Поиск ингибиторов поли(adp-рибозо)полимеразы-i. миметики поли(adp-рибозы)
На правах рукописи
ДРЕНИЧЕВ Михаил Сергеевич
ПОИСК ИНГИБИТОРОВ ПОЛИ(aDP-РИБОЗО)пОЛИМЕРАЗЫ-i.
мИМЕТИКИ ПОЛИ(adp-РИБОЗЫ)
03.01.03 - Молекулярная биология
Автореферат
диссертации на соискание ученой степени
кандидата химических наук
Москва 2013
Работа выполнена в Лаборатории стереохимии ферментативных реакций Федерального государственного бюджетного учреждения науки Института молекулярной биологии им.
В.А. Энгельгардта Российской академии наук.
Научный руководитель: заведующий Лабораторией стереохимии ферментативных реакций Федерального государственного бюджетного учреждения науки Института молекулярной биологии им. В.А. Энгельгардта Российской академии наук (ИМБ РАН), доктор химических наук, профессор
С.Н. Михайлов
Официальные оппоненты: профессор химического факультета Федерального государственного бюджетного образовательного учреждения высшего профессионального образования «Московский государственный университет имени М.В.Ломоносова», доктор химических наук, профессор
Т.С. Орецкая
ведущий научный сотрудник Лаборатории молекулярных основ действия физиологически активных соединений Федерального государственного бюджетного учреждения науки Института молекулярной биологии им. В.А. Энгельгардта Российской академии наук, доктор химических наук
А.Р. Хомутов
Ведущая организация: Федеральное государственное бюджетное учреждение науки Институт биоорганической химии им. академиков Ю.А.Овчинникова и М.М. Шемякина Российской академии наук
Защита диссертации состоится «____» _____________ 2013 г. в _____ часов на заседании диссертационного Совета Д 002.235.01 при Федеральном государственном бюджетным учреждении науки Институте молекулярной биологии им. В.А. Энгельгардта Российской академии наук по адресу: 119991, Москва, ул. Вавилова, д. 32.
С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Федерального государственного бюджетного учреждения науки Института молекулярной биологии им. В.А. Энгельгардта Российской академии наук по адресу: 119991, Москва, ул. Вавилова, д. 32.
Автореферат разослан «____» _____________ 2013 г.
Ученый секретарь Диссертационного совета
кандидат химических наук А.М. Крицын
Актуальность исследования. Поли-ADP-рибозилирование – посттрансляционная модификация белков в эукариотических клетках, катализируемая поли(ADP-рибозо)полимеразами (ПАРП). Эти ферменты осуществляют превращение никотинамидадениндинуклеотида (NAD+) в поли(ADP-рибозу) (ПАР) с высвобождением никотинамида [Hassa P.O. et al. Microbiol. Mol. Biol. Rev., 2006, 70, 789–829]. ПАР вовлечена в процессы модуляции структуры хроматина, репликации, транскрипции, репарации ДНК и дифференцировки клеток и представляет собой разветвленный биополимер, в котором остатки 2-O--D-рибофуранозиладенозина соединены между собой пирофосфатными связями. Поли(ADP-рибозо)полимераза-1 (ПАРП) относится к числу ключевых белков, осуществляющих регуляцию процесса репарации оснований и одноцепочечных разрывов ДНК, и отвечает за синтез 90% поли(ADP-рибозы) в клетке.
До настоящего времени ПАР не синтезирован, что связано как со сложностями синтеза дисахаридных нуклеозидов, так и с образованием пирофосфатной связи. Лишь недавно в нашей лаборатории был впервые получен 2'-О--D-рибофуранозиладенозин – мономерное звено ПАР.
Ингибиторы ПАРП представляют интерес как потенциальные противораковые агенты [Ferraris D.V., 2010, J. Med. Chem., 53, 4561–4584]. Алкилирующие препараты, которые реагируют с гетероциклическими основаниями нуклеиновых кислот и вызывают повреждение ДНК, и ионизирующее излучение, применяют в схемах лечения многих форм онкозаболеваний. Системы репарации ДНК противостоят действию агентов, повреждающих ДНК, поэтому терапевтический эффект зависит от эффективности систем репарации ДНК. Направленное ингибирование репарации ДНК может быть основой очень эффективной сопровождающей терапии. Ожидается, что использование ингибиторов ПАРП в комплексной химиотерапии позволит снизить концентрацию алкилирующих противоопухолевых агентов и, следовательно, понизить общую токсичность лечения. Вышесказанное определяет актуальность и большой интерес к изучению миметиков ПАР и созданию ингибиторов ПАРП.
Целью работы являлся поиск новых ингибиторов ПАРП-I в ряду дисахаридных нуклеозидов, а также получение миметиков ПАР, исходя из фосфорамидитных синтонов на основе дисахаридных нуклеозидов и их ациклических аналогов. В ходе исследования решались следующие задачи:
- оптимизация методов получения дисахаридных нуклеозидов, исследование устойчивости 1,1,3,3-тетраизопропилдисилоксан-1,3-диил (TIPDS) защитной группы в основных средах и подбор оптимальных условий для удаления ацильных защит (деблокирования);
- разработка синтеза фосфорамидитных синтонов на основе дисахаридных нуклеозидов и их ациклических аналогов;
- получение миметиков ПАР, разработка подходов, позволяющих вводить функциональные группы в олигонуклеотиды и получать разветвленные миметики ПАР;
- синтез пиримидиновых дисахаридных нуклеозидов и изучение их ингибиторной активности в реакции поли(ADP-рибозил)ирования, катализируемой рекомбинантной ПАРП-1, а также в культуре клеток.
Научная новизна и практическая значимость работы. Оптимизирован предложенный ранее метод получения 2-O--D-рибофуранозиладенозина, мономерного звена ПАР, и других пентафуранозилнуклеозидов, что позволило увеличить общий выход целевых продуктов. Исследована стабильность исходных 3',5'-О-(тетраизопропилдисилоксан-1,3-диил)нуклеозидов в основных средах и подобраны оптимальные условия для удаления ацильных защитных групп без затрагивания силильной группы. Получен большой ряд миметиков ПАР на основе дисахаридных нуклеозидов и их ациклических аналогов. В ряду пиримидиновых дисахаридных нуклеозидов найдены ингибиторы ПАРП с Ki~10-5. В ходе работы синтезировано 60 новых соединений, структура которых подтверждена данными масс-спектрометрии, УФ- и ЯМР-спектроскопии. Впервые осуществлен синтез 3'-О--D-рибофуранозиладенозина – сигнальной молекулы, вырабатываемой в ответ на поражение растений фитопатогенными бактериями.
Апробация работы. Основные положения диссертационной работы были представлены на научной конференции молодых ученых ИМБ РАН (Москва 14 октября 2010), на XIX международной конференции «Нуклеозиды, нуклеотиды и нуклеиновые кислоты» (Lyon, France, 29 August - 3 September 2010), на XXIII зимней молодежной школе-конференции Института биоорганической химии им. академиков Ю.А.Овчинникова и М.М.Шемякина РАН (Москва, 7-10 февраля 2011), на XV международном симпозиуме по химии компонентов нуклеиновых кислот (Cesky Krumlov, Czech Republic, June 5-10, 2011) и на научной конференции молодых ученых ИМБ РАН (Москва, 30 октября 2012).
Публикации По материалам диссертации опубликовано 2 статьи, глава в продолжающемся методическом издании и 3 тезисов докладов.
Структура и объем диссертации Диссертационная работа состоит из введения, обзора литературы, обсуждения результатов, экспериментальной части, выводов и списка цитируемой литературы ( наименований). Работа изложена на страницах, включает рисунков, схем и таблиц.
СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ
Миметики ПАР являются потенциальными ингибиторами ПАРП и поли(ADP-рибозо)гликогидролазы, фермента, ответственного за деградацию ПАР, и представляют интерес в качестве новых объектов для исследований в молекулярной биологии, медицинской химии и биохимии (изучение систем репликации, транскрипции и репарации ДНК). Сложность синтеза ПАР и ее структурных аналогов связана с введением лабильных пирофосфатных связей между остатками дисахаридных нуклеозидов. Для получения миметиков ПАР пирофосфатные связи могут быть заменены на фосфатные, при сохранении расстояния между основными функциональными группами. Такая замена позволяет использовать автоматический олигонуклеотидный синтез с использованием фосфорамидитных синтонов.
Важной проблемой является направленный поиск новых ингибиторов ПАРП. Перспективное направление поиска - создание структур, схожих по строению с мономерным звеном поли(ADP-рибозы).
Синтез дисахаридных нуклеозидов
Ранее в нашей лаборатории был получен - 2'-О--D-рибофуранозиладенозин с применением 1,1,3,3-тетраизопропилдисилоксан-1,3-диил (TIPDS) защитной группы, предложенной Маркевичем. Стадия гликозилирования протекала в присутствии SnCl4 c хорошим выходом (62%). Общий выход дисахаридного нуклеозида составил 13%. Относительно невысокий общий выход целевого продукта связан с нестабильностью TIPDS-нуклеозидов на стадии удаления ацильных групп. Поэтому в настоящей работе была изучена устойчивость бис-силильной защитной группы в условиях деблокирования ацильных защитных групп. При обработке TIPDS-нуклеозидов 1 метилатом натрия, раствором аммиака или DBU в метаноле происходит раскрытие восьмичленного цикла с образованием 5'-региоизомера 2, содержащего метоксильную группу (схема 1). В 1Н-ЯМР-спектре (DMSO-d6) соединения 2 (B = Ura) присутствует сигнал метильной группы в виде синглета. Гидроксильные группы проявляются в виде двух дублетных сигналов, которые исчезают при добавлении к образцу D2O, а в спектре производного 3 присутствуют сигналы двух ацетильных групп.
Схема 1. Раскрытие восьмичленного цикла в TIPDS-рибонуклеозидах (B=Ura). i. 4М NH3-MeOH, 20 С, 24 ч, 25%, или DBU-MeOH (MeONa-MeOH), 20 С, 8 ч, 75%; ii. Ac2O/пиридин, 20 С, 1.5 ч, 88%.
Подбор оптимальных условий деблокирования ацильных групп (Bz, Ac, i-Bu) проводили в спиртовых растворах различных аминов и аммиака (таблица 1). Как видно из таблицы 1, для удаления ацильных защитных групп целесообразно использовать растворы аминов в этаноле. В этих условиях образование продуктов 2 составляло не более 2%.
Раствор MeNH2-EtOH использовался в синтезе 2'-О--D-рибофуранозиладенозина для удаления бензоильных защитных групп (схема 2, реакция ii). Однако при использовании алкиламинов для удаления бензоильных защит происходит как O-, так и N-дебензоилирование с образованием продукта 8. В связи с этим было решено использовать в реакции гликозилирования производное аденозина 5 со свободной аминогруппой. О-Гликозилирование протекало стереоспецифично, с образованием -гликозидной связи (схема 2). Наличие в присоединяемом
Таблица 1. Относительная стабильность TIPDS- и N-ацильных защитных групп в 4М спиртовых растворах аминов/аммиака при 20 °С1.
| № опыта | Основание в нуклеозиде 1 | Реагент | Время деацилирования | Степень расщепления TIPDS-нуклеозидов через 24 ч2 |
| 1 | 1a B = Ura | NH3-MeOH | 25% | |
| 2 | NH3-EtOH | <2% | ||
| 3 | MeNH2-EtOH | 2% | ||
| 4 | 1b B = CytBz | NH3-MeOH | 3.5 ч | 50% |
| 5 | NH3-EtOH | 40 ч | <2% | |
| 6 | MeNH2-EtOH | 30 мин | 2% | |
| 7 | EtNH2-EtOH | 3.5 ч | <2% | |
| 8 | PrNH2-EtOH | 3.5 ч | <2% | |
| 9 | 1c B = CytAc | NH3-MeOH | 10 мин | 50% |
| 10 | NH3-EtOH | 10 ч | <2% | |
| 11 | MeNH2-EtOH | 5 мин | 2% | |
| 12 | EtNH2-EtOH | 10 мин | <2% | |
| 13 | PrNH2-EtOH | 10 мин | <2% | |
| 14 | 1d B = Guai-Bu | NH3-MeOH | 15 ч | 50% |
| 15 | NH3-EtOH | 4 дня | <2% | |
| 16 | MeNH2-EtOH | 2.5 ч | 2% | |
| 17 | EtNH2-EtOH | 35 ч | <2% | |
| 18 | PrNH2-EtOH | 35 ч | <2% |
1Протекание реакций контролировали методом ТСХ.
2При определении степени расщепления TIPDS-нуклеозидов учитывалось образование продуктов полного десилилирования (нуклеозиды) и продуктов раскрытия восьмичленного цикла.
моносахариде соучаствующей О-бензоильной группы обеспечивало образование 1,2-транс-замещенных арабинофуранозидов.
После удаления бензоильных групп вводилась вторая защитная TIPDS-группа по 3''- и 5''-OH группам арабинофуранозного остатка (схема 2, реакция iii). Далее следовало обращение конфигурации при С-2'' атоме углерода и удаление силильных групп действием тригидрата TBAF или фторида триэтиламмония (схема 2, реакция vi). Таким образом, общий выход нуклеозида 13 удалось повысить с 13 до 19-21%. Данные ЯМР, УФ и масс-спектроскопии для структуры 13 согласуются с данными, описанными в литературе.
Схема 2. Синтез 2'-О--D-рибофуранозиладенозина и его оптимизация. i. SnCl4/ДХЭ, 0 °C, 24ч, 62-64%; ii. 0,1 M MeONa/MeOH, 10 °C, 40 мин, 79: 47% или MeNH2/EtOH, 24ч 710: 77%; 810: 87%; iii. TiPDSCl2 /пиридин, 24ч, 20 °С, 80%; iv. DMSO/Ac2O 65 °С, 4ч; v. NaBH4/EtOH, 0 °C, 1ч, 62% (iv+v); vi Bu4NF·3H2O/ТГФ, 69% или Et3N·HF/ТГФ, 78%.
Заражение растений фитопатогенными бактериями индуцирует образование ряда метаболитов, которые являются производными индолов или нуклеозидов. При инфицировании культур арабидопсиса (Arabidopsis thaliana) бактериями Pseudomonas syringae образуется 3'-О--D-рибофуранозиладенозин, который был выделен из клеток пораженных растений Беднареком и коллегами [Bednarek et al., 2004, Planta, 218, 668-672]. В данной работе был впервые осуществлен синтез этого нуклеозида (схема 3).
В качестве исходных соединений использовались 1-О-ацетил-2,3,5-три-О-бензоил-D-рибофураноза 15 и 2',5'-ди-О-(трет-бутилдиметилсилил)аденозин 14, полученный по известной методике. Реакция гликозилирования протекала без заметной миграции силильной группы с выходом 64%. Десилилирование нуклеозида 16 протекало в присутствии Bu4NF·3H2O с выходом 55%. Конечный дисахаридный нуклеозид 18 был выделен кристаллизацией из воды с суммарным выходом 23%.
Схема 3. Получение 3'-О--D-рибофуранозиладенозина. i. SnCl4/ДХЭ, 0 °C, 16ч, 64%; ii. Bu4NF·3H2O/THF, 45 мин, 55%; iii. NH3/MeOH, 3 дня, 65%.
Конфигурация при С-1'' атоме в рибозном остатке производного 18 подтверждается данными 1Н-ЯМР-спектроскопии: значение КССВ J1'',2'' = 0 Гц свидетельствует о транс-расположении атомов Н1''-Н2''. В 13С-ЯМР-спектре соединения 18 сигнал С-3' атома в аденозиновом остатке сильно смещен в сторону слабого поля по сравнению с исходным нуклеозидом 14, что доказывает присоединение рибозного остатка к аденозину в положении С-3'. Сигналы в 13С-ЯМР-спектре были отнесены с использованием спектров HSQC. Наличие между углеводными остатками гликозидной связи 3 - 1 также было подтверждено ЯМР-экспериментом с использованием гетероядерных корреляций дальних взаимодействий (HMBC).
В спектре присутствуют кросс-пики между атомами H-1'' (Rib) и С-3' (Ado) и между H-3' (Ado) и C-1'' (Rib). ЯМР спектры 18 идентичны приведенным в литературе для выделенного соединения.
Рисунок 1. HMBC-спектр соединения 18 при 50 °С (323 К)
Таким образом, были получены производные аденозина, содержащие рибофуранозные фрагменты в 2'- и 3'-положениях. Показана возможность применения TBDMS-защиты в условиях реакции гликозилирования. В ходе работы были подобраны оптимальные условия деблокирования ацильных защит в TIPDS-нуклеозидах, что позволило существенно повысить общий выход дисахаридных нуклеозидов.
Получение миметиков поли(ADP-рибозы)
К настоящему времени, благодаря рентгеноструктурному анализу, строение активного центра ПАРП изучено достаточно подробно. Согласно данным молекулярной динамики, ПАР – подвижная молекула и расстояние между атомами в соседних звеньях варьирует в пределах 5.0-16.2 (рисунок 2, таблица 2). Природная ПАР представляет собой полимер с нерегулярной структурой, в то же время синтетические миметики ПАР имеют регулярную структуру, что важно для изучения их взаимодействий с белками.
Рисунок 2. Структура ПАР
Таблица 2. Расстояния между дисахаридными звеньями в поли(ADP-рибозе) и ее миметиках1
| Полимер | С-1'-C-1', | O-O (furan) |
| ПАР max 16.2 min 5.0 2 | 10.3-11.3 | 11.4-11.8 |
| ПАР в комплексе с ПАРП | 10.7-11.3 | 10.6-11.4 |
| Ado--D-Rib3 | 11.3 | 11.2 |
| Ado--D-Rib | 10.8 | 10.2 |
| Ado--D-Ara | 11.3 | 11.2 |
| Ado-CH2OCH2CH2 | 13.5 | 14.0 |
| Ado-CH2OCH2CH2CH2 | 15.0 | 15.2 |
1-в миметиках ПАР пирофосфатная связь заменена на фосфатный остаток. На рисунке отмечены атомы, расстояния между которыми указаны в таблице
2-диапазоны расстояний между атомами рассчитаны с использованием молекулярной динамики ПАР в свободном состоянии и в комплексе с ферментом (к.х.н. Д.К.Нилов НИИ ФХБ имени А.Н.Белозерского МГУ)
3-среднестатистические расстояния между атомами рассчитаны при помощи программы ChemDraw Ultra 11.0
Для создания миметиков пирофосфатные связи были заменены на фосфатные, при этом сохраняются основные функциональные группы и расстояния между ними. Для увеличения стабильности миметиков ПАР предлагается также изменить конфигурацию гликозидной связи в остатках 2’-О--D-рибофуранозиладенозина, либо использовать ациклические аналоги дисахаридных нуклеозидов.
Нами был получен ряд фосфорамидитных производных дисахаридных нуклеозидов и их ациклических аналогов. Олигонуклеотидный синтез с использованием таких «строительных блоков» позволяет создавать олигомеры с расстояниями между функциональными группами, близкими к поли(ADP-рибозе) (таблица 2). Для получения фосфорамидитных синтонов на основе дисахаридных нуклеозидов необходимо проводить защиту всех ОН-групп. В этих соединениях присутствуют две первичных и три вторичных гидроксильных группы, для дифференциальной защиты которых требуются многостадийные манипуляции. Также необходимо блокировать аминогруппу аденина. Возможны два подхода к получению фосфорамидитных синтонов на основе дисахаридных нуклеозидов (схема 4).
Схема 4. Стратегия химической модификации дисахаридных нуклеозидов.
Путь А заключается в получении производных, содержащих фосфорамидитную группу в 5'-положении нуклеозида и кислотолабильную тритильную защиту по 5''-положению, вторичные ОН-группы блокируются ацильными защитами. Этот вариант существенно сложнее пути В и требует проведения большего числа стадий. Путь В заключается в получении производного, содержащего фосфорамидитную группу в 5''-положении рибофуранозы и тритильную группу 5'-положении аденозина.
Использование полностью ацилированных нуклеозидов типа 7-8 (схема 2) исключает возможность дифференциальной защиты 5''-первичной гидроксильной группы. Для селективного блокирования этого положения (стратегия В) была использована левулиновая защитная группа (Lev), которая может быть селективно удалена в мягких условиях гидразинолиза без затрагивания других ацильных групп.
Синтоны на основе дисахаридных нуклеозидов были получены согласно схеме 5. N6-Бензоил-3',5'-О-(тетраизопропилдисилоксан-1,3-диил)аденозин 4 вводился в конденсацию с защищенным производным арабинофуранозы 19 в присутствии SnCl4. TIPDS-группа удалялась действием трехводного фторида тетрабутиламмония. Тритилирование, ацилирование и гидразинолиз проводили последовательно с хроматографической очисткой производного 22 на последней стадии. Фосфитилирующим агентом выступал 2-цианоэтил-N,N,N',N'-тетраизопропилфосфорамидит, реакцию проводили в инертной атмосфере азота при 0 С с использованием 1Н-тетразола в качестве активирующего реагента.
По аналогичной схеме были получены производные 24a и 24b, содержащие остаток рибофуранозы в -конфигурации. Введение изо-бутироильной группы в 3'-положение позволяет повысить выход продукта на стадии удаления левулиновой группы, поскольку ацетильная группа частично удаляется в этих условиях.
Фосфорамидитные синтоны на основе 2'-О-гидроксиалкоксиметилнуклеозидов были получены согласно схеме 6, аналогично дисахаридным прозводным. Реакция с диацетатами 25a-c протекает значительно быстрее О-гликозилирования. Было показано, что при конденсации нуклеозидов с ациклическими производными целесообразно использовать нуклеозид 5 со свободной аминогруппой. В случае N6-бензоил-производного 4 образуется значительное количество побочных продуктов вследствие неустойчивости N-гликозидной связи в условиях реакции. В 1Н-ЯМР-спектрах 26а-с (CDCl3), наряду с сигналами рибофуранозы и пуринового основания, проявляются дополнительные сигналы, относящиеся к ациклическому фрагменту. Удаление ацетильной группы в присутствии 4M MeNH2-EtOH протекало с высоким выходом и позволило избежать существенного раскрытия бис-силильной группы. Применение NH3/MeOH на данной стадии существенно снижает выход продуктов 27.
Схема 5. Получение амидофосфитных синтонов на основе дисахаридных нуклеозидов (Lev=С(О)СН2СН2С(О)СН3) i. SnCl4/ДХЭ, 0 °C, N2, 20 ч, 58%; ii. Bu4NF·3H2O/ТГФ, 10 мин, 73%; iii. MMTrCl/пиридин, 16 ч, iv. Ac2O, 0 °C, 4 ч; v. N2H4·H2O/AcOH/пиридин, 0 °C, 40 мин, выход на 3 стадии iii-v 55%; vi. (i-Pr2N)2PO(CH2)2CN/ 1H-тетразол, ацетонитрил, пиридин, N2, 30 мин, 85%.
Структура полученных соединений 23, 24a-b, 32a-c подтвержается данными 31P-ЯМР спектроскопии (таблица 3). Общие выходы рассчитаны по схемам 5 и 6, исходя из TIPDS-производных 4 и 5.
В синтезе миметиков ПАР использовалось два типа фосфорамидитных синтонов – с MMTr-группой (соединения 23, 32a-c) и с DMTr-группой (соединения 24a-b). Твердофазный синтез олигомеров проводили на автоматическом синтезаторе ABI 3400 (Applied Biosystems, США) с использованием в качестве твердого носителя стекла с контролируемым размером пор (500) и ковалентно пришитым дезоксиаденозином или защищенным аминолинкером С7 (производное 7-амино-2-(гидроксиметил)гексан-1-ола) по методике, описанной в работе [Mikhailov et al., 2009, CPNAC, 4.36.1-4.36.19, ссылка 3 в списке литературы] для MMTr-производных. При использовании DMTr-производных протокол олигонуклеотидного синтеза изменяется на стадии детритилирования. Масштаб синтеза составлял 0,2 мкмоль. Деблокирование олигомеров проводили в стандартных условиях (конц. водный аммиак, 6 часов, 55 оС). В таблице 4 приведены некоторые синтезированные олигомеры.
Схема 6. Получение синтонов на основе 2'-О-гидроксиалкоксиметилнуклеозидов. i. SnCl4/ДХЭ, -10 °C, N2, 40 мин, 26a - 43%, 26b -56%, 26c – 54%; ii. 4M MeNH2/EtOH, 24ч, 27a – 93%, 27b – 85%, 27c – 87% iii. Me3SiCl/пиридин, 1 ч; BzCl, 2 ч; NH4OH, 0 °C, 20 мин, 28a – 80%, 28b – 72%, 28c - 79%; iv. LevOH/DCC, диоксан, 40 мин, 29a – 84%, 29b – 78%, 29c – 81%; v. Bu4NF·3 H2O /ТГФ, 10 мин, 30a – 85%, 30b – 81%, 30c - 76%; vi. MMTrCl/пиридин, 16 ч, vii. 1.5eq BzCl, 0 °C; viii. N2H4·H2O/AcOH/пиридин, 0 °C, 40 мин; выходы на 3 стадии vi-viii 31a – 74%, 31b – 60%, 31c – 70%; ix. (i-Pr2N)2PO(CH2)2CN/ 1H-тетразол, ацетонитрил, пиридин, N2, 30 мин, 32a – 58%, 32b – 61%, 32c – 41%.
Таблица 3. 31P-ЯМР и общие выходы амидофосфитных синтонов.*
| Соединение | 31P-ЯМР, (м.д.) | Общий выход, % |
| 23 | 150.90(c); 150.71(c) | 19.8 |
| 24a | 151.26(с); 150.88(с) | 18.6 |
| 24b | 151.27(с); 150.82(с) | 22.5 |
| 32a | 150,18(c); 150.14(c) | 9.8 |
| 32b | 150,68(c); 149.31(c) | 7.9 |
| 32c | 149.10(c) | 6.5 |
*Спектры 23, 24a-b, 32a, 32c регистрировались в DMSO-d6 с подавлением сигналов протонов, спектр 32b – в CDCl3 с подавлением сигналов протонов
Олигонуклеотиды 1-12 не проявляют ингибирующего действия на ПАРП-I в концентрациях менее 0.1 мМ. Короткие олигомеры на основе 2'-О--D-арабинофуранозиладенозина, содержащие эозиновый флуоресцентный маркер, ингибируют интегразу ВИЧ, снижая активность фермента на 50% в концентрации 0.3 мкM (проф. М.Б.Готтих, НИИ ФХБ им.А.Н.Белозерского МГУ).
Таким образом, исходя из соответствующих фосфорамидитных производных, были впервые получены и описаны миметики ПАР. Миметики ПАР, имеющие определенный состав и структуру, открывают новые возможности для изучения репарации ДНК и других важных клеточных процессов: а) изучения белков, участвующих в репарации ДНК; б) выяснения регуляторных функций поли(ADP-рибозы) в клетке.
Таблица 4. Структура и MALDI-спектрометрия миметиков ПАР.
| № | Синтон | Состав олигомера | Mcalcd | Mfound |
| 1 | 23 | H2N(CH2)4CH(CH2OH)CH2O(5pAraAdo5)11 | 5221.8 | 5216.7 |
| 2 | 23 | Eosin-HN(CH2)4CH(CH2OH)CH2O(5pAraAdo5)11 | 5927.8 | 5924.2 |
| 3 | 23 | dAdo(pdAdo)2 (5pAraAdo5)11 | 5952.2 | 5953.6 |
| 4 | 23 | dAdo(5pAraAdo5)15 | 7171.1 | 7173.4 |
| 5 | 23 | dAdo(5pAraAdo5)18 | 8555.1 | 8557.5 |
| 6 | 24a-b | dAdo(pdAdo)2 (5pRibAdo5)11 | 5952.2 | 5950.1 |
| 7 | 24a-b | dAdo(5pRibAdo5)15 | 7171.1 | 7175.6 |
| 8 | 24a-b | dAdo(5pRibAdo5)18 | 8555.1 | 8554.7 |
| 9 | 32a | dAdo(pCH2CH2OCH2-Ado5)7 | 3067.2 | 3074.9 |
| 10 | 32a | dAdo(pCH2CH2OCH2-Ado5)11 | 4676.3 | 4678.9 |
| 11 | 32a | dAdo(pCH2CH2OCH2-Ado5)12 | 5078.6 | 5078.4 |
| 12 | 32a | dAdo(pCH2CH2OCH2-Ado5)14 | 5883.2 | 5885.0 |
Использование «click»-реакции для функционализации олигонуклеотидов и создания разветвленных миметиков ПАР.
Включение дополнительных функциональных групп в состав олигонуклеотидов широко используется для решения ряда проблем, таких как их внутриклеточный транспорт и селективное накопление в клетках и тканях, введение флуоресцентных меток, модификация пептидов и белков и создание разветвленных олигонуклеотидов, изучение активности и механизма действия ферментов и.т.д. Одним из подходов для получения разветвленных биополимеров является циклоприсоединение методом «click»-химии. «Click»-реакции протекают в воде при комнатной температуре с выходами, близкими к количественным. Наиболее часто применяется циклоприсоединние RN3 по терминальной тройной связи в присутствии солей одновалентной меди. Все перечисленные особенности делают «click»-химию ценным методом для модификации иммобилизованных биополимеров.
В данной работе был предложен способ, позволяющий вводить два разных углеводных остатка в иммобилизованные олигонуклеотиды методом «click»-химии. Для этого были синтезированы амидофосфитное производное 43, содержащее атом брома, и H-фосфонат 44, содержащий азидную функциональную группу.
N4-бензоил 3',5'-O-(тетраизопропилдисилоксан-1,3-диил)цитидин вводился в конденсацию с (2-бромэтокси)метилацетатом в присутствии SnCl4 при –12 С (схема 7). Последующая реакция с NaN3 давала производное 33b. Дальнейшие стадии проводились аналогично схемам, описанным выше. Бромпроизводное 35а превращалось в 3'-(2-цианоэтил-N,N-диизопропилфосфорамидит) 36. В случае производного 35b получали 3'-(Н-фосфонат) 37. Использование Н-фосфоната 37 обусловлено тем, что соответствующий фосфорамидит может вступать в реакцию Штаудингера с соседней азидной группой.
Схема 7. Синтез синтонов для модификации олигонуклеотидов (B = CytBz). i. Bu4NF·3H2O/ТГФ, 10 мин, 41a-57%, 41b-94%; ii. DMrCl/пиридин, 16 ч, 42a-71%, 42b-72%; iii. (i-Pr2N)2PO(CH2)2CN, Et3N/ДХМ, N2, 2ч, 71%; iv. (PhO)2P(O)H, пиридин, 45 мин., Et3N/H2O, 15 мин. 86%.
Фосфорамидитный блок 36 и Н-фосфонатный блок 37 позволяют вводить в состав олигонуклеотидов разные заместители. Были синтезированы 15-мерные 2'-O-метилированные олигорибонуклеотиды, содержащие (2-азидоэтокси)метильный и (2-бромэтокси)метильный линкеры в углеводном остове (синтез олигонуклеотидов проводился в лаборатории проф. Х. Лоннберга, университет Турку, Финляндия). Включение блоков 36 и 37 в олигонуклеотидную последовательность проводилось по стандартным процедурам: конденсация амидофосфита 36 протекает в присутствии тетразола c выходом 99.9%, активация пивалоилхлоридом позволяет присоединить к нуклеотидной последовательности Н-фосфонат 37 с выходом 85%. После завершения сборки цепи на полимерном носителе проводили модификацию иммобилизованных олигонуклеотидов методом «click»-химии (схема 8). В качестве вводимых функциональных остатков использовались пропаргил-2,3,4,6-тетра-О-ацетил--D-маннопиранозид и пропаргил-2,3,4,6-тетра-О-ацетил--D-галактопиранозид.
Схема 8. Введение двух разных моносахаридных лигандов в иммобилизованные 2'-O-Me-олигорибонуклеотиды, Pr - защитные группы (protecting groups). i. CuSO4/TBTA/Аскорбат натрия/1-О-пропаргил-2,3,4,6-тетра-О-ацетил--D-маннопиранозид, ii. TMGA/NaI/DMF 65 C, или NaN3/NaI/DMF 65 C iii. CuSO4/TBTA/Аскорбат натрия/1-О-пропаргил-2,3,4,6-тетра-О-ацетил--D-галактопиранозид, iv. 33% NH3(водн.), 55 С.
Реакция маннопиранозы, содержащей терминальную тройную связь, с азидогруппой катализировалась системой CuSO4/аскорбат натрия. Присоединение моносахаридного фрагмента проводилось в присутствии трис[(1-бензил-1,2,3-триазол-4-ил)метил]амина (TBTA), образующего хелатный комплекс с ионами меди, что препятствует деградации олигонуклеотида в условиях проведения «click»-реакции. Далее атом брома в модифицированном олигонуклеотиде заменяется на азидогруппу. Наилучшие результаты были получены при использовании тетраметилгуанидиний азида (TMGA). Повторную «click»-реакцию проводили с пропаргил-2,3,4,6-тетра-О-ацетил--D-галактопиранозой. Деблокирование и удаление с полимерного носителя осуществлялось действием водного аммиака. Наличие моносахаридных фрагментов в составе синтезированных олигонуклеотидов подтверждалось данными ESI-MS-спектроскопии.
Два углеводных остатка в составе 2'-О-Me-РНК способствуют незначительной дестабилизации ее дуплексов с комплементарными последовательностями ДНК и 2'-О-Me-РНК. С увеличением числа вставок, содержащих дополнительные углеводные фрагменты, стабильность дуплексов падает.
Таким образом, был предложен способ, позволяющий вводить в олигонуклеотиды два разных заместителя. Описанный метод может быть использован для получения разветвленных миметиков ПАР.
Ингибирование ПАРП-I человека дисахаридными нуклеозидами - производными структурного элемента поли(ADP-рибозы).
Природные нуклеотиды и нуклеозиды являются слабыми ингибиторами ПАРП c IC50 около или более 1 мМ [Banasik M., Ueda K., 1994, Mol. Cell Biochem., 138, 185-197]. Их характеристики могут быть улучшены за счет введения соответствующих заместителей. В нашей работе был продолжен поиск ингибиторов ПАРП среди модифицированных аналогов структурного звена поли(ADP-рибозы). По известным методикам, исходя из 5-замещенных дезоксиуридинов, были синтезированы дисахаридные нуклеозиды, содержащие различные заместители в 5-м положении (таблица 5).
Таблица 5. Значения IC50 в реакции поли(ADP-рибозил)ирования, катализируемой рекомбинантной ПАРП-1 для различных дисахаридных нуклеозидов.
 | Заместитель X | IC50 мкM |
| X=F | >1000 | |
| X=I | 44 | |
| X=Ме | 38 | |
| 3-AB1 | 50 |
13-АВ-3-аминобензамид
Для определения ингибиторных характеристик дисахаридных нуклеозидов в реакции поли(ADP-рибозил)ирования, катализируемой рекомбинантной ПАРП, была использована тест-система, основанная на полимеризации меченного тритием по адениновому остатку NAD+ (исследования проводились совместно с Институтом химической биологии и фундаментальной медицины СО РАН, зав. лабораторией проф. Лаврик О.И.). В качестве показателя эффективности ингибирования использовали значение IC50 (таблица 5).
Дисахаридные нуклеозиды, представленные в таблице 5, обладают рядом структурных особенностей. Прежде всего, это наличие фармакофорной группы - карбоксамидного фрагмента в составе гетероциклического основания, что обеспечивает связывание с сайтом фермента, отвественным за связывание никотинамидного остатка (водородная связь с Ser-904 и Gly-863 ПАРП). Гидроксильные группы в составе углеводных остатков обеспечивают хорошую растворимость веществ в воде. Данные, приведенные в таблице 5, позволяют сделать вывод о влиянии заместителя Х на ингибиторные свойства дисахаридных нуклеозидов. Соединения, содержащие объемные заместители (X=I, Me), обладают гораздо большей активностью, сравнимой с активностью 3-аминобензамида (3-АВ).
Полученные результаты согласуются с данными рентгеноструктурного анализа (РСА) ПАРП в комплексе с рядом ингибиторов, близких по структуре гетероциклическим основаниям в составе полученных дисахаридных нуклеозидов. Согласно данным РСА, объемный заместитель X может увеличивать прочность связывания с ферментом, размещаясь в гидрофобном кармане (Ala898-Lys903) рядом с сайтом связывания никотинамида [Hattori K et al., 2004, J. Med. Chem., 47, 4151–4154].
Было решено проверить, как наиболее активные из полученных в данной работе соединений влияют на клетки. В институте молекулярной генетики РАН (м.н.с. А.С.Ефремова, руководитель сектора к.х.н. С.И.Шрам) было показано, что пиримидиновые дисахаридные нуклеозиды (X=I, Me) и их диальдегидные производные проникают в ядра клеток и ингибируют ПАРП. Исследования проводились на культуре опухолевых клеток SKOV-3 в условиях окислительного стресса (обработка перекисью водорода). Ингибирование ПАРП оценивали по окрашиванию ядер флуоресцентно мечеными антителами к поли(ADP-рибозе).
Таким образом, были обнаружены дисахаридные нуклеозиды, способные эффективно накапливаться в ядрах клеток и ингибировать ПАРП.
Также была изучена цитотоксичность синтезированного 3'-О-рибофуранозил-2'-дезокси-5-фторуридина на культурах клеток L1210, FM3A, Molt4, Cem и HeLa (проф. Я.Бальзарини, Рега институт, Бельгия). Активность дисахаридного нуклеозида оказалась примерно на три порядка ниже активности 5-фтордезоксиуридина. Можно предположить, что низкая активность пиримидиновых дисахаридных нуклеозидов в этих клетках обусловлена отсутствием ферментов, гидролизующих О-гликозидную связь.
Выводы
1. Впервые синтезирован большой ряд миметиков поли(ADP-рибозы) на основе дисахаридных нуклеозидов и их ациклических аналогов, в которых пирофосфатный остаток в природном полимере заменен на фосфатный. В этих соединениях сохранены основные важнейшие функциональные группы и расстояния между ними.
2. Предложены новые синтоны для получения олигонуклеотидов, содержащих азидоалкильные и бромалкильные группы для постсинтетической модификации, позволяющие вводить в 2'-положение олигонуклеотидной цепи различные заместители.
3. Впервые синтезирован 3'-O--D-рибофуранозиладенозин, который был выделен из листьев Arabidopsis thaliana при бактериальном заражении Pseudomonas syringae. Оптимизирован метод получения дисахаридных нуклеозидов.
4. Исследована стабильность 3',5'-О-(тетраизопропилдисилоксан-1,3-диил)нуклеозидов в основных средах и подобраны оптимальные условия для удаления ацильных защитных групп.
5. В ходе работы синтезировано 60 новых соединений, структура которых подтверждена данными масс-спектрометрии, УФ- и ЯМР-спектроскопии. В ряду синтезированных соединений обнаружены ингибиторы рекомбинантной поли(ADP-рибозо)полимеразы-1 с IC50 3-5.10-5 М.
Основное содержание работы отражено в следующих публикациях:
1. M.S.Drenichev, I.V.Kulikova, G.V.Bobkov, V.I.Tararov, S.N.Mikhailov. A New Protocol For Selective Cleavage of Acyl Protecting Groups in 3',5'-O-(Tetraisopropyldisiloxane-1,3-diyl)ribonucleosides. // Synthesis, 2010, № 22, 3827-3834.
2. A.Kiviniemi, P.Virta, M.S.Drenichev, S.N.Mikhailov, H.Lnneberg. Solid-Supported 2'-O-Glycoconjugation of Oligonucleotides by Azidation and Click Reactions. // Bioconjugate Chemistry, 2011, v. 22, 1249-1255.
3. S.N.Mikhailov, E.N.Timofeev, M.S.Drenichev, E.V.Efimtseva, P.Herdewijn, E.B.Roesch, M.M. Lemaitre. Oligonucleotides, containing N1-methyl-2'-deoxyadenosine and N6-methyl-2'-deoxyadenosine. // Current Protocols in Nucleic Acid Chemistry, 2009, Unit 4.36.1-4.36.19. Supplement 38. John Wiley & Sons.
4. M.S.Drenichev, G.V.Bobkov, V.I.Tararov, S.N.Mikhailov. Selective Cleavage of Acyl Protecting Groups in 2'-O-Modified 3',5'-O-(Tetraisopropyldisiloxane-1,3-diyl)ribonucleosides. Сollection Symposium series, 12, 403-404 (2011).
5. M.S.Drenichev, I.V.Kulikova, G.V.Bobkov, V.I.Tararov, S.N.Mikhailov. Stability of tetraisopropyldisiloxane-1,3-diyl blocking group. XIX International Round Table “Nucleosides, Nucleotides and Nucleic Acids” (Lyon, France, 29 August - 3 September 2010). Conference book, Abstract PA094, pages 245-246.
6. М.С.Дреничев, И.В.Куликова, Г.В.Бобков. Стабильность тетраизопропилдисилоксан-1,3-диил - защитной группы и ее использование в синтезе дисахаридных нуклеозидов. Тезисы XXIII зимней молодежной школы-конференции. ИБХ РАН (Москва, 7-10 февраля 2011). С.121. Сборник тезисов.
Работа выполнена при финансовой поддержке РФФИ, программы РАН «Молекулярная и клеточная биология» и ФЦП «Исследования и разработки по приоритетным направлениям
развития научно-технического комплекса России на 2007-2013 годы» (государственный контракт № 16.512.11.2239).
Список использованных сокращений.
Ado – аденозин
DBU – 1,8-диазабицикло[5,4,0]ундец-7-ен
DMSO – диметилсульфоксид
DMTr – диметокситритил
ESI-MS – electron-spray ionization spectroscopy, методика проведения съемки масс-спектра, основанная на ионизации направленным пучком электронов
IC50 – half maximal inhibitory concentration, концентрация ингибитора, при которой активность фермента составляет 50% от исходной
MALDI – matrix-assisted liser desorbtion ionization, методика проведения съемки масс-спектра, основанная на ионизации лазером
MMTr – монометокситритил
HMBC – heteronuclear multibond correlation, методика гетероядерной корреляции дальних взаимодействий
HSQC – heteronuclear single quantum coherence, методика гетероядерной {1H,13C}-одноквантовой корреляции
TBAF – тетрабутиламмоний фторид
TIPDS – тетраизопропилдисилоксан-1,3-диил
TMGA – тетраметилгуанидиний азид
Rib – остаток рибозы
ДХМ – дихлорметан
ДХЭ – 1,2-дихлорэтан
КССВ – константа спин-спинового взаимодействия
ПАРП – поли(ADP-рибозо)полимераза
ТГФ - тетрагидрофуран
