Эколого-биологические особенности сибирских штаммов fusarium, расп р остраненных на зерне пшен и цы
На правах рукописи
САВИЦКАЯ АННА ГЕННАДЬЕВНА
Эколого-биологические особенности
сибирских штаммов Fusarium,
распространенных на зерне пшеницы
03.02.08 экология (биология)
Автореферат
диссертации на соискание ученой степени
кандидата биологических наук
Тюмень 2013
Работа выполнена в Сибирском государственном технологическом университете на кафедре Химической технологии древесины и биотехнологии
| Научный руководитель: | кандидат биологических наук, доцент, Литовка Юлия Александровна |
| Официальные оппоненты: | Петухова Галина Александровна, доктор биологических наук, профессор Тюменского государственного университета Прудникова Светлана Владиславна, кандидат биологических наук, доцент Сибирского федерального университета |
| Ведущая организация: | Новосибирский государственный аграрный университет |
Защита состоится «26» марта 2013 г. в 1000 часов на заседании диссертационного совета Д 220.064.02 в Тюменской государственной сельскохозяйственной академии по адресу:
625003, г. Тюмень, ул. Республики, 7
Тел./факс: (3452) 46-87-77, E-mail: [email protected]
С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Тюменской государственной сельскохозяйственной академии
Автореферат разослан «22» февраля 2013 г.
| Ученый секретарь диссертационного совета, кандидат с.-х. наук | ____________________ | Литвиненко Наталья Владимировна |
ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ
Актуальность исследования. Грибы рода Fusarium широко распространены в природе, большинство из них являются факультативными паразитами, ведущими сапрофитный образ жизни, переходящих к различной степени паразитизма при определённых условиях. Действие видов рода Fusarium на растения определяется совокупностью их патогенных свойств, которые значительно варьируют у различных видов и популяций внутри вида в силу высокого уровня природного полиморфизма, обусловленного генетической изменчивостью и наличием различных типов вегетативной совместимости, приводящей к клональной структуре популяций. Наличие внутривидового полиморфизма у фитопатогенных грибов и почвенно-климатические условия региона способствуют отбору экологически пластичных и высоко патогенных популяций, которые занимают доминирующее положение в структуре фитопатогенного комплекса и вытесняют виды рода Fusarium, обладающих случайной или низкой степенью встречаемости и слабо выраженными патогенными свойствами. Изучение внутривидовой изменчивости дает возможность оценить инфекционный фон наиболее стабильных токсигенных видов, прогнозировать возможные эпифитотии фузариоза и проводить направленный отбор эффективных фунгицидов.
Фитопатогенные штаммы рода Fusarium представляют практический интерес для современной биотехнологии как продуценты биологически активных веществ селективных факторов отбора устойчивых сортов в клеточной селекции зерновых и конструирования высокоспецифичных маркеров для их обнаружения, а также служат тест-объектами для создания биологических средств защиты растений. Таким образом, всестороннее исследование этой группы грибов в условиях конкретного почвенно-климатического региона является актуальным как с теоретической, так и практической точки зрения.
Цель исследования: изучение эколого-биологических особенностей сибирских штаммов Fusarium, распространенных на зерне районированных сортов пшеницы.
Задачи исследования:
- Изучить видовой состав и частоту встречаемости грибов рода Fusarium на семенах пшеницы.
- Оценить фитопатогенные свойства видов рода Fusarium и гетерогенность их популяций по этому признаку.
- Изучить внутривидовую изменчивость сибирских штаммов рода Fusarium и их вегетативную совместимость.
- Охарактеризовать чувствительность видов рода Fusarium к биологическим фунгицидам в лабораторных и полевых условиях.
- Определить возможность использования фитотоксичных штаммов рода Fusarium для отбора устойчивых сортов в клеточной селекции зерновых и конструирования видоспецифичных маркеров.
Основные защищаемые положения:
- Вид Fusarium sporotrichioides является наиболее типичным представителем рода Fusarium в зерне пшеницы, районированных для Сибири сортов.
- Популяционная структура видов Fusarium sporotrichioides и Fusarium oxysporum представляет собой мозаику клонов с различными типами вегетативной совместимости, морфолого-культуральными особенностями, фитопатогенными свойствами и восприимчивости к действию биологических фунгицидов.
- Живые культуры или биологические активные вещества отдельных штаммов рода Fusarium могут быть использованы в практических целях, для отбора устойчивых сортов в клеточной селекции зерновых и конструирования видоспецифичных маркеров для обнаружения чувствительных клеток-мишеней.
Научная новизна. Впервые был изучен видовой состав и определена частота встречаемости видов рода Fusarium на зерне пшеницы районированных для Сибири сортов. Исследованы внутривидовые особенности видов Fusarium sporotrichioides и Fusarium oxysporum по совокупности морфолого-культуральных свойств, фитопатогенности, вегетативным реакциям и резистентности к биологическим фунгицидам, исследованы взаимоотношения фитопатогенных штаммов с растениями и почвенной микрофлорой. Впервые сибирские штаммы рода Fusarium и бактерий Salmonella были использованы в качестве объектов селекции высокоспецифичных олигонуклеотидов для создания видоспецифичных маркеров.
Практическая значимость. Составлен перечень видов грибов рода Fusarium, распространенных на сортах пшеницы, рекомендованных для выращивания в условиях Сибири; выявлен вид, представляющий потенциальную опасность для развития заболеваний в благоприятных условиях. Установлен диапазон чувствительности видов Fusarium sporotrichioides и Fusarium oxysporum к действию метаболитов микроорганизмов-антагонистов. Подобраны концентрации метаболитов штамма Fusarium sporotrichioides для получения устойчивых к ним каллусных культур пшеницы. Подобраны условия для проведения селекции аптамеров к клеткам Fusarium oxysporum и Salmonella для создания видоспецифичных маркеров.
Апробация работы. Результаты исследования были представлены на конференциях различного уровня: Международной конференции «Современные разработки методов диагностики заболеваний человека» (Оттава, Канада, 2011); 4-й Канадской химической конференции-выставке «Химия и здоровье» (Монреаль, Канада, 2011); Международной научной конференции «Фитосанитарная безопасность экосистем» (Новосибирск, 2010); Конференции молодых ученых и студентов с международным участием «Молекулярно-генетические методы диагностики инфекционных заболеваний» (Красноярск, 2011); ХIV Международной конференции «Аграрная наука сельскохозяйственному производству Сибири, Монголии и Казахстана» (Красноярск, 2011); Всероссийской конференции «Химико-лесной комплекс – проблемы и решения» (Красноярск, 2009-2010); Международной конференции «13th Tetrahedron Symposium Asia Edition» (Тайпей, Тайвань, 2012). Научно-практическом семинаре «Молекулярно-генетические методы исследования на современном этапе» (Красноярск, 2011), а также на расширенном семинаре кафедры химической технологии и биотехнологии Сибирского государственного технологического университета (Красноярск, 2012).
Работа выполнена при поддержке гранта Президента Российской Федерации для обучения и прохождения научной стажировки в зарубежных высших учебных заведениях и научных центрах на 2010/2011 учебный год по приоритетным направлениям развития науки, технологии и техники в Российской Федерации; при финансовой поддержке РФФИ «Красноярский краевой фонд поддержки научной деятельности».
Публикации. По результатам исследований опубликовано 14 работ, в том числе 5 статей в журналах, рекомендованных ВАК РФ.
Объем и структура диссертации. Диссертационная работа состоит из введения, семи глав, заключения, библиографического списка из 148 наименований, из которых 78 на иностранном языке. Объем работы составляет 184 страницы машинописного текста, включая 82 иллюстрации и 16 таблиц. Приложение состоит из 52 таблиц, 10 рисунков.
Место проведения работы. Основная часть работы выполнена на кафедре химической технологии древесины и биотехнологии Сибирского государственного технологического университета; исследования по созданию аптамеров и оценке вегетативных реакций выполнены на кафедре химии Университета г. Оттава (Канада); эксперименты по клеточной селекции зерновых на базе Красноярского НИИСХ Россельхозакадемии; селекция аптамеров к бактериям Salmonella на базе НИИ молекулярной медицины и патобиохимии КрасГМУ им. проф. В.Ф. Войно-Ясенецкого Минздравсоцразвития.
Личный вклад автора. Основная работа по получению материала, обобщению результатов и формулированию выводов выполнена автором лично. Автор выражает глубокую благодарность своему научному руководителю Ю.А. Литовке и консультанту Т.В. Рязановой; сотрудникам лаборатории оценки селекционного материала Красноярского НИИСХ Н.В. Зобовой, С.Ю. Луговцовой, Н.А. Нешумаевой, В.Ю. Ступко, Т.В. Осиповой, А.В. Сидорову; сотрудникам кафедры химии Университета г. Оттава М. Berezovsky, D. Mucharemagic, A. Chechik, сотрудникам НИИ молекулярной медицины и патобиохимии КрасГМУ им. проф. В.Ф. Войно-Ясенецкого Минздравсоцразвития А.С. Замай, О.С. Коловской.
СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ
Введение
Обоснована актуальность темы диссертации, сформулирована цель и задачи исследования, приведена общая характеристика работы.
- Обзор литературы
В первой главе диссертации рассмотрены история и современное состояние таксономии грибов рода Fusarium; классические и современные методы идентификации; представлены особенности генетического аппарата, обзор баз данных сиквенсов Fusarium sp. и перспективные способы определения грибов с помощью специфичных маркеров-аптамеров; изложены эколого-биологические особенности данной группы грибов и генетические аспекты образования вегетативно совместимых (несовместимых) групп; рассмотрен видовой состав, ареал возбудителей фузариоза злаковых культур и вызываемые ими заболевания.
- Материалы и методы исследований
Объектом исследования служили 117 штаммов грибов рода Fusarium, выделенных из семян пшеницы районированных для Сибири сортов и селекционных линий (всего 18 наименований), а также микроорганизмы-антагонисты: штамм 19/97-М Streptomyces lateritius (ВКПМ Ас-1637, 2002), МГ 99/9 Trichoderma asperellum и МГ 99/1 Trichoderma harzianum, характеризующиеся высокой антагонистической активностью в отношении грибов рода Fusarium, выделенных из ризосферы и сеянцев хвойных растений в ранее проведенных исследованиях (Громовых Т.И., Литовка Ю.А., Садыкова В.С., 2005). Выделение грибов проводили из семян пшеницы, ризосферы и почвы Мининского опытно-производственного хозяйства согласно общепринятым методам на селективные питательные среды (Нетрусов А.И., 2005; Nelson P.E., 1983). Видовую принадлежность моноспоровых культур определяли по таксономической системе П. Нельсона, корректируя современные изменения таксономии по руководству Лесли (Leslie J.F., 2006). Видовую принадлежность F.sporotrichioides подтверждали молекулярно-генетическим методами.
Фитотоксичность метаболитов оценивали путем их биотестирования на семенах, проростках и вегетирующих растениях (Билай В.И., 1982). Фитопатогенные свойства оценивали по модифицированной методике Челковского-Манки (Гагкаева Т.Ю., 2009). Вегетативные реакции изучали путем сращивания nit мутантов, полученных на средах с различными источниками азота (Leslie J.F., 2006; Дьяков Ю.Т., 1995). Индукцию каллусов незрелых зародышей пшеницы осуществляли на среде введения (2,4Д – 1мг/л, ИУК – 2 мг/л), пролиферацию каллусных культур – на среде Мурасиге-Скуга с различной концентрацией метаболитов грибов рода Fusarium (Шахмеятов И.Ф., 2001). Чувствительность Fusarium к метаболитам микроорганизмов-антагонистов изучали с использованием методов перпендикулярных штрихов, агаровых блочков и лунок (Егоров Н.С., 2004). Гиперпаразитизм и микопаразитизм определяли методами перпендикулярных высевов и культивированием на часовых стеклах (Алимова Ф.К., 2006) Подбор аптамеров к клеткам штамма гриба рода Fusarium и бактериям Salmonella осуществляли на основе методики Cell-SELEX (Berezovsky M., 2008).
Полевые испытания биопрепаратов «латерин» и «триходермин» проводили в селекционных севооборотах Красноярского НИИСХ на территории Емельяновского района Красноярского края (56010c.ш., 92042в.д.). Биопрепарат «латерин» получали путем глубинного культивирования штамма 19/97-М Streptomyces lateritius, предпосевную обработку семян осуществляли погружением семян в культуральную жидкость в течение 24 часов. Препарат «триходермин» получали твердофазным культивированием штамма MГ 99/9 Trichoderma asperellum на измельченном растительном субстрате в течение 7 суток; препарат вносили в почву вместе с семенным материалом (Кобылянский В.Д., 1981). Статистическую обработку данных осуществляли с помощью программ MS Excel, Snedecor, STATISTICA 6.0; результаты считали статистически достоверными при p<0,05.
- Оценка фитосанитарного состояния зерна сортов пшеницы, рекомендованных для возделывания в условиях Сибири
 |
| Рисунок 1 – Лабораторная всхожесть и уровень зараженности семян пшеницы исследуемых сортов |
Исследование микофлоры семян 18 районированных для Сибири сортов и селекционных линий пшеницы показало, что все партии семенного материала были контаминированы смешанной внутрисеменной инфекцией в пределах 23-70%, максимальный уровень зараженности отмечен на сорте «Омский корунд» (70%), минимальный – у сортов «Ветлужанка», «Чагытай» и «Геракл» (23-25%) (рис. 1). В начальный период наблюдения на зерновках активнее развивались представители темноокрашенных грибов из родов Bipolaris, Alternaria, реже, Aspergillus, суммарная доля которых в большинстве случаев превысила 50%, позднее грибы рода Fusаrium, процентное содержание которых составило 13-47% от общего количества микроорганизмов, у 53% изученных сортов инфицированность семян Fusarium составила более 10%, а у 40% зараженных проростков были отмечены симптомы гниения корневой системы. Максимальная представленность грибов рода Fusarium отмечена на семенах пшеницы сортов «Юната» (47%), «ОмГАУ» (44%) и «Минуса» (40%) (рис. 2).
Рисунок 2 – Процентное соотношение представителей микрофлоры семян некоторых исследуемых сортов пшеницы
Всего из семенного материала было выделено 117 чистых культур грибов рода Fusarium, идентификация которых позволила их отнести к 8 видам из 5 секций. Представители рода обнаружены на всех изучаемых сортах; максимально представлен в исследуемом материале вид Fusarium sporotrichioides (36,8%), вторым по частоте встречаемости является вид Fusarium oxysporum (17,1%) (табл. 1).
Таблица 1 – Перечень видов рода Fusarium, выделенных из зерна пшеницы
| № п/п | Вид | Доля вида от количества Fusarium, % | Сорта, на которых обнаружены виды |
| I секция Sporotrichiella | |||
| 1. | Fusarium sporotrichioides Sherb. | 36,8 | Авиада, Аннет, Ветлужанка, Геракл, Минуса, Новосибирская 15, Омский корунд, Таежная нива, Тулунская-12, Юната, К1629, К64-2, К174-1 |
| 2. | Fusarium poae (Peck) Wollenw | 8,6 | Минуса, К64-2 |
| II секция Roseum | |||
| 3. | Fusarium avenaceum (Fr.) Sacc. | 10,3 | Таежная нива, Тулунская 12 |
| III секция Discolor | |||
| 4 | Fusarium culmorum (Smith) Sacc. | 6,0 | Ветлужанка, К174-1 |
| 5 | Fusarium sambucinum sensu lato | 7,7 | Минуса, Омская-32 |
| IV секция Elegans | |||
| 6. | Fusarium oxysporum Schlecht. Emend. Snyd. & Hans. | 17,1 | Ветлужанка, Новосибирская 15, ОмГАУ – 90, Омский корунд, Тулунская 12, Чагытай, К1629 |
| V секция Arthrosporiella | |||
| 7. | Fusarium diversisporum Sherb. | 5,1 | Юната, Бурятская остистая |
| 8. | Fusarium semitectum Berk. &Rav. | 8,6 | Мана-2, Омская-32 |
Поскольку одним из лимитирующих факторов развития грибов является температура, особенно в климатических условиях Сибири, провели оценку радиальной скорости роста при различных температурных режимах (10; 20; 30±1оС). Установлено, что большинство исследуемых культур предпочитают температуру 20-30оС, средняя радиальная скорость внутри вида при этих температурных показателях существенно не различается и находится пределах 2,2-5,6оС. Снижение температуры до 10±1оС существенно замедляет ростовые процессы, средняя скорость роста составляет 0,7-1,3 мм/сут. Группу быстрорастущих видов составили F.sporotrichioides, F.poae и F.oxysporum.
Для дальнейшей работы были отобраны штаммы F.sporotrichioides и F.oxysporum, как наиболее распространенные виды не только на зерне пшеницы, но и в других экологических нишах, включая почву, ризосферу и ризоплану сеянцев хвойных в лесных питомниках Сибири, согласно данным ранее проведенных нами исследований.
- Фитопатогенные свойства сибирских штаммов Fusarium sporotrichioides и Fusarium oxysporum, выделенных из зерна пшеницы
Фитотоксические свойства метаболитов, полученных при глубинном культивировании грибов на токсигенной среде, оценивали их биотестированием на семенах, проростках и вегетирующих растениях. Установлено, что метаболиты всех изученных штаммов F.sporotrichioides ограничивали лабораторную всхожесть семян и ингибировали развитие проростков пшеницы, по сравнению с контролем, в пределах 3-36%. Исследование динамики фитотоксической активности позволило выявить внутривидовые отличия и распределить штаммы по трем условным группам: оказывают сильное фитотоксическое действие (снижение длины корней более чем на 50%) в течение всего исследуемого периода; проявляют сначала умеренное, а затем выраженное фитотоксическое действие; проявляют ростостимулирующее, а в дальнейшем фитотоксическое действие (рис. 3).
Рисунок 3 – Динамика фитотоксической активности некоторых штаммов Fusarium sporotrichioides
Изучение фитопатогенных свойств F.sporotrichioides показало, что все исследуемые культуры достоверно снижают длину проростков пшеницы, по сравнению с контролем: 55% штаммов приводят к уменьшению длины в пределах 50-84% (средний показатель группы 62%); 46% снижают длину в диапазоне 37-49% (средний показатель 44%). Некротические поражения в 77% случаев составили 0,1-0,8 балла по 3-х бальной шкале (рис. 4).
| Рисунок 4 – Влияние штаммов Fusarium sporotrichioides на длину проростков пшеницы и их некротические поражения |
При моноконидиальном рассеве штамма Z3-06 F.sporotrichioides были получены моноспоровые культуры, фитопатогенные свойства которых существенно различались. Метаболиты 56% культур обладали высокой фитотоксической активностью (60-90%) уже на седьмые сутки культивирования; 44% обладали ростостимулирующим действием либо не оказывали достоверного влияния на проростки на седьмые сутки, однако с увеличением срока культивирования на токсигенной среде фитотоксическая активность возрастала и находилась в пределах 65-97% (рис. 5).
Рисунок 5 – Динамика фитотоксической активности моноспоровых культур штамма Z 3-06 Fusarium sporotrichioides
Фитопатогенность живых моноспоровых культур также была неоднородной: 27% снижали длину проростков пшеницы в пределах 68-75%, что достоверно не отличается от показателя природного изолята; 73% штаммов оказало более выраженное действие –уменьшение длины проростков в пределах 84-98%, у 55% культур некротические поражения проростков составили 1,8-2,6 балла, что превысило показатель природного изолята в среднем в 1,8 раз (рис. 6).
 |
| Рисунок 6 – Фитопатогенные свойства моноспоровых культур штамма Z3-06 Fusarium sporotrichioides |
Исследование ростовых процессов пшеницы на искусственном инфекционном фоне показало, что штамм Z3-06 F.sporotrichioides оказывает ингибирующее действие на показатели грунтовой всхожести и биометрические показатели вегетирующих растений: накопление сырой биомассы стебля и корня уменьшилось в среднем на 43% и 38% соответственно; длина надземной и корневой части – на 17% и 43%; площадь ассимиляционной пластины – на 46,5%. Замедление ростовых процессов сказалось на количественных показателях изучаемых групп микроорганизмов, что свидетельствует об ином характернее формирования прикорневой микрофлоры и количественных перестройках микроорганизмов из различных физиологических групп, по сравнению с контролем (рис. 7). Аналогичные исследования по оценке фитопатогенных свойств были проведены со штаммами вида F.oxysporum, что позволило выявить внутривидовые и внутриштаммовые различия в отношении семян и проростков чувствительных объектов.
А | Б |
В  | Г  |
| Рисунок 7 – Динамика численности микроорганизмов, усваивающих минеральный формы азота (А), аммонифицирующих бактерий (Б), азотфиксирующих бактерий (В) и микромицетов (Г) в ризосфере пшеницы на искуссвтенном инфекционном фоне | |
Сравнивая фитопатогенные свойства изученных видов, можно заключить, что метаболиты F.sporotrichioides оказывают более выраженное действие на ростовые процессы – 54,5% изученных штаммов ингибируют развитие тест-объектов на 80-100%, тогда как у штаммов F.oxysporym значения фитотоксической активности не превышают 80%; фитопатогенные свойства живых культур F.sporotrichioides также характеризуются более сильным проявлением – снижение длины проростков в среднем на 77,6%, некротические поражения интенсивностью не менее 0,6 балла.
В целом, в ходе проведенного исследования показаны внутривидовые различия по фитопатогенным свойствам у представителей вида F.sporotrichioides и F.oxysporum, которые при моноконидиальном рассеве способны выщеплять линии, отличные от природного изолята по степени фитотоксичности и фитопатогенности. Метаболиты, содержащие смесь биологически активных веществ, и живые культуры грибов оказывают ингибирующее влияние на развитие семян, проростков и вегетирующих растений, а значит, в благоприятных условиях представляют потенциальную опасность для восприимчивых растений.
5 Вегетативные реакции сибирских штаммов Fusarium sporotrichioides и Fusarium oxysporum
Исследование вегетативной совместимости проводили на мутантных штаммах двух фенотипов NitM и nit1 видов F.sporotrichioides и F.оxysporum путем их парного сращивания. Выделение хлорат-устойчивых мутантных секторов осуществляли на минимальной среде с KClO3, дальнейшее фенотипирование проводили на средах с различными соединениями азота: NitM мутантные штаммы утилизируют нитрит, но не гипоксантин; nit1 нитрит и гипоксантин; nit3 гипоксантин, но не нитрит. Из 124 хлорат устойчивых секторов F.oxysporum было получено 48,4% nit мутантов, которые в дальнейшем были разделены по фенотипам: NitM – 18,3%, nit1 – 43,4%, nit3 – 38,3%. Из 26 хлорат-устойчивых секторов F.sporotrichioides было получено 19% nit мутантов.
В результате сращивания NitM и nit1 мутантов F.oxysporum выявлены следующее распределение вегетативных реакций: 58,5% вегетативная совместимость (анастомоз); 1,4% нейтральная реакция; 40,1% вегетативная несовместимость (37,1% – бордюр, 0,7% барраж, 2,3% мелдинг реакция) (рис. 8).
 |  |
| Рисунок 8 – Вегетативные реакции при сращивании nit-мутантов Fusarium oxysporum и Fusarium sporotrichioides | |
Оценка вегетативных реакций nit мутантов F.oxysporum, полученных из природных штаммов с различным ареалом (семена, ризосфера злаковых и хвойных растений), показала, что в 75% случаев при сближении двух колоний формировался бордюр, в остальных случаях мелдинг реакция. Сращивание NitM и nit1 мутантов F.sporotrichioides в 65,5% случаях выявило реакции вегетативной совместимости и 35,5% нейтральные реакции.
Наличие вегетативной несовместимости обеспечивает генетическую изоляцию комплекса адаптивных к паразитированию генов, в связи с чем, большое разнообразие вегетативно несовместимых групп, как правило, присутствует у менее патогенных штаммов.
Проведённые исследования позволили выявить наличие вегетативно несовместимых групп только среди сибирских штаммов F.oxysporum, которые характеризуются менее выраженными фитопатогенными свойствами по сравнению с F.sporotrichioides, среди штаммов которых вегетативно несовместимых групп обнаружено не было.
6 Чувствительность сибирских штаммов Fusarium sporotrichioides и Fusarium oxysporum к биоконтрольным микроорганизмам
Исследование чувствительности штаммов F.sporotrichioides к потенциальным биоконтрольным культурам MГ 99/9 T. asperellum, МГ 99/1 T.harzianum и 19/97-М S.lateritius выявило их внутривидовую гетерогенность.
В среднем 55% штаммов F.sporotrichioides оказались нечувствительными к действию всех изученных антагонистов, остальные культуры проявили различную степень восприимчивости – зоны отсутствия роста составили 1,3-13 мм. Чувствительность к грибам рода Trichoderma (2-7,6 мм) отмечена у 25% штаммов F.sporotrichioides, к актиномицету St.lateritius (1,3-13 мм) – у 59% штаммов. При моноконидиальном рассеве Z3-06 F.sporotrichioides все моноспоровые культуры оказались восприимчивыми к действию биологически активных веществ синтезируемых антагонистами 63,6% культур проявили высокую чувствительность; 36,4% умеренную. Аналогичная тенденция была выявлена при изучении штаммов F.oxysporum – большинство исследуемых культур оказались слабовосприимчивыми или резистентными к действию микроорганизмов-антагонистов, при этом подавляющее большинство моноспоровых культур проявляли различную степень чувствительности и существенно отличались от природного штамма.
Изучение паразитической активности штаммов рода Trichoderma в отношении Fusarium выявило высокую устойчивость последних: 63% штаммов F.sporotrichioides и 46% F.oxysporum проявляли гиперпаразитическую активность, ограничивая рост представителей рода Trichoderma. В среднем, в 50% случаев наблюдалось реакция обоюдного подавления при контакте, через некоторое время фитопатоген продолжал расти поверх колонии Trichoderma. Исследование микопаразитической активности показало, что только 27% штаммов F.sporotrichioides и 30,7% F.oxysporum проявили чувствительность, но площадь обрастания мицелия фитопатогенов грибами рода Trichoderma составила не более 30%.
Для полевых испытаний использовали опытные партии биофунгицидов «триходермин» (получен путем твердофазной ферментацией штаммов рода Trichoderma на растительных субстратах, подобранных в ранее проведенных исследованиях) и «латерин» (получен путем глубинного культивирования St.lateritius на жидкой крахмалосодержащей среде). Установлено, что применение препарата «триходермин» не выявило достоверных различий с контролем в структуре урожая, тогда как при обработке семян препаратом «латерин» наблюдалось достоверное увеличение показателей структуры урожая у сорта Таежная Нива и линии КС 1607 по двум параметрам из шести, что подтверждено актом производственных испытаний (табл. 2).
Таблица 2 – Влияние предпосевной обработки семян биопрепаратом «латерин» на параметры структуры урожая пшеницы
| Длина стебля, см | Длина колоса, см | Число зерновок в колосе, шт. | Число зерен в колосе, шт. | Масса 1000 зерен, г | |||||
| к. | опыт | к. | опыт | к. | Опыт | к. | опыт | к. | опыт |
| Таежная Нива | |||||||||
| 54,4± 7,3 | 65,5± 9,8 | 5,8± 1,1 | 7,4± 1,3 | 11,7± 1,6 | 12,9± 2,5 | 30,4± 8,2 | 40,6± 2,0 | 39,7± 6,2 | 48,7± 5,3 |
| КС- 1607 | |||||||||
| 87,9± 6,1 | 101,3±3,6 | 9,5± 1,8 | 12,8± 1,3 | 16,7± 2,4 | 15,0± 1,5 | 46,7± 9,1 | 56,1± 0,4 | 35,1± 3,7 | 38,6± 2,8 |
Исследование динамики общего количества микромицетов в ризосферной почве не выявило достоверных различий между опытными и контрольным вариантами, что свидетельствует об отсутствии существенных количественных изменений микофлоры под влиянием предпосевной обработки семян биопрепаратами. Изучение качественного состава микроскопических грибов позволило выявить в ряде случаев изменение процентного соотношения родов наиболее значимых фитопатогенов зерновых культур (рис. 9).
Посев (контроль)  | Появление всходов | |
Контроль  | Опыт  | |
| Окончание вегетации | ||
Контроль  | Опыт  | |
Рисунок 9 – Влияние предпосевной обработки семян биопрепаратом «латерин» на процентное соотношение некоторых родов микроскопических грибов в ризосфере пшеницы сорта Таежная Нива по фазам вегетации
В контроле соотношение родов основных фитопатогенных грибов достаточно стабильно на протяжении всего вегетационного периода: доля представителей рода Alternaria составила 14-20%, Bipolaris – 11-15%, Fusarium – 18-20%. При использовании биопрепарата «латерин» отмечено снижение доли грибов рода Fusarium в среднем на 5-6% на фоне увеличения доли сапротрофных грибов.
7 Возможности практического применения фитопатогенных штаммов рода Fusarium
Проведена оценка возможности получения растений-регенерантов, устойчивых к действию метаболитов грибов рода Fusarium. Установлено, что биологически активные вещества, содержащиеся в культуральной жидкости, оказывают ингибирующее действие, снижая уровень пролиферации каллусов и образования регенерантов у всех исследуемых образцов. При введении в среду Мурасиге-Скуга метаболитов в концентрации 20% пролиферация каллусов снижалась в среднем в 1,5 раза по сравнению с контролем; при использовании концентрации 40% происходило полное угнетение пролиферации каллусов у большинства изученных сортов за исключением линии КС 1607 и сорта Таежная Нива, которые были отобраны для дальнейшего исследования (табл. 3).
Таблица 3 – Характеристика регенерационных процессов на средах с
метаболитами Fusarium в культуре незрелых зародышей пшеницы
| Сорт, линия | Введено, шт. | Индукция каллусогенеза, % | Пролиферация, % | ||
| к | к1 | к2 | |||
| КС 1607 | 51 | 78,9 | 67,8 | 47,7 | 30,2 |
| Минуса | 20 | 75,0 | 80,0 | 60,0 | 0 |
| Новосибирская 15 | 12 | 83,3 | 89,1 | 75,0 | 0 |
| Кантегирская 89 | 15 | 86,6 | 97,0 | 40,4 | 0 |
| Таежная Нива | 35 | 85,5 | 98,8 | 72,4 | 29,1 |
| Среднее | 133 | 81,9 | 86,5 | 59,1 | 11,9 |
| НСР0,05 | 56,7 | ||||
| Примечание: к контроль; к1 концентрация КЖ 20%; к2 концентрация КЖ 40%. | |||||
На втором этапе оценивали выживаемость каллусных культур и возможность получения регенерантов на средах с различной концентрацией метаболитов штамма Z3-06 F.sporotrichioides, отобранного по результатам предварительных исследований. Использование метаболитов в концентрации 20% приводило к ограничению пролиферации каллусов у линии КС 1607 и сорта Таежная Нива в среднем на 26% по сравнению с контролем; метаболиты в концентрации 30% ингибировали каллусогенез на 27 и 39% соответственно; в концентрации 40% на 48 и 74% (табл. 4).
Получение регенерантов после пролиферации каллусов проводили на среде регенерации без добавления культуральной жидкости гриба. Образование регенерантов в контроле составило 65%; при использовании концентрации метаболитов 20% доля регенерантов линии КС 1607 и сорта Таежная нива составила 5,7 и 1,2% соответственно, что на 51 и 71% ниже контрольных показателей. Отмечено, что, как и в случае с пролиферацией, регенерационные процессы лучше протекали на каллусах, полученных из линии КС 1607.
Таблица 4 – Пролиферация каллусов в культуре незрелых зародышей пшеницы на средах с различными концентрациями метаболитов Fusarium
| Сорт, линия | Введено, шт. | Индукция каллусогенеза, % | Пролиферация каллусов, % | |||
| Контр. | Z 3-06 | |||||
| 20% | 30% | 40% | ||||
| КС 1607 | 51 | 55 | 65,7 | 43,2 | 38,5 | 18,1 |
| Таежная Нива | 193 | 87 | 95,3 | 65,8 | 56,3 | 21,7 |
| Среднее | 244 | 71 | 86,5 | 54,5 | 47,4 | 19,9 |
| НСР0,05 | 46,7 | |||||
Вторым направлением по практическому использованию грибов рода Fusarium было изучение возможности получения аптамеров в качестве высокочувствительных маркеров для обнаружения F.oxysporum. В настоящее время, основными областями применения аптамеров являются изучение механизмов взаимодействия белков с нуклеиновыми кислотами; детекция патогенных бактерий, грибов, токсинов, включая микотоксины (Aguado C., 2008), о селекции аптамеров в отношении клеток Fusarium данных в литературе не обнаружено.
Селекция аптамеров в течение 10 раундов для F.oxysporum, при различных температурных условиях (4; 25 и 37±1оС), показала, что оптимальная температура отбора 25±1оС, при этом максимум связывания наблюдается на третьем раунде отбора (рис. 10).
 |
| Рисунок 10 – Процент связывания аптамеров с клетками Fusarium oxysporum штамма в зависмимости от температурного режима и раунда селекции |
Дальнейший отбор аптамеров заключался в проведении трех раундов непрерывной негативной селекции с клетками грибов отличных родов (Penicillium, Alternaria), а также с клетками грибов рода Fusarium, отличного вида, и к мертвым клеткам исходного штамма F.oxysporum. В результате проведения негативной селекции был отобран пул после пятого раунда отбора, показавший максимальное связывание с клетками гриба – 59,6%. Для подтверждения достоверности специфичности аптамеров провели их инкубацию с клетками вида F.equiseti, процент связывания аптамеров с которыми не превышал 0,42% и был на уровне связывания клеток с исходной ДНК-библиотекой – 0,41%.
В целом, в результате проведения процедуры селекции олигонуклеотидов к клеткам штамма F. oxysporum получен пул аптамеров, характеризующийся относительно высокой специфичностью к клеткам-мишеням, который был секвенирован на отдельные клоны для дальнейшего исследования эффективности их связывания с клетками F.oxysporum и возможного влияния на их биологические свойства.
ВЫВОДЫ
- Грибы рода Fusarium являются типичными представителями микофлоры зерна пшеницы районированных для Сибири сортов; частота их встречаемости находится в пределах 14-47%. Качественный состав представлен 8 видами: Fusarium avenaceum (Fr.) Sacc., Fusarium culmorum (Smith) Sacc., Fusarium diversisporum Sherb., Fusarium oxysporum Schlecht. Emend. Snyd. & Hans., Fusarium poae (Peck) Wollenw, Fusarium sambucinum sensu lato, Fusarium semitectum Berk. &Rav, Fusarium sporotrichioides Sherb.
- Вид F.sporotrichioides является наиболее типичным представителем микофлоры семян пшеницы и характеризуется выраженными фитопатогенными свойствами. Метаболиты, содержащие смесь биологически активных веществ и живые культуры оказывают достоверное ингибирующее влияние на развитие семян, проростков и вегетирующих растений.
- Популяции видов F.sporotrichioides и F.oxysporum гетерогенны и характеризуются высокой степенью полиморфизма: при моноконидиальном рассеве выщепляются линии, отличные от природного изолята по морфолого-культуральным, фитопатогенным свойствам и восприимчивости к действию биологических фунгицидов. Выявлено наличие вегетативно несовместимых групп среди сибирских штаммов F.oxysporum, что свидетельствует об определенной генетической изолированности их друг от друга.
- Виды F.sporotrichioides и F.oxysporum обладают различной чувствительностью к метаболитам грибов рода Trichoderma и актиномицета Streptomyces lateritius (ВКПМ Ас-1637), в ряде случаев проявляя в их отношении гиперпаразитическую активность. В полевых условиях предпосевная обработка семян Streptomyces lateritius способствует увеличению показателей структуры урожая пшеницы и снижению численности грибов рода Fusarium в прикорневой зоне растений, улучшая, таким образом, фитосанитарное состояние растений.
- Показана возможность использования различных концентраций метаболитов вида F.sporotrichioides для получения жизнеспособных каллусных культур пшеницы как селективного фактора отбора устойчивых форм растений в искусственных условиях. А также возможность селекции олигонуклеотидов к клеткам F.oxysporum и получения специфичного пула аптамеров для создания видоспецифичного маркера.
СПИСОК РАБОТ, ОПУБЛИКОВАННЫХ
ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ
- Голованова, Т.И. Взаимоотношения пшеницы с микроскопическими грибами // Т.И. Голованова, Ю.А. Литовка, Е.В. Долинская, Е.А. Сичкарук, А.Ф. Валиулина, О.П. Схиладзе, А.Г. Савицкая // Вестник КрасГАУ. 2010. №9. С. 90-96.
- Литовка, Ю.А. Внутривидовая изменчивость F.oxysporum, распространенного в лесных питомниках Южной Сибири. Материалы микологического междисциплинарного форума с международным участием // Ю.А. Литовка, А.Г. Савицкая, Т.А. Шалаева / Иммунопатология, аллергология, инфектология. Москва, 2010. № 1. С. 9-10.
- Литовка, Ю.А. Проблемы применения растительных отходов для получения биологических препаратов защиты растений // Ю.А. Литовка, А.Г. Савицкая, Т.В. Рязанова, Н.А. Нешумаева / Химия растительного сырья. 2011. №3. С. 167-172.
- Литовка, Ю.А. Видовой состав и фитотоксичные свойства микромицетов рода Fusarium, распространенных в лесных питомниках Средней и южной Сибири // Ю.А. Литовка, Т.В. Рязанова, А.Г. Савицкая / Хвойные бореальные зоны. 2011. Вып. XXIX. № 3-4. С. 233-237.
- Литовка, Ю.А. Биологический контроль сибирских штаммов грибов рода Fusarium в лабораторных и полевых условиях // Ю.А. Литовка, А.Г. Савицкая, Т.В. Рязанова, Н.В. Зобова / Вестник КрасГАУ. 2011. № 11. С. 97-102.
- Савицкая, А.Г. Оценка устойчивости к биоконтрольным агентам штаммов рода Fusarium, распространенных в агроценозах Средней Сибири // А.Г. Савицкая, Ю.А. Литовка // Аграрная наука – сельскохозяйственному производству Сибири, Монголии, Казахстана и Болгарии: Мат. XIV Междунар. науч.-практ. конф. Красноярск, 2011. Часть 1. С. 298-291.
- Савицкая, А.Г. Клеточная селекция злаковых на устойчивость к токсинам грибов рода Fusarium, распространенных в агроценозах Сибири // А.Г Савицкая, Н.В. Зобова, Ю.А. Литовка // Фитосанитарная безопасность агроэкосистем: Мат. Междунар. науч. конф. / Новосибирск, 2010. С. 150-152.
- Литовка, Ю.А Оценка фитопатогенности и устойчивости к биоконтрольным агентам штаммов рода Fusarium, распространенных в агроценозах Средней Сибири // Ю.А. Литовка, А.Г. Савицкая // Фитосанитарная безопасность агроэкосистем: Мат. Междунар. науч. конф. / Новосибирск, 2010. С. 220-223.
- Савицкая, А.Г. Видовой состав и фитопатогенные свойства сибирских штаммов рода Fusarium // А.Г. Савицкая, Ю.А. Литовка / I Междунар. интернет-конф. «Растения и микроорганизмы»: Сб.тр. Казань, 2011. С.162-165.
- Савицкая, А.Г. Клеточная селекция злаковых на устойчивость к микотоксинам сибирских штаммов грибов рода Fusarium // А.Г. Савицкая, Ю.А. Литовка, Н.В. Зобова / Растения и микроорганизмы: Сб.тр. I Междунар. интернет-конф. Казань, 2011. С. 113-115.
- Савицкая, А.Г. Фитотоксическая активность сибирских штаммов рода Fusarium и перспективы их использования дл клеточной селекции зерновых // А.Г. Савицкая, О.В. Бормина / Молодые ученые в решении актуальных проблем науки: Мат. Всеросс. науч.-практ. конф. Красноярск, 2009. Т. 1. С. 292-297.
- Савицкая, А.Г. Клеточная селекция злаковых на устойчивость к микотоксинам грибов рода Fusarium, распространенных в агроценозах Сибири // А.Г. Савицкая, Ю.А. Литовка / Молодые ученые в решении актуальных проблем науки: Мат. Всеросс. науч.-практ. конф. Красноярск, 2010. Т. 2. С. 48-50.
- Литовка, Ю.А. Изучение реакций вегетативной совместимости сибирских штаммов Fusarium oxysporum // Ю.А. Литовка, А.Г. Савицкая / Современная микология в России: Тез. докл. III съезда микологов России. Москва, 2012. С. 292.
- Савицкая, А.Г. Получение аптамеров в качестве высокочувствительных маркеров для обнаружения клеток Fusarium oxysporum // А.Г. Савицкая, Ю.А. Литовка, Т.В. Рязанова, М.В. Березовский, А.В. Чечик // Современная микология в России: Тез. докл. III съезда микологов России. Москва, 2012. С. 307.
Подписано в печать 16.01.2013 г. Тираж 120 экз.
Печать трафаретная. Заказ 059.
Отпечатано в печатном цехе «Ризограф»
Тюменского Аграрного Академического Союза
625003, г. Тюмень, ул. Республики, 7
