Влияние фракций сапропеля с антиоксидантными свойствами на непрерывное внутрисосудистое свертывание крови и толерантность к тромбину (экспериментальное исследование)

На правах рукописи

Созонюк Александр Данилович

ВЛИЯНИЕ ФРАКЦИЙ САПРОПЕЛЯ С АНТИОКСИДАНТНЫМИ

СВОЙСТВАМИ НА НЕПРЕРЫВНОЕ ВНУТРИСОСУДИСТОЕ

СВЕРТЫВАНИЕ КРОВИ И ТОЛЕРАНТНОСТЬ К ТРОМБИНУ

(экспериментальное исследование)

03.01.04 – Биохимия

Автореферат диссертации на соискание ученой степени

кандидата медицинских наук

Уфа – 2012

Работа выполнена в Государственном бюджетном образовательном учреждении высшего профессионального образования «Тюменская государственная медицинская академия» Министерства здравоохранения и социального развития Российской Федерации.

Научный руководитель:

доктор медицинских наук, профессор Сулкарнаева Гульнур Ахмеровна

Официальные оппоненты:

Заведующий кафедрой лабораторной диагностики Института последипломного образования ГБОУ ВПО «Башкирский государственный медицинский университет» Минздравсоцразвития России, доктор медицинских наук, профессор

Гильманов Александр Жанович

Заведующий кафедрой биохимии ГБОУ ВПО «Омская государственная медицинская академия» Минздравсоцразвития России,

доктор медицинских наук, профессор

Высокогорский Валерий Евгеньевич

Ведущая организация

Государственное бюджетное образовательное учреждение высшего профессионального образования «Московский государственный медико-стоматологический университет» Минздравсоцразвития России

Защита состоится «22» мая 2012 г в 12 часов на заседании диссертационного совета Д 208.006.03 при Государственном бюджетном образовательном учреждении высшего профессионально образования «Башкирский государственный медицинский университет» Минздравсоцразвития Росии по адресу:

г. Уфа, ул. Ленина, 3.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке ГБОУ ВПО «Башкирский государственный медицинский университет» Минздравсоцразвития России, г. Уфа, ул. Ленина, 3.

Автореферат разослан «21» апреля 2012 года

Ученый секретарь

доктор медицинских наук, профессор Мирсаева Г.Х.

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность проблемы. Анализируя литературу последних лет мы обратили внимание на экстракт из сапро­пелевых грязей, из которых выделены ин­гибиторы свертывания, влияющие на плаз­менный и тромбоцитарный гемостаз (О.А.Русакова, 1993; И.Э.Полле и др., 2001). Показано, что в сапропеле (сырье доступном и недорогом) содержатся эффекторы свертывания крови, которые могут быть выделены как индивидуальные беспримесные продукты. Торможение ими гемокоагуляции реализуется преимущественно на уровне коагуляционных превращений фибриногена (ФГ) и агрегации тромбоцитов (АДФ- и адреналининдуцируемую). Особенно важным нам показалось то, что эти эффекторы при внутримышечном и интраперитонеальном введении лабораторным животным малоток­сичны, и отличаются широким терапевтическим диапазоном действия [Е.А. Чирятьев и др., 2008; Э.А.Ортенберг и др., 2008; А.Е.Бушин и др., 2008].

В последние десятилетия особый интерес [А.Ш.Бышевский, 1984; А.Ш.Бышевский и др., 2003; А.И.Бродер, 2004; Г.А. Сулкарнаева, 2004], представляет характер влияния антикоагулянтов на скорость непрерывного внутрисосудистого свертывания крови (НВСК) - процесс медленно про­текающий, а при ускорении разнообразными воздействиями, перерастающий в диссеменированное внутрисосудистое свертывание крови (ДВСК), сопровождающее многие патологические состояния [З.С.Баркаган, 1998; И.Н.Бокарев, 2002]. Вместе с тем влияние антикоагулянтов из сапропелей, перспективных с позиций медицинской практики, на НВСК и способность организма противостоять ускорен­ному образованию тромбина - ключевого энзима гемостаза – не изучено. Именно появление тромбина инициирует (через накопление активных форм ФГ) неферментативный этап образования нестбильного или растворимого фибрина. Тромбин же через активацию ф.XIII обеспечивает переход расстворимого фибринаs в фиб­рин нерасстоворимый. [А.С.Шитикова, 2000; Л.П.Папаян, 2003].

Интерес к оценке интенсивности НВСК, про­текающего в условиях здоровья с малой скоростью [Д.М.Зубаиров, 1976, 2000; А.Ш.Бышевский и др., 1984, 2003], обусловлен тем, что при экстремальных воз­дей­ствиях сдвиги уровня маркеров НВСК поз­воляют различать наклонность к гипер - и гипокоагуляции [А.П.Момот, 1990; И.Н.Бокарев, 2002; М.К.Умутбаева, 2005]. Кроме того, показано, как соотносятся уровень маркеров НВСК и толерант­ность к тромбину (ТкТР), что и позволило оценивать её неинвазивным приёмом. Это важно потому, что ранее известные способы оценки ТкТР требуют парентерального введения тромбина, что в клинике недопустимо.

Поставив перед собой задачу, получить данные о перспективности использования антикоагулянтов из сапропеля в коррекции гиперкоагулемических состояний (т.е. выяснить их влияние на устойчивость организма к воздействиям, вызывающим гипертромбинемию), мы сформулировали цель представленной работы.

Цель исследования – оценить влияние очищенных фракий экстракта сапропеля на интенсивность непрерывного внутрисосудистого свертывания крови и толерантность к тромбину в физиологических условиях и после воздействий, изменяющих интенсивность НВСК в эксперименте.

Задачи исследования

1. Выделить эффекторы гемокоагуляции из сапропеля, влияющие преимущественно на неферментативную фазу фибринообразования.

2. Изучить их влияние в нетоксичных дозах на сверты­вающую активность крови, плазменный уровень маркеров НВСК и толерантность к тромбину (ТкТР).

3. Изучить влияние фракций экстракта сапропеля на свертывающую активность крови, НВСК и ТкТР, используя модели, характеризующиеся гипер- и гипокоагулемическими сдвигами.

4. Изучить изменения НВСК и ТкТР при введении экстракта сапропеля у животных. 5. В эксперименте сравнить влияние эффекторов из сапропеля на толерантность к тромбину.

Научная новизна. Установлено, что сочетание, двух фракций из экстракта сапропеля, содер­жащих олигопептиды с противосвертывающей активностью, при вну­три­венном однократном введении дозазависимо снижает на 24 ч коагулопотенциал (замедление НВСК и рост ТкТР).

Впервые найдено, что эти эффекты дозазависимы и, прогрессируя в первые часы после однократного введения, постепенно ослабляются, сохраняясь достоверно выраженными в течение 12 часов (р < 0,05).

Обнаружено, что снижение коагулопотенциала олигопептидами более выражено при гиперкоакуляции, спровоцированной разными по природе и механизмам воздействиями (глубокий эфирный наркоз, экзогенная адреналинемия, кровопотеря, интенсивная физическая нагрузка, введение прооксидантов), а также усугубляет гипокоагулемию, вызываемую угнетением липидпероксидации (ЛПО) факторами, объединенными лишь тем, что они вызывают снижение уровня липидпероксидов, скорости индуцированной оксидации и удлиняют период индукции (гипотиреоз, введение разных соединений с антиоксидантными свойствами).

Впервые установлено, что при повторных введениях этих олигопептидов (интервал - 12 ч) их эффекты на гемостаз выше вызванных первой инъекцией на 10-12% (р < 0,05).

Впервые найдено, что при разнообразных по этиологии гипер- и гипокоагулемиях, введение исследуемых олигопептидов снижает скорость НВСК и повышает ТкТР.

Впервые установлено, что при их введении ТкТР, отражающая готовность системы ге­мо­стаза к ответу на изменения скорости тромбиногенеза, тесно отрицательно ассоци­ирована с интенсивностью НВСК, и что теснота этой связи не зависит от степени изме­нения коагулопотенциала (значения rs при изменениях коагулопотенциала колеблется от -0,83 до -0,91). Это подтверждает возможность использования неинвазивного метода оценки ТкТР в изучении регуляции неферментативного этапа фибринообразования (можно использовать его и при изучении ингибиторов самосборки фибрина).

Практическая ценность. Апробирован способ получения суммы антикоагулянтов, действующих на уровне неферментативного этапа свертывания крови, из недорогого сырья, запасы которого практически неограничены. Уточнены механизмы действия суммы исследуемых олигопептидов как антикоагулянта. Учитывая, что эти эффекторы ограничивают плазменные и тромбоцитарные компоненты гемостаза in vivo и in vitro, и не обладают острой и хронической токсичностью в эксперименте, как показано ранее [Е.А.Чирятьев и др., 2000; А.Е.Бушин и др., 2008 а, б, в], следует расширить их углубленное изучение, в том числе их токсикологический аспект.

Полученные данные могут использовать научные учреждения, изучающие молекулярные механизмы регуляции неферментативного этапа свертывания крови.

Основные положения, вынесенные на защиту

1. Сумма двух фракций из экстракта сапропеля, включающих олигопептиды с противосвертывающей активностью, при внутривенном однократном введении дозаза­ви­симо снижает на 24 ч интенсивность НВСК, ограничивая скорость тромби­ногенеза, что сопровождается увеличением способности организма адекватно реа­гировать на гипертромбинемию – т.е. ростом ТкТР.

2. Эффекты суммы исследуемых олигопептидов дозазависимы и нарастают в первые часы после однократного введения, постепенно ослабляясь к к 12-му часу.

3. Снижение коагулопотенциала при введении этих олигопептидов заметнее на фоне гиперкоагуляции, вызванной разными по природе и механизмам воздействиями (глубокий эфирный наркоз, экзогенная адреналинемия, кровопотеря, интенсивная физическая нагрузка, введение прооксидантов). На фоне гипокоагулемии, вызванной угнетением ЛПО (гипотиреоз, введение разных соединений с антиоксидантными свойствами), олигопептиды снижают уровень липидпероксидов, скорость индуцированной оксидации и удлиняют период индукции.

4. При повторных введениях эти олигопептидов (интервал 12 ч) их эффекты на гемостаз воспроизводятся, превышая вызванные 1-й инъекцией не более, чем на 10-12% (р < 0,05).

5. При экспериментальных ситуациях (разных по этиологии гипо- или гиперкоагулемиях) введение исследуемых олигопептидов из сапропеля замедляет НВСК и повышает ТкТР, тесно и отрицательно ассоциирующуюся с НВСК - теснота связи не зависит от степени изменения коагулопотенциала. 6. Неинвазивный метод определения ТкТР может использоваться при изучении регуляции нефермента­тивного этапа фибринообразования.

Апробация. Результаты работы были доложены и обсуждены на россйской конференции "Актуальные проблемы теоретической и прикладной биохими", посвещенной 80 – летию со дня рождения Р.М. Лившица (Челябинск, 2009 г.); Всероссийской конференции " Разработка, исследования и маркетинг новой фармацевтической продукции. (Пятигорск, 2010); 45-й всероссийской научной конференции с международным участием студентов и молодых ученых (Тюмень, 2011); Всероссийской научно-практической конференции биохимиков и специалистов по лабораторной медицине " Медицинская биохимия и клиническая лабораторная диогностика в аспекте модернизации научных исследований" (Омск, 2011); на совместном заседании кафедр биохимии, гигиены с основами экологии, фармакогнозии, технологии лекарств с курсом ботаники, аналитической и органической химии с курсом токсикологии (Тюмень, 2012)

Публикации. Материалы диссертации опубликованы в 8 научных статьях, включая 3 работы в изданиях, рекомендованные ВАК Минобразования России.

Личное участие автора. Проведение экспериментов, обработка и интерпретация экспериментальных данных, а также подготовка к публикации основных результатов исследования по диссертационной работе и их апробация выполнялись лично автором или при его непосредственном участи.

Связь с планами научно-исследовательских работ. Диссертационная работа выполнена в соответствии с планом НИР ГБОУ ВПО ТюмГМА Минздравсоцразвития России. Номер государственной регистрации 01.200964768.

Объем и структура работы. Материалы исследования, включая указатель литературы, изложены на 134 страницах машинописного текста. В работе содержатся 21 рисунок и 15 таблиц. Диссертация состоит из введения, обзора литературы (76 российских и 160 зарубежных источников), главы, содержащей 5 подразделов, где изложены результаты собственных исследований, заключение и выводы.

Содержание работы

Материалы и методы исследования. Из сапрофеля озера Большой Тараскуль (Тюменская обл.) выделены два олигопептида по методу, предложенному Е.А. Чирятьевым (1989). Объе­ди­ненная фракция сапропеля, содержащая оба олигопептида, отличалась малой токсич­ностью (IV группа) при парентеральном введении (крысы и мыши). Полученный продукт не отличался от ранее описанного [Е.А.Чирятьев и др., 1989, 2008; А.Е.Бушин, 2006, 2009].

Изучив хроматографический профиль полученного и очищенного нами продукта из сапропеля (гель-фильт­рация), мы нашли, что он содержит две фракции с активностью ингибитора самосборки (ИС), как это было показано и ранее: полученная нами хроматограмма активной фракции сапропеля и хроматограмма такой же фракции, полученной ранее [А.Е.Бу­шин, 2009], подтвердили это. То же подтвердили одинако­вые объемы выхода из колонки максимальных количеств ИС 1-й и 2-й фракции, а также его близкая антикоагулянтная активность (на массу очищенной от гуминовых кислот смеси обеих фракций).

Выбор животных. Опыты провели на нелинейных белых крысах-самцах (390 осо­бей, 168±13 г и 200±15 г.) Объем быстро отбираемой пробы (до 35-40 мл/кг массы тела) достаточен для изучения намеченного комп­лекса тестов, и обеспечивает соблюдение гемостазиологи­ческих требований к взятию крови. Важно и то, что есть данные о примерных дозировках факторов, которые мы использовали для провокации гипо- и гиперко­гуле­мии [В.П.Балуда и др., 1980; З.С.Бар­каган, 1998].

Все опыты включали контрольную группу (интактные животные), исклю­чая слу­чаи с коротким интервалом между сериями (общая контрольная группа). Кровь брали у наркотизированных крыс (диэтиловый эфир) силиконированным шприцом из обнаженной овальным разрезом яремной вены (стабилизатор 3,8% р-р ци­трата натрия, 1:9). Рану закрывали кожным швом (кетгут).

Оценивали ТкТР через 0.5 ч после внутривен­ной инъекции тромбина, в дозе, предусмотренной методом, описанным ниже. Для оценки НВСК определяли продукты, уровень которых позволяет судить об интенсивности внутрисосудистого взаимодействия тромбин-фибриноген, отражающей скорость НВСК: содержание ПДФ (маркера коагуляционной активности или компенсаторной активации фибринолиза, определяли по описанию [А.Ш.Бышевский и др., 1991]; содержание D-димеров (мкг/мл эквивалентов ФГ) - маркеров коагуляционной активности [Н.К.Зяблицкая 2003; de De P.Moerloose, F.Boehlen, 2003] - определяли, используя набор «D-dimer test» (Roche); содержание растворимых комплексов мономерного фибрина (РКМФ) - определяли количественным вариантом фенантролиновым тестом [А.П.Момот и др., 1999]; концентрацию в плазме ФГ. Для оценки свертываю­шей активности крови определяли АВР и тромбиновое время (ТВ) [Г.Н.Детинкина и др. 1984]; общую коагуляционную активность тромбоцитов (ОКАТ) [А.Ш.Бышев­ский и др., 1996]; ТкТР - определяли согласно описанию к патенту [А.Ш.Бышев­ский и др., 2003]. Метод основан на оценке степени изменения фибриногенемии после внутривенной инъекции стандартной дозы тромбина интактным и подвергающимся воздействиям крыс. Схема определения ТкТР: раствор тромбина (активность - 24 с) ввести в яремную вену фиксированной на станке крысы. Пробу крови взять через 30 мин (0.9 мл в шприц с 0.1 мл 3.8% раствора тринатрийцитрата). Определить содержание коагулируемого тромбином ФГ для установления степени сдвига фибриногенемии - меры ТкТР животного. Содержание ФГ определяли спектрофотометрически, устанавливая содержание ФГ по калибровочной кривой.

Результат рассчитывали по формуле, учитывающей концентрацию ФГ в плазме крови интактных крыс (исходный уровень) и концентрацию ФГ после введения тромбина (остаточная концентрация): D = {1- [(Ск – Со) : Ск]} х 100, где где D – остаточная концентрация ФГ, (%), Ск – концентрация у крыс, которым тромбин не вводили и воздействиям не подвергали (исходный уровень); Со – концентрация ФГ у крыс, которым ввели тромбин после изучающегося воздействия (остаточная концентрация). Остаточную концентрацию (D) у крыс, которым тромбин ввели, принимали за 100-процентную величину ТкТР, и устанавливали степень изменения (в %) ТкТР при конкретном воздействии по формуле: Х% = (Do : Dк)х100, где X - ТкТР в %, Do – остаточная концентрация ФГ (в %) у крыс подопытной группы, Dк - остаточная концентрация ФГ (в %) у группы крыс, не подвергавшейся изучаемому воздействию (контрольная группа). Результат расчета (ТкТР, %) позволяет судить о направлении и степени влияния изучаемых воздействий на ТкТР, т.е. на способность организма животного отвечать на тромбообразование.

Мономерный фибрин (МФ) получали, используя модификацию [Е.А. Чирятьев, 1990]. Концентрацию МФ определяли на спектрофотометре. (Т.П. Угарова, В.А. Белицер, 1978). Скорость самосборки фибрина определяли в системе, содержащей 0,5 мл 0,075 М боратного буфера с рН 7,6, 0,1 мл исследуемого экстракта и 0,1 мл раствора МФ. В контроле заменяли экстракт равным объемом растворителя. Проти­во­свертывающую активность фракций экстракта оценивали по их вли­янию на взаимодействие тромбин-ФГ и на время аутополимеризации МФ in vitro [Е.А. Чирятьев, 1990]). Результаты выражали значениями эффективности торможения (i) по формуле: i = 1 - Vo/Vk, где Vo и Vk - скорость реакции в опыте и контроле соответственно. При необходимости содержание антикоагулянтов во фракциях выражали в единицах активности (ЕА), принимая за 1 ЕА количество эффектора, ак­тив­ность которого (i) равна 0,3.

Статистическая обработка результатов. Статистическую обработку данных, проводили с помощью медикобиологической программы Biostat 4.03 [С.А.Гланц, 1998]. Использовали метод вариационной статистики для малых рядов наблюдений, вычисляя среднюю арифметическую (М), среднюю ошибку средней арифметической (m) и среднеквадратическое отклонение (). Сопоставляя интенсивные показатели, использовали альтернативное варьирования, определяя те же статистические величины. Достоверность отличий оценивали, вычисляя доверительный коэффициент Стъюдента (t) и степень вероятности (р). Взаимосвязи переменных оценивали методом ранговой корреляции Спирмена, рассчитывая коэффициенты Rs. Различия рассматривали как достоверные при степени вероятности ниже 0.05 (р < 0,05). Графический анализ выполняли в системе Microsoft Graf, используя приложение MS Word 2003. Корректность трендов, оценивали по значению коэффициентов аппроксимации (R2).

Чтобы установить тип кооперации эффектов двух воздействий, результаты опытов подвергали математической обработке, позволяющей различать в их суммарном действии наличие синергизма, антагонизма или суммации. Для этого использовали уравнение М.Диксона и Э.Уэбба, [1966], которое может иметь знак (=, <, >), сое­диняющий его обе части: I. i1,2 = (i1 + i2) - (i1 х i2); II. i1,2 < (i1 + i2) - (i1 х i2); III. i1,2 > (i1 + i2) - (i1 х i2), где i1 парциальный эффект одного фактора, i2 - парциальный эффект второго фактора, i1,2_эффект, установленный при одновременном воздействии обеими факторами. Значение i (эффективность воздействии) рассчитывали как частное от деления показателя эффекта, выраженного в виде интенсивной величины в опыте, на такую же величину в контроле, вычитая частное от единицы. Результат, отвечающий уравнению I - признак суммации, уравнению II - антагонизма и уравнению III - синергизма.

В работе использованы следующие коммерческие препараты и реагенты: тромбин и ФГ бычьей крови, тромбопластин (кадаверный лиофилизированный), кефалин, набор «D-dimer test” фирмы «Roche», каолин (легкая фракция), димефосфон (г.Казань), соли, основания и кислоты, - х.ч., этанол медицинский (после двукратной перегонки), реагенты 1-й, 2-й, 3-й и 5-й фирмы («Технология-стандарт»)

РЕЗУЛЬТАТЫ СОБСТВЕННЫХ ИССЛЕДОВАНИЙ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ

Гемостатические сдвиги у крыс после выхода из глубокого наркоза (без предварительного введения ИСПП и с его введением) иллюстрирует рисунок 1.

Рис.1. Степень отклонения (в % от контроля АВР, ТВ, маркеров НВСК и ТкТР после выхода крыс из наркоза (без введения ИСПП и с его введением).

При введении ИСПП ускорены ТВ, АВР и НВСК (рост уровня всех маркеров, особенно D-диме­ров), и значительно снижена ТкТР. Достоверно снижен уровень ФГ, рост коа­гу­ло­потенциала достиг той степени, когда ускоряется потребление ФГ, что и ранее находили при эфирном наркозе [С.Л.Галян и др., 2004]. Здесь, видимо, развитие гипокоагулемии - следствие потребления ФГ из-за первичной гиперкоагуляции. Это же находили и при других и стрессвоздействиях [В.Г.Соловьев, 1997; А.Э.Шабанов и др., 1999].

У крыс, которым вводили ИСПП, КП, напротив, уменьшился: удли­не­ны АВР, ТВ и уровень маркеров НВСК в плазме, а ТкТР снизилась примерно в 2 раза. Следовательно, введение ИСПП животным с заметно повышенным после наркоза КП, ограничило гиперкоагуляционные сдвиги.

Сходные данные получили и в опытах, где рост КП стимулировали введением адреналина - факт известный и неоднократно подтвержденный [В.П.Балуда, 1958, 1981; Е.М.Шаповалова, 2010]. В наших опытах контрольным крысам вводили 0,85% раствор NaCl, а подопытным - ИСПП (30мг/кг). Через 3 ч (на высоте действия ИСПП) вводили адреналин, отбирая пробы крови одновременно у контрольных и подопытных крыс.

У контрольных крыс введение адреналина сократило АВР и ТВ, снизило уровень ФГ (рис.2). Следовательно, адреналин повысил КП до степени, сопровождаюшейся ускоренным потреблением ФГ, как это было и после наркоза. Повышены в плазме контрольных крыс и уровни всех маркеров НВСК, а ТкТР снизилась.

И рост коагулопотенциала и ускорение НВСК, и снижение ТкТР после введения адреналина выражены менее заметно, чем после выхода наркоза. Отношение КП/ТкТР - величина, отличающаяся постоянством при многих по этиологии гипо- и гиперкоагуляционных состояниях. [Г.А. Сулкарнева, 2006; Е.М.Шаповалова и др., 2007]. Это соотношение, если КП выражен (как в наших опытах) уровнем плазменных маркеров НВСК, позволяет прогнозировать падение толерантности к тромбину, которая, и снизилась в обсуждаемом экспе­ри­менте.

Рис. 2. Степень отклонений (в % от контроля) АВР, ТВ, маркеров НВСК и ТкТР после введения адреналина (30 мкг/кг, внутримышечно)

Это наблюдение, неоднократно опи­санное, и послужило основанием для суждения о ТкТР по уровню в плазме крови ПДФ и фибрина (они и являются соединениями, которые считают маркерами НВСК) [A.Sh.Byshevsky e.a., 2008, 2010; В.А. Полякова и др., 2010]. Введение ИСПП крысам, получившим адреналин, как и в опытах с гиперкоагуяционным состоянием, вызванным наркозом, существенно ограничило сдвиги в гемостазе.

Как вид воздействий, ускоряющих тромбиногенез (следовательно, и повышение КП), мы использовали модель эндогенной тромбинемии, вызываемой кровопотерей (известно, что при извлечении крови растет КП [В.Г.Со­ло­вьев, 1997; М.К.Умубаева, 2005; Р.Г.Алборов, 2006]). На рис. 3 видно, что через 6 ч после кровопотери растет свертываемость крови (укорочение АВР и ТВ). Степень гиперкоагуляции здесь была такой, что ускорилось потребление ФГ, как и при вышерассмотренных моделях. Этому соответствовало ускорение НВСК (прирост уровня ПДФ, РКМФ и D-димеров, а также и снижение ТкТР, более выразительное, чем в предыдущих опытах).

Рис. 3. Степень отклонений (в % от контроля) АВР, ТВ, уровня маркеров НВСК и ТкТР через 6 ч после кровопотери (~25% от ОЦК).

Далее, мы провели опыты, применив ещё один способ вызывания гипер­коагуляции - воздействие, ускоряющее липидпероксидацию (ЛПО). Здесь гиперкоагулемию моделировали введением свинца (его введение ускоряет ЛПО [И.А.Мухачева и др.,1992; А.Ш.Бышевский и др., 2004; R.G.Alborov, 2004], следовательно и рост уровня липидпероксидов, сопровождающийся повышением КП [С.Н.Ельдецова,1990; А.Ю.Рудзевич и др., 2003] преимущественно за счет активации тромбоцитов [С.Л.Галян и др., 2005; В.А.Полякова и др., 2007]. Рисунок 4 демонстрирует результаты опыта, в котором крысам на фоне предварительного обогащении рациона ацетатом свинца вводили ИСПП.

Рис. 4. Степень отклонений (в % от величин у контрольных крыс) АВР, ТВ, маркеров НВСК и ТкТР у крыс, получавших 25 дней с рационом ацетат свинца (50 мг/кг ежедневно) под воздействием ИСПП.

Здесь видно, что введение свинца в контроле повысило КП: сократилось АРВ, ТВ и снизился уровень ФГ в крови ( как и на рис. 1-3). Как и при дру­гих моделированных нами гиперкоагулемиях вырос уровень всех маркеров НВСК и снизилась ТкТР, а введение ИСПП все эти сдвиги ограничило. Следовательно, и в этом случае, т.е. при введении прооксиданта (свинца), вызывающего гиперкоагулемию через другие механизмы, выявлены сходные сдвиги: рост коагулопотенциала, ускорение НВСК и снижение ТкТР. Мы разместили в одной системе координат степень отклонения каждого из показателей от контроля, сдвиги которого приняты за нуль.

Рис. 5. Степень отклонения АВР, ТВ, маркеров НВСК и ТкТР у крыс, подвергавшихся наркозу, введению адреналина, кровопотере или введению свинца (в % от показателей у контрольных крыс). В поле рисунка расположены коэффициенты аппроксимации (R2)

Линейный тренд показателя динамики сдвигов ТкТР в зависимости от степени гиперкоагулемии отличается самым высоким значением коэффициента аппроксимации - R2 = 0,86 (рис.5).

Вместе с тем сдвиги ТкТР отрицательно ассоциированы с уровнем маркеров НВСК, R2 которых колеблются в малых пределах и в небольшой мере удалены от единицы - величины, которая отражала бы стопроцентную зависимость ТкТР от увеличения интенсивности НВСК. Так же выглядят и результаты анализа степени сдвигов у крыс, которым после воздействий, вызывавших гиперкоагуляцию, вводили ИСПП (рис. 6).

Таким образом, анализ результатов эксперимента подтверждает, что при изменениях КП введением ИСПП, ограничивающим преимущественно самосборку фибрина (Е.А. Чирятьев 1990, выявляется отрицательная зависимость между сдвигами НВСК и ТкТР.

Следовательно, эта закономерность присуща не только состояниям гемостаза, смо­делированным воздействием прокоагулянтов на 1-ю или 2-ю фазы свертывания [А.Ш.Бышевский и др., 2009; Р.Г.Алборов и др., 2009; М.Г.Галушко и др., 2009], но и воздействиями, меняющими скорость неферментативных превращений ФМ – самосборки растворимого фибрина. Причем в этом отношении эффект ИСПП из сапропеля, близок, и даже несколько выше аналогичного эффекта витаминов с анти­оксидантными свойствами, влияющими преимущественно на активность тромбоцитов [Е.М.Шаповалова и др., 2007; В.Г.Соло­вьев, и др., 2007; А.Ш.Бышевский, и др,, 2009].

Рис. 6. Отклонения АВР, ТВ, маркеров НВСК и ТкТР у крыс, подвергавшихся наркозу, введению адреналина, кровопотере или введению свинца с последующим внутривенным введением ИСПП (в % от показателей у интактных крыс). (В поле рисунка расположены значения коэффициентов аппроксимации - R2).

Далее мы изучили эффекты ИСПП, вводившегося при воздействиях, снижающих КП. Гипокоагуляцию моделировали введением двух разных по механизму действия соединений. Одно из них – димефосфон (ДМ) – синтетический продукт со свой­ст­вами антиоксиданта - он тормозит ЛПО особенно в тромбоцитах [И.А.Де­мен­тьева и др., 1997; Г.А.Сулкарнаева и др., 2004]. Выполняя эксперимент с введением ДМ (1 г/кг – в такой дозе он снижает активность тромбоцитов [М.К.Умутбаева, 2003]) - мы моделировали снижение коашуляционной активности и сопоставили в эффект ИСПП на фоне ДМ и без него. Видно, что введение ДМ снижает КП (удлинение АВР и ТВ), замедляет НВСК (снижен уровень маркеров НВСК), при одновременном росте ТкТР и уровня ФГ. У крыс, которым за 3 ч до отбора проб ввели ИСПП эти сдвиги усилились. Особенно заметно снизился уровень маркеров НВСК и увеличилась ТкТР, а изменения достоверны не только к контролю, но к показателям у крыс, которым на фоне ДМ ввели ИСПП. Следовательно, действие ИСПП усилило эффект ДМ (или ДМ усилил эффект ИСПП?). Графики сдвига интересующих нас величин у этих крыс (рис. 7).

Рис. 7. Отклонения (в % от величин в контроле) АВР, ТВ, уровня маркеров НВСК и ТкТР под воздействием ИСПП у крыс, получавших 15 дней ДМ с рационом (1,0 г/кг).

Оценив одновременное действие двух факторов приемом М.Дик­сона и Э.Уэбба, нашли, что эффекты ДМ и ИСПП на все определявшиеся показатели гемостаза потенцированы (величина эффекта отвечает формуле III - i1,2 > (i1 + i2) - (i1 х i2).

Далее, используя как фактор, вызывающий гипокоагулемию, тиреостатик 6-метидтиоурацил (6-МТУ) - его введение снижает КП за счет развития гипотиреоза [А.Ш.Бышев­ский, 1965; Р.Г.Алборов, О.Ф.Мысник, 2001; С.Г.Аптекарь, 2003], - нашли, что на фоне 6-МТУ введение ИСПП усугубляет гипокоагулемическиие сдвиги. Так, на рис. 8 видно, что введение крысам 6-МТУ снизило у них коагулопотенциал: удлинились АВР и ТВ, замедлилось НВСК, а ТкТР, напротив, возросла.

Рис. 8. Степень отклонений под воздействием ИСПП (в % от контроля) АВР, ТВ, маркеров НВСК и ТкТР у крыс, получавших 20 дней с рационом 6-МТУ (300 мг/кг).

Введение ИСПП на этом фоне усилило все сдвиги примерно в той же мере, как его введение на фоне ДМ. Более того, как и в опытах с ДМ, ИСПП потенцировал действие 6-МТУ на все величины, (исключение - уровень ФГ), что установили приемом М.Дик­сона и Э.Уэбба.

Таким образом, ИСПП ограничивает сдвиги, связанные с гиперкоа­гуляцией, и потенцирует изменения, наблюдаемые под влиянием воздействий, вызывающих гипокоагулемические сдвиги. Важно и то, что как на фоне гиперкоагуляции, так и на фоне воздействий, снижающих КП, введение ИСПП сопровождается противоположно направленными сдвигами НВСК и ТкТР. Их отрицательная и тесная ассоциация подтверждена и с помощью ранговой корреляции по Спирмену - при сопоставлении сдвигов каждого из маркеров НВСК со сдвигами величин ТкТР значения rs ко­ле­ба­лись от - 0,78 до - 0,89 по данным, полученным в опытах.

Естественно, представляло интерес рассмотреть экспериментально дозазависимость эффекта ИСПП на все изучающиеся показатели в условиях гиперкоагуляции. Принимая во внимание, что использовавшаяся нами в экспериментальных ситуациях доза ( 30 мг ИСПП на кг массы тела) достаточно эффективна, мы для определения дозазависимости, использовали эту дозу и дозы, составляющие 1/3 и 1/6 её часть (линейное изменение дозы). Результаты опытов представлены на рис. 9. Как и в других опытах эффект оценивали как (процент отклонения величин, наблюдаемых под воздействием определенной дозы ИСПП от контрольной величины). На графиках видно, что введение ИСПП в дозах 5, 10 и 30 мг/кг изменяло степень сдвигов АВР и ТВ у крыс, подвергшихся кровопотере: сдвиги показателей уменьшались линейно с повышением дозы. Следовательно, КП снижался пропорционально дозе (коэффици­енты аппроксимации трендов (R2) близки к единице – 0,99 и 0,98 соответственно.

Линейно же ограничивался вызванный кровопотерей прирост уровня всех маркеров НВСК (значения R2 для ПДФ, РКМФ и D-димеров равны соответственно 0,88, 0,86 и 0,92). Следовательно, с увеличением дозы ИСПП, наряду с линейным снижением КП, также линейно уменьшается и скорость НВСК. В то же вре­мя ТкТР линейно (R2 = 0,92) возрастает при повышении дозы ИСПП.

Анализ взаимосвязи каждого из определявшихся маркеров НВСК с определением rs, выявил следующее: с увеличением дозы ИСПП степень ограничения прироста содержания в плазме ПДФ, РКМФ и D-димеров находится в обратной отрицательной связи с ТкТР. Связь эта достаточно тесная, особенно в паре D-димеры-ТкТР – величина rs при сопоставлении сдвигов этих двух величин равна 0,99, в то время как в других парах (ПДФ и ТкТР, РКМФ и ТкТР) она составила 0,88 и 0,91 соответственно.

Эти данные подкрепляют защищаемое в течение трёх-четырёх послед­них лет положение об отрицательной связи между интенсивностью НВСК и ТкТР [A.Sh. Byshevsky e.a., 2008; А.Ш.Бы­шевский и др., 2011; М.Г.Галушко, С.Л.Галян, 2011 М.Г.Галушко, 2011].

Рис. 9. Зависимость степени и направления сдвигов (в % от показателей у крыс, которым ИСПП не вводили) АВР, ТВ, уровня маркеров НВСК и ТкТР у крыс при внутри­венном введении разных доз ИСПП, осуществленном на фоне гиперкоагулемии, вызванной предварительной кровопотерей, составляющей ~ 25% ОЦК.

Далее, определив сдвиги тех же показателей через 0,5, 1 и 2 ч после введения эффекивной дозы ИСПП (30 мг/кг) интактным животным, мы получили возможность оценить динамику изменения эффекта ИСПП за время, прошедшее после его внутри­венного введения. Как и ранее, графически анализировали интенсивные вели­чины, т.е. степень отклонения цифровых выражений отдельного показателя от его значения у контрольных крыс, получавших 0,85% раствор NaCl (рис. 10).

Рис. 10. Сдвиги и направленность изменений АВР, ТВ, уровня маркеров НВСК и ТкТР (в % от контроля, где крысам вводили 085% NaCl) через 0,5, 1 и 2 ч у крыс при в/в введении ИСПП на фоне здоровья.

На рисунке видно, что характер трендов, отражающих зависимость степени сдвигов от времени, прошедшем после введения ИСПП, свидетельствует об их увеличении. Особенно удлинились АВР и ТВ. В значительной мере с увеличением интервала между инъекцией и отбором проб росла степень снижения плазменного уровня маркеров НВСК и повышалась ТкТР (все это по отношению к контрольной группе). Видно и то, что в интервале между 0,5 и 1,0 ч после введения ИСПП прирост эффектов выше, чем в интервале между двумя и тремя часами, где прирост эффекта ИСПП не так велик. Видно, что и после 6 ч по введении ИСПП гипокоагуляция усугубилась, но в меньшей мере, чем на более ранних этапах. Так как в способности организма противостоять угрозе тромбообразования особенно важна роль именно ТкТР мы провели дополнительный опыт, оценивая ТкТР через 3, 4, 6 и 8 ч по введении ИСПП. Оказалось (рис. 11), что с 8-го часа после введения ИСПП величина ТкТР снижается и постепенно кривая зависимости от времени приближается к абсциссе, уменьшаясь до сравнительно небольших величин. Через 13 ч по введении ИСПП величины ТкТР не отличается от контроля.

Динамику изменения НВСК и ТкТР при введении экстракта сапропеля мы исследовали, вводя ИСПП здоровым животным, не подвергавшимся каким-либо дополнительным воздействиям, и сопоставляли результаты с данными контрольных групп, где крысам вводили равный объем 0,85% р-ра NaCl. Из-за необходимости повторного отбора проб крови в этом опыте ограничились определением только ТкТР и одного из маркеров НВСК – уровня D-димеров. Степень снижения величины всех основных маркеров НВСК по сути равноценна.

Рис. 11. График зависимости влияния ИСПП на ТкТР от времени после введения, увеличенного до 12 ч. Абсцисса – время после введения, ордината – степень изменения ТкТР в процентах относительно к контрольному значению.

Как следует из графика рис. 12, при повторном введении ИСПП лишь достоверно возросла (относительно контроля) степень сдвига уровня D-димеров. При введениях ИСПП в 3-й, 4-й и 5-й раз сдвиги нарастали в виде тенденции, не подтверждающейся статистически. Малая величина коэффициента аппроксимации тренда (0,69) свидетельствует о слабо выраженной линейности этого небольшого при­роста. Обсуждаемый эксперимент продлили, осуществляя введение ИСПП каждые 12 часов и отбирая пробы после 8, 12 и 16-й инъекций ингибитора. Результаты эксперимента (рис. 13) свидетельствуют, что и после бльшего числа инъекций степень сдвигов уровня D-ди­меров и ТкТР была несколько бльшей, чем после первой инъекции, а при последующих инъекциях сдвиги отличалась от найденных после первой из них не более, чем на 2-4% (p > 0,05).

Рис. 12. Изменения уровня D-димеров (D-д) и ТкТР (в % от контроля) при повторном (пятикратном) введении ИСПП (отбор проб везде через 6 ч после введения). Абсцисса - порядковые номера повторных введений ИСПП, ордината – степень отклонения от контроля, в котором крысам вводили 0,85% р-р NaCl.

Можно заметить, что графики рисунков 12 и 13 почти одинаковы и это позволяет считать, что ИСПП при введении с интервалом в 12 ч вызывает эффект на НВСК и ТкТР, найденный после 1-го введения

Рис. 13. Сдвиги уровня D-димеров (D-д) и ТкТР (в % от контроля) при 8-ми, 12-ти- и 16-кратном введении ИСПП (отбор проб - через 6 ч). Абсцисса - порядковые номера повторных введений, ордината – отклонения от контроля (вводили 0,85% р-р NaCl).

Кроме того, статистически недостоверная, но закономерно повторяющаяся тенденция увеличения эффекта, начиная с 3-го введения ИСПП, указывает на возможность сдерживать повторными инъекциями интенсивность НВСК на постоянно сниженном уровне, и сохранять высокое значение ТкТР по крайней мере в течение недели. Заметим, что здесь, как и в ранее рассмотренных ситуациях, интенсивность НВСК (по уровню D-димеров) и величина ТкТР обнаружили достаточно тесную отрицательную корреляцию – величина rs оказалось равной - 0,89.

Мы сопоставили действия ИСПП на ТкТР, устанавливаемую использованным нами неинвазивным способом, с результатами инвазивного способа её оценки, который не может применяться при обследовании человека (вводить даже низкие дозы тромбина внутривенно (вообще парентерально) недопустимо в связи с его способностью уже в следовых количествах запускать механизмы аутоактивации тромбинообразования [Б.А.Кудряшов, 1975]. В этом опыте речь шла об оценке влияния ИСПП на частоту выживания крыс, которым внутривенно вводили тромбин в токсичных дозах, вызывающих гибель животных вследствие развивающихся тромбозов [Б.А. Кудряшов, 1960; Л.В Михайлова, 1970; R.G.Al­borov, 2004]. Отбор крыс здесь был более строгим: в опыт брали крыс, мало разнящихся по массе тела (175±6,7 г), а перед экспериментом две недели содержали в абсолютно одинаковых условиях (одно помещение, одинаково освещенные клетки, одинаковое питание и по-парное разделении на группы непосредственно перед опытами). Животных распределили на 3 группы: контроль (вводили 0,85% р-р NaCl, 0,5 мл/100 г), опыт 1-й (вводили тот же объем ИСПП (30 мг/кг в 0,85% р-ре NaCl, 0,5 мл/100 г), опыт 2-й (воздействия на животных те же, что в опыте 1-м). Через 3 и 6 ч после инъекции ИСПП (т.е. в момент, когда его эффект макси­мален, с крысами опыта 1-го провели тромбиновую пробу (ввели внутривенно раствор тромбина активностью 17 с DL 50%) и учитывали число выживших в течение 24 ч. У животных опыта 2-го брали пробу крови (также через 3 и 6 ч по введении ИСПП), и определяли ТкТР неинвазивным приемом. Для лучшего восприятия и анализа результатов приводим их графически (рис. 14). При обращении к рисунку, прежде всего, видим, что оба приема оценки ТкТР выявили её рост и через 3 и через 6 ч. При обоих приёмах величины ТкТР выше контроля и через 3 ч и через 6 ч после введения ИСПП. Разница между результатами невелика: при инвазивном методе после 6 ч выживаемость повысилась с 45 до 51% (р < 0,05), по результатам уровень D-димеров с 163 до 179% (р < 0,05). Это сравнительно небольшое увеличение ТкТР между третьим и четвертым часом после введения ИСПП согласуется с данными, представленными на рис. 12, согласно которым через 6 ч после введения ИСПП выявляется максимальное ограничение общей свертывающей активности крови (позднее эффект ингибитора имеет лишь статистически неподтверждаемую тенденцию к усилению).

Рис. 14. Толерантность к тромбину, установленная инвазивным (светлые столбцы) и неинвазивным (темные столбцы) при введении ИСПП. При инвазивном способе размерность ТкТР - процент выжив­ших крыс, при неинвазивном – процент от величины ТкТР у интактных крыс.

Таким образом, неинвазивный метод определения ТкТР выявляет ту же направленность её изменений, как и инвазивный способ. Различие состоит лишь в том, что по данным инвазивного способа (по частоте выживания животных после введения тромбина в дозе DL50) ниже, чем по результатам оценки ТкТР неин­вазивным приемом, основанном на оценке НВСК по уровню её маркеров (даже одного из них - D-димеров). Впрочем, этот феномен отмечен авторами неинвазивного способа в описании, прилагаемом к патенту [А.Ш.Бы­шев­ский и др., 2000]. Отметим, что один из авторов метода определения ТкТР [Р.Г.Алборов, 2006], использованного нами, также находил примерно такие же различия между результатами неинвазивного и инвазивного способов оценки ТкТР. Свя­зано это, с нашей точки зрения, с тем, что частоту выживания крыс при внутривенном введении токсичных доз тромбина, учитывают в течение 24 ч. За это время крысы гибнут не только из-за низкой ТкТР, но в зависимости от тромбообразования в сосудистом русле. Другими словами - выживае­мость зависит не только от антикоагулятного потенциала у особи, но и от индиви­дуальных особенностей кровоснабжения различных регионов.

Заключение. Источником ИСПП, взятого в одном из многих озер юга Тюменского региона, послужил продукт, вклю­чаю­щий две фракции олигопептидов с противосвертывающими свойствами, реализующимися главным образом на неферментативном этапе коагуляционных превраще­ний ФГ. Исследованная нами суммарная фракция из экстракта сапропеля по способности вызывать гипокоагуляцию строго соответствуют данным, описанным Е.А.Чирятьев и др.,1998, 2008. Это, а также ранее установленная малая токсичность ИСПП при эффективных дозах и разных путях введения, позволили реализовать задачи, предусмотренные целью нашей работы. Основная из них - выяснить, как изменяются показатели состояния гемостаза (НВСК и ТкТР), позволяющие оценить готовность организма к адекватному ответу на воздействия, вызывающие гиперкоагуляцию, следовательно, и повышающие риск тромбообразования. Началу исследований предшествовало изучение эффекта ИСПП в широком диапазоне доз (5, 10, 30, 50 мг/кг) на состояние КП в течение 1-36 часов после инъекции. Результаты этой части работы позволили осуществить выбор испытуемой в дальнейшем дозы и интервала между её введением и отбором проб крови для исследований.

При реализации следующих задач выяснилось, что ИСПП при внутривенном введении снижает общую свертывающую активность крови, проявляющуюся существенным удлинением АВР и ТВ, снижением уровня продуктов коагуляционного превращения ФГ, растворимых комплексов мономерного фибрина и D-димеров. Так как все эти продукты - следствие взаимодействия тромбина со своим специфическим субстратом (ФГ) убыль их уровня в плазме крови свидетельствует о замедлении непрерывно протекающего в кровотоке коагуляционного превращения ФГ, т.е. о замедлении НВСК. При выполнении очередной задачи выяснилось, что и в условиях гиперкоагулемии введение ИСПП уменьшает плазменный уровень тех же продуктов, т.е. замедляет ускоренное НВСК. Важно и то, что ИСПП вызывает этот эффект независимо от причины, обусловившей гиперкоагулемию. Введение ИСПП крысам с гипокоагулемией, спровоцированной факторами, отличающимися по механизму дейст­вия на гемостаз, усугубляет сдвиги - сниженный у этих животных уровень маркеров НВСК, падает в ещё большей степени.

Эффекты ИСПП на гемостаз характеризуются дозазависимостью в физиологических условиях и на фоне гиперкоагуляции – ограничивают ускорение НВСК, гиперкоагуляции – усугубляют торможение процесса. Эффекты ИСПП отличаются по выраженности в зависимости от времени, прошедшего после введения продукта – в первые часы наблюдается нарастание эффекта, затем постепенное ослабление изменений. Во всех изученных ситуациях повышению уровня маркеров активации свертывания сопутствует снижение ТкТР, а в ситуациях, которые сопровождаются снижением уровня тех же маркеров, толерантность к тромбину возрастает.

Оказалось, что повторное введение ИСПП с интервалом в 12 ч позволяет поддержи­вать высокую тромбинорезистентность, хотя заметного роста эффекта ИСПП при повторном введении не происходит.

Полученные результаты, в целом, обосновывают целесообразность дальнейшего доклинического исследования этих олигопептидов и сопропеля с целью создания на их базе нового эффективного и относительно доступного препарата - антикоагулянта, ограничивающего преимущественно неферментативный этап фибринообразования.

ВЫВОДЫ

1. Сочетание двух фракций из экстракта сапропеля озера Большой Тараскуль, включающую два различающихся по молекулярной массе олигопептида (ИСПП), при введении в кровоток здоровым животным дозазависимо снижает свертывающую активность крови на протяжение 6 -24 часов после однократной инъекции с максимумом эффекта через 3-6 ч после введения.

2. Введение в кровоток ИСПП ограничивает рост КП, провоцируемого у животных разными по характеру воздействиями - эфирным наркозом, введением адреналина, кровопотерей, физической нагрузкой, ускорением ЛПО.

3.Введение в кровоток ИСПП усугубляет снижение коагуляционного потенциала.

4. Эффекты ИСПП дозазависимы, нарастают в первые часы после однократного введения и постепенно снижаясь, сохраняются в течение 12 ч (р <0,05).

5. При повторных введениях ИСПП с интервалом в 12 ч эффекты на гемостаз воспроизводятся, превышая вызванный первой инъекцией, не более, чем на 10-12% (разница между эффектом 1-го и 16-го введений достоверна - р<0,05).

6. Во всех ситуациях, сопровождающихся экспериментально спровоцированным сниже-нием или ростом коагуляционного, введение ИСПП ограничивает интенсивность непрерывного внутрисосудистого свертывания крови и увеличивает ТкТР.

7. Толерантность к тромбину, тесно и отрицательно ассоции­рована с интенсивностью непрерывного внутрисосудистого свертывания крови; теснота связи не зависит от степени изменения коагулопотенциала (значение rs при разных величинах коагулопотенциала колеблется в небольших пределах от -0,83 до -0,91).

8. Как ингибитор неферментативной полимеризации фибрин-мономера, выделяемый из доступного и недорогого сырья, ИСПП, - перспективный объект дальнейших исследований.

Список работ, опубликованных по теме диссертации

1. Созонюк А.Д. Защитное действие экстракта сапропеля при экспериментальной тромбопластинемии /Созонюк А.Д., Ортенберг Э.А., Шаповалов П.Я., Русакова О.А., Чирятьев Е.А.// Медицинская наука и образование Урала. – 2009. – 4(60). – С.46-47.

2. Созонюк А.Д., Пептидные ингибиторы свертывания крови: биохимический и фармакологический аспекты /Калинин Е.П., Созонюк А.Д., Ортенберг Э.А., Шаповалов П.Я., Русакова О.А., Чирятьев Е.А.// Медицинская наука и образование Урала.–2010.–2(62).–С.127-133.

3. Созонюк А.Д. Ингибиторы самосборки фибрина растительного происхождения. /Бышевский А.Ш., Сулкарнаева Г.А., Чирятьев Е.А., и др.//Медицинская наука и образование Урала.-2012.-С.11-15

4. Созонюк А.Д., Влияние антикоагулянтной фракции сапропеля на биоэлектрическую активность миокарда лабораторных животных /Созонюк А.Д., Ортенберг Э.А., Шаповалов П.Я., Русакова О.А., Чирятьев Е.А.// «Актуальные проблемы теоретической и прикладной биохимии» Российская конф., посвященная 80-летию со для рождения Р.И. Лифшица, Челябинск. 5-8 октября 2009г. С.158-160.

5. Созонюк А.Д. Токсикологическая характеристика экстракта сапропеля при его субхроническом введении /Созонюк А.Д., Ортенберг Э.А., Шаповалов П.Я., Русакова О.А., Чирятьев Е.А.//«Актуальные проблемы теоретической и прикладной биохимии» Российская конф., посвященная 80-летию со для рождения Р.И. Лифшица, Челябинск. 5-8 октября 2009г. С.253-255.

6. Созонюк А.Д., Влияние экстракта сапропеля на некоторые жизненные функции лабораторных животных /Созанюк А.Д.// Разработка, исследование и маркетинг новой фармацевтической продукции: сб. науч. Тр. – Пятигорск. - 2010. -Вып.65. - С.507.

7. Созонюк А.Д. Природные Антикоагулянты из озерных иловых отложений /Чирятьев Е.А., Шаповалов П.Я. // Материалы 45-й Всероссийской научной конференции с международным участием студентов и молодых ученых. - Тюмень. – 2011. – С.39-40.

8. Созонюк А.Д., Прокоагулянты Растительного Происхождения. Выделение и природа /Созонюк А.Д., Кашеев В.В.// Медицинская биохимия и клиническая лабораторная диагностика в аспекте модернизации системы научных исследований: материалы Всероссийской научно-практической конференции биохимиков и специалистов по лабораторной медицине. – Омск.-2011. - С. 272-273.

Принятые сокращения

АВР Активированное время рекальцификации

ИС Ингибитор самосборки

ИСПП Ингибитор самосборки пептидной природы

ЛПО Липидпероксидация

НВСК Непрерывное внутрисосудистое свертывание крови

ОЦК Объем циркулирующей крови

ПДФ Продукты деградации фибрина

ТВ Тромбиновое время

ТкТР Толерантность к тромбину

ФГ Фибриноген

КП Коагуляционный потенцеиал

КА Коагуляционная активность

Созонюк Александр Данилович

ВЛИЯНИЕ ФРАКЦИЙ САПРОПЕЛЯ С АНТИОКСИДАНТНЫМИ

СВОЙСТВАМИ НА НЕПРЕРЫВНОЕ ВНУТРИСОСУДИСТОЕ

СВЕРТЫВАНИЕ КРОВИ И ТОЛЕРАНТНОСТЬ К ТРОМБИНУ

(экспериментальное исследование)

03.01.04 – биохимия

Автореферат диссертации на соискание ученой степени

кандидата медицинских наук

Лицензия № 0177 от 10.06.96 г.

Подписано к печати 18.04.2012 г.

Отпечатано на ризографе с готового оригинал-макета,

представленного авторами.

Формат 60х84 1/16. Усл.-печ. л. 1,5 Уч.-изд. л. 1,5.

Тираж 100 экз. Заказ № 21.

450000, г. Уфа, ул. Ленина, 3,

ГБОУ ВПО БГМУ Минздравсоцразвития России