Механизмы регуляции длины теломер и дистанционных регуляторных взаимодействий у drosophila melanogaster.
На правах рукописи
УДК 575.22:595.773.4
Мельникова Лариса Сергеевна
Механизмы регуляции длины теломер и дистанционных регуляторных взаимодействий у Drosophila melanogaster.
03.01.07 – молекулярная генетика
Автореферат
диссертации на соискание ученой степени
доктора биологических наук
Москва
2013
Работа выполнена в Лаборатории регуляции генетических процессов Федерального государственного бюджетного учреждения науки Института биологии гена Российской академии наук (ИБГ РАН)
Научный консультант:
академик РАН, профессор Георгиев Павел Георгиевич
Официальные оппоненты:
доктор биологических наук Любомирская Наталия Вениаминовна
доктор биологических наук Набирочкина Елена Николаевна
доктор биологических наук Шпаковский Георгий Вячеславович
Ведущая организация: Федеральное государственное бюджетное учреждение науки Институт молекулярной и клеточной биологии Сибирского отделения Российской академии наук (ИМКБ СО РАН)
Защита диссертации состоится «19» марта 2013 года в «12 » часов
на заседании Диссертационного совета Д002.037.01 при Федеральном государственном бюджетном учреждении науки Институте биологии гена Российской академии наук (ИБГ РАН)
по адресу: 119334, г. Москва, ул. Вавилова, д.34/5.
С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Федерального государственного бюджетного учреждения науки Института молекулярной биологии им. В.А.Энгельгардта Российской академии наук
по адресу: 119991, г.Москва, ул. Вавилова, д.32.
Автореферат разослан «---» февраля 2013 года.
Ученый секретарь Диссертационного совета
кандидат фармацевтических наук Грабовская Л.С.
Общая характеристика работы
Актуальность работы:
Теломеры – это специализированные ДНК-белковые комплексы, находящиеся на концах линейных хромосом. Теломеры предохраняют концы хромосом от слипания, деградации, узнавания системой репарации ДНК. Таким образом, основной функцией теломер является обеспечение стабильности эукариотического генома. В настоящее время доказано, что поддержание строго определенного размера теломер критично для жизнедеятельности организма. Изменение длины теломер тесно связано с опухолеобразованием и старением клетки. У большинства высших эукариот теломеры состоят из простых повторов G-богатой последовательности, а их удлинение обеспечивается специальным ферментом - теломеразой. У Drosophila melanogaster теломеры состоят из мобильных элементов типа LINE, ориентированных «голова к хвосту» - HeT-A, TART и TAHRE. В результате проведенных в нашей лаборатории исследований было показано, что удлинение теломер дрозофилы может происходить по трем механизмам: с помощью транспозиции мобильных элементов на конец хромосомы; с помощью генной конверсии и с помощью рекомбинации между теломерными повторами. Основными структурными единицами нормальной теломеры являются: 1) терминальный комплекс – это белковый комплекс, формирующийся на конце хромосомы и защищающий его от ферментов репарации; 2)теломерный хроматин, который формируется на последовательностях теломерной ДНК. Данные структуры играют основную роль в процессе регуляции длины и стабильности теломер. Важной особенностью дрозофилы, является то, что у нее теломерный хроматин может формироваться на любой неспецифичной последовательности ДНК, в то время как у теломеразозависимых организмов теломерная структура формируется только при наличии строго определенных последовательностей, которые представляют собой сайты связывания для белков, формирующих теломерный хроматин. Необходимо отметить, что несмотря на различия в структуре теломер, у теломеразозавимых организмов и у дрозофилы существуют общие механизмы, обеспечивающие поддержание стабильного размера теломер. Во-первых, эксперименты, проведенные на дрожжах и млекопитающих, доказали, что при инактивации теломеразы у данных организмов индуцируется альтернативный механизм удлинения теломер, связанный с процессами конверсии\рекомбинации. В том числе, альтернативные механизмы удлинения теломер часто реализуются в раковых клетках. Во-вторых, в последнее время было найдено, что некоторые консервативные белки, участвующие в репарации ДНК, также принимают участие в формировании терминального комплекса, как у дрожжей и млекопитающих, так и у дрозофилы. Поэтому данные, полученные при изучении теломер дрозофилы помогут понять закономерности процесса регуляции длины теломер у различных эукариотических организмов и выявить основные белки, формирующие теломерный комплекс.
Также, актуальным направлением исследований современной молекулярной генетики является изучение функциональных взаимодействий между регуляторными элементами генома, расположенными на большом расстоянии друг от друга, и роли таких взаимодействий в регуляции транскрипции. Точная временная и тканеспецифичная транскрипция генов высших эукариот обеспечивается с помощью ряда регуляторных элементов. В настоящее время наиболее изучены различные типы энхансеров, усиливающих транскрипцию, сайленсеров, ослабляющих транскрипцию, и промоторов, обеспечивающих базовый уровень транскрипции. Часто регуляторные элементы находятся на очень больших расстояниях от промоторов и могут отделяться от них другими генами. Существует несколько моделей, объясняющих механизм дистанционных взаимодействий между регуляторными элементами. Наиболее популярна модель «выпетливания». Эта модель предполагает, что активация транскрипции происходит в результате прямого взаимодействия между транскрипционными факторами, связанными с энхансером и промотором, при этом ДНК между ними выпетливается. В образованной хроматиновой петле находятся не активные на данном этапе развития гены. Таким образом, модель «выпетливания» поднимает актуальный вопрос: как потенциально разнородные регуляторные элементы, входящие в состав cis-регуляторной области, игнорируют близкие к ним промоторы и взаимодействуют с промотором только своего гена-мишени? На энхансер-промоторные взаимодействия может влиять еще один тип регуляторных элементов, названных инсуляторами. Классическим свойством инсуляторов является их способность, располагаясь между энхансером и промотором, блокировать взаимодействие между ними. Но уже неоднократно, в том числе и в данной работе, показано, что взаимодействуя между собой, инсуляторы способны реорганизовывать пространственную структуру ДНК. Таким образом, они могут модулировать взаимодействия между энхансерами и промоторами и даже способствовать взаимодействию между регуляторными элементами, расположенными на расстоянии друг от друга.
Представленная работа посвящена выявлению молекулярно-генетических факторов, участвующих в регуляции длины теломер дрозофилы, исследованию свойств теломерного хроматина, а также изучению регуляторных последовательностей и белков, участвующих в организации и в поддержании дистанционных взаимодействий, влияющих на транскрипцию.
Цели и задачи исследования:
Основными целями работы были выявление и описание функций белков, участвующих в регуляции удлинения и в стабилизации теломер дрозофилы; описание свойств теломерного хроматина; функциональная характеристика регуляторных последовательностей и белков, обеспечивающих взаимодействие между регуляторными элементами генома, расположенными на большом расстоянии друг от друга. Для достижения целей работы ставились следующие задачи:
1. Провести функциональное сравнение двух мутаций, Tel и E(tc), влияющих на удлинение теломер дрозофилы.
2. Выяснить, какую роль белки HP1, Ku70 и Ku80 играют в регуляции удлинения теломер у Drosophila melanogaster.
3. Изучить влияние теломерного хроматина на:
- Polycomb–зависимую репрессию,
- частоту транспозиций Р–элемента,
- дистанционные взаимодействия в регуляторной системе гена yellow.
4. Детально исследовать структуру предпромоторной области гена yellow и выявить коммуникаторные элементы, обеспечивающие дистанционное взаимодействие между энхансером и промотором.
5. Изучить зависимость функционального взаимодействия между Su(Hw) инсуляторами от их взаимного расположения и расстояния между ними.
6. Изучить влияние инсулятора Su(Hw) на частоту транспозиций P-элемента.
7. Выяснить, способны ли сайты связывания GAF обеспечивать коммуникацию между регуляторными элементами, расположенными на большом расстоянии друг от друга.
8. Изучить взаимодействие между GAGA фактором и белком Mod(mdg4) в модельных системах in vitro и in vivo.
9. Выяснить, участвует ли белок Zeste в обеспечении дистанционных взаимодействий между энхансером и промотором гена white.
Научная новизна и практическая ценность работы:
Большинство генов, контролирующих длину теломер, в настоящее время неизвестны. В представленной работе впервые показано, что несмотря на весьма близкую генетическую локализацию, два доминантных генетических фактора, Telomere elongation (Tel) и Enhancer of terminal gene conversion (E(tc)), являются разными мутациями, но при этом влияют на один и тот же механизм удлинения теломер – терминальную конверсию. Обе мутации тестировались в модельной системе, основой которой являются Х хромосомы дрозофилы с терминальными обрывами в регуляторной области гена yellow. Эта модельная система использовалась практически во всех экспериментах по изучению структуры и свойств теломерного хроматина. Результаты экспериментов свидетельствуют, что данная система может служить хорошим инструментом in vivo анализа происходящих на конце хромосомы событий и тестирования различных факторов, участвующих в поддержании определенной структуры и размера теломер. Кроме того, точное описание функциональных свойств мутаций Tel и E(tc) позволяет использовать их для быстрой модификации модельной системы и получения линий дрозофил, несущих на конце хромосом заранее заданные последовательности ДНК. Накопленный в ходе выполнения работы методический и фактический материал в дальнейшем может быть использован научными коллективами, ведущими сходные по тематике исследования.
Ранее было найдено и изучено лишь несколько отдельных белков, входящих в состав теломерного комплекса дрозофилы: это НР1 (основной компонент гетерохроматина), HOAP (белок, взаимодействующий с НР1), Mre11/Rad50 (белки систем репарации и рекомбинации). В представленной работе впервые в различных модельных системах подробно изучалось влияние мутаций гена Su(var)2-5, кодирующего белок HP1, и делеций генов, кодирующих Ku80 и Ku70, на частоту терминальных генных конверсий и присоединений к концу хромосомы HeT-A/TART элементов. Показано, что частота терминальных генных конверсий на фоне уменьшения количества белка HP1 значительно возрастает, если на конце хромосомы присутствуют тандемные копии гомологичных последовательностей. В прочих модельных системах мутации Su(var)2-5 значительно увеличивают частоту присоединений HeT-A/TART транспозонов к концам терминально делетированных хромосом. Уменьшение концентрации белков Ku70 и Ku80 так же значительно увеличивает частоту присоединений HeT-A/TART элементов и частоту элонгации терминальной ДНК путем генной конверсии. Эффект Df Ku80 более выражен, чем эффект Df Ku70. Однако снижение концентрации Ku70 приводит к дестабилизации концов терминально делетированных хромосом. Кроме того, белки Ku70 и Ku80 не влияют на транскрипцию HeT-A элементов. Таким образом, гетеродимер Ku70/Ku80 играет важную роль в защите концов хромосом у Drosophila, тогда как белок HP1 преимущественно регулирует транскрипцию HeT-A элементов.
С помощью различных модельных систем были исследованы свойства теломерного хроматина, формирующегося на концах терминально делетированных хромосом. На основании полученных результатов сделано заключение, что размер теломерного хроматина составляет 4-5 т.п.н. и эта структура способна блокировать взаимодействия между различными регуляторными белковыми комплексами.
Обобщенный анализ изложенных выше результатов и относящихся к теме исследования данных из литературных источников позволил сформулировать новую модель механизма регуляции длины теломер дрозофилы, основанную на антагонизме между теломерным и субтеломерным хроматином и предполагающую наличие T-петли на концах хромосом дрозофилы.
В предпромоторной области гена yellow впервые была локализована последовательность, необходимая для поддержания дистанционных взаимодействий между промотором yellow и либо стимулирующими транскрипцию энхансерами, либо репрессирующим транскрипцию инсулятором.
Было изучено взаимодействие между инсуляторами, находящимися на различном расстоянии друг от друга и влияние такого взаимодействия на энхансер-промоторную коммуникацию. Показано, что энхансер-блокирующая активность инсуляторов зависит от их взаимного расположения и от расстояния между ними. Кроме того, белковый комплекс Su(Hw) инсулятора препятствует связыванию транспозазы с концами P-элемента, если инсулятор присутствует в составе транспозона. Эти данные являются еще одним свидетельством многообразия регуляторных функций инсуляторов в процессе жизнедеятельности эукариотической клетки.
В ходе работы подробно изучалось функциональное взаимодействие между сайтами связывания белков GAF и Zeste, которые, как предполагалось, играют важную роль в организации дистанционных взаимодействий в геноме, а также взаимодействие между этими белками и Su(Hw) инсулятором. Продемонстрировано, что в дрозофиле сайты связывания GAF не могут обеспечить дистанционные взаимодействия между промотором модельного гена и активатором транскрипции. Однако взаимодействие между белком GAF и компонентом Su(Hw) инсулятора, белком Mоd(mdg4)-67.2, позволяет энхансерам преодолеть блокирующее действие инсулятора. Эти данные помогают по-новому взглянуть на роль BTB-содержащих белков в организации дистанционных регуляторных взаимодействий.
Также, было показано, что белок Zeste не нужен для базовой активности промотора гена white, как предполагалось в нескольких выполненных ранее работах. Доказано, что белок Zeste, обеспечивает дистанционное взаимодействие между энхансером и промотором гена white. Кроме того, так же как белок GAF, в модельной системе гена white Zeste помогает преодолеть Su(Hw) зависимую инсуляцию.
Таким образом, представленная работа имеет большое значение для развития фундаментального направления современной молекулярной генетики. Кроме того, изучение регуляторных элементов эукариотического генома и механизмов взаимодействия между ними имеет большое практическое значение. В настоящее время искусственно созданные векторы, экспрессирующие заданные гены под контролем определенного набора регуляторных элементов, широко применяются в биотехнологии и в фармацевтике. Поэтому представленные результаты могут быть использованы при создании конструкций с определенным сочетанием регуляторных элементов, обеспечивающих эффективную и стабильную экспрессию трансгена, не зависящую от геномного окружения.
Апробация работы:
Результаты работы были представлены на следующих симпозиумах и конференциях: Annual Drosophila Research Conference – Ежегодная конференция по исследованиям на дрозофиле (США, 2004, 2005, 2006); конференции «Advances in Molеcular Cell Biology» (Москва, 2004); на 10-ой Пущинской школе-конференции молодых ученых «Биология – наука XXI века» (Пущино, 2006); на международной конференции молодых ученых Young Scientist Forum (Вена, 2007); на 32-ой конференции FEBS (Вена, 2007); на международной молодежной научно-методической конференции «Проблемы молекулярной и клеточной биологии» (Томск, 2007); на международной студенческой биологической конференции (Ереван, 2009); на 13-ой Пущинской школе-конференции молодых ученых «Биология – наука XXI века» (Пущино, 2009); на отчетных конференциях по программе фундаментальных исследований Президиума РАН «Молекулярная и клеточная биология» (Москва, 2005, 2007, 2009); на межинститутском семинаре «Хромосома» (Москва, 2007,2012).
Публикации:
По результатам диссертации опубликовано 17 научных статей, из которых 11 статей в рецензируемых международных и 6 в российских научных журналах; 2 из перечисленных статей являются обзорными публикациями.
Объем и структура диссертации:
Диссертация изложена на 265 страницах и состоит из разделов: введение, обзор литературы, материалы и методы, цели и задачи исследования, результаты исследования и их обсуждение, выводы и список литературы. Диссертация содержит 60 рисунков и 11 таблиц. Библиография включает 281 литературный источник.
Содержание работы
1. Изучение структуры теломерного хроматина и механизма регуляции длины теломер у Drosophila melanogaster.
1.1 Функциональное сравнение генетических факторов Telomere elongation (Tel) и Enhancer of terminal gene conversion (E(tc)).
Ранее в нашей лаборатории было показано, что у дрозофилы удлинение теломер может происходить по трем механизмам: с помощью транспозиции мобильных элементов на конец хромосомы, с помощью генной конверсии и с помощью рекомбинации между теломерными повторами (Kahn et al., 2000). В 2002 году у Drosophila melanogaster были найдены два доминантных генетических фактора, влияющие на удлинение теломер – это Telomere elongation (Tel) (Siriaco et al., 2002) и Enhancer of terminal gene conversion (E(tc)) (Melnikova and Georgiev, 2002). Мутация Tel, выделенная из природной линии Gaiano, существенно увеличивает количество мобильных элементов HeT-A и TART в теломерных районах хромосом. Мутация Tel была идентифицирована при помощи in situ гибридизации политенных хромосом линии Oregon, несущей хромосому 3 из линии Gaiano, с фрагментами ДНК HeT-A и TART элементов. Поэтому неизвестно, какой именно механизм – присоединение новых ретротранспозонов или конверсия/рекомбинация между гомологичными последовательностями мобильных элементов – привел к увеличению количества HeT-A и TART (Siriaco et al., 2002).
В отличие от Tel, мутация E(tc), обнаруженная в лабораторной линии y w, практически не влияет на присоединение HeT-A и TART элементов, но значительно повышает частоту терминальной генной конверсии. Функциональная роль E(tc) изучалась при помощи линий с терминально делетированной Х хромосомой, в которых терминальный обрыв находился в регуляторной области гена yellow (yTD*) (Melnikova and Georgiev, 2002).
С помощью генетической рекомбинации оба фактора, Tel и E(tc), были локализованы в районе 91-93 хромосомы 3R. Этот район включает более 320 т.п.н. и 27 описанных на настоящий момент генов. Возникает вопрос: являются ли Tel и E(tc) одной и той же мутацией или это мутации в различных генах?
Чтобы выяснить, может ли Tel так же как E(tc) вызывать увеличение частоты терминальных генных конверсий, мы решили протестировать мутацию Tel в обычно используемой нами модельной системе. Для этого аутосомы в выбранных для работы линиях yTD*/y1 w заменили на хромосому 2(G2/G2) или 3(G3/G3) из линии Gaiano. С помощью генетических скрещиваний были получены контрольные линии yTD*/y1w;CyO/If; TM6,Tb/MKRS,Sb, в которых все аутосомы являлись балансерными хромосомами, т.е. не несли какие-либо факторы, влияющие на изменение длины теломер; линии yTD*/y1w;G2/G2; TM6,Tb/MKRS,Sb, которые несли хромосому II из линии Gaiano и линии yTD*/y1w;CyO/If; G3/G3, которые несли хромосому III из линии Gaiano.
Обычно для изучения структуры и функций теломерных последовательностей используются линии Drosophila melanogaster, несущие терминальные делеции. В таких линиях концевые последовательности ДНК, формирующие нормальную теломеру, отсутствуют, и концы Х хромосом находятся в регуляторной или кодирующей областях гена yellow. Локус yellow определяет пигментацию кутикулы, при этом степень пигментации прямо кореллирует с уровнем транскрипции, что позволяет визуально тестировать экспрессию гена. Ген yellow находится на дистальном конце Х хромосомы. Гемизиготные самцы или гомозиготные по уTD хромосоме самки не выживают, т.к. между геном yellow и теломерой находятся несколько жизненно важных генов. Поэтому для поддержания терминально делетированных хромосом используют различные балансерные линии.
Изначально были выбраны 3 линии, в которых концы терминально делетированных хромосом находились на расстоянии -80 п.н.( yTD-80), -100 п.н.( yTD-100), -140 п.н.( yTD-140) от сайта инициации транскрипции гена yellow (Рис.1). В исходных линиях yTD* отсутствовали энхансеры, отвечающие за пигментацию тела и крыльев, терминальный обрыв хромосомы находился в непосредственной близости от промотора yellow, но в интроне гена присутствовал энхансер, отвечающий за окраску щетинок, поэтому мухи имели неокрашенные тело и крылья и вариабельно окрашенные щетинки – фенотип уv. В таких линиях присоединение содержащего промотор HeT-A элемента к концам терминально делетированных хромосом приводит к появлению мух, у которых все щетинки становятся полностью окрашенными - фенотип у2 (Kahn et al., 2000). В используемых линиях хромосома yTD* была сбалансирована хромосомой y w. Аллель y w не мешает фенотипическому анализу, т.к. вследствие замены нуклеотида в ATG кодоне ген yellow не экспрессируется. Однако в линии yTD*/ y w хромосома, несущая аллель y w, может служить матрицей для терминальной генной конверсии (Mikhailovsky et al., 1999). Поэтому удлинение хромосомы yTD* может происходить как с помощью присоединений мобильных элементов, так и с помощью терминальных конверсий. Появление в результате конверсии перед промотором гена yellow последовательности размером до 1700 п.н. также приводит к возникновению у2 фенотипа. После введения в линии yTD-80, yTD-100 и yTD-140 аутосом из линии Gaiano и балансерных хромосом в потомстве были отобраны отдельные самки, имеющие фенотип у2. Необходимо отметить, что такие самки появились только в линиях yTD*/y w; CyO/If; G3/G3. Отобранные самки были индивидуально скрещены с самцами у ac w, у которых на Х хромосоме отсутствовали последовательности гена yellow. Структура терминально делетированных хромосом в потомстве этих скрещиваний была изучена с помощью Саузерн-блот анализа и ПЦР-анализа с использованием праймеров из промоторной области гена yellow и из 5' нетранслируемой области HeT-A. Выяснилось, что генетический фактор Tel, находящийся в линии Gaiano на хромосоме 3 вызывает два типа событий. Было установлено, что в одних производных линиях удлинение хромосомы произошло вследствие присоединения HeT-A элемента, в других же при помощи терминальной генной конверсии.
Чтобы понять, как в присутствии Tel соотносятся частота конверсионных событий и частота присоединений мобильных элементов к концу хромосомы, мы использовали две производные линии, в которых мухи имели фенотип у2 и неокрашенные аристы, а терминальный обрыв хромосомы находился на расстоянии -900 п.н.( yTD-900) и -1100 п.н.( yTD1100), т.е. в непосредственной близости от энхансеров тела и крыльев yellow (Рис.1).
