Идентификация в растении thellungiella salsuginea (pall.) генов tsabf и ts14-3-3, анализ взаимодействия кодируемых ими белков

На правах рукописи

Высоцкий Денис Александрович

Идентификация в растении Thellungiella salsuginea (Pall.) генов TsABF и Ts14-3-3, анализ взаимодействия кодируемых ими белков

03.01.06. – Биотехнология (в том числе бионанотехнология)

Автореферат

диссертации на соискание ученой степени

кандидата биологических наук

Москва 2013

Работа выполнена в лаборатории стрессоустойчивости растений Государственного научного учреждения Всероссийский научно-исследовательский институт сельскохозяйственной биотехнологии Россельхозакадемии (г. Москва).

Научный руководитель:

Бабаков Алексей Владимирович, доктор биологических наук, профессор

Официальные оппоненты:

Соловьев Александр Александрович, доктор биологических наук, профессор, заведующий кафедрой генетики и биотехнологии РГАУ-МСХА

Комахин Роман Александрович, кандидат биологических наук, заведующий лабораторией индуцированного рекомбиногенеза ВНИИСБ

Ведущая организация:

Институт физиологии растений им. К.А. Тимирязева РАН (г. Москва)

Защита состоится « » 2013 г. в__ часов на заседании диссертационного совета Д.006.027.01 при Всероссийском научно-исследовательском институте сельскохозяйственной биотехнологии по адресу: 127550, Москва, Тимирязевская 42. Тел.: (499) 976-65-44, факс: (499) 977-09-47, e-mail: [email protected]

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Всероссийского научно-исследовательского института сельскохозяйственной биотехнологии.

Автореферат разослан «___» ____________ 2013 г., размещен на Интернет-сайте www.vniisb.ru. «___» ____________ 2013 г.

Ученый секретарь диссертационного совета,

Кандидат биологических наук Вобликова В.Д.

Общая характеристика работы

Актуальность проблемы. Абиотические стрессовые воздействия, такие как повышенные и пониженные температуры, засуха, засоление почв, отрицательные температуры, тяжелые металлы и т.п. являются основными факторами, способными снижать урожайность культурных растений на 70% (Boyer 1982). При этом, высокая степень засоления почв и длительная засуха обладают самыми пагубными последствиями, приводя к жесткому дефициту влаги (Yoshida et al. 2010). На сегодняшний день, немалая доля пахотных земель находится в зонах, подверженных данным стрессовым воздействиям (Kogan 1997).

Изучение механизмов передачи стрессорного сигнала имеет важнейшее фундаментальное значение для понимания процесса адаптации растительных клеток к стрессовым факторам. В зависимости от типа и характера стрессового воздействия, растения и отдельные их клетки используют различные механизмы передачи сигнала, приводящие, в конечном итоге, к изменению экспрессии сотен генов (Новикова et al. 2007; Huang et al. 2012). Одним из основных механизмов, определяющим физиологический ответ растительной клетки на осмотический стресс является передача сигнала, регулируемого фитогормоном абсцизовой кислоты (АБК). Несмотря на то, что АБК влияет на множество физиологических и биохимических процессов в растениях, основной ее функцией является регуляция водного баланса растения и адаптация к осмотическому стрессу (Schroeder et al. 2001; Finkelstein et al. 2002; Zhu 2002; Himmelbach et al. 2003). В условиях солевого стресса АБК запускает в клетках каскады реакций, приводящие к изменению экспрессии многих генов (Hoth et al. 2002; Seki et al. 2002; Takahashi et al. 2004). Несмотря на достигнутые успехи в понимании механизмов передачи АБК-зависимого стрессорного сигнала, целый ряд пробелов в отдельных стадиях прохождения сигнала по-прежнему ожидает заполнения. В частности, не в полной мере изучены механизмы регуляции активности белков ABF (ABRE Binding Factor), ключевых факторов транскрипции, регулирующих экспрессию генов в рамках АБК-зависимого пути передачи стрессорного сигнала. Так, например, недавно был установлен факт взаимодействия факторов транскрипции ABF ячменя с регуляторными белками 14-3-3. Однако, какова физиологическая роль такового взаимодействия для белков ABF и для процессов адаптации в целом, не вполне ясно. Принимая во внимание разнообразие изоформ 14-3-3 в различных растениях, встает вопрос о возможной специфичности их взаимодействий с факторами транскрипции ABF или же, наоборот, о том, какую роль может играть возможное многообразие вариантов взаимодействия белков 14-3-3 и ABF. Более того, остается неясным, какую роль для сигнальной трансдукции может играть многообразие изоформ 14-3-3 в разных видах растений. Слабая изученность данной области сигнальной трансдукции, а также важность понимания фундаментальных основ передачи стрессовых сигналов послужила причиной нашего интереса к изучению возможных механизмов взаимодействия белков 14-3-3 с факторами транскрипции ABF.

В качестве объекта исследований было использовано растение Thellungiella salsuginea, близкородственное Arabidopsis, но проявляющее большую устойчивость к таким факторам абиотического стресса, как высокие концентрации солей в почве и воздействие пониженных температур. Данное растение было принято научной общественностью в качестве нового модельного объекта для изучения механизмов устойчивости к абиотическому стрессу.

Перед выполнением работы была сформулирована следующая цель:

- выяснить, возможна ли посттрансляционная регуляция активности факторов транскрипции ABF на основе их взаимодействия с регуляторными белками 14-3-3, а также выяснить, есть ли какие либо отличительные особенности в структуре данных белков и экспрессии кодирующих их генов в растениях Thellungiella salsuginea.

Для достижения поставленной цели было необходимо решить следующие задачи:

- идентифицировать в Thellungiella salsuginea гены факторов транскрипции ABF;

- охарактеризовать первичную структуру белков ABF из растений Thellungiella;

- охарактеризовать особенности экспрессии генов ABF из Thellungiella под влиянием высоких концентраций солей в питательной среде;

- идентифицировать гены, кодирующие разные изоформы белков 14-3-3 в растениях Thellungiella, и охарактеризовать их первичную структуру;

- охарактеризовать особенности экспрессии генов 14-3-3 в Thellungiella в нормальных условиях и в ответ на стрессовые воздействия;

- выяснить, возможно ли взаимодействие регуляторных белков 14-3-3 с факторами транскрипции ABF и если таковое взаимодействие имеет место, установить, какой мотив в аминокислотной последовательности белков ABF является сайтом связывания белками 14-3-3;

- охарактеризовать степень специфичности взаимодействий регуляторных белков 14-3-3 с факторами транскрипции ABF в Thellungiella.

Научная новизна. В данной работе впервые идентифицированы 4 гена, кодирующих факторы транскрипции ABF в растениях Thellungiella salsuginea. Также, впервые идентифицированы 9 генов, кодирующих разные изоформы регуляторных белков 14-3-3. Установлены полные последовательности кДНК идентифицированных генов. Выявлено, что экспрессия большинства из исследуемых генов возрастает в ответ на действие повышенных концентраций солей. Также обнаружено, что возрастание экспрессии генов, чья функция, по-видимому, связана с адаптацией растения к стрессовым воздействиям, происходит значительно быстрее в растениях Thellungiella в сравнении с модельным объектом Arabidopsis thaliana. Установлено, что большинство изоформ 14-3-3 взаимодействует с факторами транскрипции ABF, при этом такое взаимодействие носит специфичный характер. Выявлено, что мотив RRTLT/SGP белков ABF является критическим для данного взаимодействия.

Апробация работы. Результаты исследований представлены на VII и X молодежных научных конференциях «Биотехнология в растениеводстве, животноводстве и ветеренарии» (2007, 2010), VI международном съезде общества физиологов растений России (2007), международном симпозиуме «Plant Abiotic Stress Tolerance» (2009), Всероссийском симпозиуме «Растение и стресс» (2010).

Структура и объем диссертации. Диссертационная работа состоит из введения, обзора литературы, описания методов и объектов исследования, результатов и их обсуждения, заключения, выводов и списка цитируемой литературы, включающего 209 источников. Материалы диссертации изложены на 112 страницах машинописного текста, включая 8 таблиц и 30 рисунков.

Объекты и методы исследований

Биологический материал. Использовали растения 4-х экотипов растений Thellungiella - Yakutsk, Saratov, Buriatia и Altai II, обладающих разной фенотипической реакцией в ответ на стрессовые воздействия. Необходимо отметить, что растения экотипа Saratov, обладающие морфологией, отличной от растений других экотипов, использованных в данной работе, принадлежат к отдельному виду Thellungiella botschantzevii, недавно охарактеризованному в литературе (German 2008). Экотипы же Yakutsk, Buriatia и Altai II, также как и наиболее часто использующиеся в исследовательских работах Shandong и Yukon, принадлежат к виду T. salsuginea.

Для проведения эксперимента по измерению экспрессии генов ABF и 14-3-3 в ответ на действие повышенных концентраций солей растения Arabidopsis и Thellungiella выращивали в водной культуре в климатической камере в среде Хогланда. В возрасте 6 недель после прорастания и через 2 дня после очередной смены питательной среды растения подвергали воздействию повышенной концентрации NaCl в течение 1 суток. Для этого концентрация соли в течение 2-х часов была доведена до 200 mM посредством 4-х последовательных добавлений в среду 5M NaCl. Группы по 3 растения были собраны через 0(контроль), 2, 8 и 24 часа после доведения конечной концентрации соли в растворе до 200 mM. После сбора растения замораживали в жидком азоте и хранили в морозильной камере (-70C) до выделения тотальной РНК.

Для проверки тканеспецифичности экспрессии различных изоформ 14-3-3 в Thellungiella семена экотипа Yakutsk высевали на смесь почвы с песком в соотношении 2:1 соответственно. В возрасте 9 недель, когда сформировалось достаточное количество незрелых стручков, отдельно собранные здоровые листья, корни, цветки, цветоножки и стручки замораживали в жидком азоте и хранили в морозильной камере.

Для измерения экспрессии генов 14-3-3 при воздействии пониженных температур (4C), растения экотипа Yakutsk выращивали в почве. По достижении возраста 6 недель растения переносили в климатическую камеру при 16-часовом дне и выдерживали там при 4 C в течение 3, 6, 10, 24, 50 и 96 часов. В указанные временные точки группы из 4-х растений были собраны (корни и надземные части отдельно), заморожены в жидком азоте и помещены в морозильную камеру для хранения при -70C. Растения контрольной группы, не подверженные действию пониженной температуры, были собраны в начале эксперимента. Опыт проводили в трехкратной повторности.

Выделение тотальной РНК из растений проводили с использованием реагента Trizol («Invitrogen», США) в соответствие рекомендациям фирмы-изготовителя. Все измерения проводили в трехкратной повторности.

Синтез кДНК, постановку ПЦР, клонирование генно-инженерных конструкций осуществляли согласно протоколам «Molecular cloning» (Sambrook and Russell, 2001).

Идентификация генов 14-3-3 и ABF в растениях Thellungiella. Фрагменты четырех предполагаемых изоформ 14-3-3, гомологичных изоформам Chi, Epsilon, Omega и Mu из Arabidopsis, были обнаружены в базе данных на сайте Национального центра биотехнологической информации (NCBI - http://www.ncbi.nlm.nih.gov). Чтобы установить последовательности центральных фрагментов кДНК других пяти изоформ 14-3-3 из Thellungiella (Upsilon, Psi, Omicron, Phi and Lambda), были подобраны пары специфичных праймеров, основываясь на ожидаемой гомологии с аналогичными генами Arabidopsis. Для идентификации центральных фрагментов генов ABF использовали вырожденные праймеры. Полные последовательности кДНК, кодирующие разные изоформы 14-3-3 и ABF были установлены методами 3' и 5' RACE-PCR.

Измерение экспрессии генов ABF и 14-3-3 в растениях Arabidopsis и Thellungiella. Измерение экспрессии генов, кодирующих разные изоформы 14-3-3 и ABF, проводили с использованием олигонуклеотидов, специфичных для 3'-нетранслируемых областей отдельных генов. ОТ-ПЦР в реальном времени проводили на приборе Chromo 4™ (BioRad) в присутствии интеркалирующего красителя SYBR Green I с использованием реакционной смеси, содержащей Hot Start Taq полимеразу. Для расчета результатов использовали [delta][delta]Ct метод. Амплификацию фрагмента гена актина использовали в качестве внутреннего стандарта. Для сравнения уровней экспрессии генов 14-3-3 в растениях Thellungiella и Arabidopsis проводили их калибровку по абсолютному количественному уровню экспрессии гена актина методом [delta]Ct.

Дрожжевой двугибридный анализ проводили для проверки возможного взаимодействия белков 14-3-3 с факторами транскрипции ABF. Для проведения анализа был использован штамм дрожжей PJ69-4A, а также экспрессионные векторы pBD-GAL4 Cam (Stratagene) и pGADT7 (Clontech). Кодирующие части восьми генов 14-3-3 из Thellungiella были амплифицированы и клонированы в вектор pBD-GAL4 Cam. Кодирующие части генов ABF2 и ABF4 были клонированы в вектор pGADT7. Кроме того, в pGADT7 вектор была клонирована кодирующая часть гена ABF2 с точечной мутацией в предполагаемом сайте связывания с белками 14-3-3, приводящей к замене серина в позиции 393 на аланин. Трансформацию дрожжей проводили стандартным методом с использованием ацетата лития (Gietz et al. 1992). Качественный анализ взаимодействия белков проводили на селективной среде SD, не содержащей лейцин, триптофан, гистидин и аденин (SD–LWHA). По активности -галактозидазы оценивали интенсивность взаимодействия белков. Активность -галактозидазы измеряли в единицах Миллера (Miller 1972)

Результаты и обсуждение

Идентификация генов ABF. С целью идентификации генов ABF в растениях Thellungiella нами были подобраны вырожденные праймеры, используя гены Arabidopsis в качестве основы в силу родства данных видов. В результате амплификации были получены 4 фрагмента ожидаемых размеров. Все фрагменты были клонированы в векторе pGEM-T. Установление нуклеотидной последовательности фрагментов подтвердило, что они кодируют центральные домены генов ABF в Thellungiella. Используя вновь установленные нуклеотидные последовательности, были подобраны изоформ-специфичные праймеры для проведения RACE-PCR. После амплификации 3'- и 5'-концевые фрагменты предполагаемых генов ABF Thellungiella были также клонированы в векторе pGEM-T и секвенированы. Идентифицированные гены были названы TsABF1-4 в соответствии с их гомологами из Arabidopsis. Гомология аминокислотных последовательностей TsABF1, TsABF2, TsABF3 и TsABF4 с таковыми из Arabidopsis составила 71, 77, 85 and 88%, соответственно.

Рис. 1. Выравнивание аминокислотных последовательностей идентифицированных изоформ ABF. А – Схематическое изображение расположения консервативных доменов факторов транскрипции ABF. Б – Выравнивание аминокислотных последовательностей идентифицированных изоформ. Аминокислотные остатки, выделенные черным цветом, являются идентичными. Выравнивание было проведено с использованием программы ClustalW.

Все идентифицированные гены были зарегистрированы в электронной базе данных GenBank на сайте NCBI под учетными номерами JQ971971, JQ971972, JQ971973 and JQ971974 (TsABF1-4, соответственно). Схематическая структура, отображающая консервативные домены, характерные для идентифицированных белков TsABF, приведена на рис. 1. Все изоформы идентифицированных белков из Thellungiella, как и их гомологи из Arabidopsis, содержат характерный для всех факторов транскрипции ABF bZIP Basic region/leucine zipper motif (основной домен/ лейциновая молния) домен с 4-мя повторами лейцина, составляющими лейциновую молнию, а также 3 консервативных (С1, С2 и С3) N-концевых домена и 1 консервативный (С4) C-концевой домен. При этом высокая степень консервативности данных доменов отмечена для разных видов растений. Основные отличия изоформ TsABF друг от друга и от их аналогов из Arabidopsis были характерны для междоменных областей. Наибольшие отличия от гомологичного белка из Arabidopsis наблюдались для TsABF1. Основываясь на наблюдении фенотипов тройных мутантов the abf2 abf3 abf4 по литературым данным белки ABF2, ABF3 и ABF4 были охарактеризованы как основные факторы транскрипции, регулирующие экспрессию генов под действием засоления и АБК (Yoshida et al. 2010). Возможно потому, что ABF1 играет менее важную роль в адаптивных процессах, для данного гена была характерна более высокая дивергенция в Thellungiella от общего с AtABF1 предка.

Как показано стрелкой на рис. 1Б, домен С4 содержит высококонсервативный остаток серина/треонина в составе мотива RRTLT/SGP, являющегося классическим (mode II) для связи с регуляторными белками 14-3-3. Поскольку известно, что белки 14-3-3 среди прочих функций также принимают участие в сигнальной трансдукции, и при этом их количество в разных видах растений разнообразно, это послужило причиной нашего к ним интереса в контексте устойчивости Thellungiella к неблагоприятным условиям среды.

Анализ экспрессии генов TsABF. Из литературных источников известно, что Thellungiella обладает повышенной устойчивостью к воздействию высоких концентраций солей в почве, поэтому мы провели анализ зависимости экспрессии генов ABF в Thellungiella от действия данного стрессового фактора. Анализ был проведен с помощью ПЦР в реальном времени с использованием праймеров, специфичных к отдельным генам TsABF. Как показано на рис. 2, экспрессия генов TsABF2, TsABF3 и TsABF4 значительно увеличивалась под влиянием солевого стресса. Наибольшее увеличение экспрессии наблюдалось для гена TsABF2.

Рис. 2. Экспрессия генов ABF в растениях Thellungiella (экотип Yakutsk), подверженных воздействию 200mM NaCl. А - экспрессия генов в надземной части растения, Б - экпрессия генов в корнях растения. Точки обозначают среднее значение ± 95% C.I. (N=3).

В целом, повышенная в среде концентрация NaCl вызывала быстрое увеличение уровня экспрессии генов TsABF в надземной части с пиками значений через 2 и 8 часов после начала обработки, после чего уровень экспрессии понижался до значений, сопоставимых с экспрессией в контрольной группе (без стресса). Экспрессия же гена TsABF1 под влиянием солевого стресса практически не менялась (результаты не приведены). Наряду с данными, свидетельствующими в пользу схожести выполняемых факторами транскрипции ABF функций, наблюдаемые в настоящей работе и в ряде работ других авторов определенные отличия в экспрессии кодирующих их генов свидетельствуют также и в пользу некоторой специфичности их действия(Choi et al. 2000; Kim et al. 2004; Fujita et al. 2005). В дополнение к этому следует отметить, что Thellungiella от других растений отличает также быстрая индукция экспрессии генов ABF (наибольший рост отмечался через 2-8 часов после начала обработки) в ответ на стрессовое воздействие. Например, в аналогичных экспериментах в Arabidopsis экспрессия генов ABF значительно возрастала в среднем лишь через 18-24 часов после начала воздействия солевого стресса (Uno et al. 2000; Fujita et al. 2005).

Помимо регуляции на уровне транскрипции белки ABF также подвергаются посттрансляционной регуляции, таким как фосфорилирование и последующие за ним изменения, а также протеолитической деградации и т.п. (Choi et al. 2005; Kobayashi et al. 2005; Fujii et al. 2007; Sirichandra et al. 2010). Несмотря на обнаруженную способность протеинкиназ из семейства SNRK2 фосфорилировать и активировать белки ABF под действием стресса, механизм таковой активации до недавнего времени был неясен (Kobayashi et al. 2005; Fujita et al. 2009). Вопрос о том, что фосфорилирование дает с функциональной точки зрения для факторов транскрипции ABF, стал косвенно проясняться, когда в ходе анализа библиотеки генов ячменя было обнаружено, что белки ABF, а также близкородственный им фактор транскрипции ABI5, взаимодействуют с белками 14-3-3 (Schoonheim et al. 2007a; Schoonheim et al. 2007b; Schoonheim et al. 2009). Известно, что 14-3-3 образуют большое семейство белков, осуществляющих широкий спектр регуляторных функций посредством связывания со специфичными фосфорилированными мотивами регулируемых ими белков. В недавней литературе появились косвенные свидетельства в пользу того, что АБК-зависимое фосфорилирование факторов транскрипции ABF, а также последующее их взаимодействие с регуляторными белками 14-3-3 предотвращает деградацию первых, тем самым оказывая косвенное влияние на процесс регуляции транскрипции факторами ABF (Sirichandra et al. 2010).

Идентификация генов 14-3-3. С целью анализа структуры белков 14-3-3 в Thellungiella, а также с целью проверки возможности их взаимодействия с факторами транскрипции ABF была проведена работа по идентификации и установлению полных нуклеотидных последовательностей генов 14-3-3 в растениях Thellungiella. На первом этапе в базе данных GenBank на сервере NCBI по транскриптому Thellungiella были обнаружены 4 последовательности EST, гомологичные фрагментам генов 14-3-3, кодирующих изоформы Chi, Epsilon, Omega и Mu из Arabidopsis. Кроме того, используя подобранные на основе гомологии с Arabidopsis праймеры, нам удалось амплифицировать фрагменты еще 5 генов 14-3-3, кодирующих изоформы Lambda, Omicron, Phi, Psi и Upsilon. Все фрагменты были клонированы в векторе pGEM-T, после чего была установлена их нуклеотидная последовательность. Методом RACE-PCR были установлены полные нуклеотидные последовательности идентифицированных генов. Все идентифицированные последовательности были зарегистрированы в GenBank. Выявленным изоформам белков 14-3-3 были даны названия в соответствии с гомологичным им белкам из Arabidopsis.

Рис. 3. Выравнивание аминокислотных последовательностей идентифицированных изоформ Ts14-3-3 (А), а также сравнительное выравнивание С-концевых фрагментов наиболее отличных изоформ Ts14-3-3 с их аналогами из Arabidopsis (Б). Аминокислотные остатки, выделенные черным цветом, являются полностью идентичными, выделенные серым цветом - идентичны на 50-80%. Выравнивание было проведено с использованием программы ClustalW.

Гомология аминокислотных последовательностей изоформ 14-3-3 Thellungiella и Arabidopsis составила от 88 до 95 %. Все идентифицированные белки 14-3-3 содержат высококонсервативный центральный домен и, в то же время, имеют вариабельные N- и С-концевые последовательности, что характерно для данного семейства (рис. 3А). Однако, С-концевые фрагменты изоформ 14-3-3 Chi, Mu и Omicron из Thellungiella существенно отличаются от таковых из Arabidopsis, что отображено на рис. 3Б. Изоформа Ts14-3-3 Epsilon также отличается от аналогичной из Arabidopsis главным образом своей С-концевой последовательностью. Необходимо отметить, что по литературным данным именно С-концевые фрагменты белков 14-3-3 отвечают за специфичность их взаимодействия с белками-мишенями (Shen et al. 2003; Bornke 2005; Visconti et al. 2008).

Различия в С-концевых доменах, как было отмечено в литературе, могут играть важную роль в определении специфичности отдельных белков (Obsilova et al. 2004; Silhan et al. 2004; Bornke 2005; Sinnige et al. 2005). Так, к примеру, было показано, что взаимодействие изоформы GF14-6 кукурузы с H+-АТФазой зависит от С-концевого домена белка GF14-6. Делеционный анализ белка GF14-6 выявил, что интенсивность взаимодействия GF14-6 с H+-АТФазой меняется, при этом меняется также и активность самой H+-АТФазы (Visconti et al. 2008).

Оценка экспресси генов 14-3-3 в растениях Thellungiella. Поскольку в Thellungiella обнаружено большое количество изоформ 14-3-3, возник вопрос, имеет ли место специфичность в экспрессии генов отдельных изоформ 14-3-3 в разных органах растений и как она меняется в зависимости от внешних воздействий? На рис. 4 представлены данные по экспрессии генов 14-3-3 в разных органах растений. Большинство генов, за исключением Mu и Psi, демонстрировали высокий уровень экспрессии в листьях и цветках. Экспрессия гена 14-3-3 Psi была невысокой во всех органах, а экспрессия гена 14-3-3 Mu была крайне низка, что было подтверждено с использованием разных пар праймеров при постановке ПЦР.

Рис. 4. Анализ экспрессии генов 14-3-3 в разных органах растений Thellungiella методом ОТ-ПЦР. СТ – стручки, ЦН – цветоножки, ЦВ – цветки, ЛС – листья, КР – корни. Экспрессию гена Actin использовали в качестве стандарта.

Некоторые отличия в профилях экспрессии отдельных генов могут свидетельствовать в пользу специфичности их функций, однако тем не менее наблюдаемое сходство является также аргументом в пользу общности функций, выполняемых кодируемыми ими белками.

Используя ОТ-ПЦР в реальном времени, нами были измерены изменения в экспрессии генов 14-3-3 в ответ на действие таких стрессовых факторов, как повышенная концентрация соли (200 mM NaCl) в среде и пониженная температура (4° С). Экспрессия большинства из анализируемых генов возрастала (до 2,5 раз относительно контроля) в ответ на действие повышенной концентрации соли в растворе, хотя данный эффект и носил кратковременный характер. Уже через 8 часов после того, как растения были подвержены стрессовому воздействию, экспрессия генов возвращалась на уровень, сопоставимый с экспрессией в стандартных условиях. Также, действие пониженной температуры приводило к небольшому повышению уровня экспрессии генов 14-3-3, и.

Помимо регуляции на уровне экспрессии генов происходят также и посттрансляционные изменения активности белков, чья функция связана с адаптацией растений к стрессовым воздействиям. Как было упомянуто ранее, в недавних исследованиях было обнаружено, что белки 14-3-3 взаимодействуют с факторами транскрипции ABF. Однако встает вопрос о роли многообразия форм белков 14-3-3 в различных растениях, и, в частности, в Thellungiella. Большое количество изоформ 14-3-3, как предполагают исследователи, может служить предпосылкой существования определенной специфичности во взаимодействии с белками-мишенями. В то же время, такое многообразие может служить и причиной замещаемости функций одних изоформ другими. Тем не менее, в литературе, наряду со свидетельствами в пользу взаимозаменяемости изоформ 14-3-3, имеются также данные, указывающие на специфичность их функций.

Оценка взаимодействия факторов транскрипции TsABF с белками 14-3-3. Проверку взаимодействия факторов транскрипции TsABF с белками 14-3-3 проводили дрожжевым двугибридным анализом. Для этого было создано 8 генетических конструкций, кодирующих химерные белки, состоящие из домена связывания (BD) дрожжевого фактора транскрипции GAL4 и сшитого с ним гена одной из изоформ 14-3-3. Также были созданы 2 конструкции, кодирующие химерные белки, состоящие из домена активации (AD) GAL4 и сшитого с ним гена TsABF2 или TsABF4, несущих в их С-концевой области мотивы для связывания белков 14-3-3: RRTESGP у TsABF2 и RRTLTGP у TsABF4. Помимо этого, была создана генетическая конструкция, кодирующая химерный белок, состоящий из домена AD и сшитой с ним мутантной формы TsABF2S393A, в которой замена серина на аланин в мотиве RRTESGP в соответствие с литературными данными (Yaffe et al. 1997) должна полностью блокировать связывание между TsABF2 и белками 14-3-3.

Рис. 5. Результаты качественного дрожжевого двугибридного анализа. TsABF2S393A – мутантная форма белка TsABF2 с заменой серина в позиции 393 на аланин. Клеточную культуру дрожжей, трансформированную парой генетических конструкций, точечно наносили на селективную среду SD-LWHA.

Как видно из рис. 5, на селективной среде SD-LWHA способны расти клетки дрожжей штамма PJ69-4A, экспрессирующие 6 из 8 анализируемых изоформ 14-3-3, причем этот результат практически одинаков для обеих изоформ ABF. Примечательно, что клетки, несущие изоформы 14-3-3 Epsilon, Omicron и Phi росли на селективной среде слабо либо не росли вовсе. Точечная мутация по замене аминокислотного остатка серина в позиции 393 на аланин привела к полной потере способности клеток дрожжей расти на селективной среде SD-LWHA.

Для количественной оценки интенсивности взаимодействия исследуемых белков мы проанализировали активность -галактозидазы, обусловленную уровнем экспрессии репортерного гена LacZ. Результаты анализа представлены на рис. 6.

Рис. 6. Количественная оценка интенсивности взаимодействия белков 14-3-3 с факторами транскрипции ABF. Точки обозначают среднее значение ± 95% C.I. (N=3).

Из рисунка видно, что интенсивности взаимодействий исследуемых белков существенно различаются между собой, причем наибольшей активностью в этом тесте обладала изоформа 14-3-3 Chi, наименьшей - изоформа 14-3-3Phi. Кроме этого видно, что точечная мутация S393A в гене TsABF2 привела к полному блокированию активности -галактозидазы, что лишний раз подтверждает, что обнаруженный мотив RRTESGP в белке TsABF2 и его вероятное фосфорилировнаие по серину являются критическим для связывания с белками 14-3-3 и что полученные в данном исследовании результаты на основе дрожжевого двугибридного анализа не являются артефактом.

Заключение

Одним из ключевых элементов в механизме регуляции зависимой от действия АБК экспрессии генов, являются факторы транскрипции ABF. В нашем исследовании мы идентифицировали и охарактеризовали четыре гена, кодирующих факторы транскрипции семейства ABF из растения Thellungiella salsuginea.

В ходе работы было выявлено, что аминокислотные последовательности факторов транскрипции ABF из Thellungiella содержат 5 характерных для всех белков данного семейства консервативных доменов. В то же время, рассматриваемые факторы транскрипции отличаются от таковых из Arabidopsis главным образом их междоменными областями. Отличия аминокислотных последовательностей могут служить причиной разной функциональной активности белков, поэтому необходимо дальнейшее сравнительное изучение данных белков в рассматриваемых видах растений. Следует также отметить, что обнаруженный у факторов транскрипции TsABF потенциальный мотив для связывания с белками 14-3-3 является практически идентичным во всех изоформах TsABF1-4, что свидетельствует о важности данного мотива для реализации физиологических функций белков ABF.

Измерение экспрессии исследуемых генов в условиях стресса показало их высокую индуцибельность. Более того, быстрая индукция экспрессии генов, связанных с адаптацией к стрессовым воздействиям (наибольший рост отмечался уже через 2-8 часов), характерна для Thellungiella, что свидетельствует о существовании в этом растении механизмов регуляции экспрессии генов, вероятно обуславливающих его преимущества как экстремофила.

Разнообразие изоформ 14-3-3, взаимодействующих с факторами транскрипции ABF, может приводить к формированию гомо- и гетеродимерных комплексов с различными партнерами, такими как разные изоформы ABF, а, возможно, и другие белки транскрипционного аппарата клетки. В случае с белками 14-3-3 из Thellungiella, это могут быть и уникальные комплексы, поскольку С-концевые домены отдельных изоформ существенно отличаются от таковых из Arabidopsis.

Кроме этого, белки 14-3-3 могут регулировать активность связывания ДНК факторами транскрипции. Так, было показано, что взаимодействие белков p53 c регуляторными белками 14-3-3 человека приводит к более эффективному формированию функционально активных тетрамеров фактора транскрипции. Было доказано, что фомирование такого комплекса существенно повышает эффективность связывания p53 с ДНК (Rajagopalan et. al. 2008). Более того, белки 14-3-3 способны связывать несколько мономеров, димеров или даже тетрамеров в более сложные структуры, выступая в роли каркасных белков, как в случае с фактором транскрипции p53 человека (Rajagopalan et. al. 2008). В этой связи необходимо отметить, что отличия белков 14-3-3 растений Thellungiella могут служить фактором, обусловливающим возникновение уникальных сложных белковых структур, играющих важную роль в регуляции процессов адаптации этого растения.

Перспективно также использование идентифицированных генов в биотехнологии растений, поскольку известно, к примеру, что трансгенные растения риса, обладающие сверхэкспрессией генов AtABF, проявляют повышенную устойчивость к стрессовым факторам абиотическоой природы. Также целесообразно дальнейшее исследование промоторов генов TsABF, изучение действия их регуляторных элементов на экспрессию генов при стрессовых воздействиях.

Выводы

1. Показано специфичное взаимодействие между изоформами белков Ts14-3-3 и факторами транскрипции TsABF2 и TsABF4, что указывает на вероятность участия фосфорилирования мотива RRTLT/SGP белков ABF в механизме передачи стрессового сигнала с участием фитогормона абсцизовой кислоты.

2. Идентифицировано 4 гена TsABF1-4, кодирующих факторы транскрипции, участвующие в гормональной регуляции АБК в растении Thellungiella salsuginea, проявляющем повышенную устойчивость к абиотическоиму стрессу.

3. Установлено, что экспрессия генов TsABF1-4 растений Thellungiella значительно возрастает под действием высоких концентраций солей, причем скорость индукции экспрессии рассматриваемых генов в несколько раз выше в сравнении с аналогичными генамим Arabidopsis.

4. Идентифицировано 9 изоформ регуляторных белков 14-3-3 в растениях Thellungiella, три из которых Chi, Omicron и Mu существенно отличаются по аминокислотной последовательности С-концевых участков от их аналогов в Arabidopsis.

5. Уровни экспрессии генов большинста изоформ 14-3-3 выше в листьях и цветках по сравнению с другими органами растений, причем наибольший уровень экспрессии оказался у изоформы.

Список работ, опубликованных по теме диссертации

1. D. A Vysotskii, M. B. Kostina, T. Roslyakova, T. Leonova, E. Souer, A. V. Babakov and A. H. Boer. Sequence analysis and expression profiling of 14-3-3 genes from the extremophile Thelungiella salsuginea, ecotype Yakutsk. 2012, Russian Journal of Plant Physiology. 59(2): 255-265.
2. D.A. Vysotskii, I.J. de Vries-van Leeuwen, E. Souer, A.V. Babakov and A.H. de Boer. ABF transcription factors of Thellungiella salsuginea: structure, expression profiles and interaction with 14-3-3 regulatory proteins. 2013, Plant signaling and behavior. 8 (1): e22672(64-70).
3. Д.А. Высоцкий, A.H. de Boer, А.В. Бабаков. ABF факторы транскрипции в новом модельном растении Thellungiella salsuginea // VI съезд общества физиологов растений России. Сыктывкар, 2007 г. Тезисы Докладов. С. 179-180
4. D.A.Vysotskii, Kostina M.B., Babakov A.V., De Boer A.H. 14-3-3 Proteins Interact with ABF Transcription Factors // Plant Abiotic Stress Tolerance, Vienna, 2009. International conference. p132.
5. Д.А. Высоцкий, A.H. de Boer, А.В. Бабаков. О возможной роли регуляторных белков 14-3-3 в механизме передачи стрессорного сигнала по АБК-зависимому пути в растениях Thellungiella salsuginea // Всероссийский симпозиум «Растение и Стресс». Москва, 2010 г. Тезисы докладов. С.97-98.