Конструирование, биотехнологические характеристики и клинико-морфологическое обоснование терапевтической эффективности иммуномодулятора иммуно-safe
На правах рукописи
Исаева Анна Юрьевна
Конструирование, биотехнологические характеристики
и клинико-морфологическое обоснование терапевтической
эффективности иммуномодулятора «Иммуно-Safe»
03.01.06 – биотехнология (в том числе бионанотехнологии)
06.02.01 – диагностика болезней и терапия животных, патология, онкология и морфология животных
АВТОРЕФЕРАТ
диссертации на соискание ученой степени
кандидата биологических наук
Саратов - 2013
Работа выполнена в Федеральном государственном бюджетном
образовательном учреждении высшего профессионального образования
«Саратовский государственный аграрный университет имени Н.И. Вавилова»
| Научные руководители: | доктор биологических наук Староверов Сергей Александрович |
| доктор ветеринарных наук Волков Алексей Анатольевич | |
| Официальные оппоненты: | Гулий Ольга Ивановна доктор биологических наук, доцент Федеральное государственное бюджетное учреждение науки Институт биохимии и физиологии растений и микроорганизмов Российской академии наук, ведущий научный сотрудник лаборатории физиологии микроорганизмов |
| Никулин Иван Алексеевич | |
| доктор ветеринарных наук, профессор Федеральное государственное бюджетное образовательное учреждение высшего профессионального образования Воронежский государственный аграрный университет им. императора Петра I, профессор кафедры терапии и фармакологии |
Ведущая организация: Федеральное государственное автономное образовательное учреждение высшего профессионального образования «Северо-Кавказский
федеральный университет»
Защита состоится «26» апреля 2013 года в ____ часов на заседании диссертационного совета Д 220.061.04 при ФГБОУ ВПО «Саратовский государственный аграрный университет имени Н.И. Вавилова» по адресу: 410005, г. Саратов, ул. Соколовая, 335, диссертационный зал.
С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке ФГБОУ ВПО «Саратовский ГАУ».
Автореферат диссертации разослан «____» марта 2013 г.
Отзывы на автореферат направлять по адресу: 410012, г. Саратов, Театральная пл.1, ФГБОУ ВПО «Саратовский ГАУ» учёному секретарю диссертационного совета.
Ученый секретарь
диссертационного совета
доктор биологических наук, профессор Карпунина Лидия Владимировна
ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ
Актуальность темы. Биофармацевтическая промышленность является одной из важнейших отраслей биотехнологии, однако многие методы лечения и способы приготовления лекарственных форм значительно устарели и требуют существенной модернизации. К сожалению, большинство традиционных лекарственных форм имеют ряд существенных недостатков, таких как: ненаправленное действие лекарственного вещества, т.е. взаимодействие с нецелевыми биообъектами (что приводит к побочным эффектам), сложности в поддержании оптимальной терапевтической концентрации и как следствие - повышенный расход лекарственных веществ, недостаточная биосовместимость, нежелательные физиологические эффекты и др.
Соответственно, значительное количество традиционных лекарственных форм уже не отвечают современным жёстким требованиям, а их производство и применение в значительной степени тормозит развитие ветеринарной медицины, а также фармацевтической науки и индустрии.
Таким образом, одной из важнейших проблем в фармацевтической отрасли остается адресная доставка лекарственных веществ с целью повышения эффективности лечения и снижения себестоимости препаратов.
При этом необходимо решить две взаимосвязанные задачи – сначала адресно доставить препарат на носителе, а затем отделить препарат от носителя. Также сложность данных задач заключается в том, что, в ряде случаев, носители оказывают раздражающее действие на иммунную систему (все носители хорошо распознаются и захватываются иммунной системой при введении в организм, а выведение частиц из организма происходит в течение достаточно длительного времени) (Zhou Yin et al., 2011). Миграция оставшихся структур в малых количествах по организму приводит к дестабилизации иммунной системы и, в дальнейшем, к аллергическим и аутоиммунным заболеваниям.
Поскольку в доступной нам литературе представлены несколько разрозненные, а зачастую и противоречивые представления о методах адресной доставки лекарственных веществ, то тематика данной работы является весьма актуальной.
Цель работы - поиск безопасного переносчика биологически активных веществ к органам мишеням и клеткам, сконструировать на его основе эффективный иммуномодулирующий препарат, и изучить его основные биологические, фармако-токсикологические, морфодинамические и терапевтические свойства.
Для достижения намеченной цели в работе были поставлены следующие задачи:
1. Разработать технологию синтеза коллоидного селена, используемого в качестве переносчика биологически активных веществ.
2. Разработать технологию приготовления и оптимизировать состав иммуномодулирующего лекарственного препарата «Иммуно-Safe», созданного путём конъюгирования комплекса кислотоустойчивых белков сыворотки молока (лактоферрин, лактоальбумин, лактоглобулин) и коллоидного селена, используемого в качестве наноразмерного носителя.
3. Изучить основные биологические и фармако-токсикологические свойства препарата «Иммуно-Safe», а так же на лабораторных моделях изучить его влияние на неспецифические факторы иммунитета.
4. Изучить морфодинамические параметры распределения препарата «Иммуно-Safe» в органах и тканях животных при различных способах введения.
5. На основании клинических, гематологических, биохимических и морфологических исследований подтвердить безопасность применения и иммуностимулирующую эффективность препарата «Иммуно-Safe».
Научная новизна.
Разработана технология синтеза коллоидного селена, используемого в качестве наноразмерного носителя, изучены его физико-химические и биологические свойства. Отработана технология выделения комплекса кислотоустойчивых белков сыворотки молока (лактоферрин, лактоальбумин, лактоглобулин) и на лабораторных моделях изучено влияние полученной субстанции на неспецифические факторы иммунитета.
Сконструирован принципиально новый ветеринарный иммуномодулирующий лекарственный препарат «Иммуно-Safe», созданный на основе наноразмерных частиц коллоидного селена, используемых в качестве наноплатформы для адресной доставки биологически активных веществ к иммунокомпетентным органам. Экспериментально подтверждена доставка во внутриклеточное пространство биологически активных веществ, конъюгированных на наноносителе.
Установлены основные фармако-токсикологические свойства иммуномодулирующего препарата «Иммуно-Safe», подтверждённые патоморфологическими и морфо-биохимическими исследованиями. При этом установлено отсутствие токсических, аллергизирующих и местно-раздражающих свойств. Изучены основные морфодинамические параметры распределения препарата в органах при различных способах введения. Изучено влияние препарата на биохимические и гематологические показатели, а также на морфофункциональное состояние внутренних органов животных.
Практическая значимость.
Разработан эффективный и безопасный способ доставки биологически активных веществ во внутриклеточное пространство.
Производству предложена технология синтеза коллоидного селена. На лабораторных моделях изучено влияние коллоидного селена и комплекса кислотоустойчивых белков сыворотки молока (КБСМ) на неспецифические факторы иммунитета.
Ветеринарной медицине предложен новый иммуномодулирующий лекарственный препарат «Иммуно-Safe», созданный на основе наноразмерного носителя. На производство и применение препарата разработан проект нормативной документации (технические условия и инструкция по применению). Установлены основные фармако - токсикологические свойства и морфодинамические характеристики препарата «Иммуно-Safe». Клинически и морфологически обоснована безопасность применения сконструированного препарата «Иммуно-Safe».
По материалам диссертационной работы опубликованы методические рекомендации «Конструирование новых лекарственных препаратов на основе коллоидного селена, используемого в качестве наноразмерного носителя» (в соавторстве с А.А. Волковым, А.С. Староверовым) для практических занятий студентов старших курсов, а также для работы аспирантов и научных работников (2012 г.). Материалы исследований используются в учебном процессе и научной работе ФГБОУ ВПО «Саратовский ГАУ», ФГБОУ ВПО «Донской ГАУ», УО «Витебская ордена «Знак Почета» государственная академия ветеринарной медицины» (Республика Беларусь).
Работа выполнена на кафедре терапия, акушерство и фармакология ФГБОУ ВПО «Саратовский государственный аграрный университет имени Н.И. Вавилова» в рамках научно-исследовательской работы: «Проведение исследований механизма взаимодействия нанокомпозиций на основе коллоидных металлов и полимерных производных с иммунной и метаболической системой животных» (№ гос. регистрации 01201280016, научный руководитель темы, заведующий лабораторией д.б.н. Староверов С. А.).
Основные положения, выносимые на защиту:
1. На основе коллоидного селена, используемого в качестве наноразмерного носителя и биологически активного вещества (комплекса кислотоустойчивых белков сыворотки молока) сконструирован иммуномодулирующий препарат «Иммуно-Safe». Разработаны технологические параметры его изготовления.
2. Разработанный иммуномодулирующий препарат «Иммуно-Safe» не обладает местно-раздражающим, кумулятивным и токсическим действием.
3. При изучении биодинамических параметров распределения иммуномодулятора «Иммуно-Safe» в органах животных, выявлено явление тропизма препарата к иммунокомпетентным органам, что подтверждает возможность его применения в качестве иммуномодулирующего средства.
4. Клинические, гематологические, биохимические и морфологические исследования свидетельствуют о безопасности применения и терапевтической эффективности иммуномодулятора «Иммуно-Safe».
Апробация работы. Основные материалы диссертации представлены на: Международной научно – практической конференции «Ветеринарная медицина XXI века. Инновации, обмен опытом и перспективы развития» (Саратов, 2012), Международной научно-практической конференции «Новые и возвращающиеся болезни животных заразной и незаразной этиологии» (Витебск, 2012), Международной научно-практической конференции «Современные проблемы ветеринарии, зоотехнии и биотехнологии» посвящённой 100-летию «СГАУ им. Н.И. Вавилова» (Саратов, 2013).
Публикации. По материалам диссертационной работы опубликовано 8 работ, из них 3 статьи в журналах, рекомендованных ВАК РФ.
Структура и объем работы.
Диссертация состоит из введения, обзора литературы, собственных исследований, включающих объекты и методы исследований, результаты исследований и их обсуждение, а также заключения, выводов, практических предложений, списка литературы. Работа изложена на 136 страницах компьютерного текста, содержит 38 таблиц, иллюстрирована 52 рисунками и диаграммами. Список литературы включает в себя 169 источников.
СОБСТВЕННЫЕ ИССЛЕДОВАНИЯ
ОБЪЕКТЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЙ
Объекты исследований. В работе использовали культуры клеток почек эмбрионов свиньи (линия СПЭВ) и человеческих раковых клеток линия HeLa, клетки Staphylococcus aureus 209-P, биомасса полевого изолята Salmonella thyphimurium, убитой нагреванием. В качестве лабораторных животных использовали белых нелинейных мышей (77 животных), белых нелинейных крыс (10 голов), а также кролики «Белый великан» (22 головы) в возрасте 6 месяцев и живой массой 3,5-4 кг. Животные подбирались по принципу аналогов.
Условия культивирования клеточных культур: культивирование клеточных культур проводили по стандарной методике (Мейхи, 1988).
Подсчет клеток производили в камере Горяева по общепринятому методу (Меньшиков, 1999).
Микробиологические исследования проводились по стандартным протоколам (Лабинская, 1978).
Методы. Выделение КБСМ (лактоферрин, лактоальбумин, лактоглобулин) проводили по общепринятой технологии (Naidi, 2000).
Титр агглютинирующих антител в сыворотках экспериментальных животных определяли, используя метод радиальной иммунодиффузии в 1,5% агаровом геле (Фримель, 1987).
Перитонеальные клетки мыши (ПКМ) получали по стандартной методике (Пастер, Овод, 1989), затем определяли их концентрацию на автоматическом гематологическом анализаторе HEMA SCREEN 18 (HOSPITEX DIAGNOSTICS).
Изучение влияния КБСМ на выживаемость стафилококка в присутствии перитонеальных клеток проводили по следующей методике: смешением раствора белков сыворотки молока или физиологического раствора вместо него, свежей среды, суспензий ПКМ и Staphylococcus aureus 209-P, получали культуры с различными концентрациями компонентов. Полученные культуры инкубировали 40 мин. при 37°С, определяли число КОЕ стафилококка высевом разведений исходных образцов на солевой мясо – пептонном агар и подсчетом числа выросших колоний.
Для изучения биораспределения препарата в организме животных применяли метод маркировки КБСМ флюоресцеинизоционатом (ФИТЦ) (Фримель, 1987).
Размер частиц коллоидного селена определяли при помощи электронного микроскопирования, которое осуществляли на электронном микроскопе LIBRA 120 (CarlZeiss, Германия) (Шиммель, 1972).
Для подтверждения способности наноплатформы доставлять биоактивные вещества во внутриклеточное пространство, проводили исследование на клеточной линии HeLa. Для исследования применяли конфокальный микроскоп Leica TCS-SP5 (Leica Microsistems, Германия). Для возбуждения флуоресценции использовались аргоновый лазер, излучающий на длинах волн 458 и 543 нм и гелий-неоновый лазер, излучающий на длине волны 633 нм.
Для изучения влияния препарата «Иммуно-Safe» на окислительно-восстановительные процессы клеток препарат вносился в монослойную культуру клеток в концентрации 1 мг на 10 мл среды. Культивирование проводили в течение 48 часов после чего клетки снимались трипсинизацией и у них определялась интенсивность дыхания в МТТ тесте (Bernas, Dobrucki, 2000). Показания оптической плотности считывали на планшетном ридере Multiscan Ascent (Thermo Scientific).
Лизосомально-катионовый тест проводили по общепринятому методу (Меньшиков, 1999). Фагоцитарную активность и фагоцитарное число определяли по методу (Пастер, Овод, Позур, 1989; Гуткин, Горбатов, Феоктистова, 1984) и рассчитывали по формуле:
АФ = 100(а-б)/а,
где а и б – концентрация стафилококка в контроле и опыте, соответственно.
Определение субпопуляций лимфоцитов проводили методом розеткообразования по общепринятой методике (Петров, 1984).
С целью доказать безопасность применения и отсутствие негативного воздействия иммуномодулятора «Иммуно-Safe» на клеточные и неспецифические факторы иммунитета исследования проводились по стандартным методикам (Хабриева, 2005). При постановке эксперимента было сформировано 3 группы лабораторных животных (кроликов породы «Белый великан») по 5 голов в каждой. Возраст кроликов составлял 6 мес, живая масса 3,5-4 кг.
Содержание и уход за животными, а так же их эвтаназия проводились в соответствии с требованиями Министерства здравоохранения РФ к работе экспериментально-биологических клиник и «Европейской конвенции по защите позвоночных животных, используемых для экспериментальных и других научных целей».
Клинические и гематологические исследования проведены по общепринятым методам, биохимические – в соответствии с «Методическими указаниями по применению унифицированных биохимических методов исследований крови, мочи и молока в ветеринарных исследованиях» (М., 2004). Биохимические исследования проводили на биохимическом анализаторе «МindrayBA-88A» с использованием диагностических систем фирмы «Ольвекс диагностикум».
Животных (кроликов) выводили из эксперимента на 20 сутки. Для морфологического исследования брали печень, селезёнку, почки и подколенные лимфатические узлы с обеих тазовых конечностей.
Материал фиксировали в 10%-м водном нейтральном забуференном растворе формалина. Затем по общепринятым методикам изготавливали гистологические срезы на замораживающем микротоме Reichert. Для обзорных целей гистологические срезы окрашивали гематоксилином Эрлиха и эозином (Меркулов, 1969; Автандилов и др., 1982). Морфометрические исследования проводили при помощи линейки окуляр-микрометра МОВ-1-10 при увеличении микроскопа 7х10. Цифровой материал подвергали статистической обработке на ПК Pentium с использованием прикладных программ пакета Microsoft Office.
РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЙ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ
В ветеринарной практике применяются иммуностимулирующие препараты на основе лактоферрина, в частности «Полиферрин А». Однако, несмотря на широкий спектр биологической активности лактоферрина, данный препарат имеет ограниченное применение в связи с высокой стоимостью (1 доза - 150 руб.).
Нами был проведён поиск безопасных переносчиков биоактивных молекул (в частности КБСМ) к клеткам и органам-мишеням. В процессе работы, было установлено, что коллоидный селен в наноразмерном состоянии является перспективным материалом (платформой) для приготовления эффективных фармакологических препаратов, позволяющих произвести адресную доставку лекарственного вещества непосредственно во внутриклеточное пространство, тем самым представляя возможность значительно снизить концентрацию ДВ без снижения эффективности препарата.
Кроме того, нами установлено, что применение предлагаемого нами принципа внутриклеточной доставки позволяет повысить эффективность ДВ, в частности, нами предлагается применять не только один дорогостоящий белок лактоферрин, а комплекс кислотоустойчивых белков сыворотки молока (лактоферрин, лактоальбумин, лактоглобулин), технология выделения которых более доступна, и позволяет снизить себестоимость без потери эффективности препарата.
Поскольку в доступной литературе имеются данные, что соединения селена оказывают иммуностимулирующее, антибластическое и антиканцерогенное действие, то нами была изучена возможность использования комплекса коллоидного селена и КБСМ в качестве иммуномодулирующего препарата.
Изучение влияния полученной субстанции КБСМ на неспецифические факторы иммунитета лабораторных животных
Выделение комплекса кислотоустойчивых белков сыворотки молока (КБСМ) проводили по общепринятой технологии. Изучение влияния полученной субстанции КБСМ на неспецифические факторы иммунитета определяли в тесте с нитротетразолевым синим на перитонеальных клетках белых нелинейных крыс. Было установлено, что полученная субстанция заметно стимулирует клеточную систему иммунитета, что выражается в усилении митохондриального дыхания перитонеальных макрофагов, в зависимости от концентрации белков сыворотки молока.
Повышение уровня восстановления нитротетразолия перитонеальными клетками в присутствии КБСМ позволяет судить о росте активности фагоцитоза. Фактом, подтверждающими данную гипотезу, являются приведенные ниже результаты по усилению бактерицидной активности ПКМ в присутствии КБСМ (таблица 1).
Меньшая выживаемость клеток стафилококка в культуре ПКМ в присутствии КБСМ, очевидно, является результатом усиления фагоцитоза. Сравнение контроля, где отсутствовали какие-либо бактерицидные или бактериостатические агенты, и культур «КБСМ + S. aureus» показывает, что в данной концентрации и при данных условиях инкубации КБСМ не оказывают выраженного бактериостатического эффекта в отношение стафилококка.
Таблица 1 – Результаты взаимодействия микробных клеток и перитонеальных клеток мыши с белками сыворотки молока
| Концентрации компонентов | Концентрация клеток стафилококка, млн. КОЕ/мл | |||||
| ПКМ млн. кл/мл | КБСМ мкг/мл | исход. конц. | по истечении инкубации | активность фагоцитоза | ||
| ПКМ + S. aureus + КБСМ | I | 3 | 333 | 200 | 415 | 5 |
| II | 3 | 333 | 20 | 28 | 41 | |
| ПКМ + S. aureus | I | 3 | - | 200 | 429 | 2.72 |
| II | 3 | - | 20 | 47 | 2.1 | |
| S. aureus + КБСМ | I | - | 333 | 200 | 434 | - |
| II | - | 333 | 20 | 48 | - | |
| Контроль | I | - | - | 200 | 441 | - |
| II | - | - | 20 | 48 | - | |
Однако при совместном присутствии КБСМ и ПКМ выживаемость стафилококка заметно падает, о чем свидетельствует сравнение культур «ПКМ+S. aureus + КБСМ» и «ПКМ+S. aureus» между собой и с контрольной культурой. Очевидно, снижение выживаемости стафилококка в первом из образцов обусловлено усилением фагоцитоза. Уменьшение числа выживающих стафилококков (рост активности фагоцитоза) более заметно при низких и средних исходных плотностях посева.
Таким образом, установлено, что полученная субстанция КБСМ повышает активность фагоцитоза, что позволяет предполагать его стимулирующее влияние на формирование гуморального иммунитета.
Для подтверждения полученных данных были произведены эксперименты по иммунизации мышей антигенами сальмонелл в присутствии полученной субстанции КБСМ. На рисунке 1 представлены результаты определения титра агглютинирующих АТ в сыворотках иммунизированных мышей.
Наиболее высокий титр АТ обнаружен в сыворотке мышей, иммунизированных смесью сальмонелл и КБСМ. У мышей, иммунизированных только биомассой, и мышей, иммунизированных биомассой через день после инъекции КБСМ, титры АТ одинаковы и существенно ниже, чем у животных, получавших КБСМ и антиген одновременно. В сыворотке не иммунизированных животных также обнаруживаются АТ, агглютинирующие антигены сальмонелл.
Рисунок 1 - Титр агглютинирующих АТ в сыворотках
иммунизированных мышей
Таким образом, нами установлено, что иммунизация мышей биомассой сальмонелл совместно с КБСМ происходит эффективнее, что вероятно обусловлено стимулированием фагоцитоза корпускулярного антигена, способствуя тем самым более полной и эффективной его презентации иммунной системе макроорганизма.
Установив стимулирующее влияние полученной субстанции КБСМ на неспецифические факторы иммунитета, было выполнено конструирование препарата на основе корпускулярного носителя (коллоидного селена) и КБСМ.
Конструирование иммуномодулятора «Иммуно-Safe» на основе
наночастиц коллоидного селена с КБСМ
Коллоидный селен, используемый в качестве переносчика биологически активных веществ (в частности КБСМ), синтезировался по следующей технологии: во флакон объемом 20 мл внесли 0,5 мл 1 М солянокислого гидразина, добавили 2 мл miliQ воды. В полученном растворе ресуспензировали 20 мг белка (КБСМ), после чего добавляли 0,125 мл 1 М селенита натрия и доводили объем раствора до 5 мл.
Через несколько минут, когда раствор окрасился в оранжевый цвет, довели pH смеси до 7,2 1 М гидроксидом натрия. Провели диализ раствора против miliQ воды, в течение 96 часов, со сменой воды каждые 24 часа.
Физико-химическая характеристика иммуномодулятора «Иммуно-Safe»
Для установления биосовместимости полученного иммуномодулятора «Иммуно-Safe» определяли рН, чего значение составило 7,2 ед., что соответствует физическим параметрам инъекционных растворов для парентерального введения.
Для определения равномерности и однородности распределения компонентов иммуностимулирующей композиции определяли спектр в диапазонах длин волн от 200 до 1000 нм, с шагом 1 нм. Было установлено, что раствор имеет достаточно однородную среду поглощения света в диапазоне от 200 до 650 нм.
Размер частиц коллоидного селена определяли при помощи электронного микроскопа LIBRA 120 (Carl Zeiss, Германия) (рисунок 2 а). На рисунке видно, что описанный выше синтез позволяет создать коллоидный раствор, содержащий частицы селена от 60 до 100 нм.
Одновременно была проведена электронная микроскопия полученного нами препарата. Исследования проводили на электронном микроскопе LIBRA 120 (Carl Zeiss, Германия) с приставкой для элементного анализа (спектрометр с омега фильтром) с возможностью записи спектра энергетических потерь электронов для идентификации селена (рисунок 2 б).
  а |   б |
Рисунок 2 – (а) - электронная микроскопия наночастицы селена, (б) - электронная микроскопия наноплатформы с приставкой для элементного анализа
На рисунке 2 б наблюдается красноватое свечение, что свидетельствует о наличии в составе препарата селена.
Предварительное изучение биодоступности разработанного нами иммуномодулятора «Иммуно-Safe» с биологическими объектами проводили на клетках линии HeLa. Данные по взаимодействию частиц с клетками приведены на рисунке 3.
 а |  б |
Рисунок 3 –- Микроскопия образцов в проходящем (а) и отраженном свете (б).
На всех фотографиях отражено оранжевое свечение, что является включением селена в клетках.
Для подтверждения способности наноплатформы доставлять биоактивные вещества во внутриклеточное пространство, проводили исследование на клеточной линии HeLa. Для обнаружения комплекса кислотоустойчивых белков сыворотки молока (КБСМ) во внутриклеточном пространстве проводили мечение данного комплекса белков флуоресцинизоцианатом (рисунок 4,5).
Рисунок 4 – Конфокальная микроскопия клеток линии HeLa,
культивированных в присутствии наноплатформы, несущей КБСМ, меченных ФИТЦ (интенсивное зеленое свечение)
Рисунок 5 - Конфокальная микроскопия клеток линии HeLa, культивированных в присутствии КБСМ, меченных ФИТЦ без наноплатформы (слабое зеленое свечение)
На рисунке 4 отмечается интенсивное зеленое свечение, что свидетельствует о свободном проникновении во внутриклеточное пространство нанокомплекса - КБСМ (меченного ФИТЦ), конъюгированного с наночастицами селена. Напротив, на рисунке 5 наблюдается едва заметное слабое зеленое свечение, указывающее лишь на частичное проникновение КБСМ, меченных ФИТЦ во внутриклеточное пространство.
Таким образом, белки сыворотки молока, конъюгированные с коллоидным селеном свободно проникают во внутриклеточное пространство. Отдельно же (без наноплатформы) данные белки практически не проникают во внутриклеточное пространство.
Установив, что наноплатформа свободно проникает во внутриклеточное пространство, мы изучили её влияние на метаболические (окислительно-восстановительные) процессы клеток. Учитывая, что в высоких концентрациях селен обладает токсическим действием, одной из задач данного исследования являлось установление оптимальной (безопасной) концентрации селена в составе нанокомпозита, обладающей наиболее высоким терапевтическим эффектом.
Изучение биологической активности иммуномодулятора «Иммуно-Safe»
Установив, что иммуномодулятор «Иммуно-Safe» проникает через клеточную мембрану, мы провели изучение биологической активности данного препарата. Исследования проводились на клеточной линии SPEV-2.
Из данных рисунке 6 следует, что культивирование клеток в присутствии иммуномодулятора «Иммуно-Safe», приводит к повышению дыхательной активности почти в 4 раза. Что свидетельствует о способности препарата активировать окислительные процессы клеточного метаболизма.
Рисунок 6 – Изменение дыхательной активности в клеточной популяции при культивировании их в присутствии иммуномодулятора «Иммуно-Safe» (р<=0,05)
Изучение иммунотоксичности препарата «Иммуно-Safe» проводили на клеточной линии HeLa. Нами были получены следующие результаты: на рисунке 7 отражена выявленная нами зависимость угнетения роста клеток от концентрации селена в культуральной жидкости.
Рисунок 7 – Зависимость угнетения роста клеток HeLa инкубированных с препаратом «Иммуно-Safe» от концентрации селена
Можно отметить, что концентрация селена 10 мкг/мл не только не вызывает угнетения роста клеток, но и вызывает стимуляцию клеточного дыхания на 28%.
В дальнейшей работе, выполняя титрование селена, от концентрации 10 мкг/мл до 1 мкг/мл, мы установили, что концентрация 2,5 мкг/мл также вызывала стимулирование дыхания клеток линии HeLa от 28 до 30%. Таким образом, оптимальной (терапевтической) концентрацией селена можно считать содержание селена в коллоидном растворе от 10 мкг/мл до 2,5 мкг/мл.
Отметив стимуляцию клеточного дыхания у клеток линии HeLa, было проведено исследование по изучению влияния препарата «Иммуно-Safe» на стимуляцию клеток селезенки крыс в сравнении с селенитом натрия и фитогемагглютинином. Установлено, что препарат вызывал стимуляцию пролиферативной активности лимфоидных клеток на 91%, селенит натрия на 9%, а фитогемагглютинин на 26% по сравнению с контролем.
Изучение биодинамических параметров иммуномодулятора «Иммуно-Safe»
При изучении распределения иммуномодулятора «Иммуно-Safe» в органах лабораторных животных (3 группы белых мышей по 9 голов в каждой) были получены следующие результаты.
Динамика распределения препарата «Иммуно-Safe» в периферической крови: при оральном введении комплекса коллоидного селена с КБСМ (препарата «Иммуно-Safe»), меченного ФИТЦ через 2 и 6 часов препарат в крови отсутствовал, а через 24 часа после введения отмечается зеленое свечение флуоресцинизоцианата в межклеточном пространстве, которое свидетельствует о наличии комплекса коллоидного селена с КБСМ в крови.
При внутрибрюшинном введении, препарат в периферической крови отмечается уже через 2 часа и сохраняется до 6 часов.
При внутримышечном введении препарата «Иммуно-Safe», меченного ФИТЦ, также как и при внутрибрюшинном отмечается свечение флуоресцеинизоцианата в крови через 2 и 6 часов. Через 24 часа наблюдается полное выведение препарата из крови.
Динамика распределения препарата «Иммуно-Safe» в костном мозге: при оральном введении препарата «Иммуно-Safe», меченного ФИТЦ, отмечается довольно интенсивная флюоресценция в костном мозге через 6 часов после введения, а через 24 часа препарат полностью элиминирует из костного мозга.
При внутрибрюшинном введении препарата флюоресценция в костном мозге отмечается уже через 2 часа после введения и сохраняется до 6 часов.
Аналогичная ситуация просматривается в костном мозге и при внутримышечном введении препарата «Иммуно-Safe». Через 24 часа флюоресценция полностью отсутствует.
Динамика распределения препарата «Иммуно-Safe» в печени: при оральном введении препарата его накопление в печени отмечается через 6 часов, а через 24 часа препарат полностью выводится из печени.
При внутрибрюшинном введении препарат поступает в печень через 6 часов и полностью выводится через 24 часа.
Вместе с этим, при внутримышечном введении препарат также поступает в паренхиму печени через 6 часов, но сохраняется в ней более чем 24 часа с момента введения.
Динамика распределения препарата «Иммуно-Safe» в почках: при оральном введении препарата было установлено, что он достигает почечной ткани через 24 часа после введения, о чем свидетельствует довольно интенсивная флюоресценция в мазке отпечатке паренхимы почки мыши.
При внутрибрюшинном введении препарата флюоресценция в почечной ткани отмечается уже через 2 часа и исчезает через 6.
Аналогичные процессы происходят и при внутримышечном введении препарата «Иммуно-Safe»: через 2 часа наблюдается флюоресценция в мазке отпечатке паренхимы почки мыши, которая исчезает через 6 часов и не просматривается через 24 часа.
Динамика распределения препарата «Иммуно-Safe» в селезенке: при оральном введении препарата «Иммуно-Safe» через 2 часа наблюдается его постепенное свечение в селезенке и сохраняется в течение 24 часов. Свечение имеет строго очерченные границы и форму, что дает основание предполагать локализацию препарата внутри клеточных структур. Аналогичные данные получены при внутрибрюшинном введении препарата.
Вместе с этим, при внутримышечном введении пик флюоресценции наблюдался через 2 часа и длился до 6 часов, а через 24 часа наблюдалось полное выведение препарата, что свидетельствует о тропизме препарата к иммунокомпетентным органам и подтверждает возможность его применения в качестве иммуномодулирующего средства.
Фармако-токсикологические свойства иммуномодулятора
«Иммуно-Safe»
Изучения аллергенной и местно-раздражающей реакции иммуномодулятора «Иммуно-Safe» проводили на 6 кроликах при помощи метода кожной пробы, метода внутрикожной пробы и метода глазной пробы. По итогам исследования было установлено, что исследуемый препарат не обладает местно-раздражающим действием.
Изучение острой токсичности иммуномодулятора «Иммуно-Safe» проводили на 4 группах белых нелинейных мышей по 6 голов в каждой. Количество введённого препарата «Иммуно-Safe» составило: 0,5; 1; 2,5 и 5 мл. Препарат вводился однократно, внутрибрюшинно. При наблюдении за животными в течение 7 суток было отмечено, что препарат не вызвал гибели ни одного животного. Полученные данные позволяют сделать вывод, что препарат «Иммуно-Safe» при внутрибрюшинном введении не обладает токсическим действием.
Изучение хронической токсичности иммуномодулятора «Иммуно-Safe» проводили на 3 группах белых нелинейных мышей по 6 голов в каждой. Животным 1 и 2 группы ежедневно в течение 30 дней внутримышечно вводили препарат в следующих дозах 500 и 250 мг/кг по действующему веществу. Животным контрольной группы, при тех же условиях содержания и кормления, вводили равный объем раствора вспомогательных веществ, входящих в состав препарата без активного вещества из расчета 0,8 мл/кг.
В течение всего опыта вели наблюдение за состоянием и поведением животных, динамикой роста массы тела, регулярно проводили исследования по оценке функционального состояния печени, почек и изучали влияние препарата на гематологические показатели. Статистическую обработку полученных данных проводили по Стьюденту-Фишеру.
На протяжении всего опыта гибели животных не было, признаков интоксикации у мышей не отмечалось. Все животные как опытной, так и контрольной группы были активными, реакция на внешние раздражители сохранена.
Анализ биохимических показателей крови животных опытных и контрольной групп при длительном введении препарата «Иммуно-Safe» не выявил статистически значимых отличий. Эти данные косвенно свидетельствуют об отсутствии нарушений в функциональном состоянии почек и печени.
Влияние препарата на периферическую кровь лабораторных животных оценивали по морфологическому составу клеток и уровню гемоглобина. Как показали наши результаты, хроническое введение иммуномодулятора «Иммуно-Safe» не вызывало видимых отличий гематологических показателей в сравнении с контролем. При патоморфологическом исследовании внутренних органов мышей, получавших препарат, не отмечали каких-либо изменений.
Таким образом, полученные результаты свидетельствуют об отсутствии у препарата в указанных дозах эффекта кумуляции по токсическому признаку.
Клинико-морфологическое обоснование терапевтической эффективности
иммуномодулятора «Иммуно-Safe»
Исследование проводили на 3 группах животных (кроликов породы «Белый великан») по 5 голов в каждой. Возраст кроликов составлял 6 мес, живая масса 3,5-4 кг. Животным 1-й опытной группы внутримышечно ежедневно в течение 10 дней вводили препарат «Иммуно-Safe» в дозе 250 мг/кг по действующему веществу или 0,4 мл/кг. Животным 2-й опытной группы - 500 мг/кг по действующему веществу или 0,8 мл/кг. Животным 3-й (контрольной) группы, при тех же условиях содержания и кормления, вводили равный объем физиологического раствора из расчета 0,8 мл/кг.
Наблюдение за клиническим состоянием животных вели на протяжении 20 суток от начала опыта. Кровь брали до введения препарата, а так же через 3, 5, 10 и 20 дней после введения препарата, при этом проводили клиническое исследование крови (количество эритроцитов, лейкоцитов, гемоглобина, выводили лейкоцитарную формулу). В эти же сроки оценивали функциональное состояние печени по изменению активности гепатоспецифических ферментов (холинэстеразы, аспартатаминотрансферазы, аланинаминотрансферазы) и определяли содержание билирубина в крови.
Введение препарата «Иммуно-Safe» в дозе 250 мг/кг и 500 мг/кг по действующему веществу в течение 10 дней не вызывало видимых клинических изменений в организме животных. Кролики активно двигались, хорошо и полностью поедали корм, адекватно реагировали на внешние раздражители.
Влияние иммуномодулятора «Иммуно-Safe» на клеточный и неспецифический факторы иммунитета животных
В таблице 2 приведены данные по изменению показателей иммунного статуса животных после проведения лечебных мероприятий в 1 и 2 опытных группах по сравнению с контролем.
Из полученных данных видно, что субпопуляции лимфоцитов в процентном отношении находятся в пределах нормы, однако иммунорегуляторный индекс во всех группах находился ниже нормы и составлял 0,94±0,2, 1,3±0,2 и 0,93±0,2 соответственно. Что указывает на преобладание в организме механизмов иммуносупресии.
По мере проведения введения иммуномодулятора «Иммуно-Safe», у подопытных животных 1 опытной группы отмечалась постепенное повышения иммунорегуляторного индекса до 1,8±0,3 (за счет увеличения Т-хелперного звена иммунитета на 33%), а у животных 2 опытной группы повышения иммунорегуляторного индекса до 2±0,4 (за счет увеличения Т-хелперного звена иммунитета на 37%).
Таблица 2 - Показатели иммунного статуса животных до введения и на 10 день после введения препарата «Иммуно-Safe»
| № группы | Данные исследования | Иммунологические показатели | ||||
| Т-лимфоциты общие (Е-РОК), % | Т-хелперы, (CD4+), % | Т-супрессоры, (CD8+), % | иммуно-регуляторный индекс (CD4+/ CD8+) | В-лимфоциты (М-РОК), % | ||
| 1 группа | до введения препарата | 61,8±7,07 | 30±3,6 | 31,8±5,4 | 0,94±0,2 | 38,2±5,4 |
| на 10 день введения | 70±7,5 | 45±4,6 | 25±7,8 | 1,8±0,3 | 30±6,5 | |
| 2 группа | до введения препарата | 50±7,07 | 29±3,6 | 21±5,4 | 1,3±0,2 | 50±5,4 |
| на 10 день введения | 65±7,5 | 40±4,6 | 20±7,8 | 2±0,4 | 35±6,5 | |
| Контроль | до введения NaCl | 55,8±7,07 | 27±3,6 | 28,8±5,4 | 0,93±0,2 | 44,2±5,4 |
| на 10 день введения NaCl | 57±7,5 | 30±4,6 | 27±7,8 | 1,1±0,3 | 43±6,5 | |
Примечание - иммунорегуляторный индекс - норма 1,4-2,0.
В контрольной группе нами не наблюдалось существенных изменений со стороны иммунного статуса животных, в частности повышения иммунорегуляторного индекса не выявлено.
Таким образом, в результате проведенных исследований было установлено, что 10-ти дневное введение иммуномодулятора «Иммуно-Safe» в терапевтической и двух кратной терапевтической дозе не оказывает негативного воздействия на иммунный статус животных. Напротив, в опытных группах наблюдалось достоверное повышение иммунорегуляторного индекса за счет увеличения Т-хелперного звена иммунитета, что свидетельствует об эффективности иммуномодулятора «Иммуно-Safe».
Влияние иммуномодулятора «Иммуно-Safe» на гематологические
и биохимические показатели
В результате проведенных исследований установлено, что при введении иммуномодулятора «Иммуно-Safe» картина крови у кроликов обеих опытных групп практически не изменяется и находится в пределах физиологической нормы. В таблице 3 представлены гематологические показатели опытных и контрольной групп кроликов в динамике.
Таблица 3 - Усреднённые данные общего анализа крови опытных и
контрольной групп кроликов
| № п/п | Показатель | Ед. изм | 1 опытная группа | 2 опытная группа | Контрольная группа | Норма |
| 1 | RBC | х1012/L | 5,67±0,6 | 6,03±0,98 | 6,37±0,68 | 5-8 |
| 2 | MCV | Fl | 65±3,2 | 61±2,8 | 59±2,4 | 58-67 |
| 3 | HCT | % | 36,6±1,86 | 36,8±1,42 | 37±2,08 | 33-50 |
| 4 | WBC | х109/L | 12,2±0,23 | 10,0±0,68 | 11,2±0,45 | 5-12,5 |
| 5 | HGB | g/l | 137±7,89 | 139±6,98 | 134±5,42 | 100-170 |
| 6 | MCH | Pg | 24,2±0,98 | 23,1±1,02 | 21,4±1,08 | 17-24 |
| 7 | MCHC | g/l | 37,4±2,02 | 37,8±1,98 | 36,2±1,64 | 29-37 |
Так же было установлено, что 10-ти дневное введение иммуномодулятора «Иммуно-Safe» в терапевтической и двукратной терапевтической дозе не вызывает негативных функциональных изменений в организме кроликов, о чём свидетельствуют данные биохимических показателей крови опытных и контрольной групп кроликов в динамике (таблица 4).
Таблица 4 - Биохимические показатели крови опытных и контрольной групп кроликов в динамике
| Показатели, ед. изм. | Интервалы исследования | ||||||||
| до введения | через 3 дня | через 10 дней | |||||||
| 1 | 2 | К | 1 | 2 | К | 1 | 2 | К | |
| АЛТ, Е/л | 57 ±2,3 | 58 ±3,04 | 57 ±3,2 | 58 ±2,8 | 80 ±4,6 | 58 ±3,8 | 70 ±2,4 | 38 ±2,1 | 70 ±2,2 |
| АСТ, Е/л | 32 ±2,1 | 31 ±1,8 | 32 ±2,3 | 22 ±1,6 | 26 ±1,7 | 22 ±1,9 | 37 ±2,0 | 19 ±1,2 | 37 ±1,6 |
| щел. ф-за, Е/л | 75 ±4,3 | 151 ±6,7 | 75 ±3,8 | 103 ±6,8 | 146 ±7,2 | 103 ±5,8 | 125 ±3,9 | 109 ±7,1 | 125 ±4,2 |
| -амилаза, Е/л | 662 ±12,8 | 665 ±23,8 | 662 ±21,4 | 534 ±18,4 | 730 ±23,6 | 534 ±24,7 | 885 ±98,6 | 453 ±16,9 | 885 ±87,2 |
| глюкоза, ммоль/л | 7,14 ±0,98 | 8,02 ±1,02 | 7,14 ±1,1 | 8,74 ±1,09 | 7,69 ±1,2 | 8,34 ±0,89 | 5,39 ±1,2 | 8,09 ±1,3 | 5,39 ±1,08 |
| триглицериды, ммоль/л | 1,2 ±0,23 | 1,1 ±0,08 | 1,2 ±0,1 | 1,01 ±0,04 | 1,06 ±0,08 | 1,11 ±0,06 | 1,17 ±0,06 | 1,11 ±0,1 | 1,17 ±0,05 |
| белок общий, г/л | 82,4 ±3,4 | 68,1 ±4,8 | 81,4 ±3,8 | 79,8 ±4,6 | 75,9 ±6,1 | 69,9 ±2,4 | 75 ±3,6 | 82,2 ±6,1 | 75 ±2,9 |
| альбумин, г/л | 36,7 ±1,8 | 33,3 ±2,6 | 36,7 ±3,2 | 42,6 ±2,8 | 36,8 ±3,4 | 42,6 ±2.6 | 31,1 ±2,8 | 34,9 ±1,98 | 31,1 ±2,06 |
| глобулин, г/л | 45,7 ±2,4 | 34,8 ±2,3 | 44,7 ±2,8 | 37,2 ±2,6 | 39,1 ±2,9 | 27,3 ±3,1 | 43,9 ±1,8 | 47,3 ±2,1 | 43,9 ±2,8 |
| АСТ/АЛТ | 0,56 ±0,2 | 0,53 ±0,1 | 0,56 ±0,3 | 0,38 ±0,2 | 0,33 ±0,2 | 0,38 ±0,1 | 0,53 ±0,1 | 0,5 ±0,2 | 0,53 ±0,2 |
| А/Г | 0,8 | 1,0 | 0,8 | 1,1 | 0,9 | 1,6 | 0,7 | 0,7 | 0,7 |
| холестерин, ммоль/л | 1 ±0,01 | 0 | 1 ±0,02 | 1 ±0,01 | 1 ±0,01 | 1 ±0,02 | 1 ±0,01 | 0 ±0,01 | 1 ±0,01 |
Влияние иммуномодулятора «Иммуно-Safe» на состояние
морфологических структур внутренних органов животных
Кроликов выводили из эксперимента на 20 сутки. Для морфологического исследования брали печень, селезёнку и почки. Как показали наши результаты, применение иммуномодулятора «Иммуно-Safe» не вызывало видимых отличий морфологических структур внутренних органов животных в сравнении с контролем. При патоморфологическом исследовании внутренних органов кроликов, получавших препарат, не отмечали каких-либо патологических изменений. Таким образом, полученные результаты свидетельствуют об отсутствии у препарата в указанных дозах негативного действия на внутренние органы.
ВЫВОДЫ
- Разработана технология синтеза позволяющая создавать коллоидный раствор, содержащий частицы селена размером от 60 до 100 нм, несущих на своей поверхности кислотоустойчивые белки сыворотки молока.
- Установлено, что полученная субстанция комплекса кислотоустойчивых белков сыворотки молока (лактоферрин, лактоальбумин, лактоглобулин) оказывает стимулирующее действие на неспецифические факторы иммунитета, что выражается в повышении активности фагоцитоза и усилении митохондриального дыхания перитонеальных макрофагов.
- Доказано свойство коллоидных частиц селена проникать во внутриклеточное пространство и свободно переносить конъюгированные на их поверхности биологически активные вещества.
- Установлено, что препарат «Иммуно-Safe» обладает тропизмом к иммунокомпетентным органам, в частности к селезенке, что указывает на лимфогенный путь распространения препарата по организму.
- Определён класс опасности препарата «Иммуно-Safe»: IV класс опасности - малоопасные вещества (ГОСТ 12.1.007-76).
- Изучено стимулирующее влияние на клеточный и неспецифический факторы иммунитета животных препарата «Иммуно-Safe».
- Повышение пролиферативной активности клеток селезенки крысы указывает на возможность использования наночастиц коллоидного селена в качестве носителя для конструирования вакцинных препаратов.
ПРАКТИЧЕСКИЕ ПРЕДЛОЖЕНИЯ
1. Коллоидный селен, выполняющий функцию наноразмерного носителя, является перспективным материалом для разработки новых лекарственных средств, а так же для наномодификации уже имеющихся лекарственных препаратов.
2. Учитывая тропизм к иммунокомпетентным органам, представляется возможным создание при помощи наноразмерного неорганического селена химических вакцин.
3. Результаты исследований, изложенные в диссертации, рекомендуются для использования в учебном процессе на ветеринарных, зооинженерных и биологических факультетах, при написании учебных пособий и монографий, а также при проведении научно-исследовательских работ по изучению биологически активных веществ и их влияния на организм животных. Результаты исследований могут быть включены в программу повышения квалификации зооветеринарных специалистов.
СПИСОК РАБОТ, ОПУБЛИКОВАННЫХ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ
1. Изучение биологических свойств наноразмерной структуры на основе коллоидного селена in vitro / А.Ю. Исаева, С. А. Староверов, А.А. Волков [и др.] // Ветеринарная патология. 2012. № 3 (41). С.111-114.
2. Конструирование наноразмерной структуры на основе коллоидного селена / А.Ю. Исаева, С. А. Староверов, А.А. Волков [и др.] // Ветеринарная патология. 2012. № 3 (41). С. 114-117.
3. Уточнение некоторых биодинамических параметров комплекса коллоидного селена конъюгированного с лактоферрином in vitro / А.Ю. Исаева, С.А. Староверов, С.В. Волков [и др.] // Ученые записки Витебской Академии ветеринарной медицины. 2012. Т. 48, Вып. 2. Часть II (июль-декабрь). С.222-225.
4. Изучение возможности использования коллоидного селена в качестве наноразмерного средства внутриклеточной доставки / А.Ю. Исаева, С.А. Староверов, А.А. Волков [и др.] // «Ученые записки Витебской Академии ветеринарной медицины». 2012. Т. 48, Вып. 2. Часть II (июль-декабрь). С.225-227.
5. Уточнение биологической активности пептидных фрагментов лактоферрина / А.Ю. Исаева, С. А. Староверов, С.В. Язынин [и др.] // Доклады академии военных наук. 2012. №2 (55). С. 181-183.
6. Изучение влияния протеолитических производных лактоферрина на выживаемость стафилококка в присутствии перитонеальных клеток/ А.Ю. Исаева, С. А. Староверов, В.Г. Мандыч [и др.] // Доклады академии военных наук. 2012. №2 (55). С. 183-184.
7. Изучение местно-раздражающего действия и острой токсичности комплекса лактоферрина с коллоидным нано-селеном / А.Ю. Исаева, С. А. Староверов, А.А. Волков [и др.] // Доклады академии военных наук. 2012. №2 (55).С.184-186.
8. Конструирование конъюгатов коллоидного селена и коллоидного золота с белком вируса гриппа и изучение их иммуногенных свойств / П.В. Меженный, С.А. Староверов, А.А. Волков, С.В. Козлов, В.Н. Ласкавый, Л.А. Дыкман, А.Ю. Исаева // Вестник Саратовского госагроуниверситета им. Н.И. Вавилова. 2013. № 2. С.15 -17.
