Модуляция активности транскрипционных регуляторов p53 и nf-kb в условиях микоплазменной инфекции как фактор, способствующий трансформации эукариотических клеток и опухолевой прогрессии

На правах рукописи

Логунов

Денис Юрьевич

Модуляция активности транскрипционных регуляторов p53 и NF-kB в условиях микоплазменной инфекции как фактор, способствующий трансформации эукариотических клеток и опухолевой прогрессии

03.02.03 – «микробиология»

03.01.03 – «молекулярная биология»

АВТОРЕФЕРАТ

диссертации на соискание ученой степени

доктора биологических наук

Москва – 2011

Работа выполнена в Федеральном государственном бюджетном учреждении «Научно-исследовательский институт эпидемиологии и микробиологии имени почетного академика Н.Ф.Гамалеи» Министерства здравоохранения и социального развития Российской Федерации (ФГБУ «НИИЭМ им.Н.Ф.Гамалеи» Минздравсоцразвития России)

Научные консультанты:

доктор биологических наук, профессор Народицкий Борис Савельевич

доктор биологических наук Раковская Ирина Валентиновна

Официальные оппоненты:

доктор биологических наук, профессор,

Член-корреспондент РАМН, Смирнов Георгий Борисович

доктор медицинских наук, профессор, Альтштейн Анатолий Давидович

доктор биологических наук, профессор, Тарантул Вячеслав Залманович

Ведущая организация: ФГБУ "ГНЦ "Институт иммунологии" ФМБА России

Защита диссертации состоится « » 2011 года в ___ часов на заседании диссертационного совета Д 208.130.01 ФГБУ «НИИЭМ им.Н.Ф.Гамалеи» Минздравсоцразвития России (123098, г.Москва, ул.Гамалеи, д.18)

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке ФГБУ «НИИЭМ им.Н.Ф.Гамалеи» Минздравсоцразвития России.

Автореферат разослан « » 2011 г.

Ученый секретарь

диссертационного совета

доктор медицинских наук, профессор Е.В.Русакова

АКТУАЛЬНОСТЬ ПРОБЛЕМЫ

Микоплазмы (класс Mollicutes) – мельчайшие патогенные бактерии, характерной особенностью которых является отсутствие клеточной стенки. Представители данного семейства являются причиной различных заболеваний респираторного и урогенитального тракта, а также острых и хронических заболеваний суставов у человека и животных [Прозоровский С.В., Раковская И.В., 1995]. Одной из особенностей микоплазм является их способность персистировать in vivo в течение длительного периода без каких-либо клинических проявлений. Такая способность микоплазм обусловлена рядом особенностей, которые позволяют им эффективно «ускользать» от иммунной системы хозяина. Для микоплазм свойственна молекулярная мимикрия и фенотипическая пластичность, которые приводят к тому, что микоплазмы не эффективно распознаются и элиминируются иммунной системой хозяина. Это позволяет микоплазмам сохраняться в организме хозяина в течение длительного времени, что часто может являться причиной хронических заболеваний [Barile M., 1993, Razin S.,1991,1998]. Другой характерной особенностью микоплазм является их способность к длительному персистированию in vitro - в культурах эукариотических клеток. Являясь облигатными мембранными паразитами, они сохраняются в клеточных культурах в течение десятков лет. Эта способность микоплазм создает уникальную модель для наблюдений и исследований взаимодействия прокариотических и эукариотических клеток.

В настоящее время, считается, что патогены, вызывающие хронические заболевания, ассоциированные с хроническим воспалением, являются одним из ключевых факторов, влияющих на опухолевую прогрессию [Coussens L., 2002, DeMarzo A., 2004, 2007, Gupta S., 2004, Karin M., 2006, Nelson W., 2003, Platz E., 2004, Sfanos K., 2008, Sutcliffe S., 2008, Wagenlehner F., 2007]. Примерами таких патогенов являются: вирус Эпштейна-Барр (назофарингеальная карцинома); вирусы гепатита B и C (гепатоцеллюлярная карцинома); папилломавирус человека (аногенитальные опухоли); паразит Clonorchis sinensis (холангиокарцинома) [Parkin D., 1993, Ames B., 1995, Karin M., 2006, Keam S., 2008, Mantovani F., 2001, Mager D., 2006], среди патогенов бактериальной природы - Helicobacter pylori (мукоза-ассоциированные опухоли и аденокарцинома желудка) [ Correa P., 2007, Ito M., 2009, Malfertheiner P., 2005, Marshall B., 2005]. Еще целый ряд патогенов бактериальной природы в настоящее время подозреваются в качестве этиологических факторов различных опухолевых заболеваний: Salmonella typhi (опухоли желчного пузыря); Streptococcus bovis (опухоли кишечника); Bartonella sp. (гемангиомы) [Dehio C., 2005, Ellmerich S., 2000, Mager D., 2006, Tewari M., 2010].

Хроническая природа микоплазменной инфекции позволяет предположить, что она также может являться источником хронического воспалительного процесса и ассоциированных с ним проканцерогенных эффектов в условиях in vivo. Дополнительными аргументами в пользу этого предположения являются такие эффекты in vitro, сопровождающие хроническую микоплазменную инфекцию, как повышение генетической нестабильности в инфицированных культурах клеток [Allison A., 1966, Chernova O., 1996, Paton G., 1965], иммортализация и злокачественная трансформация клеток [Paton G., 1965, Cimolai N., 2001, Feng S. 1999, Namiki K., 2009, Logunov D., 2008, Pehlivan M., 2005, Zhang B. 1996, Zhang C. 2004, 2006, Каган Г., 1975]. Также показано, что сами микоплазмы и их структурные компоненты способны блокировать апоптоз, повышать инвазивность клеток опухоли и стимулировать прогрессию опухолевого заболевания [Каган Г., 1975, Ketcham С., 2005, Pehlivan М., 2005, Gerlic М., 2007, Gong М., 2008, Ushio S., 1995, Щебляков Д., 2008]. Последнее, по-видимому, связано с активацией основного провоспалительного и анти-апоптотического транскрипционного фактора NF-kB в результате взаимодействия структурных микоплазменных белков (липопептидов) с рецепторами врожденного иммунитета – TLR2/6.[Логунов Д., 2009]

На сегодняшний день, несмотря на значительный интерес со стороны ученых и наличие большого числа научных фактов, механизмы, характеризующие опухолестимулирующую и трансформирующую активность микоплазм остаются практически неизученными.

Известно, что одними из ключевыми клеточных факторов, активность которых изменяется более чем в 90% опухолевых клеток являются NF-kB и р53. При этом активность NF-kB в опухолях повышается, а функция р53 подавляется. NF-kB, контролирует экспрессию значительного числа генов, продукты которых важны для выживания опухолевых клеток и для опухолевой прогрессии. В списке таких генов цитокины (IL-1,6, TNFa и др.); хемокины (KC-1, MIP-2, Gro1); ростовые и ангиогенные факторы (GM-CSF, VEGF, IL-6); протеазы (ММР-9); анти-апоптотические факторы (Bcl-2, Bcl-XL, c-FLIP); проинфламаторные ферменты (COX-2, iNOS); гены, стимулирующие прогрессию клеточного цикла (циклин D1) [Karin М., 2006]. р53, наоборот, является главным опухолевым супрессором, основными функциями которого являются поддержка генетической стабильности и супрессия аберрантной активности онкогенов.

В нашей работе было проведено изучение влияния различных видов микоплазм на активность ключевых стресс-активируемых транскрипционных факторов р53 и NF-kB, а также оценен вклад подавления их активности в трансформирующую и опухолестимулирующую активность микоплазм.

Получение новых данных, связанных с изучением трансформирующей активности микоплазм, а также влияния ее компонентов на прогрессию опухолевого заболевания, имеет существенное значение для понимания механизма взаимодействия бактериальных патогенов с клетками хозяина, а также для выяснения роли хронических бактериальных инфекции в прогрессии опухолевых заболеваний. Поэтому изучение описанных свойств микоплазм в настоящее время представляет научный и практический интерес.

В целом исследование молекулярных механизмов взаимоотношения микоплазм с клетками хозяина даст возможность адекватно оценить значение микоплазм при многих патологических процессах.

Цель работы: Изучить влияние различных видов микоплазм на активность ключевых стресс-активируемых транскрипционных факторов р53 и NF-kB и оценить взаимосвязь модуляции активности этих факторов с трансформирующими и опухолестимулирующими свойствами микоплазм.

Задачи:

1. Отработать условия экспериментального заражения культур клеток различными видами микоплазм с последующей количественной оценкой микоплазм в инфицированных клетках.
2. Провести анализ способности микоплазм влиять на активность транскрипционного фактора р53 и р53-зависимые процессы – апоптоз и арест клеточного цикла.
3. Оценить влияние микоплазм на активность транскрипционного фактора NF-kB в результате взаимодействия с различными Толл-подобными рецепторами в экспериментах in vitro.
4. Провести анализ экспрессии Толл-подобных рецепторов, участвующих в распознавании липопептидов микоплазм, в различных линиях опухолевых клеток и отобрать клеточные культуры, экспрессирующие специфические по отношению к микоплазме Толл-подобные рецепторы.
5. Изучить влияние Толл-рецептор-зависимой активации NF-kB в условиях микоплазменной инфекции на выживаемость отобранных клеточных культур, в условиях генотоксического стресса.
6. Изучить влияние микоплазмы на пролиферацию и резистентность к химиотерапии опухолевых клеток, экспрессирующих Толл-подобные рецепторы специфические к микоплазме, в экспериментах in vivo.
7. Провести анализ ассоциации микоплазменной инфекции с опухолевыми заболеваниями, основным этиологическим фактором которых считается хроническое воспаление.

Научная новизна

Впервые показана способность микоплазм ингибировать активность транскрипционного фактора р53. Установлено, что в результате ингибирования р53 в инфицированных клетках повышается устойчивость к апоптозу, а также ослабляется сенесенс-ассоциированный арест (арест, ассоциированный со старением) и арест, вызванный генотоксическими агентами. Проведено полногеномное исследование изменения экспрессии генов. Показано, что в клетках инфицированных микоплазмой снижена экспрессия таких известных р53-регулируемых генов как BTG-2, p21 Cip1, TP53I3, MDM2, ATF3, Fas.

Впервые идентифицированы сочетания Толл-подобных рецепторов, специфически распознающих M.arginini и ее структурные компоненты, при взаимодействии с которыми наблюдали активацию транскрипционного фактора NF-kB. Полученные данные имеют существенное значение для понимания механизма распознавания врожденной иммунной системой хозяина клеток M.arginini.

Впервые показана способность микоплазм и их липид-ассоциированных мембранных белков подавлять апоптоз в опухолевых клетках при действии химиотерапевтических препаратов в результате активации транскрипционного фактора NF-kB, опосредованной Толл-подобными рецепторами. Такая активация NF-kB в инфицированных микоплазмой клетках является одной из причин снижения транскрипционной активности белка р53.

На модели мышиной миеломоноцитарной лейкемии WEHI-3B в эксперименте in vivo впервые показана способность M.arginini и ее структурных компонентов (диациллипопептидов) повышать пролиферацию и устойчивость к действию химиотерапевтических препаратов опухолевых клеток, экспрессирующих Toлл-подобный рецептор 2.

Для изучения возможного механизма опухолестимулирующего действия микоплазменных липопептидов проведено полногеномное исследование изменения экспрессии генов. Показано, что введение синтетического диациллипопептида микоплазм вызывает индукцию более 3000 генов, среди которых обнаружены гены MCP-1, MCP-3, Gro1, RANTES, IL-1, IL-6, ФНОа, S100A9, SAA1, SAA3, продукты которых обладают опухолестимулирующей активностью.

Впервые изучено влияние микоплазменной инфекции на изменение метаболического профиля клетки-хозяина. Было показано, что наряду с известным по данным литературы, снижением содержания аргинина, в инфицированных микоплазмой клетках существенно понижается содержание пролина.

Практическая значимость

Результаты, полученные в данной работе, показывают, что сама микоплазма или ее антигены, которые, как известно, способны к длительной циркуляции в организме, могут негативно влиять на рост и устойчивость к химиотерапии опухолевых клеток, экспрессирующих Толл-подобные рецепторы 2 и 6.

Проведено эпидемиологическое исследование, которое выявило взаимосвязь микоплазменной инфекции (M.hominis) с раком простаты.

Полученные результаты показывают необходимость проведения дополнительных диагностических и профилактических мероприятий, направленных на идентификацию и лечение микоплазменных инфекций, особенно, у больных, которым показана химиотерапия.

Показано, что анти-апоптотическая активность микоплазменных диациллипопептидов может быть использована для создания радиопротективных средств, а также средств для мобилизации клеток предшественников гемопоэза, что может найти широкое применение в трансплантологии.

Отдельные положения работы включены в:

• Методические рекомендации «Определение бактериальных эндотоксинов в биопрепаратах при использовании клеточной линии 293, экспрессирующей Толл-подобный рецептор 4». М.-2009.
• Использование методов количественного определения наноматериалов на предприятиях наноиндустрии. Методические рекомендации. М.: Федеральный Центр гигиены и эпидемиологии Роспотребнадзора, 2010. МР 1.2.2639-10
• Медико-биологическая оценка безопасности наноматериалов. Методические указания М.: Федеральный центр гигиены и эпидемиологии Роспотребнадзора, 2010. МУ 1.2. 2635-10
• Токсиколого-гигиеническая оценка безопасности наноматериалов. Методические указания М.: Федеральный Центр гигиены и эпидемиологии Роспотребнадзора, 2009. МУ 1.2.2520-09

Положения выносимые на защиту

Микоплазменная инфекция вызывает изменения активности ключевых транскрипционных факторов р53 и NF-kB. Это приводит к изменению восприимчивости инфицированных клеток к различным проапоптотическим стимулам, а также способствует их необратимой Ras-зависимой трансформации.

Активация NF-kB транскрипционного фактора в опухолевых клетках в ответ на микоплазменную инфекцию (или ее структурные компоненты) является существенным фактором прогрессии опухолевого роста и снижения чувствительности опухолевых клеток к химиотерапии в условиях in vivo.

Полученные данные, характеризующие трансформирующую активность микоплазм, а также влияние их компонентов на прогрессию опухолевого роста, являются существенными для понимания механизма взаимодействия бактериальных патогенов с клетками хозяина, а также для выяснения роли хронических бактериальных инфекций в прогрессии опухолевых заболеваний.

Апробация работы

Основные результаты работы были доложены и обсуждены на XII международной конференции "СПИД, рак и родственные проблемы", 2004 г., IX конгрессе Всероссийского научно-практического общества эпидемиологов, микробиологов и паразитологов, 2007 г., Всероссийской научно-практической конференции «Вакцинология 2006», Российской научной конференции с международным участием «Фундаментальные исследования в уронефрологии» 2009 г., XIII Российском онкологическом конгрессе, 2009 г. IV Российском симпозиуме «Белки и пептиды», 2009 г.

Результаты работы были доложены и обсуждены на расширенном заседании Ученого совета ФГБУ «НИИЭМ им. Н.Ф. Гамалеи» Минздравсоцразвития России, 2007 г. и на научной конфереции отдела Биологии стресса клетки института рака Розвелла Парка, Баффало, США, 2008 г.

Апробация диссертации состоялась 23.11.10 на научной конференции отделов генетики и молекулярной биологии бактерий и медицинской микробиологии ФГБУ «НИИЭМ им. Н.Ф. Гамалеи» Минздравсоцразвития России

Публикации

По материалам диссертации было опубликовано 18 научных работ, в том числе 13 в журналах рекомендованных ВАК РФ.

Полученные результаты нашли отражение в 4 патентах на изобретения.

Объем и структура диссертации

Диссертационная работа изложена на 226 листах машинописного текста и включает Введение и 4 главы: «Обзор литературы», «Материалы и методы», «Результаты исследований», «Обсуждение результатов», Выводы, Список используемой литературы (265 источников, из которых 7 отечественных и 258 иностранных). Работа содержит 5 таблиц и 44 рисунка.

СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ

Материалы и методы исследований

Экспериментальное заражение культур клеток различными видами микоплазм, а также идентификация и количественная оценка микоплазм в инфицированных клетках была выполнена совместно с лабораторией микоплазм и Л-форм бактерий ФГБУ НИИЭМ им. Н.Ф. Гамалеи Минздравсоцразвития РФ. Эксперименты по изучению способности микоплазм модулировать активность транскрипционных факторов NF-kB и р53 была выполнена совместно с А.В. Гудковым (Roswell Park Cancer Institute, Buffalo NY).

В работе были использованы:

– штаммы микоплазм M.arginini, M.orale, M.hominis, M.fermentans, M.pneumoniae были любезно предоставлены д.б.н. И.В. Раковской ( лаборатория микоплазм и Л-форм бактерий ФГБУ НИИЭМ им. Н.Ф. Гамалеи Минздравсоцразвития РФ).

– плазмида pLV-CMV-Super-repressor-Bleo, содержащая мутантный IkB, была любезно предоставлена А.В. Гудковым (Roswell Park Cancer Institute, Buffalo NY).

– лабораторные штаммы Escherichia coli DH5a;

- клеточные линии MCF-7, HCT-116, содержащие ген b-галактозидазы под контролем р53 зависимого промотера, а также клеточные линии 293-null, 293hTLR2, 293hTLR1/2, 293hTLR2/6, 293hTLR2/CD14, 293hTLR4/MD2-CD14 (клетки эмбриональной почки человека, содержащие ген b-галактозидазы под контролем NF-kB-зависимого промотора, и экспрессирующие Толл-подобные рецепторы TLR2, TLR2/6, TLR2/CD14, TLR4/MD2-CD14) были любезно предоставлены А.В. Гудковым (Roswell Park Cancer Institute, Buffalo NY).

– коммерческие препараты специфических эндодезоксирибонуклеаз и других ферментов фирм "Fermentas MBI" (Литва), "Promega" (США) и «NE BioLabs» (США). Для постановки реакции обратной транскрипции использовали набор Reverse Tpanscription System («Invitrogen», США). Для анализа концентраций цитокинов использовали набор FlowCytomix BenderMedsystems (Австрия). Синтез праймеров был выполнен в ООО «Синтол». Секвенирование проводилось в НПФ «Литех».

Эксперименты проводились на бестимусных мышах линии D2&I. и BALB/c.

- наращивание и культивирование микоплазм, а также заражение культур клеток различными штаммами микоплазм проводили по стандартным методам, изложенным в работах Каган Г.Я. и Раковской И.В. (1968г.) Идентификацию и количественную оценку микоплазм в инфицированных культурах клеток проводили с использованием методов измерения активности ферментов микоплазмы в культуральной среде; ПЦР с праймерами на класс Mollicute и видоспецифическими праймерами; ПЦР в режиме реального времени.

- все генно-инженерные манипуляции проводились по стандартным методам, изложенным в Maniatis Т. (1982). Анализ активности транскрипционного фактора р53 и NF-kB в клетках проводили спектрофотометрически по реакции на -галактозидазу методом ОТ-ПЦР и методом иммуноблоттинга. Анализ пролиферации, выживаемости и уровня апоптоза в клетках проводили по реакции с субстратом МТТ, окраской клеток метиленовым голубым; измерением активности каспаз 3/7, спектрофотометрически, используя специфический флюорогенный субстрат Ac-DEVD-AMC; Анализ экспрессии Толл-подобных рецепторов 2 и 6 в опухолевых клетках проводили методом обратной транскрипции с последующей ПЦР на гены Толл-подобных рецепторов 2 и 6 и методом проточной цитофлюорометрии. Анализ экспрессии цитокинов проводили с использованием набора BenderMedsystems (Австрия) при помощи проточного цитофлюориметра с использованием коммерческого набора FlowCytomix

- статистическую обработку результатов проводили общепринятыми методами с использованием программного обеспечения Microsoft Excel.

РЕЗУЛЬТАТЫ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ

Изучение влияния различных видов микоплазм на транскрипционную активность р53

Для проверки предположения о способности микоплазм ингибировать активность р53, была использована репортерная линия клеток (Balb3T3), несущая в своем геноме p53-респонсивный элемент, под контролем которого находится ген b-галактозидазы. Такая клеточная линия позволяет производить количественный анализ активности белка р53, используя стандартную цветную реакцию с ONPG.

Данная репортерная линия заражалась Mycoplasma sp. и далее обрабатывалась доксорубицином (Dox) для индукции р53. После чего, как в обработанных Dox, так и в необработанных Dox клетках (зараженных различными видами микоплазм и контрольных незараженных клетках) оценивалась активность р53 по изменению уровня активности b-галактозидазы. Измерение активности b-галактозидазы производили через 24 часа после добавления Dox (рис.1).

Рисунок 1. Влияние микоплазменной инфекции на активность транскрипционного

фактора р53.

Относительная активность определялась по реакции ONPG как отношение значения оптической плотности в экспериментальном образце,(клетках обработанных доксорубицином, к значению оптической плотности в контрольном образце (клетках необработанных доксорубицином). Доксорубицин в культуральную среду добавляли до концентрации 1мг/мл. Клетки с доксорубицином культивировали в течение 24 часов. р53-зависимую индукцию b-галактозидазы определяли спектрофотометрически (414 нм) по изменению оптической плотности красящего раствора, содержащего о-нитрофенил-b-D-галактопиранозид (ONPG).

Полученные данные показали, что все использованные виды микоплазм способны супрессировать активность р53. Наибольшее ингибирование р53 наблюдалось в клетках, инфицированных микоплазмой M.arginini. Этот вид микоплазмы был выбран в качестве модели для проведения дальнейших исследований.

На следующем этапе M.arginini была использована для более детального исследования влияния микоплазменной инфекции на транскрипционную активность р53. Для дальнейшего более детального изучения влияния микоплазменной инфекции на транскрипционную активность р53, M.arginini были инфицированы человеческие клеточные линии HCT-116/ConA и MCF-7/ConA, также несущие р53-респонсивный элемент с геном b-галактозидазы [Gurova К., 2005]. Активность р53 была оценена в сравнении с неинфицированными клетками по изменению уровня активности репортера в ответ на обработку клеток ДНК-повреждающим агентом 5-фторурацилом (5-ФУ). Как видно из полученных результатов (Рис. 2А.) в инфицированных клетках наблюдалось очевидное снижение активности р53, при том, что выживаемость инфицированных и неинфицированных клеток статистически не отличалась.

В дополнение к трансактивационному анализу, подавление активности р53 в условиях микоплазменной инфекции, было охарактеризовано по изменению уровня транскрипции эндогенного р53-регулируемого гена – p21waf1. Детекция мРНК этого гена проводилась с помощью РТ-ПЦР. В результате этого эксперимента было показано снижение уровня индукции мРНК гена р21 в ответ на повреждение ДНК, вызванное 5-ФУ, в клетках инфицированных M.аrginini (Рис 2Б). Далее для характеристики р53-ингибирующей активности M.arginini былo проанализированo изменение уровня экспрессии p53-респонсивного гена p21 в клетках с эндогенным (диплоидные фибробласты человека BJ, обработанные 5-ФУ) и эктопически экспрессированным р53 (р53-негативные клетки аденокарциномы легкого человека H1299, инфицированные рекомбинантным аденовирусом человека 5 серотипа, экспрессирующим р53).

Как видно из Рис 2В. микоплазменная инфекция вызывала существенное снижение уровня индукции белка р21 в обеих клеточных системах. Работа проводилась совместно с к.б.н. Ильинской Г.В.

Рисунок 2. Подавление транскрипционной активности р53 микоплазмой M.arginini

(А) Активность р53-респонсивного репортера в контрольных и инфицированных M. arginini клетках HCT-116 и MCF-7. HCT-116 и MCF-7 клетки, стабильно трансфицированные лентивирусным вектором, несущим р53-респонсивную конструкцию ConALacZ, были посеяны на 96-луночный планшет, после чего инкубировались 16 часов в среде, содержащей указанные на рисунке концентрации 5-ФУ. Клетки инфицировали M.arginini не менее чем за 2 недели до эксперимента. Присутствие M. arginini в клеточной культуре подтверждали высевом, ПЦР и набором MycoAlert. Активность репортера (b-галактозидазы) определяли по конверсии ONPG (верхняя панель графиков), выживаемость клеток оценивали по окраске метиленовым голубым (нижняя панель графиков).

(Б) РТ-ПЦР анализ экспрессии p53 и p21 в контрольных и инфицированных M. arginini клетках HCT-116 и MCF-7. Для индукции р53 клетки обрабатывали 5-ФУ (30 мкM) в течение 24 часов.Уровень экспрессии мРНК p53 и p21 оценивали методом РТ-ПЦР. Уровень экспрессии GAPDH (glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase) использовался как положительный контроль, подтверждающий схожее качество и количество кДНК в каждой пробе. Клетки HCT-116 - левая электрофореграмма, MCF-7 правая электрофореграмма.

(В) Влияние микоплазменной инфекции (M. arginini) на уровень экспрессии р53-респонсивного гена р21. Лизаты, приготовленные из контрольных (неинфицированных) и инфицированных M. arginini клеток BJ и H1299 были использованы для Вестерн-блот анализа уровня экспрессии белков p53 и p21. Уровень экспрессим GAPDH использовался как контроль внесения общего количества белка в каждый трек. Для индукции р53 клетки BJ брабатывали 5-ФУ (30 мкМ) в течение 16 часов, а клетки H1299 обрабатывали аденовирусом, экспрессирующим p53 в количестве 10 БОЕ (бляшкообразующих единиц) на клетку.

Микоплазменная инфекция ингибирует р53-зависимую остановку клеточного цикла и р53-зависимый апоптоз

р53 является одним из ключевых белков, определяющих прохождение клетки через сверочные точки клеточного цикла. Для проверки влияния микоплазменной инфекции на эту функцию р53 был поставлен эксперимент по анализу включения бромдезоксиуридина (BrdU) в ДНК р53-позитивных клеток линии REF52, инфицированных и неинфицированных M.arginini. Клетки этой линии представляют собой иммортализованные фибробласты эмбриона крысы, которые способны подвергаться р53-зависимому аресту G1/S сверочной точке клеточного цикла [Sablina А., 1999]. Культура клеток REF52 была синхронизирована в бессывороточной среде в течение 72 часов, после чего обрабатывалась ДНК-повреждающим агентом – 5-ФУ.

Как можно увидеть на Рис. 3А, только 2% неинфицированных клеток смогли преодолеть запрет на вхождение в фазу синтеза (1.2% из всех клеток, обработанных 5-ФУ были BrdU-позитивными, при этом в контрольном варианте необработанном 5-ФУ процент BrdU-позитивных клеток составил приблизительно 60%). При этом в популяции инфицированных клеток около 13% клеток преодолели сверочную точку и вошли в S-фазу (8% из всех клеток, обработанных 5-ФУ были BrdU-позитивными, при этом в контрольном варианте необработанном 5-ФУ процент BrdU-позитивных клеток составил приблизительно 60%). Таким образом, полученные результаты показывают, что микоплазменнная инфекция способна ослаблять р53-зависимый арест, индуцированный обработкой 5-ФУ. Другой важной функцией, которую выполняет р53, является индукция апоптоза. Для оценки способности микоплазменной инфекции ингибировать р53-зависимый апоптоз в эксперименте была использована р53-негативная клеточная линия H1299, которая характеризуется быстрой индукцией апоптоза в ответ на восстановление функции р53. Клетки линии Н1299, инфицированные и неинфицированные M. arginini были трансдуцированы рекомбинантным аденовирусом человека, экспрессирующим дикий тип гена р53 (Ad-p53). Для контроля эффективности трансдукции в эксперименте использовали рекомбинантный аденовирус, экспрессирующий репортерный ген SEAP (placental-secreted alkaline phosphatase). Из данных представленных на Рис. 15Б очевидно, что активность SEAP была схожей в инфицированных и неинфицированных микоплазмой клетках. Это доказывает, что микоплазменная

Рисунок 3. Инфекция M. arginini ингибирует р53-зависимый арест клеточного цикла и р53-зависимый апоптоз.

(А.) Эффект микоплазменной инфекции на способность клеток REF52, синхронизированных в G0/G1 фазе на бессывороточной среде (в течение 72 часов) входить в S-фазу (включать 5-бромдезоксиуридин (5-BrdU) в растущую цепь ДНК). Включение 5-BrdU оценивали методом иммунофлюоресценции, используя специфические антитела к BrdU. Оценка включения BrdU проводилась через 7 часов после стимуляции клеток средой, содержащей 10% фетальной бычей сыворотки (ФБС) и 5-BrdU (отрицательный контроль) или 5-BrdU с 5-ФУ. Для подсчета в каждом варианте учитывали данные не менее чем для 500 клеток.

(Б.) Инфекция клеток M. arginini снижает активность эктопически экспрессированного р53.

Инфицированные (черные столбцы) или неинфицированные (белые столбцы) р53-негативные клетки линии Н1299, содержащие р53-респонсивный элемент LacZ сеяли на 96-луночный планшет, после чего трансдуцировали рекомбинантными аденовирусами Ad-p53 (верхняя панель) или Ad-SEAP (нижняя панель) в дозе 5, 10 или 20 КОЕ на клетку. p53-зависимую трансактивацию репортерного гена и активность SEAP определяли через 24 часа после аденовирусной инфекции.

(В.) Изменение активности каспазы 3 в клетках инфицированных M.arginini.

Активность каспазы 3 определяли в лизатах клеток H1299 через 24 часа после инфекции (как описано в пункте Б.) при использовании флюорогенного субстрата.

(Г.) Инфекция M. arginini снижает рост-ингибирующий эффект эктопически экспрессированного р53.

Инфицированные и неинфицированные микоплазмой клетки были посеяны на 96-луночный планшет, после чего были трансфинфицированы рекомбиннатным аденовирусом Ad-p53 в количестве 5 КОЕ/клетка. Выживемость клеток оценивалась по их окраске метиленовым голубым в указанные интервалы времени.

(Д.) Эффект инфекции M. arginini на индукцию апоптоза в клетках E-Ras.

Клетки E-Ras-LXSP и E-Ras-Bcl2 были посеяны на 96-луночный планшет и инкубировались в бессывороточной среде (16 часов) или среде, содержщей 30 мкМ 5-ФУ(24 часа). Выживаемость клеток оценивалась по окраске метиленовым голубым (верхняя панель). Активность каспазы 3 определяли используя специфический флюорогенный субстрат (нижняя панель). Инфицированные M. аrginini клетки - черные столбцы, неинфицированные клетки - белые столбцы, клетки обработанные LAMPs (2 мг/мл за 4 часа до обработки 5-ФУ - серые столбцы.

инфекция не влияла на эффективность аденовирусной трансдукции и экспрессию целевого гена в составе генома аденовируса. При этом, напротив, из данных р53-зависимой трансактивации репортера (в клетках с эктопически экспрессированным р53), видно, что микоплазменная инфекция достоверно снижала активность р53 (Рисунок 3Б, верхняя панель). Эффект микоплазменной инфекции на индукцию р53-зависимого апоптоза был также оценен по активности каспазы 3 через 24 часа после трансдукции клеток аденовирусом. При всех использованных множественностях инфекции клеток Ad-p53, активность каспазы 3 была ниже в клетках инфицированных микоплазмой (Рис. 3В). Ингибирование р53-зависимого апоптоза в клетках инфицированных микоплазмой также было показано по изменению общего уровня выживаемости клеток Н1299, трансдуцированных Ad-p53 (см. Рис. 3Г).

Таким образом, полученные результаты показывают, что снижение транскрипционной активности р53 “транслируется” в ингибирование апоптоза - одной из важнейших р53-регулируемых функций.

Влияние микоплазменной инфекции на индукцию апоптоза было дополнительно исследовано с использованием клеточной линии E-Ras (линии крысиных фибробластов, трансформированных комбинацией Е1а и Ras). [Nelyudova А., 2004]. Были использованы два варианта этой клеточной линии: E-Ras-LXSP (клетки, трансдуцированные контрольным лентивирусом без вставки целевого гена) и E-Ras-Bcl2 (клетки, трансдуцированные ретровирусным вектором, обеспечивающим гиперэкспрессию антиапоптотического белка Bcl-2). Клетки E-Ras-LXSP являются высокочувствительными к различным проапоптотическим стимулам, тогда как клетки E-Ras-Bcl2 высоко резистентны к апоптозу, вследствие гиперэкспрессии Bcl-2.

В контрольных и инфицированных M. arginini клетках E-Ras-LXSP и E-Ras-Bcl2 был индуцирован апоптоз двумя независимыми способами (удалением сыворотки из ростовой среды или обработкой 5-ФУ). Спустя 24 часа была определена выживаемость клеток. Как показано на Рис. 15Д. (верхняя панель) микоплазменная инфекция приводила к повышению выживаемости клеток E-Ras-LXSP в ответ на оба способа индукции апоптоза. Апоптозингибирующее действие микоплазмы также было подтверждено по снижению активности каспазы 3 в инфицированных микоплазмой клетках (Рисунок 3Д, нижняя панель). Суммируя результаты данного эксперимента, можно заключить, что клетки E-Ras-LXSP инфицированные микоплазмой приобретали резистентность к апоптозу, сравнимую с клетками E-Ras-Bcl2.

Необходимо отметить, что снижение количества клеток E-Ras-Bcl2 в ответ на удаление сыворотки или обработку 5-ФУ связано с индукцией ареста роста, но не апоптоза [Nelyudova А., 2004]. Дополнительно, в данном эксперименте перед индукцией апоптоза мы инкубировали клетки с липид-ассоцииро-ванными белками (LAMPs) M.arginini. Однако нам не удалось показать, что структурные элементы микоплазмы способны блокировать развитие апоптоза в клетках E-Ras.

Подводя итог, можно сделать заключение о том, что микоплазменная инфекция способна эффективно супрессировать такие главные функции р53, как контроль клеточного цикла и регуляция апоптоза.

Работа проводилась совместно с к.б.н. Щебляковым Д.В. [лаборатория молекулярной биотехнологии ФГБУ «НИИЭМ им.Н.Ф.Гамалеи» Минздравсоцразвития России].

Микоплазменная инфекция способствует Ras-опосредованной трансформации крысиных эмбриональных фибробластов

В клетках грызунов активность р53 является единственным фактором предотвращающим полную трансформацию клеток, экспрессирующих активированный онкоген Ras [Yaswen Р., 2007]. В связи с этим было интересно определить, является ли подавление р53, наблюдаемое при микоплазменной инфекции, достаточным для полной трансформации клеток, гиперэкспрессирующих онкоген Ras. Для проверки данного предположения в нашем исследовании была использована линия крысиных эмбриональных фибробластов REF52. Известно, что эти клетки характеризуются способностью к сенесенс-подобному аресту роста в ответ на экспрессию в них онкогена H-Ras. Инактивация р53 в этих клетках предотвращает арест и приводит к их злокачественной трансформации [Serrano М., 1997]. На первом этапе эксперимента мы показали, что микоплазменная инфекция приводит к снижению р53-зависимой транскрипции p21waf1 в клетках REF52 (Рисунок 4А.).Далее мы получили клеточную линию REF52 (REF52/sh-p53), в которой экспрессия р53 была подавлена в результате их трансфекции лентивирусом, экспрессирующим shРНК против р53 [Boiko А., 2006]. Нокдаун гена р53, опросредованный shРНК, был подтвержден полуколичественной ОТ-ПЦР по определению уровня мРНК р53. (Рисунок 4Б.). Далее клетки REF52 и REF52/sh-p53 были инфицированы микоплазмой M. arginini. После чего исходные неинфицированные клетки и клетки инфицированные микоплазмой были трансдуцированы лентивирусом (LV-Ras-Bleo), экспрессирующим онкоген Ras (H-Rasv12) в комбинации с геном устойчивости к блеомицину. Трансдуцированные клетки были помещены в среду с блеомицином для элиминации клеток нетрансдуцированных онкогеном Ras. Клетки были оставлены в этой среде на 3 недели для оценки изменения их морфологии и способности формировать колонии. Полученные результаты представлены на рисунке 4В. (слева, макро- и микрофотографии клеток, справа, схематическое изображение полученных результатов). Как и ожидалось через 21 день после селекции исходные клетки REF52 (содержащие функциональный р53 и неинфицированные микоплазмой) оказались арестованными и приобрели характерную морфологию для сененсентных клеток (Рисунок 4Б., панель ii). Клетки REF52/sh-p53 с нокдауном гена р53 и экспрессирующие онкоген Ras, напротив, сформировали полностью трансформированную культуру. (Рисунок 4Б., панель iii). При этом необходимо отметить, что клетки REF52/sh-p53, трансдуцированные онкогеном Ras, приобретали трансформированный фенотип вне зависимости от микоплазменной инфекции (неинфицированные клетки - панель vi, инфицированные - панель iii). Главным результатом данного эксперимента явилось то, что исходные (родительские) клетки REF52, инфицированные M.arginini, также формировали полностью трансформированную культуру, несмотря на тот факт, что они экспрессируют дикий тип гена р53 (панель v).

Таким образом, полученные результаты позволяют сделать заключение о том, что инфекция M.arginini, имитирует shРНК-опосредованное подавление активности p53, способствуя Ras-зависимой трансформации клеток REF52.

Рисунок 4. Снижение активности р53 в инфицированных микоплазмой клетках способствует их Ras-опосредованной трансформации.А. РТ-ПЦР анализ экспрессии мРНК генов р53 и р21в клетках REF52, инфицированных и неинфицированных M.arginini.

Для индукции p53 клетки обрабатывали 5-ФУ (30 мкM) в течение 16 часов. Уровень экспрессии p53 и p21определяли методом РТ-ПЦР. Уровень экспрессия GAPDH (glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase) был использован как позитивный контроль для подтверждения качества и количества кДНК в каждом образце.

(Б.) Ингибировние экспрессии мРНК p53 в клетках REF52, трансдуцированных shРНК против р53.

Уровень р53 был определен методом РТ-ПЦР через 72 часа трансдукции лентивирусом, экспрессирующим shРНК против р53. Экспрессия GAPDH (glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase) была использована как позитивный контроль для подтверждения качества и количества кДНК в каждом образце.

(В.) Микрофотографии и фотографии зафиксированных и окрашенных метиленовым голубым клеток REF52.

Неинфицированные (панели i, ii и iii) и инфицированные M.arginini (панели iv, v и vi) клетки REF52 были трансдуцированы контрольным (без вставки целевого гена) лентивирусом (“K-“, панель i и iv) и лентивирусом LV-Ras-Bleo, экспрессирующим активированный онкоген Ha-Rasv12oncogene (панели ii и v) или комбинацией лентивируса LV-Ras-Bleo и лентивируса, экспрессирующего shРНК, специфичную к p53 (“shРНКp53”, панели iii и vi). Трансдуцированные клетки (за исключением отрицательного контроля, “K-“) культивировались в присутствии блеомицина в течение 21 дня. Выжившие клетки были зафиксированы и окрашены. Репрезентативные области сфотографированы при 200Х увеличении.

Изменение профиля экспрессии генов в клетках инфицированных микоплазмой.

Для более детального изучения влияния микоплазменной инфекции на функции р53 нами был проведен анализ изменения спектра экспрессии генов (около 35000 генов) в культуре клеток карциномы толстого кишечника человека HCT-116, зараженных и незараженных M.arginini. В анализ было включено 8 вариантов образцов:

А) Клетки HCT-116 с диким типом гена р53.

1) НСТ-116 (К-);

2) НСТ-116, обработанные 5-ФУ;

3) НСТ-116, инфицированные M.arginini;

4) НСТ-116, инфицированные M.arginini и обработанные 5-ФУ.

Б) Клетки HCT-116 с нокаутом гена р53(НСТ-116 р53-/-)

5) НСТ-116 р53-/- (К2-);

6) НСТ-116 р53-/-, обработанные 5-ФУ;

7) НСТ-116 р53-/-, инфицированные M.arginini;

8) НСТ-116 р53-/-, инфицированные M.arginini и обработанные 5-ФУ.

Перед определением профиля экспрессии клетки НСТ-116, с диким типом и нокаутом гена р53, зараженные и незараженные микоплазмой рассевали по 2х106 клеток на чашки диаметром 6 см. Через сутки половина клеток для активации р53 обрабатывалась 5-ФУ. Еще через 18 часов клетки собирали в Тризоле и экстрагировали из них РНК. Полученная РНК далее была использована для определения влияния микоплазменной инфекции на изменение профиля экспрессии генов (микроэррей-анализ проводился в подразделении Affymetrix при Институте рака Розвелла Парка из средств проф. А.В.Гудкова).

По результатам проведенного анализа были сформированы 3 основные группы генов (см. Табл№1): р53-зависимые гены, экспрессия которых подавляется микоплазмой; р53-независимые гены, экспрессия которых повышается в результате микоплазменной инфекции; р53-независимые гены, подавляемые микоплазмой. В представленную таблицу внесены гены, экспрессия которых изменялась наиболее значимо.

Таблица 1. Изменение профиля экспрессии генов в клетках инфицированных микоплазмой

	Название гена	Изменение уровня экспрессии (разы) относительно клеток инфицированных мико-плазмой
р53-зависимые гены, экспрессия которых снижена в инфицированных микоплазмой клетках	- tumor protein p53 inducible protein 3 (TP53I3) - transformed 3T3 cell double minute 2, (MDM2) - BTG family, member 2 (BTG2) - cyclin-dependent kinase inhibitor 1A (p21, Cip1) - activating transcription factor 3 - TNF receptor superfamily, member 6 (Fas)	-1,55 -2,38 -1,53 -1,28 -1,62 -1,41
р53-независимые гены, экспрессия которых повышена в клетках инфицированных микоплазмой	- 5'-nucleotidase, ecto (CD73) - chemokine (C-C motif) ligand 26 - versican - tumor-associated calcium signal transducer 2 - calbindin 2, 29kDa (calretinin) - melanoma cell adhesion molecule - cystatin E/M - - GLIS family zinc finger 3 - alkaline phosphatase, placental - AXL receptor tyrosine kinase	4.33 4.33 4.08 4.06 3.68 3.66 3.52 2.60 2.23 2.20
р53-независимые гены, экспрессия которых снижена в клетках инфицированных микоплазмой	- gap junction protein, alpha 1, 43kDa - myocyte enhancer factor 2C - methyltransferase like 7A - ras homolog gene family, member U - myocyte enhancer factor 2C - mannosidase, alpha,> - phosphodiesterase 4B, cAMP-specific killer cell - lectin-like receptor subfamily C, member - PDZ and LIM domain 5	-3.96 -3.50 -3.37 -3.29 -2.76 -2.52 -2.36 -2.34 -2.30

р53-зависимые гены, экспрессия которых повышается в результате микоплазменной инфекции обнаружены не были. Гены, экспрессия которых регулируется 5-ФУ р53-независимым способом в таблицу не включены.

Результаты проведенного исследования, как и ожидалось, показали, что микоплазменная инфекция снижает экспрессию ряда р53-зависимых генов. Особенно, примечательным выглядит снижение экспрессии гена Fas, экспрессия которого является важным фактором гибели клеток, обработанных 5-ФУ. Проведенный анализ выявил значительное количество р53-зависимых генов (tumor protein p53 inducible nuclear protein 1 (TP53INP1), BAX, TP53 regulated inhibitor of apoptosis 1 (TRIAP1), sestrin 1, sestrin2, damage-specific DNA binding protein 2 (DDB2), stratifin (SFN) и др.) экспрессия которых, в клетках инфицированных микоплазмой, подавлялась слабо (1,07-1,2 раза).

Следует отметить, что в клетках инфицированных микоплазмой, значительно (более чем в 2 раза) изменялась р53-независимая экспрессия генов (экспрессия более чем 240 генов была повышена, экспрессия более 190 генов понижена). Одним из наиболее интересных р53-независимых генов, экспрессия которого была повышена в инфицированных клетках HCT-116, является ген белка versican. В недавней работе [Kim Н., 2009] показано, что этот белок является одним из ключевых факторов метастазирования клеток рака легкого.

Различные виды микоплазм приводят к активации NF-kB в клетках при взаимодействии с Толл-подобным рецептором 2.

Целью второй части работы было изучение влияния микоплазменной инфекции на активность другого стресс-активируемого транскрипционного фактора NF-kB. Этот фактор, в отличие от р53, контролирует экспрессию анти-апоптотических белков и является одним из основных факторов прогрессии опухолевого роста. Для характеристики целого ряда эффектов, сопровождающих микоплазменную инфекцию (генетическая нестабильность, увеличение резистентности к апоптозу, стимуляция метастазирования и др.) мы решили изучить, каким образом изменяется активность NF-kB в инфицированных микоплазмой клетках.

Известно, что белок M.fermentans MALP-2 активирует NF-kB через TLR2/6, липид-ассоциированные мембранные белки (ЛАМБ) M.penetrans через TLR1/2, ЛАМБ M.pneumoniae через оба сочетания Толл-подобных рецепторов (TLR2/6 и TLR1/2), а суперантиген M.arthritidis через TLR2 и TLR4- зависимые пути [Shimizu 2004, 2005, Mu 2006]. Как видно из представленных работ наиболее универсальным набором Толл-подобных рецепторов, участвующих в распознавании структурных компонентов микоплазм, является сочетание TLR2/6. Поэтому, для изучения способности различных видов микоплазм или их структурных компонентов активировать транскрипционный фактор NF-kB была использована клеточная линия, экспрессирующая Толл-подобные рецепторы 2/6, полученная на основе клеток эмбрионального почечного эпителия человека линии 293. Дополнительно, для визуального контроля активации NF-kB методом лентивирусной трансфекции в указанные клетки был введен ген b-галактозидазы под контролем NF-kB-зависимого промотора. Клеточная линия были предоставлены А.В. Гудковым (Roswell Park Cancer Institute, Buffalo NY).

Принцип использования клеточной линии основан на способности Толл-подобных рецепторов, после связывания со специфическими лигандами M.arginini, рекрутировать адаптерные молекулы MyD88, TRAF6, активировать каскад киназ, в результате чего происходит активация транскрипционного фактора NF-kB, его транслокация в ядро, где этот фактор связывается с собственным респонсивным элементом, под транскрипционным контролем которого находится ген галактозидазы. Таким образом, используемая система позволяет по цветной реакции на галактозидазу измерять активность NF-kB в клетках и регистрировать взаимодействие Толл-подобных рецепторов с лигандами микоплазмы. Указанные клетки обрабатывали либо липид-ассоциированными мембранными белками, либо культурами микоплазм (M.arginini, M.hominis, M.orale, M.fermentans, M.pneumonia). После чего проводили измерение активности NF-kB в клетках. В качестве положительного контроля активации NF-kB использовали ФНО- (фактор некроза опухоли) (рисунок 5).

Рисунок 5. Измерение активности транскрипционного фактора NF-kB в клетках, экспрессирующих Толл-подобные рецепторы 2 и 6. Данные по каждой точке являются результатом трех независимых экспериментов. (р<0,005)

Как видно из рисунка 5 обработка клеток как живыми микоплазмами, так и их липид-ассоциированными мембранными белками, приводила к достоверному (р<0,005) увеличению уровня NF-kB-зависимой экспрессии b-галактозидазы, что свидетельствует о способности всех, используемых в работе, микоплазм и их структурных компонентов активировать NF-kB в клетках в результате взаимодействия с TLR2/6.

Определение возможных сочетаний Толл-подобных рецепторов, вызывающих активацию транскрипционного фактора NF-kB после взаимодействия M.arginini или ее структурными компонентами

В качестве объекта исследования была выбрана M.arginini, для которой нами была показана способность подавлять активность р53. Кроме того, до настоящего времени в доступной научной литературе отсутствуют данные относительно взаимодействия M.arginini с Толл-подобными рецепторами и активации транскрипционного фактора NF-kB. В нашей работе мы решили охарактеризовать данный вид микоплазмы по NF-kB активирующей способности и определить все сочетания Толл-подобных рецепторов, являющихся для нее специфическими.

Для этого был использован набор индивидуальных клеточных сублиний, экспрессирующих одно из следующих сочетаний Толл-подобных рецепторов и акцессорных молекул MD2 и CD14: hTLR4/MD2-CD14, hTLR2, hTLR2/hTLR6, hTLR1/hTLR2, hTLR2/CD14, полученных на основе клеток эмбрионального почечного эпителия человека линии 293. Во все клетки, как и в предыдущем эксперименте для визуального контроля активации NF-kB методом лентивирусной трансфекции был введен ген b-галактозидазы под контролем NF-kB-зависимого промотора. Клеточные линии были предоставлены А.В. Гудковым (Roswell Park Cancer Institute, Buffalo NY).

Описанные клеточные линии обрабатывали либо липид-ассоциированными мембранными белками M.arginini (ЛАМБ), либо культурой микоплазмы. В качестве положительного контроля активации NF-kB использовали ФНО- (фактор некроза опухоли) (рисунок 6). Указанный цитокин после взаимодействия с собственным рецептором стимулирует транслокацию NF-kB в ядро и активирует экспрессию провоспалительных факторов [Pahl Н., 1999].

Для клеток 293hTLR4/MD2-CD14, с целью определения функциональной активности экспрессируемого ими Толл-подобного рецептора 4 в качестве дополнительного положительного контроля использовали специфический для данного рецептора лиганд - липополисахарид (ЛПС) E.coli.

Как видно из рисунка 6, обработка клеток ФНО- приводила к достоверному (р<0,005) увеличению уровня NF-kB-зависимой экспрессии b-галактозидазы во всех линиях клеток, что подтверждает функциональную активность NF-kB-респонсивного элемента, введенного в их геном.

Обработка клеток структурными элементами микоплазмы (ЛАМБ) или самой микоплазмой, вызывала активацию NF-kB-зависимой экспрессии гена галактозидазы только в клетках, экспрессирующих следующие сочетания Толл-подобных рецепторов: hTLR2/hTLR6, hTLR1/hTLR2, hTLR2/CD14. В клетках, неэкспрессирующих Толл-подобные рецепторы или несущих hTLR4/MD2-CD14 или hTLR2, достоверного увеличения уровня NF-kB-зависмой экспрессии b-галактозидазы не детектировалось.

Примечательно, что повышенная активность транскрипционного фактора NF-kB в клетках 293hTLR2/6, 293hTLR2/CD14 и 293hTLR1/2, инфицированных M.arginini, сохранялась в течение длительного периода и наблюдалась через 1, 7 и 35 дней после инфицирования.

Эти результаты дают основание полагать, что активация данного транскрипционного фактора в клетках в ответ на микоплазменную инфекцию является конститутивной (рисунок 7).

Рисунок 6. Измерение активности транскрипционного фактора NF-kB в клетках, экспрессирующих различные сочетания Толл-рецепторов. Данные по каждой точке являются результатом трех независимых экспериментов. (р<0,005)

Рисунок 7. Конститутивная активация NF-kB в клетках, инфицированных микоплазмой.

(А.) Измерение активности транскрипционного фактора NF-kB в клетках в различные периоды пассирования. Данные по каждой точке являются результатом трех независимых экспериментов. (р<0,005)

(Б.) Измерение уровня активности транскрипционного фактора NF-kB в клетках, экспрессирующих Толл-подобные рецепторы TLR2/6 методом Вестерн-блот анализа. (+ клетки, инфицированные M.arginini; - клетки, неинфицированные M.arginini).

Дополнительно, активацию транскрипционного фактора NF-kB в клетках в различные периоды пассирования определяли по миграции субъединицы NF-kB, белка р65, в ядро, используя метод Вестерн-блот анализа. В клетках 293hTLR2/6, инфицированных M.arginini происходила транслокация белка р65 в ядро, в то время как в клетках, не экспрессирующих Толл-подобные рецепторы, или клетках 293hTLR2/6, неинфицированных микоплазмой, уровень белка р65 в ядре не изменялся (Рисунок 7Б.).

Таким образом, на данном этапе исследования нами было показано, что различные виды микоплазм и их липид-ассоциированные мембранные белки способны активировать транскрипционный фактор NF-kB при взаимодействии с Толл-подобными рецепторами. Дополнительно, для M.arginini были определены все сочетания Толл-рецепторов, участвующие в распознавании ее структурных компонентов и активации NF-kB. Было показано, что рецепторы TLR2/6, TLR2/CD14 и TLR1/2 одинаково эффективно распознают как клетки M.arginini, так и экстрагированные из ее мембран липопротеиды (ЛАМБ).

Работа была выполнена совместно с д.б.н. А.В. Гудковым (Roswell Park Cancer Institute, Buffalo NY).

M.arginini и ее структурные компоненты подавляют апоптоз в опухолевых клетках, экспрессирующих Толл-подобные рецепторы 2/6

На следующем этапе исследования мы решили изучить, влияет ли активация NF-kB, вызванная микоплазмами или их структурными компонентами, на выживаемость опухолевых клеток в ответ на действие химиотерапевтических препаратов.

Для этого на начальном этапе был проведен скрининг опухолевых клеточных линий (WEHI-3B, B10M, L929, U937, A549, H460, H1299, HCT-116, MCF-7) на предмет выявления экспрессии Толл-подобных рецепторов, специфичных к микоплазме. Было обнаружено, что 5 из 10 линий экспрессировали TLR2 и 6 (см. главу 3.3.5 диссертации). Для дальнейшего исследования эффектов микоплазменной инфекции и ее компонентов, в экспериментах in vitro и in vivo, нами в качестве модели была выбрана линия мышиной миеломоноцитарной лейкемии WEHI-3B. При использовании этой линии клеток было показано, что микоплазменная инфекция как и добавление R-Pam2 к опухолевым клеткам WEHI-3B, вела к активации в них транскрипционного фактора NF-kB (см.рисунок 8).

Для оценки влияния микоплазмы на апоптоз, индуцируемый химиотерапевтическими препаратами, в опухолевых клетках WEHI-3B, экспрессирующих Толл-подобные рецепторы 2 и 6, проводили измерение следующих параметров: выживаемость, уровень каспаз 3/7 (рисунок 25). Клетки инфицировали M.arginini, после чего обрабатывали циспластином, таксолом или фторурацилом. После инкубации в течении 16-18 часов проводили измерение указанных параметров.

Рисунок 8. Активация NF-kB в клетках WEHI-3B в ответ на микоплазменную инфекцию.

(А.) Экспрессия TLR2 в клетках WEHI-3B. Экспрессия основного рецептора для диацилипопептидов микоплазмы была подтверждена методом проточной цитофлюорометрии. Клетки WEHI-3B инкубировали с антителами специфичными к TLR2 (eBioscience, USA). Контрольные клетки инкубировали с изотипическим контролем (анти-IgG). Исходя из фоновой флюоресценции отрицательного контроля был определен процент TLR2-позитивных клеток (измерение TLR2 проведено в полном соответствии с рекомендациями производителя).

(Б.) NF-kB-зависимая экспрессия люциферазы. В клетки WEHI-3B методом лентивирусной трансфекции был введен NF-kB-респонсивный элемент, под контролем которого находится ген люциферазы. Полученные клетки инфицировали M.arginini, после чего в инфицированных и контрольных (неинфицированных) клетках, используя стандартную методику, определяли уровень NF-kB-зависимой экспрессии люциферазы.

На рисунке 9 показана выживаемость и уровень активности основных эффекторных каспаз-3/7, при индукции апоптоза в клетках WEHI-3B, инфицированных M.arginini. Уровень каспаз-3/7 измеряли спектрофотометрически, используя специфический флюорогенный субстрат Ac-DEVD-AMC.

Рисунок 9. Выживаемость и активность каспаз 3/7 в клетках мышиной миеломоноцитарной лейкемии WEHI-3B при действии различных концентраций химиотерапевтических препаратов. (А.) Выживаемость клеток мышиной миеломоноцитарной лейкемии WEHI-3B; (Б) Активность каспазы-3/7. Данные по каждой точке являются результатом трех независимых экспериментов. (р<0,005)

Как видно из представленных результатов микоплазменная инфекция клеток WEHI-3B приводила к достоверному (р<0,005) повышению их выживаемости и снижению уровня активации каспаз-3/7 на 25-30% при различных внутриклеточных повреждениях по сравнению с неинфицированными клетками (белые столбцы).

Статистическую обработку результатов проводили общепринятыми методами с использованием программ Microsoft Excel и Statistica 6.0.

Таким образом, в первой части экспериментов in vitro было показано, что микоплазменная инфекция к опухолевым клеткам WEHI-3B, экспрессирующим набор Толл-подобных рецепторов 2 и 6, приводит к активации в них транскрипционного фактора NF-kB и подавлению апоптоза в данных клетках при различных внутриклеточных повреждениях. Полученные данные, были подтверждены в независимых экспериментах с использованием структурного компонента M.arginini – R-Pam2 (данные не приводятся). В экспериментах были использованы различные перевиваемые (B10M, 293TLR2/CD14, 293TLR2/6) и первичные (острый лимфобластный лейкоз, множественная миелома) культуры клеток, экспрессирующие специфические к микоплазме Толл-подобные рецепторы (см. главы 3.3.7 и 3.4. диссертации). Примечательно, что активация NF-kB в ответ на микоплазменную инфекцию (обработку структурными компонентами микоплазмы), существенно влияла на выживаемость клеток, но не влияла на скорость их пролиферации (см. главу 3.4).

Работа выполнена совместно с к.б.н. Щебляковым Д.В. [лаборатория молекулярной биотехнологии ФГБУ «НИИЭМ им. Н.Ф.Гамалеи» Минздравсоцразвития России].

Влияние микоплазменной инфекции клеток WEHI-3B на прогрессию мышиной миеломоноцитарной лейкемии в экспериментах in vivo

В следующей части работы было изучено влияние микоплазмы на прогрессию опухолевого роста в экспериментах in vivo.

Поскольку доступных иммунокомпетентных для M.arginini мышиных моделей нет, для проведения исследования использовали бестимусных мышей линии D2&I. Мышам вводили клетки WEHI-3B, инфицированные M.arginini в количестве 2х106 клеток/мышь. Каждая группа состояла их 8 мышей. Животных наблюдали в течение всего периода эксперимента до момента гибели последнего животного, регистрируя их общее состояние.

Анализ кривых выживаемости Каплана-Мейера (рис. 10А) показал достоверное (р<0,001 по лог-ранговому тесту) снижение продолжительности жизни мышей, с привитыми опухолевыми клетками WEHI-3B, инфицированными микоплазмой, по сравнению с контрольными животными, получавшими не инфицированные опухолевые клетки. Также, мыши в данной группе характеризовались более ранним развитием асцитов (рис. 10Б).

У мышей в группе с введением опухолевых клеток WEHI-3B, инфицированных M.arginini, развитие асцитов регистрировалось на 8 день после введения, в то время как у мышей, получавших неинфицированные клетки WEHI-3B, асциты регистрировались на 15 день после введения. Анализ проб асцитной жидкости показал, что в основном они были представлены опухолевыми клетками WEHI-3B, а также в пробах асцитов у мышей, получавших инфицированные опухолевые клетки, обнаруживали M.arginini в высоком титре.

Работа выполнена совместно с лабораторией д.м.н. Копнина Б.П. [Институт Канцерогенеза РОНЦ РАМН]

Рисунок 10. Влияние микоплазменной инфекции на прогрессию мышиной миеломоноцитарной лейкемии. (А.) диаграмма выживаемости бестимусных мышей линии D2&I. (р<0,001 по лог-ранговому тесту). (Б.) фотографии мышей линии бестимусных мышей линии D2&I.

Влияние диациллипопептида M.arginini на пролиферацию и резистентность к химиотерапевтическим препаратам опухолевых клеток WEHI-3B в экспериментах in vivo

В работах, выполненных И.В.Раковской и соавт., было показано, что при микоплазменной инфекции антигены микоплазм могут обнаруживаться в крови человека и животных в течение длительного периода. В данной части исследования было изучено влияние циркулирующих антигенов микоплазмы на пролиферацию и устойчивость к химиотерапевтическим препаратам клеток WEHI-3B.

На первом этапе нами была проведена оценка влияния диациллипопептидов на скорость прогрессии опухолевого роста. В эксперименте участвовало 40 животных (мыши линии Balb/C, самки) массой 18-20 грамм. Животные были разделены на 4 группы по 10 животных в каждой. Первую контрольную группу составили интактные мыши. Вторую группу составили мыши, которым трехкратно внутрибрюшинно вводили R-Pam2 (схема введения как в группе 4). Третью группу составили мыши, которым перевили клетки мышиной миеломоноцитарной лейкемии WEHI-3B в количестве 2*106 клеток/мышь. Четвертую группу составили мыши, которым внутрибрюшинно перевили клетки WEHI-3B в той же дозе. Этой же группе мышей через 1,3,5 суток после перевивания опухоли вводили R-Pam2 в количестве 5 мкг/мышь. Далее, для оценки прогрессии опухоли через 20 суток мышей безболезненно умервщляли с помощью диэтилового эфира и извлекали печень и селезенку. Отобранные органы использовались для макроскопического и гистологического исследования. Также был определен средний вес селезенки в каждой экспериментальной группе. (см. Рисунок 11 А-В). По данным макроскопического исследования, видно, что в группах 1 и 2 видимых патологических изменений не наблюдается (рисунок 11А.), но наблюдается незначительное увеличение среднего веса селезенки в группе 2 (рисунок 11Б.). При макроскопическом исследовании печени и селезенки мышей, которым был перевит промиелоцитарный лейкоз (группа 3), обнаружены характерные для лейкоза изменения: увеличение селезенки и некоторое увеличение печени. На поверхности печени и селезенки обнаружены редкие беловатые опухолевые образования. При макроскопическом исследовании печени и селезенки мышей, которым был перевит лейкоз и вводился диацилипопептид R-Pam2 (группа 4), также были обнаружены характерные для лейкоза изменения. Селезенки мышей были сильно увеличены. На поверхности селезенок и печени обнаружены беловатые рыхлые образования (которые при гистологическом исследовании оказались лейкозными миелоцитарными клетками).

Измерение средней массы селезенки показало, достоверное увеличение веса этого органа у лейкозных мышей (группа 3 и 4) по сравнению с контрольными группами 1 и 2. Введение R-Pam2 лейкозным мышам (группа 4) дополнительно увеличивало среднюю массу селезенки (p<0,05) по сравнению с аналогичным показателем для группы 3 (Рисунок 11Б.).

Гистологическое исследование селезенки и печени мышей из группы 1 и 2 патологических изменений не выявило. Гистологическое исследование селезенок мышей из групп 3 и 4 выявили сходную картину. В селезенках наблюдалась диффузная плотная инфильтрация пульпы лейкозными миелоцитарными элементами; лимфатические фолликулы были атрофированы. Наибольшие отличия обнаружены при изучении образцов печени мышей из групп 3 и 4. В печени мышей из группы 3 были отмечены многочисленные мелкие лейкозные миелоцитарные инфильтраты, тогда как в группе 4 инфильтраты были значительно крупнее (рисунок 11В.) Инфильтраты располагались преимущественно по ходу синусоидов. Скопления лейкозных клеток, также обнаруживалось в отдельных кровеносных сосудах. В группе 4, в отличие от группы 3 наблюдалась выраженная поверхностная инфильтрация печени лейкозными клетками (рис.11А).

Проведенное макро- и микроскопическое исследование образцов селезенки и печени мышей, которым внутрибрюшинно перевивали клетки мышиной миеломоноцитарной лейкемии WEHI-3B, позволило сделать заключение о том, что диациллипопептид микоплазмы положительно влияет на прогрессию опухолевого заболевания.

На следующей стадии мы провели дополнительный эксперимент по оценке влияние диациллипопептида R-Pam2 на скорость роста опухоли. При этом, одновременно, было оценено, каким образом R-Pam2 влияет на резистентность перевиваемых клеток к химиотерапевтическим препаратам. Эксперимент проводился по следующей схеме. Мышам линии BALB/c внутрибрюшинно прививали клетки мышиной миеломоноцитарной лейкемии WEHI-3B в количестве 2*106 клеток/мышь. Через 24 часа мышам системно вводили синтетический диациллипопептид M.arginini (R-Pam2) в дозе 5 мкг/мышь. Спустя двое суток мышам в течение 3 дней также вводили R-Pam2, а группы мышей с проведением химиотерапии получали еще и препарат 5-фторурацил в дозе 0,6 мг/мышь. В контрольные группы вошли животные, которым отдельно вводили R-Pam2 и 5-фторурацил. Каждая группа содержала 10 мышей. Животных наблюдали в течение всего периода эксперимента до момента гибели последнего животного (32 дня), регистрируя их общее состояние. На рисунке 11Г. представлена общая диаграмма выживаемости мышей, участвующих в эксперименте.

Анализ кривых выживаемости Каплана-Мейера показал, что мыши, получавшие синтетический диациллипопептид M.arginini, хуже поддавались лечению химиотерапевтическим препаратом 5-фторурацил по сравнению с мышами, не получавшими R-Pam2. В группе мышей с химиотерапией последняя мышь пала на 33 день, в то время как мыши, одновременно с химиотерапией получавшие R-Pam2, пали уже на 26 день.

Данные по выживаемости мышей в эксперименте in vivo полностью подтвердили полученные ранее результаты на культурах клеток. Более того, как видно из диаграммы, мыши в группе с одновременным введением клеток WEHI-3B и R-Pam2 полностью пали уже на 19 день, в то время как мыши, не получавшие R-Pam2 пали на 25 день. Полученные результаты свидетельствуют о том, что внутримышечное введение R-Pam2 приводило к повышению скорости прогрессии опухолевого роста и сокращению сроков жизни мышей. Примечательно, что полученные данные в описанном эксперименте не согласовывались с результатами на культуре клеток, где добавление R-Pam2 в культуральную среду не приводило к повышению кинетики роста клеток WEHI-3B.

Рисунок 11. Влияние диациллипопептида M.arginini на пролиферацию и резистентность к химиотерапевтическим препаратам опухолевых клеток WEHI-3B

(А.) Макрофотографии органов мышей. Слева представлены макрофотографии селезенок, справа, участков печени с инфильтратами. K- группа интактных мышей, инъецированных ФСБ; R-Pam2- группа мышей, инъецированная диациллипопептидом R-Pam2; WEHI-3В группа мышей, с перевитыми опухолевыми клетками WEHI-3B; WEHI-3В+R-Pam2 - группа мышей, с перевитыми опухолевыми клетками WEHI-3B, инъецированная диациллипопептидом R-Pam2.

(Б.) Средняя масса селезенки. Селезенки извлекали из анестезированных мышей. Экспериментальные группы мышей идентичны описанным выше. Для определения средней массы использовали по 5 органов из каждой группы мышей.

(В.) Микрофотографии срезов печени. Извлеченные образцы печени помещали в 10% формалин для фиксации. Далее по стандартной методике образцы заключали в парафин, приготовленные срезы окрашивали гематоксилин-эозином.

(Г.) Диаграмма выживаемости мышей линии Balb/С. WEHI-3В K- группа мышей с внутрибрюшинным введением клеток WEHI-3B; WEHI-3В + R-Pam2 - группа мышей с внутрибрюшинным введением клеток WEHI-3B и внутримышечным введением R-Pam2; WEHI-3В + 5-Fu - группа мышей с внутрибрюшинным введением клеток WEHI-3B, получающие химиотерапевтический препарат 5-фторурацил; WEHI-3В + R-Pam2 + 5-Fu - группа мышей с внутрибрюшинным введением клеток WEHI-3B и внутримышечным введением R-Pam2, получающие химиотерапевтический препарат 5-фторурацил. (р<0,001 по лог-ранговому тесту).

Работа выполнена совместно с к.б.н. Щебляковым Д.В. [лаборатория молекулярной биотехнологии ФГБУ «НИИЭМ им. Н.Ф.Гамалеи» Минздравсоцразвития России]

Изучение влияния структурного компонента M.arginini (R-Pam2) на продукцию факторов, стимулирующих пролиферацию клеток мышиной миеломоноцитарной лейкемии WEHI-3B in vivo

Принимая во внимание основное отличие результатов экспериментов in vitro и in vivo по скорости роста клеток WEHI-3B в присутствии R-Pam2, мы предположили, что в организме экспериментальных животных после введения диациллипопептида M.arginini может происходить выработка факторов, которые являются существенными для пролиферации клеток WEHI-3B, тем самым определяя ускоренную кинетику их роста in vivo.

Для подтверждения выдвинутой гипотезы в эксперименте in vitro мы изучили влияние добавления к клеткам WEHI-3B сыворотки мышей, получавших R-Pam2 на скорость их пролиферации. Для этого мышам линии BALB/c внутримышечно вводили диациллипопептид M.arginini R-Pam2 в концентрации 5 мкг/мышь. Через 24 часа после инъекции у мышей проводили отбор крови для получения сыворотки. В качестве контроля использовали сыворотку мышей, получавших солевой фосфатный буфер. Полученные сыворотки использовали для приготовления 5% культуральной среды для клеток WEHI-3B (RPMI). Среды добавляли к клеткам WEHI-3B и высаживали на 96-луночный планшет в концентрации 103 клеток/лунку. Кинетику роста клеток определяли по накоплению клеточной биомассы в реакции с субстратом МТТ в течение 72 часов (рисунок 12).

Как видно из рисунка 12, добавление к клеткам WEHI-3B сыворотки крови мышей, получавших внутримышечно R-Pam2, способствовало увеличению скорости их пролиферации. Результаты, полученные в данном эксперименте, подтвердили сделанное ранее предположение о возможной выработке фактора, индуцирующего рост клеток мышиной миеломоноцитарной лейкемии в ответ на введение R-Pam2.

Рисунок 12. Кинетика роста клеток мышиной миеломоноцитарной лейкемии WEHI-3B при добавлении сыворотки мышей, получавших R-Pam2 (р<0,005)

На следующем этапе была предпринята попытка идентификации кандидатных факторов, способствующих усилению роста клеток WEHI-3B.

Для выполнения поставленной задачи нам был проанализирован спектр экспрессии хемокинов и цитокинов в организме животного в ответ на введение диациллипопептида M.arginini (рис.12А.). Мышам линии BALB/c внутримышечно вводили R-Pam2 в количестве 5 мкг/мышь. Далее, у мышей отбирали кровь и в полученной сыворотке методом проточной цитофлюориметрии с использованием набора FlowCytomix BenderMedsystems (Австрия) определяли концентрации 15 хемокинов и цитокинов (IL-1,2,4,5,6,10,17, ФНОа, ГМ-КСФ, MCP-1,3 MIP-1a,1b, RANTES, ИФН-гамма). На рисунке 13 представлены данные для цитокинов, уровень экспрессии которых изменялся в ответ на введение R-Pam2. Как видно из рисунка, в ответ на введение R-Pam2, изменялась экспрессия 8 из 15 исследованных цитокинов. Анализ литературных данных показал, что 5 из этих цитокинов– IL-6, MCP-1, MCP-3, RANTES, ФНОа, способны напрямую или опосредованно стимулировать опухолевый рост. Следует отметить, что полученные данные были ограничены только 15 измеряемыми цитокинами, тогда как на рост опухоли в организме может влиять значительно большее количество факторов. В связи с этим, для выявления дополнительных опухолестимулирующих факторов мы провели исследование in vivo в котором были определены органы, вовлеченные в ответ на системное циркулирование диациллипопептидов, а также проведен микроэррей-анализ для определения изменений в профиле экспрессии генов в ответ на действие микоплазменных антигенов. На первом этапе были использованы

Рисунок 13. Определение концентрации цитокинов в сыворотках крови мышей, инъецированных R-Pam2. Мышам линии BALB/C вводили диациллипопептид R-Pam2 или фосфатно-солевой буфер (ФСБ), после чего через 0,33; 0,66; 1, 2, 4, 6, 16, 24, 72 часа отбирали кровь и приготавливали сыворотку. Полученные образцы сыворотки использовали для определения уровня экспрессии цитокинов. Каждая точка представляет собой среднее значение из трех независимых повторов. На графике представлены данные соответствующие пиковой концентрации цитокинов – 1 или 4 часа после введения R-Pam2. *- Для MIP-1альфа и RANTES представлены значения концентраций соответствующие 4 и 6 часам после инъекции R-Pam2 - точкам появления и пика концентраций этих цитокинов в сыворотке крови

трансгенные мыши (полученные на основе линии Balb/C), содержащие в своем геноме NF-kB-зависимый промотер (промотер ген IkB) под контролем которого находится ген люциферазы. Мышам вводили синтетический диациллипопептид R-Pam2 (5мкг/мышь), после чего через указанные на рисунке 14А. интервалы времени, регистрировали биолюминисценцию (NF-kB-зависимую экспрессию люциферазы). Как видно из результатов в организме мышей развивался очень быстрый ответ, с максимумом активации NF-kB через 3 часа после введения R-Pam2. Для определения активности NF-kB в отдельных органах, трансгенным мышам вводили R-Pam2 после чего, через 1 и 3 часа, отбирали органы указанные на рисунке 14Б. Из отобранных органов приготавливали экстракт, после чего в экстрактах нормализованных по концентрации белка (30 мкг белка на реакцию), определяли уровень активности NF-kB. Полученные данные показали, что введение R-Pam2 вызывает достоверную активацию NF-kB во всех отобранных органах (см.рис.14В.). То есть, из полученных результатов можно сделать заключение, что диациллипопептиды способны оказывать системное действие на организм. В дополнительных экспериментах (данные не приводятся) было показано, что активация NF-kB также наблюдается в поджелудочной железе, лимфоузлах, незначительно, в костном мозге и мышцах. Практически не детектируемый уровень активации NF-kB наблюдался в образцах мозга и кожи. Следует отметить, что наибольшая активация NF-kB была обнаружена в двух органах - селезенке и печени. Наблюдаемая активность NF-kB в печени и селезенке хорошо согласуется с данными по метастазированию клеток WEHI-3B именно в эти органы.

На следующем этапе исследования для выявления дополнительных факторов, способных влиять на прогрессию опухоли мы определили, каким образом меняется спектр экспрессии генов в ответ на введение R-Pam2. Для этого была использована линия мышей Balb/C. Мышам вводили R-Pam2 (5 мкг/мышь) после чего через час отбирали образцы печени. Точка отбора образцов (1 час) для определения профиля экспрессии мРНК была выбрана с учетом того, что максимум NF-kB-зависимой экспрессии люциферазы (белка) приходится на 3 часа после введения R-Pam2. Выбор печени в качестве исследуемого органа был обусловлен тем, что она является (наряду с селезенкой) наиболее респонсивным в отношении P-Pam2 органом. Кроме того, печень является еще и самым крупным органом, а следовательно, ее активация может иметь наибольшее значение для организма в целом.

Отобранные образцы печени передавали в специализированной подразделение Института рака Розвелла Парка, где с использованием микрочипов фирмы Illumina, Inc (США) производилось полногеномное исследование изменения экспрессии генов. Проведенный анализ полученных результатов показал, что введение в организм диациллипопептида микоплазмы R-Pam2 повышает более чем 2 раза экспрессию свыше 3000 генов, экспрессия более чем 500 из этих генов

повысилась в 5-400 раз.

Ниже в таблице 2 приведен перечень генов, экспрессия которых способна позитивно влиять на рост опухоли. Кроме того, в таблицу внесены гены, участвующие в развитии провоспалительных и антиапототических реакций, которые также опосредовано могут быть важны для опухолевой прогрессии.

Рисунок 14. Влияние диациллипопептидов микоплазм на активность транскрипционного фактора NF-kB в различных органах мышей.

(А.) Изменение активности NF-кВ в трансгенных мышах в зависимости от времени.

Трансгенным мышам подкожно вводили 5 мкг R-Pam2 или в качестве контроля фосфатно-солевой буфер (ФСБ). Далее, непосредственно перед измерением уровня NF-kB-зависимой экспрессии люциферазы, мышам внутрибрюшинно вводили 20 мкг люциферина. Через 5 минут после введения опытных и контрольных мышей анестезировали изофлюраном и помещали в специальный детектор биолюминисценции (Xenogene, USA), где через указанные на рисунке интервалы времени определяли активность люциферазы

(Б.) Схема отбора органов из трансгенных мышей.

Трансгенных мышей анестезировали изофлюраном, производили цервикальную дислокацию и отбирали указанные на рисунке органы в пробирки, помещенные в сухой лед.

(В.) NF-kB-зависимая экспрессия люциферазы в органах трансгенных мышей, инъецированных диациллипопептидами микоплазмы.

Помещенные в сухой лед органы, переносили в лед, добавляли ФСБ, содержащий коктейль протеазных ингибиторов и гомогенизировали. Гомогенаты (супернатанты) использовали для определения активности люциферазы.

Данные микроэррей-анализа, объединенные с данными определения спектра цитокинов, показывают, что введение R-Pam2, приводит к синтезу в организме целого ряда белков, для которых показана опухолестимулирующая

активность: MCP-1, MCP-3, Gro1, RANTES, IL-1, IL-6, ФНОа, S100A9, SAA1, SAA3 и др. По-видимому, именно совокупное действие перечисленных факторов способствует более быстрому росту опухолей WEHI-3B in vivo.

Таблица 2. Изменение экспрессии провоспалительных и антиапоптотических белков в клетках печени в ответ на введение R-Pam2.

Краткое название гена	Полное название гена	Изменение уровня экспрессии, разы
Цитокины: CXCL1 (GRO1) CXCL10 (IP10) CXCL2 (GRO2 CXCL9 (MIG) CCL4 (MIP-1-beta) CCL7 (MCP-3) IL1A IL1B TNFа	хемокин, содержащий (C-X-C мотив) 1 хемокин, содержащий (C-X-C мотив) 10 хемокин, содержащий (C-X-C мотив) 2) хемокин, содержащий (C-X-C мотив) 9 хемокин, содержащий (C-C мотив) 4 хемокин, содержащий (C-C мотив) 7 интерлейкин 1 альфа интерлейкин 1 бета Фактор некроза опухоли альфа	39.8 36.1 54.4 3.4 226.7 118.2 23.4 62.1 174.0
Паттерн-распознающие и их адаптерные молекулы: TLR2 FCNA NOD1 SAA1 SAA3 CD14 MYD88	Толл-подобный рецептор 2 Фиколин Нуклеотид-связывающий и содержащий домен олигомеризации белок Сывороточный амилоид А1 Сывороточный амилоид А3 Молекула CD14 Ген первичного ответа миелоидной дифференцировки(88)	4,3 2,9 2.0 3.1 5.5 41.4 192.9
Антимикробные белки CFP HC LCN2 S100A8 S100A9	Фактор комплемента пропердин Гемолитический комплемент Липокалин 2 S100 кальций-связывающий белок А8 S100 кальций-связывающий белок А9	3.0 2.9 444.6 65.6 14.8
Антиапоптотические белки IER3 MCL1 Bcl2 BclXl BCL2A1B BCL2A1D SUPV3L1	Белок немедленно раннего ответа 3 Миелоидных лейкозных клеток последовательность 1 B-клеточная лейкемия/лимфома 2 (Bcl2) Bcl2-родственный белок Xl Bcl2-родственный белок А1В Bcl2-родственный белок А1D Супрессор var1, 3-подобный 1	17.7 1.9 1,5 1,7 14.7 3.3 2.9

Возможно, что опухолестимулирующим действием могут обладать и другие белки, продукция которых меняется в ответ на введение R-Pam2, однако в доступной научной литературе мы не обнаружили данных, подтверждающих участие этих белков в опухолевой прогрессии. Таким образом, обобщив полученные результаты, мы можем сделать вывод, что введение R-Pam2 в организм может оказывать прямое и опосредованное действие на клетки опухоли. Опосредованное действие связано с непрямым влиянием R-Pam2 на клетки опухоли, которое реализуется через TLR2-зависимую индукцию факторами, изменяющих пролиферативный потенциал опухолевых клеток и влияющих на их инвазивные свойства. В свою очередь, прямой эффект R-Pam2 связан с TLR2-зависимой активацией NF-kB и увеличением резистентности опухолевых клеток к химиотерапевтическим препаратам. При этом индукция NF-kB в клетках опухоли не измененяет их митогенную активность. Кроме того, мы показали, что сами клетки WEHI-3B в ответ на обработку R-Pam2 увеличивают экспрессию двух цитокинов - ФНОа и ИЛ-6, которые способны стимулировать опухолевую прогрессию (см. приложение 2).

Работа выполнена совместно с к.б.н. Щебляковым Д.В. [лаборатория молекулярной биотехнологии ФГБУ «НИИЭМ им. Н.Ф.Гамалеи» Минздравсоцразвития России].

Активация NF-KB ассоциирована с подавлением транскрипционной активности р53.

Проведенные нами исследования показали, что микоплазменная инфекция способна модулировать активность двух важных транскрипционных факторов р53 и NF-kB клетки-хозяина, изменяя тем самым целый ряд клеточных реакций. Исходя из существующих данных об антагонизме двух этих факторов (p53 и NF-kB) у нас возникло предположение, что активация транскрипционного фактора NF-kB в клетках через TLR2-сигнальный путь может быть сопряжена с подавлением активности р53. Для проверки этого предположения нами методом лентивирусной трансфекции были получены клетки на основе линии MCF-7, которые, одновременно, несут р53- и NF-kB-респонсивные элементы. При этом под контролем р53-респонсивного элемента находится ген b-галактозидазы, а под контролем NF-kB-зависимого промотера ген люциферазы. Кроме этого, как было показано ранее (см. Рисунок) данные клетки экспрессируют специфические Толл-подобные рецепторы для диациллипопептидов микоплазм.

Для того, чтобы исключить сложные воздействия, которые могут быть связаны с микоплазменной инфекцией, в эксперименте для активации NF-kB использовались только диациллипопептиды (R-Pam2). Эксперимент проводился по следующей схеме. Клетки MCF-7 обрабатывали разными концентрациями цисплатины, через 2 часа к обработанным клеткам добавляли R-Pam2 концентрации 1 мкг/мл. Через 18 часов проводилось определение уровня активности NF-kB и р53. Из представленных на рисунке 42 результатов видно, что добавление R-Pam2 вызывало мощную активацию NF-kB в клетках MCF-7. При этом повышение активности NF-kB, как и предполагалось, было ассоциировано с достоверным снижением активности р53 (р<0,05).

Таким образом, полученные нами результаты позволили сделать заключение о том, что подавление активности р53 в инфицированных миколазмой клетках может быть сопряжено только с активацией NF-kB, вызванной контактом структурных компонентов миколазмы с рецептором TLR2, без вовлечения дополнительных механизмов.

Рисунок 15. Активация NF-kB ассоциирована с подавлением активности р53.

Голубые столбцы – клетки, обработанные R-Pam2, фиолетовые столбцы - контрольные клетки. Верхний график отражает активацию NF-kB (активность люциферазы), нижний график – р53 (активность b-галактозидазы). Для активации р53 к клеткам добавляли различные концентрации ДНК-повреждающего агента цисплатины (10-100 мкМ).

Сформулированный вывод, однако, может быть верен только для клеток, экспрессирующих функиональный TLR2. Полученные результаты не объясняют подавления активности р53 в клетках не экспрессирующих TLR2 и не отвечающих активацией NF-kB в ответ на микоплазменную инфекцию, таких как, например, HCT-116.

Работа выполнена совместно с к.б.н. Тухватулиным А.И. [лаборатория молекулярной биотехнологии ФГБУ «НИИЭМ им. Н.Ф.Гамалеи» Минздравсоцразвития России].

Персистенция микоплазм в опухолях простаты

В ходе проведенных исследований нами было показано, что микоплазменная инфекция способствует трансформации клеток и увеличивает их выживаемость в стрессорных условиях. То есть, полученные результаты, вкупе с опубликованными данными, позволяют сделать заключение, что микоплазменная инфекция может выступать в качестве опухолепромотирующего агента. При этом, следует отметить, что все исследования подтверждающие это предположение, были проведены только в модельных экспериментах на животных и, на сегодняшний день, работы, которые бы доказывали ассоциацию микоплазменной инфекции с опухолевыми или предопухолевыми заболеваниями человека в научной литературе отсутствуют. В связи с чем, целью нашего следующего исследования было попытаться обнаружить подобную взаимосвязь.

Для определения ассоциации микоплазменной инфекции с раком простаты мы проскринировали методом ПЦР 250 образцов ткани простаты, полученных от 125 больных с подозрением на рак простаты (схема исследования см. На Рис 16А.). В ходе скрининга было проведено детектирование трех основных видов микоплазм, наиболее часто обнаруживаемых в урогенитальном тракте человека- M. hominis, M. genitalium и U. urealitycum. Параллельно, для всех 125 пациентов было проведено гистопатологическое исследование (ММА Сеченова, кафедра урологии), согласно которому был поставлен определенный диагноз: доброкачественная гиперплазия простаты (ДГП); простатическая интраэпителиальная неоплазия низкой или высокой степени (ПИН); рак простаты.

Каждый ПЦР-анализ проводился с одновременной детекцией последовательности ДНК, специфичной для микоплазмы и последовательности специфичной для ДНК человека (внутренний контроль, подтверждающий качество выделения ДНК из ткани простаты). На рисунке В. представлены репрезентативные результаты детекции ДНК микоплазмы в ткани простаты методом ПЦР. Верхняя полоса в треке (755 п.о.) – продукт амплификации ДНК человека (ген бета-актина), нижняя полоса – специфический продукт (342 п. о.), амплифицированный с ДНК (16S РНК) M. hominis. Результат амплификации, визуализированный в гель-электрофорезе показывает, что образцы, нанесенные в 5,6,8 треки, положительны по ДНК M. hominis, тогда как образцы 3,4,7 – отрицательны.

Анализируя аналогичным образом оставшиеся образцы (250 шт.), мы обнаружили, что в биоптатах 27 из 125 пациентов (21.6%) с предположительным диагнозом рак простаты, хотя бы в одном из образцов (биоптаты из правой или левой доли простаты) содержалась ДНК тестируемых видов микоплазм. Частота обнаружения видов микоплазмы представлена на рисунке 16Б. Среди исследованных видов, наиболее часто детектируемой была M. hominis

Эта микоплазма была выявлена у 19 из 125 пациентов (15.2%), тогда как M. genitalium и U. urealitycum были детектированы только у 5.6% и 0.8% пациентов, соответственно. Параллельно мы показали, что образцы ткани простаты не были контаминированы данными видами микоплазмы, как компонентами ректальной микрофлоры. Ни один из трех видов микоплазм не был диагностирован в ректальных мазках.

Для подтверждения присутствия микоплазмы в ткани простаты независимым методом были произведены высевы образцов ткани простаты на селективные для M. hominis и U. urealyticum среды, обогащенные аргинином. Высевы на M. genitalium не производились в связи с трудностями ее культивирования. Было обнаружено, что при высеве, частота встречаемости U. urealitycum была схожей с частотой ее обнаружения при использовании ПЦР (0.8%). Однако, частота обнаружения of M. hominis при использовании метода высева (6.3 %) была снижена по сравнению с ПЦР (15.2%). Полученная разница может иметь несколько объяснений. Наиболее вероятным представляется то, что метод высева имеет более низкую чувствительность (вследствие того, что патогенные микроорганизмы с разной эффективностью способны приспосабливаться к условиям культивирования in vitro). Другим объяснением может являться то, что в некоторых случаях мы могли детектировать методом ПЦР ДНК погибших микоплазм. Несмотря на разницу в чувствительности двух используемых методов, полученные результаты подтверждают присутствие в образцах простаты жизнеспособной микоплазмы, то есть подтверждают наличие инфекционного процесса в простате.

На следующем этапе 125 пациентов были сгруппированы в соответствии с их диагнозом (гистопатологическая оценка): (1) доброкачественная гиперплазия простаты (ДГП), (2) простатическая интраэпителиальная неоплазия низкой степени (ПИН НС), (3) простатическая интраэпителиальная неоплазия высокой степени (ПИН ВС), (4) рак простаты. Результаты ПЦР анализа для M. hominis и M. genitalium были разделены в соответствии с диагнозами (см. Табл. 3). Данные для U. urealitycum не представлены, так как данная микоплазма обнаруживалась крайне редко.

Рисунок 16. Детекция микоплазмы в ткани простаты методом ПЦР.

(А.) Схема проводимого исследования,

(Б.) Частота детекции трех видов микоплазм в биоптатах простаты

(В.) Детекция ДНК M. hominis в ткани простаты. ДНК, экстрагированная из биоптатов простаты была использована для детекции ДНК M. hominis (16S рРНК ген). Для внутреннего контроля была амплифицирована последовательность гена -актина человека. 1 – отрицательный контроль реакции; 2 – отрицательный контроль чистоты экстракции ДНК; 3-7 – образцы ДНК, выделенной из биоптатов простаты пациентов с подозрением на рак простаты. 8 – положительный контроль (ДНК человека, смешанная с ДНК M. hominis); 9 –ДНК-маркер

Диагноз	Количество пациентов	M.hominis-положительные	M.genitalium-положительные	M.hominis- и M.genitalium-положительные
ДГП	30	2 (6,7%)	1(3,3%)	3(10%)
ПИН НС	14	1 (7,1%)	1 (7,1%)	2(14,3%)
ПИН ВС	23	3 (13%)	0(0%)	3(13%)
Рак простаты	58	13 (22,4)	5(8,6%)	18(31%)
Общее количество	152	19 (15,2%)	7(5,6%)	26(20,8%)

Для анализа полученных данных мы объединили в одну группу пациентов с доброкачественными изменениями простаты (ДГП и ПИН НС), в другую группу были включены пациенты с диагнозами ПИН ВС (состояние с высокой вероятностью переходящее в рак простаты) и раком простаты. Из 81 пациента с диагнозом ПИН ВС и рак простаты 21 (25.9%) были позитивными по M. hominis or M. genitalium. Большинство из этих пациентов были инфицированы M. hominis (16 из 81). При этом в данной группе M. hominis была детектирована в 3-раза чаще (20%), чем в группе ДГП и ПИН НС (6.8%). Если проанализировать полученные данные по встречаемости ПИН ВС и рака простаты в M. hominis-позитивных и M. hominis-негативной группе, то ассоциация между микоплазменной инфекцией и раком простаты становится еще более очевидной. 84.2% M. hominis-позитивных пациентов имели диагноз ПИН ВС и рак простаты, тогда как M. hominis-негативные пациенты имели подобные диагнозы в 57.6% (p=0.033).

Таким образом, результаты проведенного ПЦР-скрининга образцов простатной ткани на предмет присутствия в ней ДНК микоплазм, показывают, что данная ткань бывает часто инфицирована M. hominis и эта инфекция преобладает у пациентов с диагнозом ПИН ВС и рак простаты по сравнению с пациентами, имеющими доброкачественные изменения в простате.

Для независимого подтверждения наличия у пациентов микоплазменной инфекции, дополнительно к детекции ДНК M.hominis методом ПЦР, мы определяли присутствие в сыворотке больных специфических по отношению к M. hominis IgG антител. Сыворотки были получены от 118 пациентов. Полученные сыворотки использовались для ИФА-анализа, предназначенного для детекции IgG антител, специфичных к рекомбинантному белку р120 M. hominis. Как видно из данных представленных на рисунке 38 35% и 44,8% ПИН ВС и раком простаты были позитивны по присутствию антител к M. hominis. При этом в группах с ДГП и ПИН НС было детектировано только 19% позитивных по антителам к микоплазме пациентов. Корреляция между частотой позитивных по ИФА пациентов в группе ПИН ВС/рак по сравнению с группой ДГП/ПИН НС была статистически достоверной (р=0.042).

Рисунок 16. Определение IgG антител, специфичных к M. hominis в сыворотке крови пациентов с подозрением на рак простаты.

Образцы сыворотки крови от 118 пациентов с различными диагнозами были исследованы методом ИФА. Было обнаружено 10 позитивных пациентов с диагнозами ДГП/ПИН НС, 13 с диагнозом ПИН ВС и 13 с диагнозом рак простаты.

В большинстве случаев данные ИФА совпадали с результатами ПЦР в реальном времени. Для 75% пациентов проанализированных обоими методами были получены одинаковые результаты (положительные или отрицательные в отношении M. hominis). В 25% случаев результаты двух методов разнились, что, по-видимому, объясняется различиями биологических материалов, используемых для анализов, и разной чувствительностью методов.

Таким образом, полученные с использованием метода ИФА результаты подтверждают наличие микоплазменной инфекции у пациентов с опухолями простаты.

Работа выполнена совместно с сотрудниками кафедры урологии ММА им. И.М. Сеченова д.м.н. Винаровым А.З. д.м.н. Аляевым Ю.Г., к.м.н. Фиевым Д.Н., и сотрудником лаборатории молекулярной биотехнологии ФГБУ «НИИЭМ им. Н.Ф.Гамалеи» Минздравсоцразвития России к.б.н. Барыковой Ю.А.

ВЫВОДЫ

1. Впервые была показана способность микоплазм ингибировать активность транскрипционного фактора р53.
2. Проведено полногеномное исследование изменения экспрессии генов в клетках HCT-116 инфицированных микоплазмой. Показано, что в этих клетках снижена экспрессия таких известных р53-респонсивных генов как BTG-2, p21 Cip1, TP53I3, MDM2, ATF3, Fas.
3. Впервые показана способность M.arginini активировать транскрипционный фактор NF-kB в результате взаимодействии со следующими сочетаниями Толл-подобных рецепторов 2/6, 2/CD14, 1/2.
4. Установлено, что TLR2-зависимая активация NF-kB микоплазмами и их структурными компонентами способствует подавлению апоптоза и увеличению выживаемости опухолевых клеток (на 25-30%) при действии на них химиотерапевтических препаратов.
5. Впервые показано, что TLR-зависимая активация NF-kB в инфицированных микоплазмой клетках является одной из причин снижения транскрипционной активности р53.
6. На модели мышиной миеломоноцитарной лейкемии WEHI-3B в эксперименте in vivo впервые была показана способность M.arginini и ее структурных компонентов (диациллипопептидов) повышать пролиферацию и устойчивость к действию химиотерапевтических препаратов опухолевых клеток, экспрессирующих Толл-подобный рецептор 2.
7. В результате полногеномного исследования изменения экспрессии генов определен возможный механизм опухолестимулирующего действия микоплазменных диациллипопептидов. Показано, что введение синтетического диациллипопептида микоплазм вызывает индукцию более 3000 генов, среди которых обнаружены гены MCP-1, MCP-3, Gro1, RANTES, IL-1, IL-6, ФНОа, S100A9, SAA1, SAA3, продукты которых обладают опухолестимулирующей активностью.
8. Проведено эпидемиологическое исследование, которое выявило взаимосвязь микоплазменной инфекции (M.hominis) с раком простаты. Показано, что M. hominis была детектирована в 3 раза чаще у пациентов с раком простаты по сравнению с пациентами, имеющими доброкачественные изменения в простате.
9. Впервые было изучено влияние микоплазменной инфекции на изменение метаболического профиля. Было показано, что в инфицированных микоплазмой клетках более чем в 2,5 раза снижается внутриклеточное содержание пролина.

Список опубликованных работ

1. Logunov DY, Ilyinskaya GV, Cherenova LV, Verhovskaya LV, Shmarov MM, Chumakov PM, Kopnin BP, Naroditsky BS. Restoration of p53 tumor-suppressor activity in human tumor cells in vitro and in their xenografts in vivo by recombinant avian adenovirus CELO-p53.//Gene Ther. – 2004. - 11(1) - С.79-84
2. Д.Ю. Логунов, Л.В. Черенова, М.М. Шмаров, Е.В. Шашкова, Л.В. Верховская, К.К. Доронин, Б.С. Народицкий In vitro и in vivo доставка гена секретируемой плацентарной щелочной фосфатазы (SEAP) в составе рекомбинантного аденовируса птиц CELO. // Молекулярная генетика, микробиология и вирусология.- 2002.- №3.- С.34-9
3. Логунов Д. Ю., Ильинская Г.В., Черенова Л.В., Шмаров М.М., Копнин Б.П., Народицкий Б.С. Восстановление транскрипционной активности опухолевого супрессора р53 в различных опухолевых клетках человека посредством рекомбинантных аденовирусов Ад-р53 и CELO-p53. // "Русский журнал ВИЧ/СПИД и родственные проблемы", 2004.-Т.8,- №2,-С.34
4. Логунов Д.Ю., Народицкий Б.С., Гинцбург А.Л., Воробьев А.А. Генетические Вакцины. //Вестник РАМН. – 2005. - №1- С.14-19
5. Логунов Д.Ю., Народицкий Б.С., Гинцбург А.Л. Разработка системы скрининга для определения специфичности и функциональной активности иммуномодуляторов. // Тезисы докладов Всероссийской научно-практической конференции «Вакцинология 2006. Совершенствование иммунобиологических средств профилактики, диагностики и лечения инфекционных болезней». – Москва.- 2006. – С.58
6. Логунов Д.Ю., Щебляков Д.В., И.В. Раковская, Народицкий Б.С., Гудков А.В., Гинцбург А.Л. Роль Толл-подобных рецепторов в повышении резистентности клеток млекопитающих, хронически инфицированных микоплазмой, к различным проапоптотическим стимулам. // Тезисы IX конгресса Всероссийского научно-практического общества эпидемиологов, микробиологов и паразитологов. Москва - 2007. – С.114-115
7. Д.Ю.Логунов, Б.С.Народицкий, А.Л. Гинцбург. Молекулярно-генетические технологии защиты от патогенов. // Ремедиум. – 2007. - №3- С. 20-24.
8. DY. Logunov, OV. Zubkova, AS. Karyagina-Zhulina, MM Shmarov, EA. Shuvalova, AP. Karpov.Identification of HI-like loop in CELO adenovirus fiber for incorporation of receptor-binding motifs. // J. Virol. – 2007. -81(18). - С. 9641-52.
9. Logunov D., Scheblyakov D., Zubkova O., Shmarov M., Rakovskaya I., Gurova K., Tararova N., Burdelya L., Naroditsky B., Ginzburg A., Gudkov A. Mycoplasma infection suppresses p53, activates NF-B and cooperates with oncogenic Ras in rodent fibroblast transformation. // Oncogene. – 2008. - 27(33) - С.4521-31
10. Проскуряков С.Я., Коноплянников А.Г., Коноплянникова О,А, Цыб А.Ф., Логунов Д.Ю., Народицкий Б.С., ГинцбургА.Л. Влияние грам-положительных микроорганизмов и их продуктов на выживаемость гемопоэтических клоногенных клеток in vivo. // Бюллетень экспериментальной биологии и медицины. - 2008. - Т.145. - №4. - С.441-446
11. Щебляков Д.В., Логунов Д.Ю., Зубкова О.В., Шмаров М.М., Раковская И.В, Народицкий Б.С. Гинцбург А.Л., Гудков А.В Микоплазменная инфекция (M.arginini) ведет к конститутивной активации NF-kB и подавлению апоптоза в клетках, экспрессирующих Толл-подобные рецепторы TLR2/6. //Молекулярная генетика, микробиология и вирусология.- 2008. - №4. - 6-10.
12. Логунов Д.Ю., Щебляков Д.В., Шмаров М.М. и соавторы Липид-ассоциированные мембранные белки M.arginini активируют NF-kB, взаимодействуя с TLR2/1, TLR2/6 и TLR2/CD14. // Молекулярная генетика, микробиология и вирусология. - 2009 г. - №2. - С. - 25-28
13. Проскуряков С.Я.,Логунов Д.Ю.,и соавторы. Стволовые клетки кишечного эпителия. Механизмы выживаемости и роль микробиоты. //Биомедицинская химия. - 2009. - 145(4) – С. 460-3.
14. А.З. Винаров, Ю.Г.Аляев, Д.Н.Фиев, Ю.А.Барыкова, Н.А.Винарова, Д.Ю.Логунов, М.М.Шмаров, Б.С.Народицкий, А.В.Гудков, А.Л.Гинцбург Микоплазменная инфекция предстательной железы человека и ее возможная роль в патогенезе рака простаты. // Андрология и генетальная хирургия. – 2009. - №4.- С.18-22
15. Семенова И.Б., Ванеева Н.П., Курбатова Е.А., Народицкий Б.С., Свешников П.Г., Логунов Д.Ю., Воробьев Д.С.. Оценка протективного действия рекомбинантной конструкции белка теплового шока с липополисахаридом против инфекции Salmonella typhimurium у мышей. // Журнал микробиологии, эпидемиологии и иммунобиологии. - 2009.-№3.- С.38-41
16. Ю.Г.Аляев, Б.С.Народицкий, А.В.Гудков, А.З. Винаров, Д.Ю.Логунов, М.М.Шмаров, Ю.А.Барыкова, Н.А.Винарова, Д.Н.Фиев. Новое о микоплазменной инфекции простаты и раке предстательной железы. // Тезисы Российской научной конференции с международным участием «Фундаментальные исследования в уронефрологии. - Москва - 2009. – С.23.
17. А. И. Тухватулин, Д. Ю. Логунов, М. М. Шмаров, Мороз А.Ф., Б. С. Народицкий. Поиск эффективных молекулярных адъювантов с использованием эукариотической тест-системы, созданном на основе клеток, экпрессирующих различные наборы Толл-подобных рецепторов. // Тезисы докладов IV Российского симпозиума «Белки и пептиды». - Казань - 2009. – С. 353
18. А.И. Тухватулин, Д.Ю. Логунов,Д.Н. Щербинин, М.М. Шмаров, Б.С. Народицкий, А.В. Гудков, А.Л. Гинцбург. Toll-подобные рецепторы и их адапторные молекулы. // Биохимия – 2010. - Т.75 - С. 1224 – 1243
19. Ю.Г.Аляев, А.З. Винаров, Д.Н.Фиев, Ю.А.Барыкова, Н.А.Винарова, Д.Ю.Логунов, М.М.Шмаров, Б.С.Народицкий, А.В.Гудков, А.Л.Гинцбург. Возможно ли влияние микоплазменной инфекции на патогенез рака предстательной железы. // Онкоурология. – 2010. – С. 128-32,
20. Ю.А.Барыкова, М.М.Шмаров, Д.Ю.Логунов, Ю.Г.Аляев, Д.Н.Фиев, А.З. Винаров, Н.А.Винарова, И.В.Раковская, Б.С.Народицкий, А.В.Гудков, А.Л.Гинцбург. // Идентификация микоплазм у больных с подозрением на рак простаты. Журнал микробиологии эпидемиологии и иммунобиологии. 2010. - №4. – С.81-85
21. Д. В. Щебляков, Д. Ю. Логунов, А. И. Тухватулин, М. М. Шмаров, Б. С. Народицкий, А. Л. Гинцбург. // Тoлл-подобные рецепторы (TLR) и их значение в опухолевой прогрессии. Acta naturae. - Т. 2 - № 3 (6) - 2010. С. 14-23
22. Tutykhina IL, Logunov DY, Shcherbinin DN, Shmarov MM, Tukhvatulin AI, Naroditsky BS, Gintsburg AL. // Development of adenoviral vector-based mucosal vaccine against influenza. J Mol Med. - 2010.