Биохимические изменения аллотрансплантатов компактной и губчатой костной ткани при замещении дефектов нижней челюсти (экспериментальное исследование)

На правах рукописи

Нагиева Саида Эйзудиновна

БИОХИМИЧЕСКИЕ ИЗМЕНЕНИЯ АЛЛОТРАНСПЛАНТАТОВ

КОМПАКТНОЙ И ГУБЧАТОЙ КОСТНОЙ ТКАНИ ПРИ ЗАМЕЩЕНИИ ДЕФЕКТОВ НИЖНЕЙ ЧЕЛЮСТИ

(экспериментальное исследование)

14.01.14 – стоматология,

03.01.04 – биохимия

Автореферат

диссертации на соискание ученой степени

кандидата медицинских наук

Краснодар

2010

Работа выполнена в Государственном образовательном учреждении высшего профессионального образования «Дагестанская государственная медицинская академия Федерального агентства по здравоохранению и социальному развитию» (ГОУ ВПО ДГМА Росздрава)

Научные руководители: кандидат медицинских наук, доцент

Чудинов Александр Николаевич

доктор медицинских наук, профессор

Быков Илья Михайлович

Официальные оппоненты: кандидат медицинских наук, профессор

Еричев Валерий Васильевич

доктор медицинских наук

Сторожук Александр Петрович

Ведущая организация: Государственное образовательное учреждение высшего профессионального образования «Ставропольская государственная медицинская академия Федерального агентства по здравоохранению и социальному развитию», г. Ставрополь

Защита состоится «____»____________2010г. в _____часов на заседании диссертационного совета Д 208.038.02 при Государственном образовательном учреждении высшего профессионального образования «Кубанский государственный медицинский университет Федерального агентства по здравоохранению и социальному развитию» (ГОУ ВПО КГМУ Росздрава) (350063, г. Краснодар, ул. Седина, 4, тел. [861] 262-73-75).

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке ГОУ ВПО КГМУ Росздрава.

Автореферат разослан «____» _____________ 2010 г.

Ученый секретарь

диссертационного совета

Д 208.038.02, профессор Л.А. Скорикова

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность исследования. Трансплантация органов и тканей остается актуальной проблемой современной медицины и, в частности, восстановительной челюстно-лицевой хирургии. Как известно, дефекты нижней челюсти различной этиологии приводят не только к деформации и обезображиванию лица, но и к значительным нарушениям жевательной функции, что требует вмешательств с использованием костной пластики [Н.А. Плотников 1993, 2003; Н.Е. Сельский, 2000; А.С. Панкратов и соавт., 2001; J.E. Lee et al., 2005; S. Imasato et al., 2006; P. Behrens et al., 2007].

Спорным остается вопрос оценки способности различных по виду костных трансплантатов в разные сроки после операции стимулировать репаративные процессы [Г.И. Лаврищева, 1999, 2006; В.Ф. Куцевляк и соавт., 2005; R. Nicholas et al., 2006; S. Scheele et al., 2007].

Вопрос о состоянии трансплантатов при замещении дефектов нижней челюсти решался разными авторами в основном путем клинических наблюдений, рентгенологических и морфологических исследований репаративных процессов в костной ткани после пересадки различных по характеру и виду трансплантатов [Н.А. Томилина и соавт., 2005; A. Joshi, 2004; E. Leroukel et al., 2004; G. Lansi et al., 2005]. Что же касается метаболизма в самом трансплантате, биохимических превращений, лежащих в основе морфологических и функциональных процессов, протекающих в пересаженной костной ткани и обеспечивающих ее жизнеспособность и эффективность приживления и перестройки трансплантата, то эти вопросы до настоящего времени исследованы недостаточно. В то же время состояние обмена в самом трансплантате, его энергетические ресурсы и ферментные системы, определяющие жизнеспособность трансплантата, позволяют судить об эффективности процесса пересадки костной ткани. Они и являются достаточно информативными критериями эффективности того или иного метода трансплантации, позволяющими в полной мере дать оценку степени приживления или гибели трансплантата и вскрыть механизмы его перестройки [Ю.А. Петрович, В.К. Леонтьев, 1994; Ю.А. Петрович, Т.П. Вавилова, И.Н. Марокко, 2001; И.П. Ермакова и соавт., 2004; M. Goldberg et al., 2005; I. Pechan et al., 2008].

В связи с изложенным, представляет интерес исследование динамики изменения важнейших биохимических показателей, в частности содержания АТФ и других адениловых нуклеотидов, креатинфосфата, неорганического фосфата, молочной кислоты, гликогена и глюкозы, а также активности пусковых ферментов их превращений в регенерирующих тканях после трансплантации. Интерес к данной проблеме еще более возрастает при трансплантации костной ткани, так как при этом резко нарушается углеводный обмен, и создаются неблагоприятные условия для использования и утилизации гликогена и глюкозы, как для энергетических, так и пластических целей [И.А. Пронченко и соавт., 2005; N. Komerik et al., 2005; J.P. Rake et al., 2006].

Цель исследования. Выявить особенности протекания метаболических процессов в костных аллотрансплантатах при замещении дефектов нижней челюсти в эксперименте.

Задачи исследования:

1. Исследовать особенности изменений рентгенологической и морфологической картин костной ткани при замещении дефектов нижней челюсти различными по виду и характеру трансплантатами (губчатой и компактной костными тканями) и определить информативность этих показателей для оценки репаративного костеобразования.

2. Изучить особенности течения биохимических процессов в регенерате костной ткани в процессе репаративной регенерации в различные сроки после аллотрансплантации и определить информативность этих показателей.

3. На основании полученных результатов разработать практические рекомендации для дифференцированного использования различных по характеру и виду костных аллотрансплантатов для замещении дефектов нижней челюсти.

Научная новизна. Впервые изучены особенности биохимических процессов, происходящих в аллотрансплантатах компактной и губчатой костной ткани при замещении дефектов нижней челюсти и установлены параллели между биохимическими, рентгенологическими и морфологическими изменениями при костной трансплантации, свидетельствующие о том, что исход операции пересадки кости и сроки репаративного костеобразования зависят от вида используемого трансплантата.

Получены новые данные о содержании гликогена, глюкозы, креатинфосфата, неорганического фосфата, молочной кислоты, активности амилазы, гексокиназы при аллотрансплантации губчатой и компактной костной ткани в динамике после пересадки, имеющие существенное значение для определения обеспеченности энергетическим и пластическим материалом репаративных процессов в пересаженной костной ткани.

Установлено повышение содержания гликогена, глюкозы и снижение содержания молочной кислоты, креатинфосфата и неорганического фосфата, снижение активности амилазы и гексокиназы в костных аллотрансплантатах при замещении дефектов нижней челюсти, причем эти изменения более выражены в трансплантатах из компактной костной ткани по сравнению с трансплантатами из губчатой кости.

Практическая значимость работы. Разработан и теоретически обоснован комплекс биохимических показателей, который может быть использован как эффективный критерий оценки состояния энергетических систем жизнеобеспечения костных трансплантатов и жизнеспособности пересаженной костной ткани в различные сроки послеоперационного периода. Полученные в работе данные расширяют имеющиеся представления о биохимии костной трансплантации.

Изучены и установлены параллели между биохимическими показателями, рентгенологическими и морфологическими изменениями, свидетельствующие о том, что исход операции пересадки кости и сроки костеобразования при замещении дефектов нижней челюсти зависят от вида и характера трансплантата. Это даёт возможность по-новому решать вопросы практической медицины в области трансплантации костей при дефектах челюстей.

Полученные в диссертации результаты используются в учебном процессе Дагестанской государственной медицинской академии при чтении лекций и проведении практических занятий по клинической биохимии и хирургической стоматологии, а также в научном и учебном процессах Дагестанского государственного университета. Результаты работы вошли в учебное пособие «Биохимия тканей полости рта» (утверждено УМО РФ; Махачкала, 2009 г.).

Основные положения, выносимые на защиту:

1. Установлено, что в процессе перестройки костных аллотрансплантатов происходят значительные изменения исследуемых биохимических показателей в зависимости от вида пересаженной кости (компактная или губчатая). При этом биохимические изменения в большинстве случаев коррелируют с рентгенологическими и морфологическими изменениями в исследуемых костных трансплантатах.

2. Установлено, что в костных аллотрансплантатах спустя 15-30 суток после пересадки происходит существенное повышение содержания гликогена и глюкозы, а также снижение активности ключевых ферментов их метаболизма – гексокиназы и амилазы. В компактной костной ткани даже спустя два месяца после операции пересадки содержание гликогена, глюкозы и активность исследуемых ферментов не достигают показателей контроля.

3. Показано, что рентгенологически и морфологически процессы перестройки и замещения пересаженной костной ткани губчатого и компактного строения происходят однотипно, но завершаются они быстрее и совершеннее при трансплантации губчатой костной ткани.

4. Установлено, что в аллотрансплантатах в ближайший послеоперационный период происходит существенное снижение количества неорганического фосфата, креатинфосфата, молочной кислоты, причем эти изменения более выражены в трансплантатах из компактной костной ткани.

Апробация результатов исследования. Основные положения работы представлялись и обсуждались на международной научной конференции «Фармакология и фармакотерапия: достижения и перспективы» (Махачкала, 2006); международной научной конференции «Стоматология и челюстно-лицевая хирургия: современные технологии, новые возможности» (Махачкала, 2007); межвузовской научной конференции «Фундаментальные проблемы морфологии» (Махачкала, 2007); международной Пироговской научной конференции РГМУ (Москва, 2009, 2010); III международном молодежном медицинском Конгрессе (Санкт-Петербург, 2009); межрегиональной научной конференции «Здоровье молодежи и сохранение трудового потенциала России» (Пермь, 2009); научной конференции, посвященной 25-летию кафедры стоматологии ФПК ДГМА (Махачкала, 2010); научной конференции, посвященной 45-летию стоматологического факультета ДГМА (Махачкала, 2010); Всероссийской научной конференции хирургов, посвященной 90-летию со дня рождения чл.-корр. АМН СССР Р.П. Аскерханова (Махачкала, 2010).

Публикации. По материалам данного исследования опубликовано 13 работ, 4 из них в изданиях, рекомендованных ВАК РФ.

Структура и объем работы. Диссертация состоит из введения, обзора литературы, описания материалов и методов исследования, результатов собственных исследований и их обсуждения, заключения, выводов и практических рекомендаций. Список литературы включает 275 источников, из них 164 отечественных и 111 зарубежных. Работа изложена на 149 страницах компьютерного текста, содержит 18 таблиц и 15 рисунков.

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ

Исследования проведены на 74 половозрелых беспородных собаках в возрасте 5-6 лет, средней массой 10-15 кг. В искусственно созданный дефект в области тела нижней челюсти пересаживался аллотрансплантат из компактной или губчатой костной ткани. В качестве трансплантата компактной кости использовали кортикальную пластинку тела нижней челюсти, взятую во время создания искусственного дефекта, в качестве губчатого – гребень подвздошной кости. Операцию пересадки костной ткани проводили с соблюдением всех правил асептики и антисептики [Т.Г. Робустова, 2001; Р.С. Османов и соавт., 2006]. Аллотрансплантация и все последующие исследования: биохимические, рентгенологические и морфологические проводились в сериях с компактной и губчатой костными тканями. Часть фрагмента нижней челюсти, содержащей трансплантат, фиксировали в 10% растворе нейтрального формалина, декальцинировали трилоном Б и заливали в целлоидин. Полученные срезы толщиной 10-15 мк окрашивали гематоксилин-эозином и нитрофуксином по Ван-Гизону. Рентгенографию производили на дентальном аппарате «Уран-70» с фокусным расстоянием от объектива 30 см при экспозиции 1-1,5 сек. Контролем во всех исследованиях служила здоровая костная ткань, взятая из тех же участков кости, что и трансплантат.

Экспериментальные животные были разделены на 3 группы. 1 группа. Контроль (10 интактных животных); 2 группа. Аллотрансплантация губчатой костной ткани при замещении образованного дефекта тела нижней челюсти (32 животных); 3 группа. Аллотрансплантация компактной костной ткани при замещении образованного дефекта тела нижней челюсти (32 животных). Исследования проводились через 7, 15, 30, 45 и 60 суток после операции пересадки.

Для изучения биохимических показателей (кроме активности ферментов) участок челюсти, содержащий трансплантат, после забоя животного тотчас погружался в сосуд с жидким азотом. Фиксация ткани в жидком азоте полностью останавливает ферментативные процессы и позволяет исследовать биологические субстраты весьма близко к прижизненному состоянию.

Определение содержания АТФ и других адениловых нуклеотидов проводили методом ионообменной хроматографии на колонке со смолой Дауэкс 1х8, 200-400 меш и рассчитывали в мкмоль на 1 г ткани, используя молярные коэффициенты экстинкции [М.М. Киреев и соавт., 1979; Э.Р. Нагиев, 2001]. Креатинфосфат определяли по нарастанию неорганического фосфора в кислой среде в присутствии молибденовокислого аммония и выражали в мкмоль на 1 г ткани [Т.Л. Алейникова и соавт., 2002]. Содержание лактата определяли лактатдегидрогеназной реакцией по образованию НАДН+Н+ и выражали в мкмоль на 1 г ткани [Н.Д. Ещенко, 1988]. Неорганический фосфат определяли колориметрически после осаждения магнезиальной смесью по Фиске-Суббароу с заменой эйконогена аскорбиновой кислотой [В.П. Скулачев, 1962] и выражали в мкмоль на 1 г ткани.

Определение содержания гликогена и глюкозы проводили в безбелковом фильтрате колориметрическим методом и выражали в мг% [В.А. Вилкова, 1988]. Активность амилазы определяли по ее способности гидролизовать гликоген и выражали в мг гидролизованного гликогена на 1 мг белка [Т.Т. Березов и соавт., 1976]. Фосфорилазную активность определяли по количеству связываемого при расщеплении гликогена неорганического фосфата [В.П. Скулачев, 1962] и выражали в мкг на 1 мг белка. Активность гексокиназы определяли по Лонгу [А.С. Шпигель, 1975] и выражали в мкг фосфорилированной за 20 мин инкубации глюкозы на 1 мг белка. Белок в пробах определяли микробиуретовым методом [Г.А. Кочетов, 1989]. Результаты исследований обрабатывали методами вариационной статистики [С. Гланц, 1999; О.Ю. Реброва, 2002], с использованием компьютерной программы «Statistika V.5.5A».

РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЙ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ

Во всех сериях экспериментов у животных в первые 2-3 суток после пересадки в области операционного поля отмечалась небольшая отечность мягких тканей. При пальпации подчелюстные лимфатические узлы были увеличены. На 7 сутки эти явления стихали и исчезали, заживление раны происходило первичным натяжением. При проведении трансплантации губчатой кости отечность была более выражена и держалась несколько продолжительнее, чем в сериях с компактной костной тканью. Рентгенологически спустя 30 суток после операции трансплантации, определяются первые признаки репаративных процессов: контуры образованного дефекта нижней челюсти становятся нечеткими и неровными, прозрачность понижена.

Рентгенологические исследования свидетельствуют, что при трансплантации компактной кости процесс перестройки и замещения был сравнительно затяжным. Первые признаки перестройки определялись через 30 суток после пересадки и характеризовались образованием первичной мозоли, сглаживанием краев трансплантата и костного ложа реципиента. В компактной кости (рис. 1А) отчетливо определяются процессы перестройки трансплантата и замещение его регенератом. Отмечается слияние границ трансплантата и краев образованного дефекта. Происходит замещение трансплантата вновь образованной костной тканью. Имеются явления остеопороза.

В трансплантатах из губчатой кости начальные признаки резорбции и репаративные процессы костной ткани определяются к концу второй недели. Через 30 суток после операции пересадки трансплантата губчатой кости отмечается замещение трансплантата вновь образованной костной тканью (рис. 1Б). Через 45 суток после трансплантации определяются более выраженные репаративные процессы, контуры становятся округлыми, видно образование костной мозоли. Кроме того, рентгенологически определяются отчетливые процессы резорбции трансплантата и замещение его вновь образованной костной тканью. Контуры аллотрансплантата и после­операционного дефекта определяются с трудом, выявляется образование костной мозоли.

Спустя 60 суток после трансплантации отмечается замещение трансплантата вновь образованной костью, структура которой во многом сходна с костной тканью нижней челюсти реципиента. На рентгенограмме после трансплантации компактной кости (рис. 1В) границы определяются с трудом из-за костного сращения между трансплантатом и ложем реципиента. В области пересадки отмечается плотность костной ткани, характерная для компактного строения.

А

Б

В

Г

Рис. 1. Рентгенологические изменения аллотрансплантатов через 30 [А, Б] и 60 сут [В, Г] соответственно компактной и губчатой кости.

На рентгенограмме нижней челюсти собаки через 60 суток после операции пересадки трансплантата губчатой кости (рис. 1Г) имеет место замещение трансплантата вновь образованной костной тканью с признаками продолжающейся его перестройки. Рентгенологически определяется полное замещение трансплантата совершенной костной структурой. Границы между трансплантатом и ложем реципиента практически неразличимы. Трансплантат полностью перестроился и заместился новообразованной костной тканью.

Что касается морфологической картины, то во всех сериях опытов можно выявить как ряд общих изменений, так и некоторые отличия, связанные с видом трансплантата и его структурой. Так, начальные признаки репаративной регенерации при замещении дефекта нижней челюсти трансплантатом компактной кости проявляются позже по сравнению с губчатой и определяются образованием клеточно-волокнистой ткани на 7-14 сутки после пересадки. Начало образования незрелой костной мозоли между трансплантатом и костным ложем реципиента определяется спустя 15 суток после трансплантации. Через 30 суток после операции пересадки трансплантата компактной кости (рис. 2А) происходит приживление трансплантата к костному ложу реципиента посредством образования незрелой костной мозоли. Образование костной мозоли происходит в участке соединения аллотрансплантата с материнским ложем.

При аллопластике губчатой костной ткани начало репаративных процессов определяется на 7 сутки после операции и характеризуется умеренной пролиферацией клеток остеобластов со стороны периоста и эндоста на фоне слабой лимфоидной инфильтрации. Через две недели наблюдается образование незрелой костной мозоли, которая спустя 30 суток после пересадки превращается в зрелую костную мозоль (рис. 2Б). Обнаруживаются мелкие участки костной ткани трансплантата среди зрелой костной мозоли. В трансплантате просматриваются остеоциты, наблюдается усиленная пролиферация остеобластов, которая осуществляется со стороны периоста. В костном ложе реципиента следы значительной перестройки костной ткани.

Спустя 45 суток после операции пересадки аллотрансплантата происходит плотное сращение трансплантата с костным ложем реципиента посредством обильно васкуляризованной вновь образованной костной тканью примитивного строения. Новообразованная кость интимно спаяна с поверхностью трансплантата. Линия соединения неровная с наличием впадин и изгибов. Однако в эти сроки видны еще широкие гаверсовы каналы, заполненные кровеносными сосудами в просвете. Вокруг гаверсовых каналов прослеживается четкий рисунок с наличием остеоцитов. Со стороны периоста происходит усиленная пролиферация клеточно-волокнистой ткани, врастающей в трансплантат.

Через 60 суток после пересадки наблюдается замещение трансплантата вновь образованной костью, сохраняющей черты незрелости. Границы аллотрансплантата как компактной, так и губчатой костной ткани определить невозможно вследствие замещения ткани трансплантатов вновь образованной костью с некоторыми признаками её незрелости в виде наличия широких костномозговых пространств, заполненных кровеносными сосудами (рис. 2 В, Г).

В костной ткани ложа реципиента наблюдается множество базофильно окрашенных линий склеивания, являющихся следствием перестройки костных структур. При аллотрансплантации компактной кости имеет место плотное спаяние трансплантата с материнским ложем посредством образования зрелой костной мозоли. В случае аллотрансплантации губчатой костной ткани происходит плотное сращение трансплантата с костным ложем реципиента с помощью зрелой костной мозоли широкопетлистого строения, из-за чего границы трансплантата различаются с трудом.

Таким образом, рентгенологические и морфологические исследования показали, что во всех сериях экспериментов конечным результатом пересадок различных по виду трансплантатов является резорбция и замещение дефектов нижней челюсти пересаженной костной ткани. Однако

А

Б

В

Г

Рис. 2. Морфологические изменения аллотрансплантатов через 30 [А,Б] и 60 суток [В,Г] соответственно компактной и губчатой кости.

при пересадке аллогенной компактной кости сроки приживления увеличены, а перестройка и замещение вновь образованной костью завершается позднее по сравнению с губчатой костной тканью. Через 60 суток после операции наблюдается активная перестройка трансплантата, но полного замещения его в компактной кости все еще не происходит.

Анализ полученных результатов свидетельствует, что аллотрансплантация губчатой и компактной кости сопровождается существенными биохимическими изменениями в процессе регенерации. В частности, заметно нарушается содержание и использование основных энергетических ресурсов костной ткани гликогена и глюкозы в зависимости от характера используемой кости – губчатая или компактная (табл. 1).

Так, после аллотрансплантации губчатой и компактной кости наблюдается значительное накопление в трансплантатах углеводных энергетических ресурсов (гликогена и глюкозы), максимальное увеличение которых происходит через 15-30 суток после операции пересадки. В дальнейшем, спустя 2 месяца после пересадки, содержание гликогена и глюкозы в трансплантате губчатой кости практически нормализуются.

Что касается пересадки компактной кости, то при аллогенной ее трансплантации отмечались некоторые особенности, хотя сама направленность изменений носила тот же характер. Так нарастание содержания гликогена и глюкозы в пересаженной ткани в одни и те же сроки исследований происходило в большей степени, а нормализация затягивалась и не наступала даже спустя два месяца после пересадки.

В отличие от губчатой кости, содержание гликогена и глюкозы в трансплантате из компактной костной ткани через 60 суток после операции пересадки достоверно превышают контроль более чем на 60%.

При исследовании активности ферментов обмена гликогена и глюкозы в костных аллотрансплантатах, в частности, фосфорилазы, амилазы, гексокиназы и при сравнении их активностей с содержанием соответствующих субстратов отмечаются интересные закономерности.

Таблица 1

Динамика содержания гликогена и глюкозы

в аллотрансплантатах костной ткани

(М ± m; мкмоль на 1 г ткани)

Серии опытов		Губчатая кость		Компактная кость
		Гликоген	Глюкоза	Гликоген	Глюкоза
Сутки после аллотрансплантации	Контроль	0,34±0,02	0,118±0,005	0,25±0,02	0,089±0,011
	7 суток	0,57±0,02*	0,209±0,008*	0,38±0,02*	0,163±0,011*
	15 суток	0,59±0,02*	0,228±0,009*	0,52±0,03*	0,202±0,024*
	30 суток	0,58±0,02*	0,216±0,007*	0,48±0,02*	0,188±0,017*
	45 суток	0,54±0,02*	0,182±0,009*	0,46±0,02*	0,166±0,013*
	60 суток	0,46±0,02	0,165±0,007	0,40±0,02*	0,144±0,012*

Примечание: здесь и далее: *р < 0,05

Следует отметить, что вопрос о костной фосфорилазе изучался и ранее многими авторами в различных аспектах жизнедеятельности костей, но до настоящего времени остается дискуссионным [В.П. Торбенко, 1993; Б.С. Касавина и соавт., 2004; А.Н. Чудинов, 2006].

Нами активность фосфорилазы определялась как в интактной кости, так и в костной ткани в различные сроки после пересадки в дефект тела нижней челюсти. Однако статистически достоверных изменений активности фосфорилазы не выявлено.

По-видимому, это может быть объяснено либо малым содержанием фермента в исследуемых костных тканях, либо трудностью извлечения фосфорилазы из костной ткани, либо, наконец, наличием веществ, тормозящих активность фермента. Последнее обстоятельство следует постоянно принимать во внимание, ибо в экстремальных условиях пересадки ткани такое ингибирование приобретает особое значение. Несомненно, эти вопросы требуют своего дальнейшего разрешения. Во всяком случае, полученные данные позво­ляют заключить, что при перестройке костных тканей в условиях их аллотран­сплантации в дефект тела нижней челюсти, основное внимание для расшифровки судьбы гликогена следует обратить на амилолитический путь его распада, обеспечиваемый ферментом амилазой. Это согласуется с мнением и других авторов, указывающих на эту особенность обмена костной ткани [А.М. Белоус и соавт., 2002; И.П. Ермакова и соавт., 2004; Б.С. Касавина и соавт., 2007; Э.Р. Нагиев и соавт., 2007; B.R. Robison, 2006; M. Rix et al., 2008].

Как показали проведенные исследования, в отличие от содержания важнейших энергетических субстратов углеводного обмена гликогена и глюкозы, активности ферментов их утилизации, в частности, амилазы и гексокиназы на многих этапах аллотрансплантации существенно снижаются по сравнению с показателями контрольной группы животных (табл. 2).

Максимальное снижение активности амилазы (54% и 60%) и гексокиназы (41% и 55%) по отношению к контролю в компактной и губчатой костной ткани соответственно наблюдается спустя 15 суток после пересадки (рис. 3,4).

Следовательно, обнаруженные сдвиги в биохимических изменениях субстратов – глюкозы и гликогена – в большинстве случаев коррелируют с изменениями активности ферментов их превращений (гексокиназы и амилазы). При анализе динамики активностей амилазы и гексокиназы, а также сопоставлении их с динамикой содержания гликогена и глюкозы в трансплантатах, обращает на себя внимание то обстоятельство, что в сроки наибольшего содержания в тканях гликогена и глюкозы активность ферментов резко угнетена и, наоборот, значительное и прогрессирующее повышение активности ферментов сопровождается и существенным снижением уровня полисахарида и глюкозы в исследуемых трансплантатах.

Нормальное (исходное) содержание гликогена и глюкозы в аллотрансплантатах наблюдается лишь тогда, когда устанавливается и исходная активность ферментов амилазы и гексокиназы. Следовательно, отмечаемое высокое содержание гликогена и глюкозы в тканях трансплантата в первые две недели после операции является результатом инактивации ферментов, обеспечивающих пусковые механизмы утилизации и использования этих важнейших углеводных ресурсов костной ткани, что, естественно, свидетельствует о значительном снижении возможностей ее жизнеобеспечения. Отсюда также следует, что уже спустя два месяца после операции в претерпевшей перестройку костной ткани, особенно губчатой, содержание гликогена и глюкозы и возможности их использования в энергетических и пластических целях полностью восстанавливаются.

Таблица 2

Активность амилазы и гексокиназы в аллотрансплантатах

костной ткани в различные сроки после пересадки

(М±m; в мг/белка)

Серии опытов		Губчатая кость		Компактная кость
		Амилаза	Гексокиназа	Амилаза	Гексокиназа
Сутки после аллотрансплантации	Контроль	0,286±0,019	7,72±0,27	0,156±0,012	4,12±0,43
	7 суток	0,194±0,011*	5,48±0,22*	0,098±0,006*	2,72±0,23*
	15 суток	0,172±0,010*	4,17±0,19*	0,084±0,004*	1,69±0,09*
	30 суток	0,206±0,012*	4,70±0,22*	0,110±0,007*	1,97±0,10*
	45 суток	0,234±0,015	5,38±0,23*	0,115±0,008*	2,51±0,18*
	60 суток	0,272±0,017	7,18±0,25	0,135±0,009	3,13±0,25*

Закономерной особенностью наблюдающихся биохимических изменений в трансплантатах как губчатой, так и компактной костной ткани является существенное снижение содержания лактата, креатинфосфата и неорганического фосфата (табл. 3).

Так, содержание креатинфосфата через 15 суток после трансплантации падает до 49% и 42% соответственно в губчатой и компактной кости по сравнению с контролем. Спустя 30 суток низкое содержание креатинфосфата сохраняется, а через 45 суток наблюдается тенденция к повышению его содержания и спустя 60 суток в трансплантате из губчатой кости нормализуется, а в компактной кости остается достоверно низкой и составляет около 75% от контроля.

Наряду с креатинфосфатом в костных аллотрансплантатах параллельно исследовали содержание универсального источника энергии в тканях – АТФ и других адениловых нуклеотидов, формирующих в клетках аденилатный энергетический заряд [А.Я. Николаев, 2007; Han Bao Fen et al., 2002].

Рис. 3. Изменения содержания гликогена и активности

амилазы в аллотрансплантатах костной ткани (в % к контролю).

Рис. 4. Изменения содержания глюкозы и активности

гексокиназы в аллотрансплантатах костной ткани (в % к контролю).

Содержание АТФ и других аденилатов определяли как в интактной кости, так и после операции аллотрансплантации. Однако ни в одном из этих случаев не удалось использованными нами методами обнаружить ни АТФ, ни ее аналогов с достаточной степенью достоверности.

Очевидно в костной ткани, в отличие от других тканей, функцию хранения и универсального поставщика энергии выполняет не столько АТФ, сколько креатинфосфат. Тем более, как это вытекает из полученных результатов и данных литературы, содержание креатинфосфата в костной ткани существенно превышает его содержание в других органах и тканях [В.В. Цыбульский, 2003; Э.Р. Нагиев, А.Н. Чудинов, 2008; C. Prats et al., 2005; P. Behrens et al., 2007; A.A. Creen et al., 2008].

Таблица 3

Содержание лактата, креатинфосфата и неорганического фосфата в аллотрансплантате из губчатой костной ткани в динамике

(М ± m; мкмоль/г ткани)

Вид аллотранс- плантата		Условия опыта	Биохимические показатели
			Лактат	КФ	НФ
Сутки после трансплантации	Губчатая кость	Контроль	4,51±0,22	31,08±0,79	2626±55,79
		7 сут	3,11±0,12*	20,21±0,47*	1995±34,12*
		15 сут	2,75±0,09*	15,23± 0,38*	1496±23,31*
		30 сут	3,26±0,14*	17,83±0,51*	1959±34,07*
		45 сут	3,53±0,18*	23,53±0,57*	2163±45,57*
		60 сут	4,28±0,23	30,15±0,66	2468±48,65
	Компактная кость	Контроль	5,99 ± 0,37	23,83 ± 0,85	3192±51,93
		7 сут	3,59±0,31*	12,86±0,55*	2298±46,13*
		15 сут	2,52±0,18*	10,01±0,37*	1691±23,17*
		30 сут	3,44 ± 0,27*	12,05± 0,42*	1992±28,54*
		45 сут	3,46 ± 0,29*	14,64±0,53*	2049±37,10*
		60 сут	4,39 ± 0,26*	18,10±0,67*	2234±45,67*

Аналогичные изменения как в случае креатинфосфата, но выраженные в разной степени, отмечаются и в отношении лактата и неорганического фосфата (рис. 5, 6). Причем во всех случаях имеет место волнообразный характер изменений биохимических показателей: вначале, спустя 7, 15 и 30 суток после пересадки происходит достоверное снижение содержания лактата, креатинфосфата и неорганического фосфата, свидетельствующее не только о снижении энергообеспечения костных аллотрансплантатов, но и о нарушении процессов минерализации пересаженной костной ткани. Вместе с тем, на заключительном этапе – через 45 и особенно 60 суток в губчатой костной ткани происходит нормализация биохимических параметров.

В аллотрансплантатах компактной костной ткани, хотя принципиально происходят однотипные изменения, они выражены более резко и не подвергаются нормализации даже спустя 2 месяца после операции пересадки.

Как известно, костная ткань отличается высокой активностью лактатдегидрогеназы и интенсивным гликолизом. Анаэробное окисление гликогена и глюкозы в тканях и, в частности, костной ткани приводит к образованию молочной кислоты. Результатом этих реакций является образование двух молекул АТФ в ходе субстратного фосфорилирования [Я. Кольман и др., 2000; С.Е. Северин, 2007; R. Cusso et al., 2006; H. Koike et al., 2007].

Проведенные исследования показали, что снижение активности гексокиназы – ключевого фермента анаэробного гликолиза, приводит не только к накоплению в аллотрансплантатах глюкозы, но и существенному падению количества молочной кислоты в результате снижения окисления глюкозы по анаэробному пути в этих условиях. Следовательно, в условиях угнетения активности пусковых ферментов превращения углеводов угнетается и течение гликолитических процессов в тканях трансплантатов, особенно резко в аллотрансплантате компактной костной ткани.

Сравнение, сопоставление и анализ полученных результатов позволяет сделать полезные выводы для практического здравоохранения в плане выработки тактики и стратегии при выборе того или иного вида трансплантационного материала, в частности, при замещениях дефектов нижней челюсти. Анализ полученных результатов позволяет заключить, что быстрее и совершеннее происходит процесс регенерации при аллотрансплантации губчатой костной ткани.

Рис. 5. Динамика изменения содержания лактата и гексокиназы в

аллотрансплантатах костной ткани (в % к контролю).

Рис. 6. Изменения содержания креатинфосфата и неорганического фосфата в аллотрансплантатах костной ткани (контроль – 100%).

Изменения важнейших биохимических показателей свидетельствует о том, что в процессе перестройки костных аллотрансплантатов в течение первых 30 суток наблюдается снижение их жизнеспособности, а затем наступает постепенная нормализация морфологических и функциональных параметров. Вместе с тем, к концу сроков наблюдений в компактной костной ткани, в отличие от губчатой кости, биохимические параметры восстановленной кости нормализуются не полностью, что находит подтверждение и рентгенологическими и морфологическими исследованиями.

Таким образом, весь комплекс полученных нами данных свидетельствует о явных преимуществах аллотрансплантатов губчатой кости по сравнению с другим видом костной пластики при замещении дефектов тела нижней челюсти. После двухнедельного периода значительного снижения жизнеспособности таких трансплантатов, к концу второго месяца важнейшие биохимические параметры перестроенной костной ткани восстанавливаются. Это подтверждается рентгенологической и морфологической картиной перестройки трансплантата. В случае же использования аллотрансплантации компактной кости приживление и перестройка трансплантата протекает значительно хуже.

Все это диктует необходимость дифференцированного подхода при подборе пластического материала костной ткани при лечении больных в клинике.

ВЫВОДЫ

1. В экспериментах на собаках показано, что аллотрансплантация губчатой и компактной костной ткани при замещении дефекта тела нижней челюсти имеет ряд отличительных признаков, как по срокам репаративных процессов, так и по характеру изменений метаболизма.

2. Рентгенологическими и морфологическими исследованиями установлено, что процессы перестройки и замещения пересаженной костной ткани губчатого и компактного строения начинаются однотипно, но завершаются они быстрее и совершеннее в аллотрансплантатах из губчатой кости.

3. Установлено, что в аллотрансплантатах из губчатой кости в течение первого месяца происходит более быстрое накопление гликогена и глюкозы, а затем наступает более интенсивное их снижение и нормализация, чем в трансплантатах из компактной кости; причем эти изменения коррелируют с изменениями активности ключевых ферментов их метаболизма амилазы и гексокиназы.

4. Выявлено, что в ближайшем послеоперационном периоде, как в тех и других костных трансплантатах снижено содержание лактата, креатинфосфата, неорганического фосфата и не выявлено изменений со стороны АТФ и других адениловых нуклеотидов. При этом в трансплантатах из губчатых костей содержание лактата, креатинфосфата и неорганического фосфата постепенно повышается и к концу второго месяца полностью восстанавливается, в то время как в трансплантатах из компактных костей этот процесс существенно отстает.

5. Выявленные особенности в обмене фосфорорганических метаболитов свидетельствует о том, что в костной ткани в послеоперационном периоде энергообеспечение идет в основном за счет резерва креатинфосфата и анаэробного окисления глюкозы, поступающей из крови.

6. Разработанный комплекс биохимических показателей и результаты рентгенологических и морфологических исследований могут служить научно обоснованными критериями для преимущественного использования губчатой костной ткани при замещении дефектов нижней челюсти.

ПРАКТИЧЕСКИЕ РЕКОМЕНДАЦИИ

1. Рекомендовать при восстановительных костнопластических операциях на нижней челюсти использовать комплекс биохимических показателей в качестве информативного критерия состояния энергетических систем трансплантатов и оценки их жизнеспособности.

2. При подборе пластического материала костной ткани для лечения больных в клинике учитывать, что исход операции пересадки кости и сроки репаративного костеобразования при замещении дефектов нижней челюсти определяются особенностями обменных процессов, протекающих в разных по виду и характеру трансплантатах.

Список научных работ, опубликованных по теме диссертации

1. Чудинов А.Н., Нагиева С.Э. Перспективы трансплантологии костной ткани в современной медицине // Труды международной научной конференции «Фармакология и фармакотерапия: достижения и перспективы». – Махачкала: ИПЦ ДГМА, 2006. – С. 254-256.

2. Чудинов А.Н., Нагиева С.Э. Активность ферментов как показатель жизнеспособности костных трансплантатов при замещении дефектов нижней челюсти // Сборник трудов международной научно-практической конференции «Стоматология и челюстно-лицевая хирургия: современные технологии, новые возможности». – Махачкала: Изд. «Лотос», 2007.– С. 62-64.

*3. Нагиева С.Э. Исследование содержания глюкозы и активности гексокиназы в костных аллотрансплантатах в эксперименте // Вестник Российского государственного медицинского университета. – 2007. – №2 (55) – С. 296-297.

*4. Чудинов А.Н., Нагиева С.Э., Исмаилова Ф.Э. Энергетический обмен при критических состояниях организма и его коррекция перфтораном // Экология промышленного производства. – 2007. – № 1. – С. 46-50.

5. Чудинов А.Н., Нагиева С.Э. Исследование содержания глюкозы и гликогена в трансплантате костной ткани в эксперименте // Материалы межвузовской научной конференции с международным участием «Фундаментальные проблемы морфологии». – Махачкала: ИД «Наука плюс», 2007. – С. 85-87.

*6. Нагиева С.Э. Исследование молочной кислоты в костных аллотрансплантатах при замещении дефектов нижней челюсти в эксперименте // Вестник Российского государственного медицинского университета. – 2009. – №3 – С. 54-55.

7. Исмаилова Ф.Э., Нагиева С.Э. Коррекция содержания АТФ и креатинфосфата при критических состояниях организма в эксперименте // III Международный молодежный медицинский Конгресс «Санкт-Петербургские научные чтения». – Санкт-Петербург. – 2009. – С. 31-32.

8. Нагиева С.Э. Изменения содержания креатинфосфата и неорганического фосфата в аллотрансплантатах из компактной кости в динамике после пересадки // Материалы межрегиональной межвузовской научно-практической конференции «Здоровье молодежи и сохранение трудового потенциала России». – Пермь: ГОУ ВПО ПГМА им. акад. Е.А. Вагнера, – 2009. – С. 37-39.

*9. Исмаилова Ф.Э., Нагиева С.Э. Исследование содержания адениловых нуклеотидов в тканях животных при аллотрансплантации и воздействии вредных экологических факторов // Вестник Российского государственного медицинского университета. – 2010. – №2. – С. 495-496.

10. Быков И.М., Чудинов А.Н., Нагиева С.Э. Рентгенологическая картина аллотрансплантатов компактной и губчатой костной ткани при замещении костных дефектов // Актуальные вопросы стоматологии: сборник научных трудов конференции, посвященной 25-летию организации кафедры стоматологии ФПК и ППС. – Махачкала, ИПЦ ДГМА. – 2010. – С. 140-143.

11. Нагиева С.Э., Быков И.М., Чудинов А.Н., Гаджиев А.Р. Морфологические изменения аллотрансплантатов компактной и губчатой костной ткани при замещении дефектов нижней челюсти в эксперименте // Актуальные вопросы стоматологии: сборник научных трудов конференции, посвященной 25-летию организации кафедры стоматологии ФПК и ППС. – Махачкала, ИПЦ ДГМА. – 2010. – С. 143-146.

12. Нагиева С.Э., Чудинов А.Н., Быков И.М., Омаров О.Г. Анаэробный гликолиз в трансплантате костной ткани при замещении дефектов нижней челюсти // Материалы научной конференции, посвященной 45-летию стоматологического факультета. – Махачкала: ИПЦ ДГМА. – 2010. – С.117-118.

13. Нагиева С.Э., Быков И.М., Чудинов А.Н. Гексокиназная реакция гликолиза в аллотрансплантатах костей при замещении дефектов нижней челюсти // Материалы Всероссийской научной конференции хирургов, посвященной 90-летию со дня рождения чл.-корр. АМН СССР Р.П. Аскерханова. – Махачкала: Изд-во «Юпитер». – 2010. – С. 211-212.

* – работа опубликована в журнале, включенном ВАК в Перечень ведущих рецензируемых научных журналов и изданий.

Список сокращений

АТФ – аденозинтрифосфорная кислота

НАД – окисленный никотинамидадениндинуклеотид

НАДН+Н+– восстановленный никотинамидадениндинуклеотид

НФ – неорганический фосфат

КФ – креатинфосфат

АМ – амилаза

ГК – гексокиназа