Влияние замораживания-отогрева и криопротекторов на структуру цитохрома р-450 и содержащих его мембран
АКАДЕМИЯ НАУК УКРАИНЫ
ИНСТИТУТ ПРОБЛЕМ КРИОБИОЛОГИИ И КРИОМЕДИЦИНЫ
На правах рукописи
ДЮБКО Татьяна Станиславовна
ВЛИЯНИЕ ЗАМОРАЖИВАНИЯ-ОТОГРЕВА И КРИОПРОТЕКТОРОВ
НА СТРУКТУРУ ЦИТОХРОМА Р-450 И СОДЕРЖАЩИХ ЕГО МЕМБРАН
03.00.22 - криобиологии
А в т о р е ф е р а т
диссертации на соискание ученой степени
кандидата биологических наук
Харьков - 1992
Работа выполнена в Институте проблем криобиологии и криомедицины АН Украины
Научный руководитель: кандидаг физ.-мат. наук,
старший научный сотрудник
О.А.Нардид
Научный консультант: доктор биологических наук,
профессор
В.А.Моисеев
Официальные оппоненты: доктор физ.-мат. наук,
профессор
Ю.П.Благой
кандидат биологических наук,
старший научный сотрудник
Л.Ф.Розанов
Ведущая организация: Институт фотобиологии АН Беларуси,
г.Минск
Защита состоится "23" декабря 1992 г. в 15 час. 30 мин на заседании Специализированного совета Д 016.60.01 по специальности "криобиология" в Институте проблем криобиологии и криомедицины АН Украины по адресу: 310015, г. Харьков, ул.Переяславская, 23.
С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Института проблем криобиологии и криомедицины АН Украины. Автореферат разослан "23 " ноября 1992 г.
Ученый секретарь Специализированного совета,
доктор медицинских наук А.Н.Гольцев
ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ
Актуальность темы. Исследование механизмов криорезистентности и криоповреждений, поиск оптимальных условий криозащиты на различных уровнях структурной организации биологических объектов является актуальной задачей современной криобиологии, имеющей теоретическое и прикладное значение (В.И.Грищенко, 1985).
Анализ многочисленных экспериментальных исследований свидетельствует о том, что криоповреждение биологических мембран сводится в основном к нарушению взаимодействия между главными структурообразующими элементами мембран — белками и липидами (А.М.Белоус, В.А.Бондаренко, 1982). В то время как термоиндуцированным структурным перестройкам липидного компонента мембран посвящено множество работ, влияние низких температур и криопротекторов на изменение структурно-функционального состояния мембранных, в особенности, интегральных белков, мало изучено. Сложность структурной организации природных мембран и, как следствие этого, неоднозначность интерпретации получаемых результатов, позволяющие лишь косвенно оценить роль интегральных белков в реакции биомембран на действие замораживания-отогрева и криопротекторов, диктует необходимость проведения исследований на модельных системах. В качестве такой системы нами были выбраны протеолипосомы, образованные фосфолипидами и интегральным микросомальным белком цитохромом Р-450 ЛМ2 (КФ 1.14.14.1).
Цель и задачи исследования. Целью работы явилось изучение влияния замораживания-отогрева и низкомолекулярных криопротекторов на структурно-функциональное состояние изолированного и встроенного в искусственные мембраны цитохрома Р-450, а также на структурное состояние искусственных фосфолипидных мембран, содержащих цитохром Р-450.
В задачи работы входило:
- изучение влияния замораживания-отогрева на структурно-функциональное состояние изолированного цитохрома Р-450;
- изучение влияния замораживания-отогрева, а также глицерина (ГЛ), I,2-пропандиола (ПД) и диметилсульфоксида (ДМСО) на структурно-функциональное состояние цитохрома Р-450 в составе искусственных мембран из яичного фосфатидилхолина (ФХ) и его смеси с фосфатидилеерином (ФХ+ФС);
- изучение влияния замораживания-отогрева, солей и криопротекторов на структуру липидных бислоев, модифицированных цито-хромом Р-450.
Научная новизна. Впервые установлено, что замораживание-отогрев цитохрома Р-450 в растворе, содержащем глицерин, и в составе ФХ-липосом приводит к конформационным перестройкам белка, выражающимся в повышении полярности окружения его гемовой группы и снижении. структурной жесткости белковой глобулы. При этом наблюдается также снижение каталитической активности фермента. Показано, что действие замораживания-отогрева на структурно-функциональное состояние мембраносвязанного цитохрома Р-450 зависит от состава среды инкубации и липидного окружения белка. Наибольшую ферментативную активность цитохром Р-450 проявляет после замораживания-отогрева в условиях высокой ионной силы в липосомах, содержащих ФС. Обнаружено, что присутствие в бислое цитохрома Р-450 приводит к модификации взаимодействия искусственных мембран с низкомолекулярными криопротекторами, которая выражается в увеличении площади поверхности и объема неполярной области мембран. Наблюдаемые эффекты усугубляются при замораживании-отогреве протеолипосом в средах, содержащих исследованные криопротекторы.
Практическая ценность работы. Полученные экспериментальные данные найдут применение в разработке общей теории криозащиты биологических объектов, в создании эффективных методов криопротекции биологических мембран и цитохрома Р-450, а также в обосновании научных подходов к выбору основных компонент криозащитных сред.
Апробация работы. Основные положения и материалы диссертационной работы докладывались на конференциях молодых ученых Института проблем криобиологии и криомедицины АН Украины (Харьков, 1989, 1991), VI Всесоюзной конференции "Органические люминофоры и их применение в народном хозяйстве" (Харьков, 1990), VII Всесоюзной конференции по спектроскопии биополимеров (Харьков, 1991), IV Всесоюзном совещании "Люминесцентный анализ и его аппаратурное обеспечение" (Москва, 1992), II Международной конференции "Успехи современной криобиологии" (Харьков, 1992).
Публикации. По материалам диссертации опубликовано 11 работ.
Структура и объем диссертации. Выполненные исследования являются частью плановых научных работ Института проблем криобиологии и криомедицины АН Украины по теме: "Исследование влияния температуры на структурное состояние изолированных и мембраносвязанных белков, в том числе в составе цитозоля и цитоскелета, на физико-химические процессы в среде инкубирования и на метаболизм в клетках с целью изучения криорезистентности клеточных структур" (шифр 2.2.6.9).
Диссертация состоит из введения, обзора литературы, описания материалов и методов исследования, трех глав собственных экспериментальных исследований, заключения, выводов и списка цитируемой литературы, включающего 270 источников. Диссертация изложена на 127 страницах машинописного текста, содержит 40 рисунков и 17 таблиц.
СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ
МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ
Цитохром. Р-450, форму ЛМ2 выделяли из микросом печени индуцированных фенобарбиталом кроликов по методу Haugen, Coon, 1976. Очищенные препараты белков имели удельное содержание цитохрома Р-450, равное 17-18 нМ/мг белка и характеризовались одной полосой при электрофорезе в денатурирующих условиях.
В работе использовали яичный ФХ, ФС из мозга крупного рогатого скота (Предприятие по производству бактерийных препаратов, г.Харьков), пирен ("Serva", Германия), 4-диметиламинохалкон (ДМХ), 4-(N.-диметиламиностирил-(1-додецилпиридиний N-толуолсульфонат (ДСП-12), n-терфенил (ПТФ) (“Zonde-1”, г. Рига), глицерин ч.д.а. ("Реахим", г. Москва), I,2-пропандиол (Кемеровское ПО "Химпром"), фармакопейный препарат диметилсульфоксида. Криопротекторы перед использованием дополнительно очищали.
Бислойные протеолипосомы, содержащие цитохром Р-450 и фосфолипиды (ФХ или его смесь с ФС, 4:1, вес.%), а также безбелковые липосомы, необходимые для контрольных экспериментов, получали методом диализа с холатом натрия (А.А. Ахрем и др., 1988). Протеолипосомы имели средний диаметр 80100 нм, а соотношение белок-липид в них составляло 1:500, 1:1000, М/М.
Эффективность N-деметилирования амидопирина цитохромом Р-450 определяли спектрофотометрически по методу Nashe (1953).
Содержание цитохрома Р-450 в растворе и протеолипосомах рассчитывали из разностного спектра поглощения его карбоксикомплекса при 450 нм с коэффициентом экстинкции 91 мМ-1 см-1.
Спектрофотометрические исследования проводили на спектрофотометрах СФ-46 ("ЛОМО", г. Ленинград) и Pye Unicam SP-8000 (Англия). Флуоресцентные измерения выполняли на спектрофлуориметрах Hitachi MPF-2A и Hitachi F-4010 (Япония).
Замораживание-отогрев образцов объемом 1—3 мл со скоростью 150-200 °С/мин проводили быстрым погружением в азот в пластмассовых ампулах, отогрев — на водяной бане (40 oС) со средней скоростью 40 °С/мин.
Эффективность тушения флуоресценции цитохрома Р-450 акриламидом оценивали по методу Штерна-Фольмера (Дж. Лакович, 1986).
Для характеристики эмиссионного спектра флуоресценции цитохрома Р-450 использовали параметры
A = (F315/F365)280; B = (F315/F365)296; = B-A (I)
Здесь F315 и F365 - интенсивность флуоресценции в спектре при длинах волн 315 и 365 нм соответственно, индексы при скобках -длины волн возбуждающего света; величина A определяется триптофановой флуоресценцией цитохрома Р-450, а величина характеризует вклад тирозиновых остатков в спектр при = 315 нм (К.К. Туроверов и др., 1970; А.А. Ахрем и др., 1988).
Изменение площади поверхности мембран оценивали по переносу энергии между пиреном и ДСП-12, а изменение объема гидрофобной области мембран — по переносу энергии между ПТФ и пиреном, используя соотношения (Г.Е. Добрецов, 1989)
(3)
(4)
где FD и FDA - интенсивность флуоресценции донора в отсутствие и в присутствии акцептора, а индексы "о" и "м" относятся к немодифицированным и модифицированным мембранам соответственно.
Статистическую обработку результатов производили по методу Фишера-Стьюдента на ЭВМ СМ-4.
РЕЗУЛЬТАТЫ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ
Влияние замораживания-отогрева на структурно-функциональные свойства изолированного цитохрома Р-450
Исследования, выполненные на изолированном цитохроме Р-450 показали, что в результате замораживания-отогрева происходит снижение скорости N-деметилирования амидопирина после 1-, 3- и 10-кратных циклов замораживания-отогрева (табл. I). При этом наблюдался также рост содержания каталитически неактивной формы фермента - цитохрома Р-420.
Таблица I
Влияние замораживания-отогрева
на активность цитохрома Р-450 в растворе
| Количество циклов за мораживания- отогрева | Активность цитохрома Р-450, % к контролю | Р |
| I | 82±1,1 | > 0,1 |
| 3 | 81±1,3 | > 0,1 |
| 10 | 72±0,5 | < 0,05 |
Анализ первых производных спектров поглощения цитохрома Р-450 в области Соре показал, что после замораживания происходит их смещение в коротковолновую область и снижение интенсивности, что отражает изменение микроокружения активного центра, обусловленное увеличением доступности тема цитохрома Р-450 растворителю (Д.И.Метелица, 1982) (рис. I).
Замораживание-отогрев изолированного цитохрома Р-450 приводят к длинноволновому смещению максимума его спектра флуоресценции, причиной которого является снижение вклада тирозиновой флуоресценции в суммарный эмиссионный спектр (табл. 2). Поскольку положение, интенсивность и форма триптофановой флуоресценции при этом не изменились, наблюдаемое тушение тирозиновой флуоресценции мы связываем с повышением доступности растворителю поверхностных индольных групп в результате вызванного замораживанием-отогревом конформационного изменения белка. Косвенным доказательством снижения структурной устойчивости фермента после замораживания является также обнаруженное увеличение его доступности денатурирующим агентам - перекиси водорода и мочевине. В то же время, после замораживания доступность белковых хромофоров изолированного цитохрома Р-450 нейтральному динамическому тушителю - акриламиду не изменилась (рис. 2), что может быть следствием изначальной доступности акриламиду тех поверхностных остатков, которые не тушатся водой до замораживания белка.
 |  |
| Рис. I. Первые производные спектров поглощения изолированного цитохрома Р-450 после I- (- - -), 3- (-•-•-•-) и 10-кратного (-••-••-••-) замораживания-отогрева. | Рис. 2. Графики Штерна-Фольмера тушения флуоресценции цитохрома Р-450 акриламидом в растворе (™,), в ФХ- (r,p) и в ФХ/ФС-липосомах (Ј,ў). Заштрихованные обозначения относятся к замораживанию-отогреву. |
Таким образом, проведенные исследования показали, что наблюдаемое в результате замораживания-отогрева снижение ферментативной активности цитохрома Р-450 в растворе сопровождается изменением его конформационного состояния, проявляющегося в увеличении доступности гемовой и полипептидной частей белковой глобулы растворителю.
Таблица 2
Влияние замораживания-отогрева на форму и положение
спектров флуоресценции цитохрома Р-450 в растворе и мембранах
| Среда | А | В | макс. фл., нм | ||
| возб. = 280 нм | возб. = 296 нм | ||||
| Трис-буфер * | 0,92 0,92 | 1,86 1,80 | 0,94 0,86 | 324,5 325,5 | 334,0 334,0 |
| ФХ-липосомы * | 1,00 0,94 | 2,46 2,41 | 1,46 1,47 | 315,2 315,5 | 332,4 332,4 |
| ФХ+ФС-липосомы * | 0,89 0,88 | 2,93 2,80 | 2,04 1,92 | 314,0 315,0 | 332,1 332,1 |
Примечание: * - после замораживания-отогрева. Среда инкубации - 30 мМ
трис-буфер, рН 7,4.
Влияние замораживания-отогрева и криопротекторов
на структурно-функциональные свойства цитохрома Р-450
в составе искусственных мембран
Перевод цитохрома Р-450 в липидное окружение сопровождается увеличением его ферментативной активности, что характерно для мембранных белков (Д.И.Метелица, 1982). Нами установлено, что активность мембрано-связанного фермента находится в зависимости от ближайшего липидного окружения и ионной силы среды инкубации. Повышение молярности трис-буфера от 10 до 90 мМ оказывало стимулирующее воздействие на ферментативную активность мембрановстроенного цитохрома Р-450 (рис. 3). Наблюдаемый эффект может быть обусловлен усилением под влиянием ионной силы гидрофобных взаимодействий в области активного центра цитохрома Р-450 (Л.М.Райхман и др., 1973), повышающих его сродство к субстрату I типа - амидопирину. Характер влияния замораживания-отогрева на активность цитохрома Р-450 в основном зависел от липидного окружения фермента и в меньшей степени - от ионной силы среды. Наибольшую каталитическую активность цитохром Р-450 проявлял при замораживании-отогреве в условиях высокой (70-90 мМ) ионной силы в липосомах, содержащих ФС. По-видимому, замораживание-отогрев индуцируют в ФХ+ФС-липосомах перестройки, приводящие в итоге к формированию более каталитически активной конформации фермента.
 | Рис. 3. Влияние замораживания-отогрева в условиях различной ионной силы на активность цитохрома Р-450 в ФХ- (™,) и в ФХ+ФС- (r,p) липосомах. Заштрихованные обозначения относятся к замораживанию-отогреву. |
В результате замораживания-отогрева мембрановстроенного цитохрома Р-450 его спектры поглощения претерпевают коротковолновый сдвиг, а спектры флуоресценции белка смещаются в длинноволновую сторону, что обусловлено, как и в случае растворимого фермента, повышением полярности микроокружения гемовой области фермента и увеличением доступности растворителю полипептидной цепи глобулы (табл. 2). При этом, замораживание-отогрев цитохрома Р-450 в липосомах приводит к повышению доступности его тирозиновых хромофоров акриламиду. Низкотемпературное воздействие также снижает устойчивость мембраноевяэанного цитохрома Р-450 к денатурирующему воздействию перекиси водорода и мочевины.
Наблюдаемое в результате действия замораживания-отогрева увеличение доступности растворителю гемовой и белковой частей изолированного и мембрановстроенного цитохрома Р-450 позволяет предположить, что механизмы воздействия замораживания-отогрева на конформацию фермента в растворе и в составе мембран имеют одинаковую природу и проявляются в его "разрыхлении".
Таблица 3
Влияние криопротекторов и замораживания-отогрева
на ферментативную активность цитохрома Р-450 в ФХ-липосомах
| Криопротектор | Активность цитохрома Р-450, % к контролю | |
| До замораживания | После замораживания | |
| Контроль | 100,0 ± 4,9 | 87,8 ± 9,8 |
| + 10 % ГЛ | 173,2 ± 19,5 | 161,0 ± 14,9 |
| + 20 % ГЛ | 173,2 ± 16,4 | 163,4 ± 12,2 |
| + 10 % ПД | 158,5 ± 24,2 | 148,8 ± 4,9 |
| + 20 % ПД | 212,2 ± 30,9 | 153,7 ± 12,3 |
| + 10 % ДМСО | 90,2 ± 14,6 | 92,7 ± 6,0 |
Исследование влияния криопротекторов на каталитическую активность мембраносвязанного цитохрома Р-450 показало, что ГЛ и ПД при добавлении в среду инкубации протеолипосом в криозащитных концентрациях, способствуют ее повышению, в то время как ДМСО несколько снижал активность фермента (табл. 3). Замораживание-отогрев в средах, содержащих ГЛ и ПГ, приводили к снижению каталитической активности фермента, которая, однако, оставалась выше контрольных значений. В то же время, в присутствии ДМСО дополнительного снижения активности фермента после замораживания не происходило.
В присутствии криопротекторов спектры поглощения цитохрома Р-450 в области Соре смещаются в длинноволновую сторону и наблюдается повышение их интенсивности, что связывают с эффектом снижения полярности растворителя (H. Rein et al., 1980). Исследуемые криопротекторы оказывают также влияние на положение и форму спектров флуоресценции мембрановстроенного цитохрома Р-450, что выражается в увеличении вклада триптофановой флуоресценции в суммарный эмиссионный спектр (табл. 4).
Таблица 4
Влияние криопротекторов и замораживания-отогрева
на форму и положение спектров флуоресценции
цитохрома Р-450 в ФХ-липосомах
| Воздействие | A | B | макс.фл., нм | ||
| возб.= 280 нм | возб = 296 нм | ||||
| Контроль * | 0,94 0,93 | 2,41 2,38 | 1,47 1,45 | 315,5 315,8 | 332,4 332,5 |
| + 20 % ГЛ * | 1,07 1,08 | 2,53 2,56 | 1,46 1,48 | 316,2 317,0 | 332,3 332,4 |
| + 20 % ПД * | 1,09 1,07 | 2,52 2,30 | 1,43 1,23 | 317,5 319,1 | 332,5 332,5 |
| + 20 % ДМСО * | 1,12 1,15 | 2,51 2,44 | 1,39 1,29 | 316,2 316,5 | 332,3 332,1 |
Примечание: * - после замораживания-отогрева.
Замораживание-отогрев цитохрома Р-450 в присутствии ГЛ не приводит к существенному изменению микроокружения хромофорных остатков мембраносвязанного белка. Анализ формы спектров флуоресценции показал, что наблюдаемое длинноволновое смещение суммарных эмиссионных спектров цитохрома Р-450 (возб. = 280 нм) в результате замораживания-отогрева в средах, содержащих ПД и ДМСО, обусловлено преимущественно снижением вклада тиро-зиновой флуоресценции. Наблюдающееся также при этом увеличение доступности белковых хромофоров акриламиду позволяет предположить, что в этом случае происходит повышение доступности цитохрома Р-450 растворителю, аналогичное наблюдаемому при замораживании-отогреве без криопротекторов.
Влияние замораживания-отогрева, криопротекторов и солей
на структурное состояние искусственных мембран,
модифицированных цитохромом Р-450
Обнаруженные изменения конформационного состояния цитохрома Р-450 под влиянием состава среды инкубации и замораживания-отогрева позволили предположить, что эти изменения могут оказывать влияние на структурное состояние бислоя, содержащего цитохром Р-450. Для проверки этого предположения нами было проведено исследование влияния замораживания-отогрева, криопротекторов и солей на структурное состояние липосом, содержащих цитохром Р-450, с использованием флуоресцентных зондов.
Исследование поверхностной области протеолипосом с помощью флуоресцентного зонда ДМХ показало, что замораживание-отогрев приводят к нарушению упаковки поверхности бислоя, проявляющейся в увеличении коэффициента поляризации и повышении гидрофобности микроокружения ДМХ (табл. 5). Присутствие ПД в среде инкубации протеолипосом также приводит к повышению гидрофобности микроокружения зонда. Сравнительный анализ спектров возбуждения и флуоресценции зонда в липосомах и протеолипосомах показал, что в присутствии ПД в протеолипосомах уменьшены количество и подвижность молекул воды, проникающих в слой карбоксильных групп жирнокислотных остатков липидов. Одним из возможных механизмов этого явления может быть изменение конформации белка, приводящее к формированию водно-криопротекторной "шубы" на поверхностных участках бислоя, окружающих белок, которая препятствует проникновению воды в область карбоксильных групп фосфолипидов.
При исследовании площади поверхности и объема неполярной области бислоя методом индуктивно-резонансного переноса энергии между локализующимися в различных областях бислоя парами пирен - ДСП-12 и ПТФ - пирен установлено, что при замораживании-отогреве протеолипосом площадь поверхности мембран существенно не изменяется (табл. 6). В то же время, добавление к протеолипосомам криопротекторов ГЛ, ПД и ДМСО приводит к увеличению как площади поверхности, так и, в особенности, объема, занимаемого неполярной областью бислоя. Это показывает, что существенная модификация биомембран происходит уже на этапе их эквилибрации с низкомолекулярными криопротекторами. Причем, определяющую роль во взаимодействии криопротекторов с бислоем играет наличие в последнем интегрального белка. Наименьшее дестабилизирующее влияние на бислой протеолипосом оказывал ГЛ, а наибольшее - ПД и ДМСО.
Таблица 5
Влияние замораживания-отогрева и I,2-пропандиола
на спектральные характеристики ДМХ в ФХ-липосомах и протеолипосомах,
образованных ФХ и цитохромом Р-450**
| Воздействие | Интенсив-ность флуорес-ценции F м, отн. ед. | Коэффици-ент поляриза-ции, p | Полуширина спектра флуорес-ценции, нм | F497/F540 | Положение максимума спектра флуоресцен-ции м, нм |
| Липосомы | |||||
| Контроль | 1,000±0,005 | 0,066±0,001 | 92,5±0,25 | 0,73 | 532 |
| * | 1,090±0,008 | 0,094±0,002 | 95,0±0,61 | 0,74 | 532 |
| + 10 % ПД | 0,918±0,006 | 0,091±0,010 | 90,0±0,12 | 0,69 | 534 |
| * | 0,843±0,009 | 0,103±0,004 | 90,0±0,12 | 0,68 | 534 |
| Протеолипосомы | |||||
| Контроль | 0,902±0,001 | 0,041±0,008 | 88,0±0,52 | 0,67 | 535 |
| * | 1,02±0,004 | 0,088±0,017 | 96,5±0,14 | 0,79 | 527 |
| + 10 % ПД | 0,839±0,008 | 0,077±0,003 | 97,5±0,12 | 0,73 | 531 |
| * | 0,811±0,003 | 0,048±0,006 | 100,0±0,02 | 0,65 | 535 |
Примечания: * - после замораживания-отогрева.
** - липосомы и протеолипосомы формировали в среде: 10 мМ трис-буфер + I мМ ЭДТА + 5 мМ MgCl2, рН 7,4. Различия по отношению к контрольным величинам достоверны (Р < 0,05).
Таблица 6
Влияние замораживания-отогрева и криопротекторов
на структуру ФХ-липосом и протеолипосом,
образованных ФХ и цитохромом Р-450
| Воздействие | E1 | E2 | Sм/So | Vм/Vo |
| Липосомы | ||||
| Контроль | 0,64 | 0,27 | I | I |
| * + 20 % ГЛ * + 20 % ПД | 0,68 0,62 0,60 0,61 | 0,43 0,36 0,37 0,34 | 0,82 1,07 1,20 1,14 | 0,59 0,84 0,76 0,90 |
| * | 0,72 | 0,22 | 0,89 | 1,34 |
| + 20 % ДМСО * | 0,61 0,62 | 0,42 0,32 | 1,10 1,05 | 0,64 0,92 |
| Протеолипосомы | ||||
| Контроль | 0,69 | 0,47 | I | I |
| * | 0,73 | 0,35 | 0,96 | 1,40 |
| + 20 % ГЛ | 0,65 | 0,42 | г.и | 1,23 |
| * | 0,74 | 0,34 | 0,94 | 1,62 |
| + 20 % ПД | 0,58 | 0,30 | 1,30 | 1,24 |
| * | 0,63 | 0,27 | 1,22 | 1,94 |
| + 20 % ДМСО | 0,62 | 0,30 | 1,23 | 1,24 |
| * | 0,62 | 0,26 | 1,20 | 2,02 |
Примечания: E1 и E2 - эффективность переноса энергии между донорно-акцепторными парями шрен-ДСП-12 и ПТФ-пирен соответственно; * - после замораживания-отогрева.
Одной из причин нарушения белок-липидных взаимодействий в биологических мембранах может быть также концентрирование солей при вымерзании воды (W.H.Fishbein, J,W,Winkert, 1977). Проведенное нами исследование влияния 30-минутной экспозиции протеолипосом в растворах, содержащих высокие концентрации KCl и NaCl на состояние бислоя с использованием пирена и переноса энергии между локализующейся в области углеводородных цепей липидов парой ПТФ-пирен показало, что в концентрированных солевых растворах возрастает микровязкость бислоя; наиболее выражен этот эффект в средах, содержащих KCl. Кроме того, в протеолипосомах обнаружено изменение монотонного хода зависимостей коэффициента эксимериэации пирена и эффективности индуктивно-резонансного переноса энергии с ПТФ на пирен в области концентраций солей I,2—1,6 М. Сопоставление этих данных с результатами, полученными Е.Д.Розановой (1984), показавшей, что 1,35 KCl и 1,4—1,5 М NaCl вызывают необратимый конформационный переход изолированного липопротеинового комплекса цитохромоксидазы, переводящий ее в более криолабильное состояние позволяет предположить, что в наших экспериментах цитохром Р-450 претерпевает аналогичный переход.
Таким образом, полученные в работе результаты позволили сопоставить структурные и функциональные изменения изолированного и мембрановстроенного цитохрома Р-450 при замораживании в средах различного состава и найти связь наблюдаемых изменений с процессами, происходящими при этих воздействиях в липид-ном бислое, модифицированном цитохромом Р-450.
ВЫВОДЫ
1. Установлено, что замораживание-отогрев изолированного и встроенного в ФХ-липосомы цитохрома Р-450 приводит к снижению его ферментативной активности. Увеличение ионной силы среды инкубации протеолипосом до 70—90 мМ трис-буфера способствует сохранению активности цитохрома Р-450 в процессе замораживания-отогрева.
2. Присутствие глицерина, 1,2-пропандиола и диметилсульфоксида в среде инкубации протеолипосом приводит к меньшему ингибированию активности фермента в результате замораживания-отогрева по сравнению с замораживанием без криопротекторов.
3. Показано, что замораживание и последующий отогрев цитохрома Р-450 в растворе и в составе ФХ-липосом приводит к изменению конформации белка, сопровождающейся повышением полярности окружения гемовой группы и увеличением доступности растворителю полипептидной цепи глобулы. Аналогичные изменения структурного состояния полипептидной цепи цитохрома Р-450 наблюдались при замораживании в присутствии исследованных криопротекторов.
4. Замораживание-отогрев протеолипосом, образованных цитохромом Р-450 и ФХ, не оказывает существенного влияния на площадь поверхности искусственных мембран, в то же время повышая объем их гидрофобной области.
5. Установлено, что присутствие в среде инкубации протеолипосом глицерина, I,2-пропандиола и диметилсульфоксида приводит к увеличению площади поверхности и объема неполярной области липидного бислоя. Наиболее выраженным этот эффект был при замораживании-отогреве протеолипосом в присутствии криопротекторов.
6. Обнаружено, что инкубация протеолипосом, содержащих в качестве белкового компонента цитохром Р-450 при комнатной температуре в растворах, содержащих KCl и NaCl, приводит к возрастанию микровязкости гидрофобной области бислоя, более выраженной в средах, содержащих KCl.
СПИСОК
работ, опубликованных по теме диссертации
1. Дюбко Т.С., Горбенко Г.П., Нардид О.А., Моисеев В.А. Исследование влияния цитохрома Р-450 на структуру липидного бислоя с помощью флуоресцентных зондов //VI Всесоюзная конфер. "Органические люминофоры и их применение в народном хозяйстве": Тез. докл.- Харьков, 1990.- С. 56.
2. Дюбко Т.С., Нардид О.А., Моисеев В.А. Исследование влияния I,2-пропиленгликоля на липид-белковые взаимодействия в искусственных мембранах с использованием 4-диметиламинохалкона// VI Всесоюзная конфер. "Органические люминофоры и их применение в народном хозяйстве": Тез. докл.- Харьков, 1990.- С. 81.
3. Горбенко Г.П., Дюбко Т.О., Нардид О.А., Моисеев В.А. Исследование взаимодействия цитохрома Р-450 с фосфолипидами методом флуоресцентной спектроскопии // Биополимеры и клетка.- 1991, № I.- С. 52-54.
4. Горбенко Г.П., Дюбко Т.О., Нардид О,А. Влияние криопротекторов на липид-белковые взаимодействия в модельных системах // Физико-химические процессы в криобиологических системах /Сб. научных тр.- Харьков, 1991.- С. 14-19.
5. Дюбко Т.О., Нардид О.А. Влияние ионной силы и липидного состава на каталитическую активность нативного и замороженного цитохрома Р-450 //Физико-химические процессы в криобиологических системах /Сб. научных тр.- Харьков, 1991.- С. 31-39.
6. Дюбко Т.С., Нардид О.А., Моисеев В.А. Влияние замораживания на собственную флуоресценцию цитохрома Р-450 в протеолипосомах различного состава // VII Всесоюзная конференция по спектроскопии биополимеров: Тез. докл.- Харьков, 1991.- С. 89.
7. Дюбко Т.О., Горбенко Г.П., Нардид О.А. Действие замораживания и проникающих криопротекторов на структуру протеолипосом // II-я Международная конференция "Успехи современной криобиологии": Тез. докл.- Харьков, 1992.- С. 62-63.
8. Нардид О.А., Репина С.В., Дюбко Т.С. Исследование влияния замораживания-отогрева на конформацию мембраносвязанных белков методом собственной флуоресценции // II-я Международная конференция "Успехи современной криобиологии": Тез. докл.- Харьков 1992.- С. 124.
9. Дюбко Т.С., Нардид О.А. Влияние цитохрома Р-450 на свойства липидного бислоя при воздействии замораживания и 1,2-пропиленгликоля //Действие холода на биологические объекты /Сб. научи, тр.- Киев: Наукова думка, 1992.- С. 5-9.
10. Дюбко Т.С., Горбенко Г.П., Нардид О.А. Исследование взаимодействия криопротекторов с модельными мембранами методом флуоресцентных зондов // IV Всес. совещание "Люминесцентный анализ в биологии и медицине и его аппаратурное обеспечение": Тез. докл.- Москва, 1992.- С. 15.
11. Нардид О.А., Дюбко Т.С., Моисеев В.А. Исследование влияния замораживания и органических добавок на флуоресценцию цитохрома Р-450 в мембранах из ДМФХ // IV Всес. совещание "Люминесцентный анализ в биологии и медицине и его аппаратурное обеспечение": Тез. докл.- Москва, 1992.- С. 16.
Ответственный за выпуск академик АН Украины,
директор ИПКиК АН Украины В.И. Гриценко
Подл, к печ. 18.11.1992 г. Формат 60x84 Г/16 Усл.печ.л.1,0
Печать офсетная. Тираж 100 экз. Зак. №165.
Отпечатано на ротапринте ФТИНТ АН Украины, Харьков, пр.Ленина, 47
