще более диффузной, и только его проксимальный участок сохраняет относительную компактность и четко выявляется на сагиттальных срезах. Во всех исследованных нами случаях на данных сроках при введении маркера в МТ происходило мечение нейронов только в вентральной тегментальной области (Рис. 4 а, б). По сравнению с предыдущими стадиями меченых нейронов в тегментальной области становится больше, также как и аксонов в составе мамиллярной ножки (Рис. 4 б, в).
Рис. 4. Выявление группы ретроградно меченых нейронов в вентральной тегментальной области и их аксонов, идущих к МТ в составе мамиллярной ножки на сагиттальных срезах мозга при нанесении DiI в МТ в двух случаях на П1,5 (а и б, в). Мн – мамиллярная ножка; остальные обозначения см. на предыдущих рис. Масштаб: а – 1 мм, б, в – 200 мкм.
На П2 впервые аксоны мамилло-тегментального тракта достигают медиальных областей ядер моста и, вероятно, начинают образовывать иннервацию нейронов данных ядер: на нескольких последовательных коронарных срезах аксоны тракта выявляются в виде мощного пучка, следующего вдоль средней линии мозга от группы меченых нейронов в тегментальной области вентрально к ядрам моста (Рис. 5 а, б). У крысят на стадиях П2 – П3 количество ретроградно меченых нейронов в среднем мозгу при введении маркеров в МТ значительно увеличивается, и они обособляются в отдельные ядра. Уже на последних эмбриональных стадиях развития в составе МТ можно выделить более крупное медиальное мамиллярное ядро (ММ) и латеральное мамиллярное ядро (ЛМ), и если зона мечения охватывает на П2 оба эти ядра, то окрашенные нейроны обнаруживаются не только в вентральной
тегментальной области – в переднем и вентральном тегментальных ядрах, но и в дорзальном тегментальном ядре (Рис. 5 в, г). При этом вентральную часть дорзального тегментального ядра занимают меченые нейроны, в то время как его дорзальная часть заполнена мечеными волокнами (Рис. 5 г).
Рис. 5. Выявление ядер тегментальной области среднего мозга, мамилло-тегментального тракта и мамиллярной ножки на П2 на коронарных срезах мозга на разных рострокаудальных уровнях после введения DiI в МТ (а – в). Распределение меченых нейронов и волокон в дорзальном тегментальном ядре на П3 (г). 4 – 4-й желудочек мозга; ВТ – вентральное тегментальное ядро; ДТ – дорзальное тегментальное ядро; ДТв – дорзальное тегментальное ядро, вентральная часть; Дтд – дорзальное тегментальное ядро, дорзальная часть; М – ядра моста; ПТ – переднее тегментальное ядро; остальные обозначения см. на предыдущих рис. Масштаб: 200 мкм.
На П6 – П11 морфология мамилло-тегментального тракта, мамиллярной ножки и тегментальных ядер, выявляемых на коронарных срезах после введении маркеров в МТ, по сравнению с предыдущими описанными стадиями практически не изменяется. Волокна мамилло-тегментального тракта, образующие терминальные ветвления в тегментальных ядрах, особенно хорошо прослеживаются в дорзальном тегментальном ядре на снимках, полученных при помощи конфокального микроскопа (Рис. 6). На сагиттальных срезах, которые являются более демонстративными для описания данных структур (Рис. 7, 8 а), видно, что количество меченых аксонов, составляющих мамиллярную ножку, значительно возрастает, в результате чего она превращается в достаточно крупную систему волокон (Рис. 8 а).
Рис. 6. Иннервация дорзального тегментального ядра аксонами мамилло-тегментального тракта на П6, продемонстрированная на микрофотографиях, которые были получены при помощи конфокального микроскопа (коронарные срезы). Меченые нейроны сконцентрированы в вентральной части ядра (а). Фрагмент (б), выделенный рамкой, показан при большем увеличении на (в). Обозначения см. на предыдущих рис. Масштаб: а, б – 80 мкм, в – 20 мкм.
К П11 формируется иннервация ядер моста аксонами мамилло-тегментального тракта. От переднего и вентрального тегментальных ядер часть аксонов тракта сначала следует каудально, повторяя изгиб мозга, а затем резко поворачивает и направляется к вентральной поверхности мозга, образуя последовательно иннервацию ретикулярного тегментального ядра моста и ростромедиального ядра моста, что особенно хорошо прослеживается на сагиттальных срезах (Рис. 9 а, 10 б).
По нашим результатам, у животных после рождения нейроны среднего мозга, иннервирующие МТ, начинают группироваться в соответствующие ядра. Их окончательное обособление происходит к П2 – П6, так как мы обнаружили, что на данных сроках в среднем мозгу выявляются три ядра: переднее, вентральное и дорзальное тегментальные ядра. При этом нейроны дорзального тегментального ядра расположены только в его вентральной части, а весь остальной объем занимает сеть меченых аксонов мамилло-тегментального тракта. Это согласуется с имеющимися данными о том, что ЛМ иннервирует всё дорзальное тегментальное ядро, а получает афференты только из его вентральной части (Allen & Hopkins, 1989, 1990; Shibata, 1987).
Рис. 7. Микрофотографии сагиттальных срезов мозга, показывающие распределение меченых структур в мозгу крыс на П10 после введения DiI в МТ. На данном сроке тегментальные ядра четко обособлены. ПМ – переднемедиальное ядро таламуса; остальные обозначения см. на предыдущих рис. Масштаб: 200 мкм.
Морфологические данные свидетельствуют о том, что реципрокные связи между МТ и ядрами покрышки среднего мозга функционируют в качестве петли обратной связи. Данная система имеет большое значение для работы мозга, поскольку, вероятно, участвует в генерации и поддержании тета-осцилляций (Kocsis, 2001), а также осуществляет регуляцию потока информации, следующей из формаций гиппокампа через МТ в ядра переднего таламуса (Shibata, 1987; Hayakawa & Zyo, 1991, 1992; Gonzalo-Ruiz et al., 1999). Полученные нами данные говорят о том, что отдельные звенья данной системы обратных связей образуются не одновременно, и ее формирование начинается с нисходящего звена – мамилло-тегментального тракта. К рождению происходит замыкание петли – прорастание аксонов тегментальных ядер в составе мамиллярной ножки к МТ, а после рождения наблюдается увеличение количества меченых волокон мамиллярной ножки пропорциональное увеличению числа меченых нейронов в тегментальных ядрах.
Рис. 8. Выявление мамиллярной ножки на П10 (а) и иннервации переднемедиального и ретикулярного тегментального ядер моста аксонами мамилло-тегментального тракта на П11 (б) после нанесения DiI на МТ на сагиттальных срезах мозга. ПММ – переднемедиальное ядро моста; РТМ – ретикулярное тегментальное ядро моста; остальные обозначения см. на предыдущих рис. Масштаб: 200 мкм.
Развитие мамилло-таламического тракта и формирование
иннервации ядер переднего таламуса его аксонами.
Мамилло-таламический тракт является одной из основных проводящих систем МТ и состоит из эфферентных волокон мамиллярных ядер, иннервирующих ядра переднего таламуса, как было показано у взрослых животных (Cruce, 1975; Seki & Zyo, 1984). Считается, что аксоны мамилло-таламического тракта представляют собой коллатерали аксонов мамилло-тегментального тракта, которые отделяются от мамилло-тегментального тракта на незначительном расстоянии от МТ (Van der Kooy et al., 1978; Takeuchi et al., 1985; Valverde et al., 2000). В нашем исследовании нанесение DiI на тегментальную область среднего мозга (Э19,5) выявляло не только волокна мамилло-тегментального тракта, но и растущий мамилло-таламический тракт (Рис. 2 г), что служит дополнительным подтверждением коллатеральной природы волокон последнего.
Нами был последовательно описан процесс развития мамилло-таламического тракта от момента обнаружения первых бифуркаций мамилло-тегментальных аксонов вплоть до его прорастания к ядрам переднего таламуса и формирования их иннервации. На Э16 введение DiI в область закладки МТ приводит к мечению мамилло-тегментального тракта, однако мамилло-таламический тракт еще не обнаруживается (Рис. 9 а). Первые волокна мамилло-таламического тракта выявляются на Э17 (Рис. 9 б). На Э18 мамилло-таламический тракт представлен на сагиттальных срезах в виде короткого (около 200 мкм длиной) толстого компактного пучка аксонов (Рис. 9 в). Сканирование с помощью конфокального микроскопа выявило места бифуркации волокон мамилло-таламического тракта и показало, что волокна отходят от мамилло-тегментального тракта в ростродорзальном направлении, образуя угол около 80° с его аксонами. Некоторые аксоны мамилло-таламического тракта выступают вперед относительно основного пучка мамилло-таламических волокон.
Рис. 9. Микрофотографии сагиттальных срезов мозга, полученные после нанесения DiI на закладку МТ, на разных сроках развития. На Э16 выявляется только мамилло-тегментальный тракт (а). На Э17 обнаруживаются первые меченые волокна мамилло-таламического тракта (стрелка, б). На Э18 мамилло-таламический тракт выявляется в виде короткого пучка растущих аксонов (в). Обозначения см. на предыдущих рис. Масштаб: 200 мкм.
На Э19,5 мамилло-таламический тракт становится длиннее, но еще не выходит за пределы гипоталамуса. В отличие от волокон мамилло-тегментального тракта, которые собраны в изолированные компактные пучки, меченые аксоны мамилло-таламического тракта в пучки не объединяются, а равномерно заполняют свободное пространство между темными немечеными телами клеток заднего гипоталамуса, что в особенности хорошо видно на снимках, полученных при помощи конфокального микроскопа (Рис. 10 а). Используя конфокальный микроскоп, мы впервые выявили наличие у большинства аксонов мамилло-таламического тракта на Э19,5 конусов роста (Рис. 10 б, в, г), что означает синхронность их развития. Роль конусов роста аксонов в развивающейся нервной ткани заключается в восприятии ближних и дистантных сигналов – различных специфических молекул, экспрессирующихся, соответственно, в окружающей их ткани и структурами-мишенями для данных аксонов. Благодаря наличию этих сигналов осуществляется выбор аксонами направления роста (Tessier-Lavigne & Goodman, 1996).
Рис. 10. Выявление мамилло-таламического тракта в пределах гипоталамуса при нанесении DiI на МТ на Э19,5 на сагиттальных срезах мозга. Конфокальные изображения проксимальных частей мамилло-таламического и мамилло-тегментального трактов (a), дистальной части мамилло-таламического тракта с многочисленными конусами роста аксонов (б) и отдельных конусов роста (стрелки, в, г). Обозначения см. на предыдущих рис. Масштаб: а – 80 мкм; б, в – 20 мкм; г – 8 мкм.
На Э20–Э21 введение DiI в МТ показало, что мамилло-таламический тракт достигает вентромедиальной области переднего таламуса (Рис. 11). На коронарных и сагиттальных срезах видно, что дистальный конец мамилло-таламического тракта расширяется, так как его аксоны начинают образовывать терминальные ветвления в области переднемедиального ядра таламуса (Рис.11).
Рис. 11. Врастание мамилло-таламического тракта в область переднего таламуса на Э21. А – сагиттальный срез мозга, б – коронарный срез мозга. ПТа – передний таламус; У – уздечка; остальные обозначения см. на предыдущих рис. Масштаб: 200 мкм.
На П2 при введении маркера в ММ густая сеть меченых аксонов мамилло-таламического тракта, вероятно, уже с терминальными ветвлениями выявляется в переднемедиальном и передневентральном ядрах таламуса (Рис. 12 а). При попадании маркера унилатерально в ЛМ меченые аксоны мамилло-таламического тракта проходят через ипсилатеральное переднемедиальное ядро таламуса и следуют, разделившись на две части, в ипсилатеральное и контралатеральное переднедорзальные ядра. Меченые волокна распределяются в пределах обоих переднедорзальных ядер неравномерно с большей плотностью в вентрокаудальной области (Рис. 12). Дорзальнее переднемедиальных ядер таламуса выявляется значительный перекрест волокон МТ, составляющий внутреннюю переднедорзальную комиссуру таламуса (Рис. 12 а). Он образован той частью аксонов мамилло-таламического тракта, которая после прохождения сквозь ипсилатеральное переднемедиальное ядро следует на противоположную сторону таламуса к контралатеральному переднедорзальному ядру.
Рис. 12. Выявление аксонов мамилло-таламического тракта в ядрах переднего таламуса на коронарных срезах мозга на П2 после введения DiI в МТ. Впк – внутренняя переднедорзальная комиссура таламуса; ПВ – передневентральное ядро таламуса; ПД – переднедорзальное ядро таламуса; остальные обозначения см. на предыдущих рис. Масштаб: 200 мкм.
В одном из случаев на П3–П4 при обширном нанесении DiI в оба МТ краситель распространился с обеих сторон в ММ и ЛМ. В результате меченые волокна и терминальные ветвления мамилло-таламического тракта выявлялись во всем объеме переднемедиальных и передневентральных ядер таламуса. Оба переднедорзальных ядра также были заполнены волокнами мамилло-таламического тракта, которые начинали образовывать в них терминальные ветвления.
На П5–П10 на коронарных срезах плотная сеть меченых терминальных ветвлений аксонов мамилло-тегментального тракта заполняет все три ипсилатеральных ядра переднего таламуса и контралатеральное переднедорзальное ядро таламуса, если зона распространения маркеров при унилатеральном введении в МТ захватывает оба, ММ и ЛМ (Рис. 13 а).
плотностью распределения терминалей, меченных DiI. В других ядрах переднего таламуса Synapsin-I практически не выявлялся (Рис. 15 б).
Остается неясным, принадлежат ли синапсинположительные терминали в переднем таламусе аксонам мамилло-таламического тракта или аксонам других систем, поскольку для разрешения данного вопроса необходимо одновременное мечение терминалей антителами к синапсину и DiI, что крайне затруднительно, учитывая особенности данных методов.
Рис. 14. Микрофотографии сети меченых терминальных ветвлений аксонов мамилло-таламического тракта, окружающей немеченые тела нейронов ядер переднего таламуса (звездочки, а), и терминальных кисточек мамилло-таламического тракта у границ переднемедиального ядра таламуса (б, в), полученные при помощи конфокального микроскопа после нанесения DiI на МТ на П10. Масштаб: 20 мкм.
Рис. 15. Иммунофлуоресцентное выявление белка Synapsin-I на коронарных срезах переднего таламуса на П5 при помощи конфокального микроскопа. Обозначения см. на предыдущих рис. Масштаб: а – 20 мкм, б – 40 мкм.
Таким образом, в данной работе было описано развитие мамилло-таламического тракта крыс, начиная с Э17. Специфическая пространственная организация проекций мамиллярных ядер на передний таламус, отмеченная многими авторами при исследование связей МТ у взрослых грызунов и макак (Seki & Zyo, 1984; Vann et al., 2007), наблюдалась в исследованных нами случаях с первых дней после рождения. Было впервые описано формирование иннервации ядер переднего таламуса аксонами мамилло-таламического тракта и установили, что этот процесс завершается в течение первой недели после рождения, о чем ранее не сообщалось. Также в настоящей работе было показано, что аксоны мамилло-таламического тракта можно условно разделить на три группы, последовательно иннервирующие различные области переднего таламуса. При этом билатеральные проекции ЛМ на переднедорзальные ядра таламуса формируются позже, чем унилатеральные проекции ММ на переднемедиальное и передневентральное ядро. Мощная и функционально активная иннервация переднедорзального ядра таламуса была выявлена нами на П5. Уникальный пространственно-временной образец развития восходящих проекций МТ на ядра переднего таламуса, вероятно, отражает важность этих связей в пределах лимбической системы.
Различия в мечении структур среднего мозга и выявлении иннервации ядер переднего таламуса при нанесении маркеров на разные области МТ.
Известно, что ММ состоит, по крайней мере, из четырех частей, каждая из которых посылает аксоны в определенную область среднего мозга и переднего таламуса и получает топографически организованные проекции от тегментальных ядер (Seki & Zyo, 1984; Allen & Hopkins, 1988; Shibata, 1992). В нескольких случаях на разных стадиях развития, начиная с П2, нам удалось получить мечение в основном либо латеральной, либо медиальной половины ММ, в результате чего выявилась специфическая топографическая организация его связей, о которой сообщалось ранее другими авторами. Данные случаи показали следующие различия. Более латеральное введение маркера в ММ обеспечивает мечение нейронов в вентральном тегментальном ядре практически равномерно с незначительным увеличением плотности в вентромедиальной его области и мечение терминальных ветвлений в вентролатеральной части передневентрального ядра таламуса. При более медиальном нанесении красителя происходит мечение нейронов преимущественно в дорзолатеральной области вентрального тегментального ядра, а терминальные ветвления мамилло-таламического тракта выявляются в дорзомедиальной части передневентрального ядра таламуса. Если же маркер при нанесении захватывает только вентральную область ММ, то меченые нейроны в вентральном тегментальном ядре среднего мозга располагаются эксцентрично, в то время как меченые волокна и терминальные ветвления мамилло-таламического тракта в передневентральном ядре таламуса сконцентрированы только в медиальной его области. Распределение меченых нейронов в тегментальных ядрах согласуется с результатами, полученными у взрослых крыс (Hayakawa & Zyo, 1984, 1991; Shibata, 1987; Allen & Hopkins, 1989; Gonzalo-Ruiz et al., 1992 а). В случае проекций на таламус имеются различия как в описании распределения меченых терминалей, приводимом разными авторами (Cruce, 1975; Seki & Zyo, 1984), так и при сопоставлении данных описаний с нашими результатами. Это связано, вероятно, с особенностями используемых методов и, прежде всего, с разными способами нанесения маркеров. Однако следует подчеркнуть, что согласно нашим данным, специфическая топографическая организация связей ММ формируется, начиная с ранних стадий постнатального развития.
Выявление свода.
Согласно данным литературы, у взрослых крыс многочисленные волокна следуют к МТ в составе свода из ретрогиппокампальной зоны (Allen & Hopkins, 1989; Shibata, 1989). В классическом гистологическом исследовании врастание волокон свода в МТ было описано на Э21 (Coggeshall, 1964). Однако позднее было показано, что свод в области закладки МТ выявляется уже на Э15 (Altman & Bayer, 1978). Мы обнаружили, что при нанесении DiI на МТ первые меченые волокна свода выявляются на П2, а на П10–П20 он прослеживается в виде мощного пучка волокон в пределах промежуточного мозга до перегородки, где число меченых волокон заметно уменьшается. В гиппокампе были выявлены единичные меченые аксоны, а нейроны не были обнаружены ни на одном из исследованных сроков развития, несмотря на то, что анализ проводился с использованием серийных срезов, представляющих все формации гиппокампа. Некоторые ученые считают, что аксоны свода оканчиваются не в самих МТ, а в супрамамиллярном ядре. Несмотря на то, что в некоторых исследованных нами случаях маркер при нанесении в МТ распространялся в окружающие ядра, в том числе супрамамиллярное, мечение нейронов в области формаций гиппокампа все равно не обнаруживалось. Таким образом, выявленные волокна в составе свода были только эфферентными волокнами МТ, тогда как свод считается одним из основных путей аксонов из субикулума, пре- и парасубикулума к МТ. Этот неожиданный результат не находит адекватного объяснения. Маловероятным кажется то, что развитие проекций гиппокампа на МТ происходит на более поздних сроках постнатального онтогенеза. Скорее всего, липофильные маркеры непригодны для выявления свода и не могут быть использованы для описания данной системы.
Особенности применения липофильных красителей.
Высокая эффективность метода распространения липофильных красителей по мембранам нейронов для изучения внутримозговых связей плодов и животных на ранних стадиях постнатального развития была наглядно продемонстрирована в данном исследовании.
Диффузия липофильных красителей в липидном слое мембран нейронов обеспечивает стабильное окрашивание нейронов, их отростков и даже претерминальной сети, образованной аксонами. Однако скорость распространения молекул маркеров по мембранам нейронов в фиксированной ткани при комнатной температуре очень низка. Поэтому для полного мечения проекционных систем, которые являются достаточно протяженными, необходимо длительное хранение мозга после нанесения маркеров (Vercelli et al., 2000; Makarenko, 2007). Это несколько ограничивает использование данного метода. Между тем в литературе встречаются сообщения о том, что повышение температуры инкубации мозга до 37C ускоряет диффузию маркеров (Friedmann et al., 1991; Lukas et al., 1998). Однако некоторые авторы (Hofmann & Bleckmann, 1999) отмечают, что хранение мозга при повышенной температуре может приводить к «размытому» мечению волоконных систем, а также к трансмембранному переходу красителя в соседние клетки. Наши попытки инкубировать мозг с введенным в МТ DiI при 37C показали, что срок хранения при повышенной температуре можно существенно сократить (например, с 6-ти до 1–1,5 месяцев для П2). При этом достигается такой же результат, как при длительном хранении мозга при комнатной температуре, и не наблюдается ухудшение качества мечения.
Результаты экспериментов с одновременным нанесением DiI и DiA на МТ разных сторон одного и того же мозга подтвердили предыдущие данные о том, что DiI лучше подходит для мечения протяженных волоконных систем, чем DiA (Трухачева и Александрова, 1999; Vercelli et al., 2000; Makarenko, 2007). Мы обнаружили, что DiI выявляет тела нейронов, а также обеспечивает яркое, стабильное и более полное мечение нервных трактов и тонких нервных отростков. DiA окрашивает в основном тела нейронов и крупные аксональные тракты, но с помощью него не удается достичь такого же четкого выявления отдельных тонких волокон и терминальных ветвлений аксонов, как с помощью DiI.
Имеются разные мнения относительно применимости DiI для мечения связей в зрелом мозгу. Полученные данные говорят о том, что качество мечения связей МТ при помощи DiI ухудшается с возрастом животного, и это заметно уже на П20. В исследованных случаях на П60 выявлялись только компактные участки мамилло-тегментального тракта, мамилло-таламического тракта и свода. Сеть терминальных ветвлений аксонов МТ была практически неразличима, а нейроны в среднем мозгу не обнаруживались вовсе. Данный феномен, по нашему мнению, может быть объяснен постепенным изменением состава мембран нейронов, происходящим при развитии мозга. Также имеются сведения о том, что процесс миелинизации аксонов некоторых основных внутримозговых трактов крыс начинается в первую неделю после рождения, наиболее интенсивен на П20, как раз тогда, когда наблюдается ухудшение мечения, и заканчивается к П40 – П70 (Jacobson, 1963; Hamano et al., 1998). Таким образом, образование миелиновых оболочек с большой вероятностью сказывается на качестве выявления нервных волокон с помощью DiI.
Заключение. В данной работе было впервые последовательно описано развитие основных проводящих систем, связывающих МТ с тегментальной областью среднего мозга, развитие мамилло-таламического тракта и формирование иннервации ядер переднего таламуса его аксонами с помощью метода транспорта длинноцепочечных липофильных красителей.
ВЫВОДЫ
1. Использование липофильных красителей, и в особенности DiI, позволило получить данные о последовательности перинатального формирования основных проводящих систем, связывающих МТ с таламусом и средним мозгом, у крыс.
2. Первым образуется эфферентный мамилло-тегментальный тракт, который обнаруживается в среднем мозгу на Э14,5 и начинает формировать иннервацию тегментальных ядер на Э18, а ядер моста – на П2.
3. Афферентный тракт – мамиллярная ножка формируется, начиная с поздних эмбриональных стадий развития, и на П2 ретроградно меченые нейроны выявляются в трех обособленных ядрах покрышки среднего мозга.
4. Аксоны мамилло-таламического тракта впервые выявляются в месте бифуркации основного мамиллярного тракта на Э17, подрастают к переднему таламусу на Э20–Э21 и формируют его иннервацию, начиная с вентральных областей. На П6 иннервация всех ядер переднего таламуса аксонами МТ хорошо выражена.
5. Топографическая организация связей отдельных областей МТ с передним таламусом и тегментальной областью среднего мозга, описанная у взрослых крыс, обнаруживается начиная с П2.
- Нейроны формаций гиппокампа и их аксоны, следующие к МТ в составе свода у взрослых животных, не были выявлены ни на одном из изученных сроков развития.
Настоящее исследование выполнено с использованием оборудования Центра коллективного пользования по биологии развития на основе использования клеточных технологий и оптических методов исследования ОБН РАН при Учреждении Российской академии наук Институте биологии развития им. Н.К. Кольцова РАН.
Работа поддержана грантами РФФИ 04-04-48073-a и 07-04-00798-a.
Список сокращений, используемых в тексте и в подписях к рисункам:
3 – 3-й желудочек мозга; 4 – 4-й желудочек мозга; впк – внутренняя переднедорзальная комиссура таламуса; ВТ – вентральное тегментальное ядро (Гуддена); ДТ – дорзальное тегментальное ядро (Гуддена); ДТв – дорзальное тегментальное ядро, вентральная часть; ДТд – дорзальное тегментальное ядро, дорзальная часть; ЛМ – латеральное мамиллярное ядро; М – ядра моста; ММ – медиальное мамиллярное ядро; мн – мамиллярная ножка; МТ – мамиллярное тело; мта – мамилло-таламический тракт; мте – мамилло-тегментальный тракт; ом – основной мамиллярный тракт; ПВ – передневентральное ядро таламуса; ПД – переднедорзальное ядро таламуса; ПМ – переднемедиальное ядро таламуса; ПММ – переднемедиальное ядро моста; ПТ – переднее тегментальное ядро; ПТа – передний таламус; РТМ – ретикулярное тегментальное ядро моста; с – свод; Т – тегментальная область среднего мозга; У – уздечка; УФ – ультрафиолетовый фильтр.
Список работ, опубликованных по теме диссертации
Статьи в журналах, соответствующих Перечню ВАК:
- Е.В. Алпеева, И.Г. Макаренко. Перинатальное развитие маммилло-тегментальных связей у крыс. // Онтогенез. Т. 38 (2), стр. 86–93, 2007 г.
- Alpeeva E.V., Makarenko I.G. Perinatal development of the mammillothalamic tract and innervation of the anterior thalamic nuclei. // Brain Research. V. 1248, р. 1–13, 2009.
Тезисы конференций:
- Алпеева Е.В. Развитие основных проводящих путей мамиллярных тел гипоталамуса в перинатальном онтогенезе крыс. // Тезисы докладов XII Международной конференции студентов, аспирантов и молодых ученых «Ломоносов – 2005» (Москва), стр. 11.
- Макаренко И.Г., Алпеева Е.В. Развитие аксональных связей перегородки с передним, средним и задним гипоталамусом в пренатальном онтогенезе у крыс. // VII Всероссийская конференция нейроэндокринологов «Нейроэндокринология – 2005» (Санкт-Петербург). Тезисы докладов, стр. 114–115.
- Макаренко И.Г., Алпеева Е.В., Гордеева О.Ф., Мельникова В.И. Развитие аксональных связей лимбических структур мозга с гипоталамусом у крыс. // Первый Международный Междисциплинарный Конгресс «Достижения нейронауки для современной медицины и психологии» (Судак, Украина, 2005 г.). Тезисы докладов, стр. 119–121.
- Alpeeva E.V., Makarenko I.G. Development of the mamillotegmental tract during perinatal ontogenesis in rats. // Abstracts of the “5th International Symposium on Experimental and Clinical Neurobiology” (The High Tatras, Slovak Republic, 2005). Folia Medica Cassoviensia, p.4.
- Макаренко И.Г., Aлпеева Е.В. Изучение ранних этапов развития аксональных связей гипоталамуса – путь к пониманию процесса формирования лимбических нервных цепей. // Труды Международного междисциплинарного семинара «Новые технологии в интегративной медицине и биологии» (Бангкок-Паттайя, Тайланд, 2006 г.). «Стресс и экстремальные состояния», стр. 45–47.
- Алпеева Е.В., Макаренко И.Г. Развитие мамилло-таламического тракта и иннервации передних ядер таламуса в перинатальном онтогенезе крыс. // Материалы V Международной конференция по функциональной нейроморфологии «Колосовские чтения – 2006» (Санкт-Петербург). Морфология, т.129, №2, стр. 13–14.
- Макаренко И.Г., Алпеева Е.В. Афферентные и эфферентные связи гипоталамуса, начинающие развиваться в процессе пренатального онтогенеза. // (Москва). Материалы Всероссийской научной конференции (сборник статей) «Структурно-функциональные и нейрохимические закономерности асимметрии и пластичности мозга – 2006» (Москва), стр. 169–171.
- Алпеева Е.В., Макаренко И.Г. Формирование связей маммиллярных тел в процессе перинатального развития у крыс. // Материалы конференции молодых специалистов ИБР РАН (Москва, 2006 г.). Онтогенез, т. 38 (4), стр. 313, 2007 г.
- Алпеева Е.В., Макаренко И.Г. Раннее пренатальное развитие хабенуло-интерпедункулярного тракта у крыс. // ХХ Съезд Физиологического общества им. И.П. Павлова (Москва, 2007 г.). Тезисы докладов, стр. 122.
- Makarenko I.G, Alpeeva E.V. Perinatal DiI tracing of developing hypothalamic connections. // 34th Annual Meeting of the Fetal and Neonatal Physiological Soсiety (Sendai, Japan, 2007). Meeting handbook, p.84.
- Алпеева Е.В., Макаренко И.Г. Новые данные о развитии маммилло-таламческого тракта у крыс. // Материалы конференции молодых специалистов ИБР РАН (Москва, 2007 г.). Онтогенез, 39 (4), стр. 308–309, 2008 г.
- Makarenko I.G., Alpeeva E.V. Early development of the limbic brain connections (DiI tracing study). // Programme & Abstracts of the Brain Development Symposium (London, Great Britain, 2008), p.64.
- Alpeeva E.V., Makarenko I.G. Carbocyanine dye tracing as a unique method for studying early development of mammillothalamic connections and formation of innervation of the anterior thalamic nuclei in rats. // Abstracts of the 6th International Symposium on Experimental and Clinical Neurobiology (Kosice, Slovak Republic, 2008), p.1.
