Диагностическое значение обратно транскриптазной полимеразной цепной реакции в выявлении клеток рака предстательной железы в крови

На правах рукописи

Забежинская Ольга Марковна

ДИАГНОСТИЧЕСКОЕ ЗНАЧЕНИЕ

ОБРАТНО ТРАНСКРИПТАЗНОЙ ПОЛИМЕРАЗНОЙ ЦЕПНОЙ РЕАКЦИИ В ВЫЯВЛЕНИИ КЛЕТОК

РАКА ПРЕДСТАТЕЛЬНОЙ ЖЕЛЕЗЫ В КРОВИ

14.00.40 - урология

03.00.04 - биохимия

АВТОРЕФЕРАТ

диссертации на соискание ученой степени

кандидата медицинских наук

Москва – 2008

Работа выполнена в ГОУ ВПО

Московской медицинской академии им. И.М.Сеченова РОСЗДРАВА

Научные руководители: доктор медицинских наук,

профессор АСЛАМАЗОВ Эдуард Гургенович

член-корр.РАЕН,

лауреат Государственной премии СССР

доктор биологических наук,

профессор ЗЕЗЕРОВ Евгений Гаврилович

Официальные оппоненты:

доктор медицинских наук, профессорТеодорович Олег Валентинович;

доктор медицинских наук, профессор Имянитов Евгений Наумович.

Ведущая организация: ГОУ ВПО «Московский государственный медико-стоматологический университет РОСЗДРАВА».

Защита диссертации состоится «__» ________ 2008 года в _____ на заседании диссертационного Совета Д 208.040.11 при ГОУ ВПО Московской Медицинской Академии им. И.М.Сеченова РОСЗДРАВА по адресу: 119991, г.Москва, ул.Трубецкая, д.8, стр.2.

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке ГОУ ВПО ММА им.И.М.Сеченова РОСЗДРАВА по адресу: 117998, г.Москва, Нахимовский проспект, д.49.

Автореферат разослан «__» _________ 2008 г.

Ученый секретарь Диссертационного Совета

доктор медицинских наук, профессор Тельпухов Владимир Иванович

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА ДИССЕРТАЦИИ

Актуальность проблемы. Рак предстательной железы (РПЖ) относится к числу наиболее значимых и распространенных заболеваний нашего времени. Cреди причин смерти мужчин от опухолей, РПЖ занимает второе место после рака легких [Лопаткин Н.А.,2002]. Настораживающей является выраженная тенденция роста заболеваемости во многих странах, в том числе и России. Одновременно отмечается рост смертности от этой болезни [Бухаркин Б.В., 2003].

Для РПЖ характерно раннее метастазирование, чаще всего гематогенным путем в кости таза и позвоночник. Применяемые методики отбора больных, включающие пальцевое ректальное исследование, определение простатического специфического антигена (ПСА), трансректальное ультразвуковое исследование простаты, пункционную биопсию с гистологическим исследованием и определением степени злокачественности по Глиссону, в большом числе наблюдений не позволяют адекватно оценить стадию заболевания и биологический потенциал рака простаты, характеризующего способность опухоли к метастазированию. Раннее выявление процесса диссеминации её необходимо для правильного выбора лечебной тактики, в том числе при отборе пациентов на радикальное хирургическое лечение, при решении вопроса о назначении адъювантной терапии до и после него. Также это важно для мониторинга состояния больных.

С 1992 года разрабатывается методика применения обратно транскриптазной полимеразной цепной реакции (ОТ-ПЦР) для определения циркулирующих в крови клеток опухоли предстательной железы, основанная на определении мРНК простатического специфического антигена [Moreno J.G., 1999]. В зарубежной литературе предложено называть обнаруженные в крови раковые клетки солидных опухолей гематогенными микрометастазами [Pelkey T.J., 1996]. Проведены исследования, подтверждающие возможность использования данной методики как для предоперационной диагностики стадии процесса, так и послеоперационного выявления рецидива [Katz A.E., 1994]. Имеются данные о применении реакции для первичной диагностики РПЖ [Bostwick D.G., 1998]. Предложено использовать данную методику для изучения возможности гематогенной диссеминации клеток рака простаты после лечебно-диагностических процедур, проводимых на предстательной железе [Cama C., 1997]. В России систематичеких исследований в этом направлении нет. Результаты опубликованных зарубежных исследований противоречивы. Для практического применения методики клиницистами необходимо продолжить исследования в этой области.

Целью настоящего исследования является изучение клинического значения выявления клеток рака простаты в периферической крови с помощью ОТ-ПЦР, специфичной мРНК ПСА, а также исследование возможности гематогенной диссеминации при проведении лечебно-диагностических манипуляций на предстательной железе.

Нами сформулированы следующие задачи исследования:

провести экспериментальный анализ и оптимизацию имеющихся методик ПСА-специфичной ОТ-ПЦР периферической крови для использования их при дальнейших клинических исследованиях;

изучить чувствительность и специфичность выбранного метода и взаимосвязь результатов ОТ-ПЦР с традиционными диагностическими и прогностическими критериями при исследовании пациентов без заболеваний простаты, с фоновыми и предраковыми заболеваниями, а также РПЖ;

сопоставить динамику изменения результатов ОТ-ПЦР крови и уровня ПСА на фоне гормонального лечения и без него при динамическом наблюдении больных РПЖ;

провести анализ влияния лечебно-диагностических процедур (биопсии простаты, массажа простаты, радикальной простатэктомии, трансуретральной резекции простаты) на результат ОТ-ПЦР исследуемых пациентов.

Научная новизна. Впервые в России проведено исследование по выявлению циркулирующих в крови клеток рака простаты с помощью ОТ-ПЦР для мРНК ПСА. Проведена оптимизация и анализ чувствительности нескольких методик ОТ-ПЦР с применением четырех групп ПСА-специфичных праймеров. Установлено, что выбранная методика обладает достаточно высокой чувствительностью и специфичностью, является сравнительно недорогостоющей и технически доступной.

На клиническом материале показана высокая чувствительность и специфичность метода, взаимосвязь его результатов с уровенем ПСА, степенью дифференцировки первичной опухоли, её размером, наличием поражения регионарных лимфатических узлов и отдаленных метастазов.

Установлена возможность выявления циркулирующих в крови клеток рака простаты с помощью ОТ-ПЦР у пациентов с отсутствием метастазов по результатам традиционных методов исследования.

При обследовании пациентов с подозрением на рак простаты установлена возможность попадания простатических клеток в кровеносное русло при простатической интраэпителиальной неоплазии высокой степени (ПИН-2).

Впервые продемонстрирована возможность гематогенной диссеминации после массажа простаты, а также после биопсии простаты, радикальной простатэктомии (РПЭ), трансуретральной резекции простаты (ТУР) у пациентов с ПИН-2 и раковой трансформацией.

Практическая ценность работы. Апробирована и оптимизирована высоко чувствительная и специфичная методика выявления клеток рака простаты в крови с помощью ОТ-ПЦР, позволяющая установить процесс гематогенной диссеминации в более ранние сроки по сравнению с традиционными методами диагностики метастазов. Результаты исследования могут использоваться для индивидуальной оценки метастатического потенциала опухоли а также риска развития РПЖ при наличии ПИН-2. Показана возможность временной гематогенной диссеминации после проведения биопсии простаты, ТУР, масажа простаты и радикальной простатэктомии, что является обоснованием для более строгих показаний при планировании подобных процедур.

Основные положения, выносимые на защиту:

1. Методика выявления циркулирующих в крови клеток рака простаты с помощью ОТ-ПЦР специфичной мРНК ПСА является высоко чувствительной и специфичной, а также коррелирует с традиционными диагностическими и прогностическими критериями РПЖ, что подтверждает ее клиническое значение.

2. У больных раком простаты методика позволяет выявлять процесс метастазирования на раннем этапе и может применяться для ранней диагностики процесса диссеминации рака предстательной железы.

3. У больных с подозрением на рак предстательной железы методика может применяться для оценки риска развития диссеминированного рака простаты.

Апробация работы. Результаты исследований доложены на X Российском съезде урологов (Москва, 2002); III съезде биохимического общества (Санкт-Петербург, 2002); Научно-практическом симпозиуме «Технологии генодиагностики в практическом здравоохранении» в рамках Международной конференции «Геномика, протеомика и биоинформатика для медицины» (Москва, 2002); конференции «Онкологическая урология: от научных исследований к клинической практике (современные возможности диагностики и лечения опухолей предстательной железы, мочевого пузыря и почки» (Москва, 2004); III конференции молодых ученых с международным участием «Фундаментальные науки и прогресс клинической медицины» (Москва, 2004); II Международной конференции «Молекулярная медицина и биобезопасность» (Москва, 2005); XI съезде Российских урологов (Москва, 2007), а также неоднократно обсуждались на научно-практических конференциях кафедрах урологии и биохимии ММА им. И.М.Сеченова. Апробация работы состоялась на совместном заседании кафедры урологии и кафедры биохимии ММА им. И.М.Сеченова 23 мая 2008 года.

Публикации. По теме диссертации опубликовано 12 работ.

Структура и объем диссертации. Диссертационная работа изложена на 123 страницах машинописного текста и содержит следующие разделы: введение, обзор литературы, материалы и методы исследования, результаты собственных исследований, обсуждение полученных результатов, выводы, практические рекомендации и список цитированной литературы, включающий 190 источников (20 отечественных, 170 зарубежных). Работа иллюстрирована 15 рисунками и 34 таблицами.

СОДЕРЖАНИЕ ДИССЕРТАЦИИ

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ

Характеристика клеточной линии. При отработке методики, а также в качестве положительного контроля при проведении ОТ-ПЦР использованы перевиваемые клетки РПЖ человека линии LNCaP. Клетки культивировали в среде RPMI 1640 с добавлением 10% фетальной сыворотки крупного рогатого скота, 100 Ед/мл пенициллина и 100 мкг/мл стрептомицина при 37° в CO2-инкубаторе (5%CO2, влажность 95%).

Характеристика исследованных больных. В исследование включены 93 человека, у которых было проведено 156 ОТ-ПЦР периферической крови. Из них 14 человек являлись здоровыми донорами и 79 наблюдались в клинике урологии ММА им. И.М. Сеченова в период с 2000 по 2003 г. Общая характеристика пациентов, включенных в исследование, представлена в табл 1.

Основную группу исследования составили 66 пациентов с подозрением, либо морфологически подтвержденным раком простаты. Из них у 22 больных при морфологическом исследовании биоптатов этого органа на момент первичной ОТ-ПЦР выявлены хронический простатит (ХП), доброкачественная гиперплазия простаты (ДГПЖ) и ПИН-1 и/или ПИН-2 в различных сочетаниях. Эти пациенты составили подгруппу с фоновыми и предраковыми заболеваниями простаты. Возраст больных - от 34 до 80 лет.

Таблица 1

Характеристика обследованных пациентов (n=93)

Группа	Количество человек	Подгруппы	Количество человек
Основная	66	Пациенты с фоновыми и предраковыми заболеваниями простаты	22
		Больные раком простаты	44
Контрольная	27	Здоровые доноры	14
		Урологические больные без патологии простаты	13

Группу больных раком простаты составили 44 пациента, из них 42 - с морфологически подтвержденным диагнозом, и 2 - с развернутой клинической картиной рака простаты при морфологическом диагнозе ДГПЖ, либо ПИН 1-2. Возраст больных - от 40 до 80 лет. Диагноз рака предстательной железы был поставлен в соответствии с международной системой TNM на основании клинических данных, результатов пальцевого исследования простаты, определения ПСА, рентгено- и остеосцинтиграфии костей скелета для подтверждения наличия очагов метастазирования. Гистологическая оценка степени дифференцировки раковых клеток осуществлялась по трехступенчатой системе (G1-G3). ОТ-ПЦР проводили до биопсии простаты, либо не менее, чем через 2 недели после нее.

Контрольную группу составили 27 человек, из них 14 здоровых доноров-мужчин в возрасте до 40 лет и 13 мужчин с различными урологическими заболеваниями без патологии простаты (8 больных варикоцеле в возрасте от 16 до 23 лет и 5 с другими урологическими заболеваниями без поражения предстательной железы в возрасте от 20 до 66 лет).

Для выявления динамики изменения результатов ОТ-ПЦР крови проведены повторные обследования с интервалом не менее, чем через 2 месяца после первичного анализа (максимальный срок – 27 месяцев) у 11 пациентов с подозрением на РПЖ (2 больных с ДГПЖ и ПИН 1-2, одного - с клинической картиной рака простаты при морфологическом диагнозе ПИН 1-2, 8 больных подтвержденным раком простаты). Полученные данные сопоставляли с динамикой уровня ПСА, наличием или отсутствием гормональной терапии и особенностями течения заболевания.

Для анализа влияния лечебно-диагностических процедур на результаты ОТ-ПЦР проведены сравнения ОТ-ПЦР крови, которую брали за 0,5-3 часа до и в течение суток после процедуры, у 34 пациентов (табл.2).

Таблица 2

Характеристика пациентов, включенных в исследование влияния на результаты ОТ-ПЦР лечебно-диагностических вмешательств на предстательной железе (n=34)

Процедура	Количество пациентов	Характеристика пациентов
Биопсия простаты	11	Фоновые и предраковые заболевания простаты
	11	Больные РПЖ
Массаж простаты	2	Предраковые заболевания простаты
	4	Больные РПЖ
РПЭ	4	Больные РПЖ
ТУР	2	Больные РПЖ

Взятие крови и выделение клеточной фракции. В соответствии с данными о локализации простатических клеток во фракции мононуклеарных лимфоцитов крови [Berteau P., 1998], её выделяли из 8-10 мл венозной цитратной крови методом центрифугирования в градиенте плотности фиколл-содержащего раствора “Limpho separation medium” (“ICN”,США), отбирая интерфазный слой с частью прилегающего сверху и снизу слоя жидкости в объеме 3-4 мл. Подсчет количества клеток проводили в камере Горяева.

Выделение РНК из клеток проводили сразу после их получения по методике P.Chomczynski, N.Sacchi (1987) в соответствии с количеством клеток в условиях постоянного охлаждения.

Контроль препаратов РНК. Качество полученных препаратов РНК оценивали с помощью электрофореза в геле 1,2 % агарозы с бромистым этидием. Количественное определение концентрации РНК проводили спектрофотометрически на основе зависимости: 1 оптическая единица соответствует 40 мкг в 1 мл РНК. Степень очистки препаратов РНК от белка определяли по показателю А260/А280.

Обратная транскрипция (ОТ). Реакцию ОТ проводили с образцами суммарной РНК, выделенной из мононуклеарных клеток крови пациентов, и РНК, выделенной из культуры клеток LNCaP (при отработке методики и затем в качестве положительного контроля).

Результаты оптимизации условий ОТ оценивали с помощью электрофореза после проведения «nested»-ПЦР с ПСА-праймерами, предложенными А.И.Глуховым и соавт. (МНИИМЭ). Приносим глубокую благодарность профессору А.И.Глухову за оказанную методическую помощь.

Для работы с образцами крови был выбран протокол, рекомендованный MBI Fermentas (Литва). Каждый препарат РНК, выделенный из клеток крови, использовали для проведения трех реакций ОТ: с вносимым объемом РНК 1,5 мкл и 3 мкл – для исключения ложноотрицательных результатов, а также контрольная реакция ОТ без внесения фермента обратной транскрипции M-MulV для исключения возможной контаминации. Параллельно в каждом эксперименте проводилась ОТ с РНК, полученной из клеток LNCaP, для последующего контроля за ходом ПЦР с ПСА-праймерами.

«Nested» - ПЦР с ПСА-праймерами. Нами был выбран метод «nested»-ПЦР, как высоко чувствительный и специфичный [Sourla A.,2001]. Для выбора оптимального варианта анализа мРНК ПСА в работе использовали четыре группы внешних и внутренних праймеров для разных экзонов гена ПСА, предложенные А.И.Глуховым и соавт. (1998), R.S.Israeli и соавт.(1994), S.Jaakkola и соавт. (1995) J-L.Gala и соавт.(1998). Последовательности использованных групп праймеров и выбранный температурный режим при работе с каждым из них опубликованы [Забежинская О.М. и соавт., 2002]. Реакционная смесь ОТ (содержащая кДНК) в объеме 2 мкл использовалась в качестве матрицы при постановке 1-го раунда ПЦР с внешней парой праймеров. Реакционная смесь для первого раунда амплификации объемом 50 мкл содержала 67 мМ трис-HCl (pH 8,8), 16,6 мМ (NH4)2SO4, 0,01% твин-20, 1,5 мМ MgCl2, четыре дезоксинуклеозидтрифосфата (по 0,16мМ каждого), 2,5 ед.акт. Taq-полимеразы, пару внешних праймеров. При работе с несколькими ПСА-праймерами оптимальная концентрация их в реакционной смеси (по результатам наших экспериментов) была различной и составляла для праймеров А.И Глухова – 20 пкмоль, праймеров R.S.Israeli – 18 пкмоль, праймеров S.Jaakkola – 18 пкмоль, праймеров J-L.Gala – 15 пкмоль. Далее 1 мкл смеси ПЦР после 1-го раунда амплификации использовали в качестве матрицы для 2-го раунда ПЦР с внутренней парой праймеров. Реакционная смесь для 2-го раунда ПЦР имела аналогичный состав.

Проведение ПЦР с праймерами к гену 2–микроглобулина. Для контроля проведения реакции ОТ в каждом эксперименте полученная кДНК (реакционная смесь ОТ) использовалась для постановки ПЦР с праймерами, комплементарными кДНК 2–микроглобулина (MIC). Данный ген конститутивно экспрессируется в клетках человека, в том числе и в лейкоцитах. Отрицательный результат ОТ-ПЦР с ПСА-праймерами считался достоверным только при положительном результате ОТ-ПЦР с праймерами на кДНК MIC для исключения ложноотрицательных результатов. Реакционная смесь для постановки ПЦР была сходного состава и содержала по 18 пмоль каждого из специфических MIC-праймеров, предложенных Е.Corey и соавт.(1997), длиной 28 нуклеотидов, перекрывающие область 3-х экзонов данного гена. Использовался двутемпературный режим ПЦР: 95 – 4 мин, 69 – 2 мин 40 сек, 1 цикл; 95 - 50 сек, 69 – 2 мин, 33 цикла; 95 - 50 сек, 69 – 1 мин 30 сек, 72 – 8 мин, 1 цикл.

Электрофорез продуктов амплификации проводили в 1,5% агарозном геле с бромистым этидием. Размер ПЦР-продуктов определяли, используя набор маркеров молекулярной массы ДНК: DNA Marker pBR 322 DNA/BSuRI (Hae III) («Fermentas», Литва).

Определение чувствительности метода. Чувствительность метода определяли двумя способами. В первом из них препарат РНК из клеток LNCaP, содержащий 0,6 мкг/мкл РНК, разводили повторно 10-кратно до 105 раз и использовали 1,5 мкл каждого разведения для постановки ОТ-ПЦР с каждой группой праймеров. В другом эксперименте готовили серию разведений клеток LNCaP в фосфатно-солевом буфере и добавляли их в пробирки, содержащие по 6106/мл периферических мононуклеарных клеток, выделенных из крови здоровых доноров описанным выше методом градиентного центрифугирования и подсчитанных в камере Горяева. Далее выделение РНК проводили из полученной смеси клеток LNCaP и мононуклеаров крови. Выделенная РНК использовалась в качестве матрицы для проведения ОТ-ПЦР.

Методы статистической обработки результатов. Для оценки полученных результатов использованы метод Фишера, t-критерий Стьюдента. При отсутствии нормального распределения использовали непараметрический U-тест по методу Манна и Уитни. При анализе средних величин учитывали медиану, 25-ый и 75-ый процентили. Различия считались статистически значимыми при уровне ошибки p<0,05. Расчеты выполнены на персональном компьютере с использованием приложения Microsoft Excel и пакета статистического анализа данных Statistica 5.1 for Windows (StatSoft Inc., USA).

РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЙ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ

1. Результаты выбора, оптимизации методики и определения ее чувствительности с использованием клеточной линии рака простаты LNCaP. Проведена оптимизация условий ОТ и «nested»-ПЦР с четырьмя группами ПСА-специфичных праймеров и с праймерами, специфичными контрольному гену 2–микроглобулина. Чувствительность методики ОТ-ПЦР для четырех групп ПСА-специфичных праймеров была одинаковой: продукт ПЦР второго раунда выявлялся при количестве вносимой РНК LNCaP 0,0009 мкг. Наиболее четкая полоса флуоресценции отмечалась при использовании ПСА-специфичных праймеров, предложенных R.S.Israeli и соавт., что позволило выбрать их для последующих анализов мРНК ПСА в крови людей. Отметим, что эти праймеры достаточно широко используются в зарубежных клинических лабораториях и один из них включает последовательности двух соседних экзонов гена ПСА, что исключает возможность амплификации хромосомной ДНК, если она присутствует в образце. Количественный выход мононуклеарных клеток из пробы крови пациентов и количество выделенной из них РНК составляли 15-25106 мононуклеарных клеток, из которых затем выделяли 10-50 мкг РНК. Показатель степени очистки РНК от белка колебался в пределах 1,7-1,9. Чувствительность метода в эксперименте со смесью клеток LNCaP и периферических мононуклеаров составила 1:106 (одна простатическая клетка среди 106 мононуклеаров). Такая чувствительность является достаточной в соответствии с результатами других исследовательских групп [Corey E., 1998].

Полученные результаты позволили использовать методику ПСА специфичной ОТ-ПЦР с праймерами, предложенными R.S.Israeli и соавт. (1994), в сочетании с контрольной ПЦР, специфичной мРНК 2–микроглобулина, для выявления микрометастазов рака простаты в периферической крови (рис.1).

I II III

___________ ___________ ___________

1 2 3 1 2 3 1 2 3

Рис. 1.Результаты ОТ-ПЦР крови у двух больных РПЖ.

Электрофореграмма продуктов ОТ-ПЦР в 1,5% агарозном геле, окрашенном бромистым этидием: 1 - первый раунд «nested»-ОТ-ПЦР с ПСА-праймерами (486 п.н.), 2 – второй раунд «nested»-ОТ-ПЦР с ПСА-праймерами (355п.н.), 3 - контрольная ОТ-ПЦР с MIC-праймерами (550 п.н.).

I – исследование крови больного диссеминированной формой РПЖ

II – исследование крови больного локализованной формой РПЖ

III – контрольное исследование РНК, выделенной из клеток LNCaP

2.Анализ результатов обследования пациентов контрольной группы. Результат ОТ-ПЦР у здоровых доноров (n=14) был отрицательным. У пациентов с урологическими заболеваниями без патологии простаты (n=13) ОТ-ПЦР была отрицательной во всех случаях, кроме одного пациента 25 лет с кондиломой крайней плоти. Положительный результат ОТ-ПЦР в этом наблюдении может быть связан с выявлением низкого уровня неспецифической транскрипции гена ПСА клетками крови [Henke W., 1998]. В связи с крайне молодым возрастом мы не можем объяснить этот результат предположением о недиагносцированном раке простаты. Таким образом специфичность метода, определяемая по проценту отрицательных результатов в контрольной группе, составила 96,3% (26/27).

3. Результаты обследования пациентов основной группы

3.1. Анализ результатов обследования пациентов с фоновыми и предраковыми заболеваниями предстательной железы.

3.1.1. Сравнение результатов ОТ-ПЦР с типом поражения предстательной железы. При анализе пациентов с нераковым поражением простаты ХП и ДГПЖ были отнесены к фоновым заболеваниям, ПИН-2 – к предраковым, а ПИН-1 рассматривался как отдельно, так и в составе подгруппы фоновых заболеваний, т.к. принято связывать ПИН-1 с хроническим воспалением. Полученные результаты представлены в табл.3.

Таблица 3

Результаты ОТ-ПЦР и показатели ПСА у больных фоновыми и предраковыми заболеваниями простаты (n=22)

Заболевания простаты	n	Показатели ПСА Q25-me-Q75*, нг/мл	Частота положительной ОТ-ПЦР
Фоновые	4	1,2-4,0-23,6	1/4 (25%)
ПИН-1	5	9,0-13,0-24,6	0/5 (0%)
Фоновые и ПИН-1**	9**	3,1-11,0-24,1	1/9 (11,1%)
ПИН-2	13	8,1-10,0-16,2	4/13 (30,8%)
Всего	22	5,9-10,0-16,9	5/22 (22,7%)

* 25-й процентиль – медиана – 75-й процентиль

** ПИН-1 рассматривался и отдельно, и в составе подгруппы фоновых заболеваний простаты

ОТ-ПЦР была положительной у одного пациента подгруппы с фоновыми заболеваниями (причем у всех пациентов с ПИН-1 результаты ОТ-ПЦР отрицательные) и у 4 пациентов с ПИН-2. Таким образом, выявлена статистически не подтвержденная (р=0,1) тенденция увеличения вероятности положительной ОТ-ПЦР при предраковых заболеваниях простаты по сравнению с фоновыми. Факт выявления простатических клеток в кровеносном русле у данных больных имеет свои объяснения. Во-первых, мы не можем исключить возможность недиагносцированного рака простаты у больных с подозрением на РПЖ. У одного пациента это подозрение подтвердилось при повторной биопсии простаты через 4 месяца. Во-вторых, достаточно высокий процент положительных ОТ-ПЦР у пациентов с ПИН-2 может объясняться морфологическими особенностями ткани простаты: разрушением базального слоя клеток, усилением ангиогенеза, что может способствовать попаданию простатических клеток в кровяное русло.

3.1.2. Анализ связи результатов ОТ-ПЦР с уровнем ПСА. Положительный результат ОТ-ПЦР выявлен только у пациентов с повышенным уровнем ПСА: 8,1нг/мл и выше. У пациентов со значениями ПСА в пределах «серой зоны» (4-12нг/мл) частота положительной ОТ-ПЦР составила 22,2%, а при более высоких значениях ПСА – 33,3%. Выявленная тенденция к увеличению вероятности положительной ОТ-ПЦР с повышением уровня ПСА статистически не значима (р>0,05).

При сравнении подгруппы пациентов с фоновыми заболеваниями, включая ПИН-1, с подгруппой ПИН-2 отмечены приблизительно одинаковые средние показатели ПСА при наличии различий в частоте положительной ОТ-ПЦР (табл.3).

Таким образом, ОТ-ПЦР может давать дополнительную информацию, по сравнению с определением ПСА, при анализе риска предракового процесса у пациентов с нераковыми заболеваниями простаты. При наличии ПИН-2 положительная ОТ-ПЦР дополнительно указывает на высокий риск развития и выявления значимого рака простаты у данного пациента.

3.2. Анализ результатов обследования больных раком простаты. При первичном анализе выявлено 16 наблюдений «положительных» результатов ОТ-ПЦР (36,4%) и 28 «отрицательных» (63,6%). Такое соотношение результатов ОТ-ПЦР соответствует преобладанию локализованных и местнораспространенных опухолей над диссеминированными у обследованных пациентов: количество больных с наличием подтвержденных традиционными методами метастазов составило 11 (25%). Показатели ПСА (Q25-me-Q75) составили: 9,4-22,9-66,5 нг/мл, что значимо выше соответствующих значений у пациентов с фоновыми и предраковыми заболеваниями (р<0,05).

3.2.1. Взаимосвязь результатов ОТ-ПЦР и результатов выявления отдаленных метастазов традиционными методами у больных раком простаты. При исследовании больных раком простаты в первую очередь был произведен анализ взаимосвязи результатов выявления клеток рака простаты в крови с помощью ОТ-ПЦР с наличием (М+) или отсутствием (М0) доказанных традиционными методами макрометастазов. Отдельную подгруппу (Мx) составили больные, которым не было проведено исследование на наличие метастазов в полном объеме (табл.4).

Клиническая чувствительность методики ОТ-ПЦР в выявлении циркулирующих в крови клеток рака простаты, оцениваемая по проценту положительных результатов ОТ-ПЦР среди пациентов подгруппы M+, составила 81,8%. Таким образом, чувствительность весьма высока и соответствует таковой у большинства исследователей [Varkarakis J., 2003]. Отрицательный результат ОТ-ПЦР у двух больных, имеющих метастазы, выявленные традиционными методами, может быть объяснен несколькими причинами, а именно фиброзированием предстательной железы на поздних стадиях рака, эффектом Монте-Карло (ошибка образца), связанным с неравномерностью распределения метастатических клеток в кровеносном русле, а также неравномерностью по времени выхода раковых клеток в кровь [Corey E., 1998; Gewanter R.M., 2003]. У одного из этих пациентов при повторном анализе через 6 месяцев реакция ОТ-ПЦР стала положительной. У второго больного отсутствовали метастазы в регионарных лимфатических узлах (N0), и, видимо, образование отдаленных метастазов было вызвано кратковременным «проскоком» опухолевых клеток в кровь, которое не совпало по сроку с анализом крови с помощью ОТ-ПЦР. Интересно, что у данного больного и после биопсии реакция ОТ-ПЦР была отрицательной, что свидетельствует о низком метастатическом потенциале этой опухоли.

Таблица 4

Результаты ОТ-ПЦР и показатели ПСА у больных (n=44) в зависимости от наличия (M+) или отсутствия (M0) отдаленных метастазов и у пациентов с невыясненным (Mx) наличием диссеминации

Под- группа	n	Показатели ПСА Q25-me-Q75,нг/мл	Частота положительной ОТ-ПЦР	Частота отрицательной ОТ-ПЦР
М+	11	46,0-80,7-100,0	9/11 (81,8%)	2/11 (18,2%)
М0	23	2,0-12,3-26,4	3/23 (13,0%)	20/23 (87,0%)
Мx	10	9,3-23,4-47,8	4/10 (40%)	6/10 (60%)

Другой возможной причиной ложноотрицательных результатов ПСА-специфичной ОТ-ПЦР является гормональное лечение, которое может подавлять сам процесс диссеминации и снижать выработку простатическими клетками мРНК ПСА, являющейся маркером клеток рака простаты в используемом нами методе. Для оценки значимости последного эффекта мы сравнили клиническую чувствительность метода в зависимости от наличия или отсутствия гормональной терапии у больных РПЖ (табл.5).

Таблица 5

Частота положительной ОТ-ПЦР крови у больных РПЖ, получавших и не получавших гормональную терапию, с учетом наличия или отсутствия отдаленных метастазов (n=44)

Подгруппа	Частота положительной ОТ-ПЦР у пациентов, получавших гормональную терапию	Частота положительной ОТ-ПЦР у пациентов, не получавших гормональную терапию
М0	0/10 ( 0%)	3/13 (23,1%)
М+	2/2 (100%)	7/9 (77,8%)
Мx	1/2 (50%)	3/8 (37,5%)
Всего	3/14 (21,4%)	13/30 (43,3%)

Частота положительной ОТ-ПЦР у больных РПЖ с отдаленными метастазами, разделенных на получавших и не получавших гормональную терапию, составила 100% и 77,8% соответственно. Это объясняется тем, что в подгруппе М+ очень мало пациентов получали гормональное лечение, поэтому какие-либо закономерности здесь не выявлены. В подгруппе М0 положительные ОТ-ПЦР получены только у больных, не получавших гормональное лечение, что позволяет предположить его влияние на результат ОТ-ПЦР. Однако это отличие статистически незначимо (р>0,05).

В подгруппе больных раком простаты без отдаленных метастазов (М0), состоявшей из 23 человек (табл.4), отрицательная реакция ОТ-ПЦР выявлена у 20 пациентов, т.е. у 87%. Этот показатель (как и высокий процент отрицательных результатов в контрольной группе) характеризует клиническую специфичность метода [Grasso Y.Z., 1998]. Положительные результаты ОТ-ПЦР выявлены у трех пациентов с характеристикой опухоли T2N0G2или3 и повышенным ПСА (>4нг/мл). Можно предположить, что процесс метастазирования у этих больных идет, но достаточно крупный метастатический очаг, который может быть выявлен традиционными методами, еще не сформировался. Вероятность этого подтверждается средне- и низкодифференцированным характером клеток опухоли. Такие больные требуют динамического наблюдения и, возможно, назначения гормональной терапии. Предположение о невыявленных метастазах подтверждается и результатами повторных ОТ-ПЦР. У одного из этих пациентов положительная реакция ОТ-ПЦР сохранялась даже после радикальной простатэктомии, а у второго – после проведения биопсии простаты. Что касается третьего больного, то он обследовался амбулаторно неоднократно в течение года, и реакция ОТ-ПЦР всегда оказывалась положительной, при уровнях ПСА 0,01-9 нг/мл. Возможно, у этого больного существовала повышенная опасность «проскока» опухолевых клеток в кровеносное русло, хотя количество этих клеток было недостаточно для формирования метастазов. Однако это количество циркулирующих клеток удавалось выявить с помощью ОТ-ПЦР. Положительные результаты ОТ-ПЦР в подгруппе М0 характеризуют возможности более раннего выявления метастатического процесса путем установления гематогенной диссеминации, чем при использовании традиционных методов.

Взаимосвязь между результатами ОТ-ПЦР и выявлением метастазов традиционными методами является статистически значимой при сравнении частоты положительных результатов в подгруппах М+ и М0 (р<0,01). Такой же уровень достоверности получен при сравнении средних показателей ПСА между данными подгруппами, причем в подгруппе больных М+ этот показатель был выше более чем в 4 раза.

В подгруппе Mx положительные результаты ОТ-ПЦР выявлены у четырех из 10 пациентов (табл.4), причем у трех из них были крупные (местно-распространенные) средне- и низкодифференцированные опухоли (T3G2-3) и повышенный ПСА:>30 нг/мл. Частота положительных ОТ-ПЦР в этой подгруппе была выше, чем в подгруппе М0 (р<0,05), но ниже, чем в подгруппе М+ (р<0,05). Показатели ПСА в подгруппе Мx оказались выше, чем у больных стадии М0, более чем в 1,5 раза. Таким образом, закономерно предположить наличие неустановленной диссеминации опухоли у части больных этой подгруппы.

3.2.2.Анализ результатов ОТ-ПЦР в зависимости от наличия или отсутствия метастатического поражения регионарных лимфатических узлов у больных РПЖ. Для оценки клинического значения нового диагностического метода проведен анализ связи результатов ОТ-ПЦР с другими показателями, характеризующими стадию рака простаты по системе TNMG, а также уровнем ПСА. Поражение регионарных лимфатических узлов обычно происходит, минуя кровеносные сосуды, но оно подтверждает агрессивный характер течения опухолевого процесса и закономерно может сопровождаться параллельным гематогенным метастазированием. Анализ результатов ОТ-ПЦР крови в подгруппах с наличием (N+) или отсутствием (N0) поражения регионарных лимфатических узлов показал значимую взаимосвязь этих показателей (р<0,01). Полученные результаты представлены в табл.6.

В подгруппе N+ ОТ-ПЦР была положительной у всех больных, имеющих отдаленные метастазы. Лишь у одного пациента с невыясненным наличием отдаленных метастазов и нормальным значением ПСА ОТ-ПЦР была отрицательной. В то же время, в подгруппе N0 у всех пациентов, кроме одного, отсутствовали документированные отдаленные метастазы. Положительные ОТ-ПЦР среди них выявлены у трех пациентов, описанных выше в подгруппе M0. Достоверно более высокими были также показатели ПСА в подгруппе N+ по сравнению с N0 (р<0,01), а также при сравнении Nx с N0 (р<0,05).

Таблица 6

Результаты ОТ-ПЦР крови и ПСА у больных РПЖ в зависимости от наличия (N+) или отсутствия (N0) метастазов в регионарные лимфатические узлы и у пациентов с неустановленным их состоянием (Nx) (n=44)

Подгруппа	n	Показатели ПСА Q25-me-Q75,нг/мл	Частота отдаленных метастазов (М+)	Частота положительной ОТ-ПЦР
N+	9	46,0-80,7-100,0	8/9 (88,9%)	8/9 (88,9%)
N0	20	3,0-12,2-26,1	1/20 (5%)	3/20 (15%)
Nx	15	14,3-30,9-91,2	2/15 (13,3%)	5/15 (33,3%)

3.2.3.Взаимосвязь результатов ОТ-ПЦР со степенью дифференцировки клеток рака простаты. Показана взаимосвязь между результатами ОТ-ПЦР и степенью дифференцировки опухоли: микрометастазы не выявлены у больных с высокодифференцированным раком простаты, а при наличии низкодифференцированных опухолей частота выявления раковых клеток в крови с помощью ОТ-ПЦР несколько выше, чем при средней степени дифференцировки (табл.7).

Сходная тенденция наблюдается при сопоставлении доли пациентов с установленными метастазами (М+), которые отсутствовали в подгруппе с высокой степенью дифференцировки. В то же время процент больных с М+ при средней и низкой степени дифференцировки отличался незначительно, что свидетельствует в пользу возможности более раннего выявления метастатического процесса с помощью ОТ-ПЦР крови. Однако значимость различий в частоте положительного результата ОТ-ПЦР между подгруппами G2 и G3 была недостаточной (р=0,1). Достоверным оказалось отличие по данному показателю между подгруппами G1 и G2, а также G1 и G3 (в обоих случаях р<0,01). Также достоверным было отличие по средним показателям ПСА в указанных подгруппах, демонстрирующее повышение уровня ПСА при снижении степени дифференцировки опухоли (р<0,05).

Таблица 7

Результаты ОТ-ПЦР крови и ПСА у больных с высоко-, средне- и низкодифференцированным (G1, G2, G3,) раком простаты* (n=44)

Подгруппа	n	Показатели ПСА Q25-me-Q75,нг/мл	Частота отдаленных метастазов (М+)	Частота положительной ОТ-ПЦР
G1	14	0,2-10,9-14,6	0/14 (0%)	0/14 (0%)
G2	17	25,8-30,9-80,7	7/17 (41,2%)	8/17 (47,1%)
G2-3 G3	8	36,2-75,6-100,0	4/8 ( 50%)	6/8 (75%)
Gx	5	4,0-9,3-20,0	1/5 (20%)	2/5 (40%)

*Пациенты с неустановленной степенью дифференцировки рака простаты включены в подгруппу Gx.

3.2.4.Взаимосвязь результатов ОТ-ПЦР с размером первичной опухоли (T). Показано статистически значимое (р<0,01) повышение частоты положительных результатов ОТ-ПЦР по мере увеличения размера опухоли (табл.8). Это закономерно отражает большую вероятность метастазирования при разрастании и местном распространении опухоли за пределы капсулы предстательной железы. В подгруппе Т3-4 частота выявления микрометастазов в крови и макрометастазов почти одинакова, в то время как на более ранних этапах развития опухоли (подгруппа Т1-2) макрометастазы во многих наблюдениях еще не определяются, а гематогенное микрометастазирование установлено.В исследуемых подгруппах показана корреляция между величиной первичной опухоли и повышением уровня ПСА (р<0,01).

Таблица 8

Сравнение результатов ОТ-ПЦР крови и показателей ПСА у больных РПЖ в зависимости от размера первичной опухоли (n=44)

Подгруппа	n	Показатели ПСА Q25-me-Q75,нг/мл	Частота отдаленных метастазов (М+)	Частота положительной ОТ-ПЦР
T1-2	23	1,4 -9,8-20,0	0/23 (0%)	4/23 (17,4%)
T3-4	21	30,9-60,0-100,0	11/21 (52,4%)	12/21 (57,1%)

3.2.6. Анализ взаимосвязи результатов ОТ-ПЦР крови и уровня общего ПСА. Проводилось сравнение результатов ОТ-ПЦР со значением общего ПСА (табл.9). Больные РПЖ были разделены на 4 подгруппы в соответствии со значением ПСА: норма (0-4нг/мл), «серая зона» (>4-12нг/мл), патогномоничный для РПЖ показатель (>12-100нг/мл), патогномоничный для диссеминированного РПЖ показатель (>100нг/мл). Выявлена тенденция к увеличению частоты положительной ОТ-ПЦР при увеличении уровня ПСА. Однако достоверно отличается только частота положительной ОТ-ПЦР в подгруппе с нормальным уровнем ПСА от остальных подгрупп (р<0,01).

Внутри подгруппы со значением ПСА>12-100нг/мл, можно отметить увеличение частоты положительной ОТ-ПЦР до 63,6% при повышении ПСА более 28нг/мл, тогда как при значениях ПСА меньше 28нг/мл этот показатель составил 27,3%. Но это различие недостоверно (р=0,1). Если же разделить всех больных раком простаты с повышенным уровнем ПСА на две подгруппы: до 28нг/мл включительно и более, то частота положительной ОТ-ПЦР составит 25 и 63,2% соответственно. Эти различия статистически значимы (р<0,05). Таким образом, существует корреляция между результатом ОТ-ПЦР и нормальным, либо повышенным уровнем ПСА. Большинством зарубежных исследователей отмечается более выраженное повышение этого показателя в случаях диссеминированной опухоли. При анализе результатов обследования пациентов с повышенным ПСА статистически значимо повышение риска гематогенной диссеминации при значениях ПСА выше 28нг/мл.

Таблица 9

Результаты ОТ-ПЦР крови у больных раком предстательной железы при различных уровнях ПСА (n=44)

Подгруппа	ПСАнг/мл	n	Частота отдаленных метастазов (М+)	Частота положительной ОТ-ПЦР
I	0-4	9	0/9 (0%)	0/9 (0%)
II	>4-12	5	0/5 ( 0%)	1/5 (20%)
III	>12-100	22	6/22 (28%)	10/22 (45,5%)
IV	>100	8	5/8 (62,5%)	5/8 (62,5%)

Интересно, что количество положительных ОТ-ПЦР у пациентов четвертой подгруппы соответствовало количеству пациентов с установленными традиционными методами отдаленными метастазами (M+) – 5/8. При этом в четырех наблюдениях были выявлены и раковые клетки в крови, и отдаленные метастазы, а соответственно в двух наблюдениях – либо одно, либо другое. В третьей подгруппе частота выявления раковых клеток в крови (10/22) превышала частоту выявления отдаленных макрометастазов (6/22), причем у 5 из 6 больных с М+ ОТ-ПЦР была положительной. Во второй подгруппе отсутствовали пациенты с установленными отдаленными метастазами при наличии одной положительной ОТ-ПЦР. Эти данные подтверждают возможность более ранней диагностики процесса диссеминации опухоли с помощью ОТ-ПЦР исследования крови.

3.3. Анализ основных клинико-лабораторных показателей пациентов с отрицательным и положительным результатом ОТ-ПЦР крови.

Для комплексной оценки связи различных факторов с циркуляцией простатических клеток, определяемой ОТ-ПЦР, целесообразно сравнить диагностические и прогностические критерии у двух подгрупп больных РПЖ - с положительной и отрицательной реакцией ОТ-ПЦР. Средние показатели ПСА при положительной ОТ-ПЦР были значимо выше, чем при отрицательной (р<0,01). Следует отметить, что процент пациентов со значением ПСА более 100 нг/мл, являющегося патогномоничным для диссеминированной формы рака простаты, был выше в подгруппе с положительной ОТ-ПЦР по сравнению с подгруппой, имеющей отрицательный результат, но не так значительно как можно было бы ожидать: 31,3% и 10,7% (р>0,05). В то же время доля пациентов с уровнем ПСА более 28 нг/мл была значимо выше (р<0,05), составив 75% в подгруппе больных РПЖ с положительной ОТ-ПЦР крови и 25% - при отрицательной (рис.2). Эти результаты подтверждают, что уровень ПСА более 28 нг/мл является прогностически неблагоприятным в отношении риска гематогенной диссеминации.

Рис.2. Процент пациентов с прогностически неблагоприятными показателями (ПСА>28нг/мл,T3-4,N+,M+,G3,) среди больных РПЖ с положительной и отрицательной ОТ-ПЦР.

В целом, как видно на рис.2, для группы больных РПЖ с положительной ОТ-ПЦР характерной была значительно большая (по сравнению с группой больных с отрицательной ОТ-ПЦР) частота таких прогностически неблагоприятных показателей как: ПСА>28 нг/мл; наличие крупных опухолей (T3-4), опухолей с метастазами в регионарные лимфатические узлы (N+), с отдаленными метастазами (M+), а также опухолей с низкой степенью дифференцировки (G3). При этом чаще всего (в 75% наблюдений) отмечали сочетание положительных результатов ОТ-ПЦР с наличием крупной первичной опухоли, прорастающей капсулу предстательной железы (T3-4) и значением ПСА более 28 нг/мл (рис.2). В группе пациентов с сочетанием положительной ОТ-ПЦР и уровня ПСА>28нг/мл больные РПЖ стадии T3-4 составили 92%. Такой результат является вполне закономерным. Наличие крупной местнораспространенной опухоли простаты характеризует агрессивное течение ракового процесса, что приводит к выбросу раковых клеток через прорастаемые сосуды в кровеносное русло, где они определяются методом ОТ-ПЦР по наличию специфичной для них мРНК ПСА. В то же время клетки рака простаты продолжают синтезировать белок ПСА, причем в связи с большими размерами опухоли количество его возрастает. ПСА выделяется в кровеносное русло, где и определяется существующими методиками.

4.Анализ влияния лечебно-диагностических манипуляций на предстательной железе на результат ОТ-ПЦР. Следует отметить, что у всех пациентов с положительной ОТ-ПЦР до манипуляций на простате (9 человек), такой же результат был получен и через сутки после нее, что указывает на хорошую воспроизводимость методики.

Что касается пациентов с начальной отрицательной ОТ-ПЦР, то после проведения биопсии простаты в группе больных фоновыми и предраковыми заболеваниями, ОТ-ПЦР стала положительной в 4 из 9 (44,4%) наблюдений (три пациента с ПИН 1-2 и один – ПИН-1). Циркуляция простатических клеток в крови у подобных пациентов описана и другими авторами [Hara N., 2001]. Можно предположить, что особенно при ПИН-2 из-за нарушения клеточных контактов вследствие дисплазии проведение биопсии простаты может вести к попаданию простатических клеток в кровеносное русло и детекции этих клеток методом ОТ-ПЦР. Взаимосвязи полученных результатов с уровнем ПСА не установлено.

В группе больных РПЖ первичный отрицательный результат ОТ-ПЦР после биопсии изменился на положительный у четырех из семи пациентов (57,2%). Такой высокий процент больных РПЖ, у которых биопсия вызвала появление гематогенных микрометастазов описан в литературе [Koutsilieris M., 1999]. При повторной ОТ-ПЦР крови у одного из этих четырех пациентов результат снова стал отрицательным вследствие элиминации из кровеносного русла циркулирующих опухолевых клеток. Взаимосвязи полученных результатов с уровнем ПСА, степенью дифференцировки, размером опухоли не установлено.

После РПЭ конверсия с отрицательного на положительный результат ОТ-ПЦР отмечена у одного из четырех обследованных пациентов, после ТУР простаты - у обоих обследованных больных. Риск диссеминации опухолевых клеток при проведении трансуретральной резекции простаты отмечен и зарубежными авторами [Heung Y.M., 2000]. При повторном исследовании крови у одного из описанных пациентов через 11 месяцев после ТУР, результат ОТ-ПЦР вновь стал отрицательным.

После массажа простаты конверсия отрицательного результата ОТ-ПЦР на положительный наблюдалась у одного из трех больных РПЖ, с клинической картиной рака простаты при морфологическом диагнозе ДГПЖ. Он погиб через 2,5 года при наличии симптомов рака простаты.

Таким образом, впервые показана возможность диссеминации простатических клеток в кровеносное русло после проведения массажа простаты, подтверждена возможность такого эффекта после проведения биопсии простаты, радикальной простатэктомии, трансуретральной резекции простаты, у пациентов с предраковыми заболеваниями простаты (ПИН-2) и РПЖ. В соответствии с нашими наблюдениями и данными других исследователей [Price D.K., 1998] эта диссеминация является временной, ее клиническое значение остается неясным и требует дальнейших исследований с длительным сроком наблюдения больных. Возможность такой диссеминации следует учитывать клиницистам и исследователям при анализе результатов выявления гематогенных микрометастазов.

5.Анализ мониторинга больных с подозрением, либо подтвержденным раком простаты с помощью ОТ-ПЦР. Перспективными для анализа риска гематогенного метастазирования являются повторные исследования крови с применением ОТ-ПЦР при длительном мониторинге. Из обследованных таким образом 11 пациентов трое больных РПЖ имели отдаленные метастазы (М+). В этой подгруппе у двух больных при мониторинге положительная реакция ОТ-ПЦР сменилась на отрицательную, а у одного отрицательная реакция стала положительной. Это свидетельствует о том, что уже сформировавшиеся вследствие диссеминации отдаленные метастазы не всегда сопровождаются повторной циркуляцией опухолевых клеток в крови.

Поэтому наибольший интерес представляют повторные ОТ-ПЦР исследования в подгруппе из трех больных с локализованным и местнораспространенным РПЖ, т.е. отсутствием макрометастазов. У одного больного высокодифференцированным локализованным раком простаты (T2N0M0G1) ОТ-ПЦР дважды была отрицательной на протяжении 2 месяцев наблюдения при уровнях ПСА в пределах «серой зоны» (9,2-9,8 г/мл). Отрицательный результат ОТ-ПЦР сохранился и после РПЭ. Учитывая высокодифференцированный характер опухоли, можно сделать вывод, что рак простаты у данного пациента характеризуется крайне низким метастатическим потенциалом, подтвержденным стабильным отсутствием в крови микрометастазов. У другого пациента с РПЖ (T2N0M0G2) ОТ-ПЦР была положительной четырежды на протяжении 13 месяцев при показателях ПСА 5,22; 1,14; 0,01; 9,0 нг/мл. Стабильное наличие клеток рака простаты в крови указывает на высокий риск диссеминации опухоли, подтверждаемый колебаниями ПСА и средней степенью дифференцировки. Известно, что этот больной на данный момент не имеет признаков активации опухолевого процесса, видимо за счет адекватного действия системы имунной защиты, либо несостоятельности механизмов, ответственных за адгезию и дальнейший рост метастатических клеток во вторичных очагах. Однако этот пациент требует тщательного наблюдения. Представленные пациенты не получали гормональную терапию.

Третий пациент с местнораспространенным низкодифференцированным раком простаты (T3N0M0G3), получал гормональное лечение на протяжении всего исследования 14,5 месяцев. Результаты ОТ-ПЦР были отрицательными дважды в течении одного месяца при уровне ПСА более 100нг/мл, являющегося патогномоничным для диссеминированных форм. После ТУР ОТ-ПЦР была положительной. Через 11 месяцев при снижении ПСА до 78,7нг/мл ОТ-ПЦР вновь стала отрицательной и сохранялась такой при повторном исследовании, проведенном в течение месяца. Через 2,5 месяца ОТ-ПЦР стала положительной на фоне подъема ПСА почти до первоначальных цифр, что свидетельствует о развитии резистентности к препарату. Через год у больного были выявлены метастазы в кости таза и в регионарные лимфатические узлы. Больной умер на фоне развившейся гормонрезистентной формы рака простаты. Это наблюдение подтверждает возможность более раннего по сравнению с традиционными методами выявления диссеминации рака простаты с помощью ОТ-ПЦР крови.

В подгруппе с клинически невыясненным наличием отдаленных метастазов (4 человека) при мониторинге результат ОТ-ПЦР оставался стабильным, и только после биопсии у двух из них отрицательная реакция сменилась на положительную. Мониторинг проведен также у больного с ДГПЖ, ПИН 1-2. Результаты ОТ-ПЦР был положительными трижды при значениях ПСА от 13,8 до 10,2 нг/мл.

Появление положительного результата ОТ-ПЦР на фоне гормонального лечения указывает на возможность мониторинга процесса гематогенной диссеминации с помощью ОТ-ПЦР на фоне данного вида лечения. Взаимосвязь между динамикой ОТ-ПЦР крови и динамикой ПСА в большинстве наблюдений не выявлена. Следовательно, мониторинг с помощью ОТ-ПЦР несет дополнительную информацию о течении и метастатическом потенциале опухоли. Реальное прогностическое значение данного показателя при различных стадиях РПЖ может быть выявлено при соответствующем динамическом наблюдении большого контингента больных.

ВЫВОДЫ

1.Выбранная и оптимизированная методика ПСА-специфичной ОТ-ПЦР крови обладает высокой чувствительностью в опытах со смесью культуры клеток РПЖ и мононуклеаров крови (1:106).

2. У пациентов без патологии простаты отрицательные результаты ОТ-ПЦР отмечены в 96,3% наблюдений, что свидетельствует о высокой специфичности метода.

3. В группе пациентов с фоновыми и предраковыми заболеваниями простаты положительные результаты ОТ-ПЦР выявлены в 23% наблюдений у больных с уровнем ПСА 8 нг/мл и выше. Это свидетельствует о возможности попадания простатических клеток в кровеносное русло уже при развитии диспластических изменений (ПИН-2).

4. Установлена корреляция положительных результатов ОТ-ПЦР у больных раком простаты с другими диагностическими критериями (в особенности с уровнем ПСА более 28 нг/мл и размером первичной опухоли Т3-4), что указывает на возможность применения ОТ-ПЦР для установления гематогенной диссеминации ракового процесса.

5. В ряде наблюдений у больных РПЖ положительные результаты ОТ-ПЦР предшествовали клиническому выявлению отдаленных метастазов.

6. Массаж предстательной железы, РПЭ, ТУР и биопсия простаты могут стимулировать диссеминацию простатических клеток в кровеносное русло у пациентов с предраковыми заболеваниями простаты и РПЖ. Наибольшая частота такой диссеминации отмечена при биопсии простаты и ТУР у больных РПЖ. Повторные ОТ-ПЦР указывают на временный характер такой диссеминации.

7. Повторные ОТ-ПЦР крови позволяют мониторировать процесс гематогенной диссеминации у больных с предраковыми заболеваниями и РПЖ, в том числе на фоне гормонального лечения. Взаимосвязь между динамикой ОТ-ПЦР и динамикой ПСА в большинстве наблюдений не выявлена.

8. Не все попавшие в кровь раковые клетки выживают и формируют метастатический очаг, однако их наличие в крови (положительная ОТ-ПЦР) указывает на высокий метастатический потенциал опухоли. Для выявления прогностического значения этого показателя показаны повторные исследования с длительным сроком наблюдения больных.

ПРАКТИЧЕСКИЕ РЕКОМЕНДАЦИИ

1. Описанная методика ПСА-специфичной ОТ-ПЦР рекомендована для исследования процесса гематогенной диссеминации рака простаты.

2. При фоновых и предраковых заболеваниях простаты у больных с ПСА более 8 нг/мл рекомендуется проведение ОТ-ПЦР крови для оценки риска развития РПЖ и диссеминации простатических клеток.

3. У больных РПЖ с невыясненным наличием отдаленных метастазов, а также больных без отдаленных метастазов с опухолью стадии T3-4 рекомендуется проведение ОТ-ПЦР для раннего выявления диссеминации и риска формирования отдаленных метастазов, особенно при уровне ПСА более 28 нг/мл.

4. После хирургических вмешательств на предстательной железе рекомендуется ОТ-ПЦР исследование крови для своевременного выявления гематогенной диссеминации клеток рака простаты.

5. При динамическом наблюдении больных РПЖ, в том числе на фоне применения гормональной терапии, рекомендуется проводить повторные ОТ-ПЦР для контроля за процессом диссеминации.

СПИСОК РАБОТ, ОПУБЛИКОВАННЫХ ПО ТЕМЕ ДИССЕРТАЦИИ

1. Аляев Ю.Г., Асламазов Э.Г., Зезеров Е.Г., Забежинская О.М. Обратно транскриптазная полимеразная цепная реакция в диагностике метастазов рака предстательной железы // X Российский съезд урологов (Москва, 1-3 октября 2002). – Москва, 2002. – С.383-384

2.Забежинская О.М., Асламазов Э.Г., Зезеров Е.Г., Северин Е.С. Выявление микрометастазов рака предстательной железы с помощью обратно транскриптазной полимеразной цепной реакции // III Съезд биохимического общества. – Санкт-Петербург, 2002. – С.157

3. Забежинская О.М., Асламазов Э.Г., Зезеров Е.Г. Диагностика микрометастазов рака предстательной железы с помощью обратно транскриптазной полимеразной цепной реакции // Технологии генодиагностики в практическом здравоохранении: Научно-практический симпозиум в рамках Международной конференции «Геномика, протеомика и биоинформатика для медицины». – Москва, 2002. – С.152-155

4. Забежинская О.М., Асламазов Э.Г., Глухов А.И., Аляев Ю.Г., Зезеров Е.Г., Белушкина Н.Н., Северин Е.С. Выявление микрометастазов рака предстательной железы с помощью совмещенных реакций обратной транскрипции и полимеразной цепной реакции // Вопросы биологической, медицинской и фармацевтической химии. - №3. – 2002. – С.28-32

5. Аляев Ю.Г., Асламазов Э.Г., Северин Е.С., Зезеров Е.Г., Забежинская О.М. Обратно транскриптазная полимеразная цепная реакция в диагностике микрометастазов при раке предстательной железы // Андрология и генитальная хирургия. -№3-4. – 2003. – С.10-18

6. Забежинская О.М., Асламазов Э.Г., Зезеров Е.Г. Обратно транскриптазная полимеразная цепная реакция в оценке возможности гематогенной диссеминации опухолевых клеток при биопсии простаты // Актуальные вопросы онкоурологии. Заболевания предстательной железы: Здравоохранение Башкортостана. Специальный выпуск №3, 2003. – С.90-92

7. Асламазов Э.Г., Забежинская О.М., Зезеров Е.Г., Северин Е.С. Диагностика микрометастазов рака предстательной железы (РПЖ) методом обратно транскриптазной полимеразной цепной реакции (ОТ-ПЦР) // Онкологическая урология: от научных исследований к клинической практике (современные возможности диагностики и лечения опухолей предстательной железы, мочевого пузыря и почки): конференция. –Москва, 2004. –С.50-51

8. Забежинская О.М. Исследование влияния врачебных манипуляций на предстательной железе на развитие гематогенной диссеминации рака простаты // Фундаментальные науки и прогресс клинической медицины: III конференция молодых ученых с международным участием. – Москва, 2004. – С.327-328

9. Зезеров Е.Г., Северин Е.С., Аляев Ю.Г., Коваленко Н.А., Асламазов Э.Г., Винаров А.З., Лесничук С.А., Спиричев В.Б., Безруков Е.А., Барашков Г.К., Бутнару Д.В., Курынин Р.В., Забежинская О.М., Бекетова Н.А., Поляковский К.А. Некоторые молекулярно-биологические маркеры рака предстательной железы (РПЖ) и простатической интраэпителиальной неоплазии (ПИН) // Молекулярная медицина и биобезопасность: II Международная конференция. – Москва, 2005. – С.138-139

10. Зезеров Е.Г., Коваленко Н.А., Забежинская О.М., Лесничук С.А., Курынин Р.В., Асламазов Э.Г., Винаров А.З., Безруков Е.А., Поляковский К.А., Бутнару Д.В., Спиричев В.Б., Бекетова Н.А., Переверзева О.Г., Попова О.Н., Барашков Г.К., Зайцева Л.И., Глухов А.И.,Белушкина Н.Н.,Аляев Ю.Г. Изучение клинической ценности определения активности теломеразы, ДНК-плоидности, содержания в крови витаминов, микроэлементов и мРНК-продуцирующих клеток для диагностики простатической интраэпителиальной неоплазии, рака предстательной железы и его микрометастазов // Вопросы биологической, медицинской и фармацевтической химии. - №3. – 2005. – С.44-54.

11. Аляев Ю.Г., Асламазов Э.Г., Северин Е.С., Зезеров Е.Г., Забежинская О.М. Возможна ли диссеминация раковых клеток при манипуляциях на пораженной раком предстательной железе? // Материалы XI съезда урологов России (Москва, 6-8 ноября 2007). – Москва, 2007. – С.92-94

12. Аляев Ю.Г., Асламазов Э.Г., Северин Е.С., Зезеров Е.Г., Забежинская О.М. Выявление гематогенных микрометастазов рака простаты с помощью обратно-транскриптазной полимеразной цепной реакции, специфичной мРНК ПСА // Материалы XI съезда урологов России (Москва, 6-8 ноября 2007). – Москва, 2007. – С.94-95