Экологические проблемы биодеградации полиуретана в различных почвенных условиях
На правах рукописи
Мирошниченко
Ирина Ивановна
ЭКОЛОГИЧЕСКИЕ ПРОБЛЕМЫ
БИОДЕГРАДАЦИИ ПОЛИУРЕТАНА В РАЗЛИЧНЫХ
ПОЧВЕННЫХ УСЛОВИЯХ
03.02.08 - Экология
Автореферат диссертации на соискание ученой степени кандидата
биологических наук
Петрозаводск
2011
Работа выполнена в Российской Военно - медицинской академии
им. С.М. Кирова МО РФ, г. Санкт-Петербург
Научный руководитель: доктор биологических наук
Зачиняева Анна Владимировна
Официальные оппоненты: доктор сельскохозяйственных наук
Федорец Наталья Глебовна
кандидат биологических наук
Тимейко Лидия Владимировна
Ведущая организация: Вологодский государственный педагогический университет
Защита состоится 16 февраля 2011 года в 14 часов на заседании диссертационного совета Д 212.190.01 при Петрозаводском государственном университете по адресу: 185910, Республика Карелия, г. Петрозаводск, пр. Ленина 33, эколого-биологичсеский факультет
С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Петрозаводского государственного университета. Электронная версия автореферата размещена на официальном сайте
http: // www.petrsu.ru.
Автореферат разослан «16» января 2011 года
Ученый секретарь диссертационного совета, И.М. Дзюбук
кандидат биологических наук
1 ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ
Актуальность темы. За последнее десятилетие спрос
на синтетические полимерные материалы на мировом рынке увеличился более чем на порядок. Емкость российского рынка пластмассовых изделий составила в 2008 г. 4.1 млн. т, а объём производства полиуретана
по аналитическим прогнозам в 2010 г. может составить от 300 до 500 тыс. т.
Такой прогноз вызывает обоснованную тревогу, так как человечество пока не пришло к однозначному решению вопроса: как утилизировать
и перерабатывать полимерные отходы, не причиняя вреда окружающей природной среде.
Стоимость полимерных материалов достаточна высока, поэтому полимерные отходы рассматриваются сейчас как ценные синтетические продукты, подлежащие материальному рециклингу, то есть переработка
с получением исходных полимеров, наполнителей, армирующих элементов, мономеров, других химических соединений.
Перспективным на сегодняшний день считается создание смесевых композитов на основе синтетического полимера, в объём которого включен природный полимер или отходы сельскохозяйственной и пищевой промышленности.
Создатели этих новых биоразлагаемых полимеров не прогнозируют картину разрушения оставшейся, после биодеструкции природной составляющей композита, синтетической матрицы в результате
её компостирования. Нет чёткого представления о динамике разрушения синтетического полимера микроорганизмами-биодеструкторами в условиях природной среды. Кроме того, отсутствует экологическая оценка влияния полимеров на почвенные биоценозы. Биотическая концепция экологического контроля базируется на фундаментальных трудах С. С. Шварца (1980),
Г. В. Добровольского (1986), Д. Г. Звягинцева (1987) и др. В результате техногенного изменения биоценозов микробиота сама становится фактором риска для здоровья населения. К числу безусловных факторов риска можно отнести биологические факторы аллергизации человека.
В этой связи исследование процессов биодеструкции полиуретана в условиях природной среды приобретает особую актуальность.
Цель работы. Оценка интенсивности биодеструкции синтетического полимера на примере полиуретана в почве и целесообразности его утилизации путем компостирования с точки зрения экологической безопасности.
Задачи исследования.
- Исследовать механизм биоповреждения полиуретана почвенными микроорганизмами.
- Изучить динамику видового состава микроорганизмов в процессе инкубации полимера в почвах различного зонального ряда; определить доминирующие виды почвенных микроорганизмов, развивающихся на поверхности полиуретана.
- Исследовать факторы патогенности микробиоты, выделенной
с поверхности полимера. - Провести оценку экологической безопасности утилизации полиуретана путём его компостирования.
Научная новизна работы. Впервые проведены исследования биодеградации полиуретанов линейного и трёхмерного строения в почвах различного зонального ряда.
Установлена более высокая степень разложения полиуретанов линейного строения за счёт распада гидролитически нестойких связей
в полимере.
Впервые представлена характеристика микробных сообществ почв (более 100 видов) различного зонального ряда и установлено изменение структурно-фунциональной организации микробных сообществ в почвах
в результате компостирования полимеров.
Идентифицированы микроорганизмы, участвующие в процессе обрастания и биоповреждения полиуретанов.
Практическая значимость и реализация результатов работы. На основании проведённых исследований доказано, что исследование процесса утилизации полиуретанов путём компостирования невозможно без понимания роли почвенных микроорганизмов в этих процессах. Показана нецелесообразность этого способа утилизации с точки зрения экологической безопасности.
Теоретические разработки и практические рекомендации исследо-вания используются в учебном процессе кафедр: микробиологии, гигиены, эпидемиологии и в научных исследованиях Ботанического института
им. В.Л. Комарова, НИИЦ (МБЗ) ГНИИИ ВМ МОРФ. Работа выполнена
в соответствии с тематическими планами научно - исследовательской работы ГВМУ МО РФ: «Исследование проблем экологической безопасности ВС РФ в мирное и военное время» 2. 07. 104. п. 7 «Антиквар».
Апробация работы. Основные результаты доложены и обсуждены
на пятом Всероссийском конгрессе по медицинской микологии (Москва, 2007), на втором съезде микологов России (Москва, 2008),
на междисциплинарном микологическом форуме (Москва, 2009),
на заседании Микробиологического общества института им. Пастера
(СПб, 2009).
Личное участие автора в получении научных результатов. Личный вклад автора состоит в постановке и проведении экспериментов, статистической обработке полученных данных, их интерпретации
и обобщении.
Публикации. По материалам диссертации опубликовано 9 работ,
из них 4 статьи в ведущих рецензируемых научных журналах.
Структура и объем диссертации. Диссертация изложена
на 135 страницах машинописного текста, состоит из введения, 4 глав, заключения и выводов, включает 16 таблиц и 37 рисунка. Список цитируемой литературы насчитывает 136 наименований, из которых
52 - на иностранных языках.
Положения, выносимые на защиту:
- Полной биодеструкции полиуретана линейного и трёхмерного строения не происходит независимо от зональности почв.
- Компостирование полимера в почвах приводит к структурному изменению микробных сообществ, доминированию видов с выраженными фитотоксическими свойствами и представляющими риск для здоровья людей.
- Компостирование полиуретана нецелесообразно в виду его низкой деструкционной активности и возникновения риска формирования устойчивого источника инфекций.
Благодарности. Выражаю глубокую признательность своему научному руководителю доктору биологических наук, профессору Анне Владимировне Зачиняевой. Благодарю профессора кафедры техносферной
и экологической безопасности ПГУПС, доктора химических наук Ярослава Васильевича Зачиняева за консультации, ценные советы и поддержку. Благодарю заведующую лабораторией биохимии почв биолого-почвенного факультета СПбГУ, к.с-х.н. Марину Алексеевну Надпорожскую, старшего научного сотрудника лаборатории систематики и географии грибов Ботанического института им. В.Л. Комарова РАН (БИН РАН), к.б.н. Елену Валентиновну Лебедеву за замечания и рекомендации. Большое спасибо родным и близким за всестороннюю помощь и моральную поддержку.
2 СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ
Во введении обосновывается актуальность работы, сформули-рованы цели и основные задачи исследования, кратко охарактеризованы научная новизна и практическая значимость работы.
Глава 1. Обзор литературы
Глава содержит анализ современного состояния проблемы утилизации и вторичной переработки полимерных отходов. Представлены существующие концепции биодеградации высокомолекулярных материалов на основе анализа зарубежной и отечественной литературы, посвященной методологической оценке их биоразложения, изучению организмов - биодеструкторов.
Глава 2. Объекты и методы исследования
В главе приведены характеристики использованных в работе объектов исследования, обоснование их выбора, а также методов испытаний.
В работе были использованы различные образцы простых полиуретанов трехмерного и линейного строения. Объектами исследования являлись:
- Почва в окрестностях города Советска Калининградской области,
на границе с Литвой (Образец 1). - Почва в районе деревни Большое Сотниково Урицкого района Орловской области (Образец 2).
- Почва окрестности п. Рощино Выборгского района Ленинградской области (Образец 3).
Отбор проб и предварительная обработка почвенных образцов
для агрохимического анализа проводились согласно ГОСТ 28168-89 "Почвы. Отбор проб" в слое 0-10 см с мая по июнь 2006 г. Пробы брали в трехкратной повторности, из которых готовили один смешанный образец для химических и микробиологических анализов.
В работе использовали как нативные образцы почв, так и стерильные образцы (в качестве контроля процесса биодеструкции полиуретана).
Для исключения влияния гуминовых кислот на процесс разрушения полимера в исследованиях использовали стерильный кварцевый песок. Перед закладкой опытов в почве были отобраны крупные корни растений. Почва была растёрта и помещена в контейнеры по 3 кг в каждый. В эксперименте нативные образцы почв (без полимера) инкубировались при Т = 18-20 0С
и влажности почвы 60% в течение 5-10-20 месяцев в пластиковых контейнерах.
Проведён анализ более 200 почвенных образцов. Агрохимические показатели исследуемых почвенных образцов определяли традиционными методами (Аринушкина Е.В., 1970) на кафедре почвоведения и экологии почв СПбГУ.
Изучение структуры и видового состава микробиоты почвы проводили методом посева из почвенной суспензии на плотные питательные среды: МПА, сусло-агар и среда Чапека в 5-кратной повторности.
Определение таксономической принадлежности микромицетов проводили на основании изучения органов и типов спороношения, используя определители отечественных и зарубежных авторов (Rifai, 1969; Raper
et al.,1968; Ellis,1976; Егорова, 1986; Miller,1990; Ramirez, 1982; Raper, Nelson at al., 1983; Domsh,1993; Thom, 1999; De Hoog et al., 2000 и других).
Характеристика структуры комплексов микроскопических грибов проведена с помощью показателя пространственной частоты встречаемости вида (Мирчинк, 1988; Евдокимова, Мозгова, 2001).
Для исследования способности почвенной микробиоты разрушать полиуретаны образцы полимера размещали в нативной и стерильной почве, а также в кварцевом песке на глубине 0,01м. Полиуретановые гранулы инкубировали в течение 20 месяцев при Т=18-200С и влажности почвы 60%. Через 5, 10 и 20 месяцев часть образца полимера изымалась
из экспериментального контейнера для оценки процесса разложения полиуретана с помощью ИК - спектроскопии. ИК - спектры образцов полиуретанов регистрировались на ИК Фурье – спектрофотометре «Shimadzu FTIR 8300» (Япония). Область записи спектров: 4000 - 350 см-1, погрешность определяемой частоты 0,25 см-1. Исследуемые образцы таблетировались с бромидом калия (5 мг образца + 50 мг КВr).
Оценка изменений структуры образцов полиуретана проводилась
по изменению их поверхности методом сканирующей микроскопии (электронный микроскоп фирмы JOEL- JMS-5400LV, Япония). Предварительно образцы полимера наклеивались на двухстороннюю углеродную клейкую ленту и покрывались напыленным в вакууме слоем золота.
Биоповреждения полиуретана (ПУ) оценивались по выявлению органических веществ, образующихся на поверхности полимерного образца, находящегося в контакте с микромицетами и исследованию поверхности полимера после иммобилизации на них почвенных микроорганизмов. Органические вещества экстрагировали различными растворителями: ацетоном (хч), хлороформом (хч) и др.
С целью сравнения продуктов, образующихся в результате естественной (старение полимера) деструкции полиуретана и в результате биодеструкции был поставлен эксперимент по термической деструкции.
Для проведения опытов по термической деструкции образцов полиуретана была использована специальная пиролитическая установка.
Для определения структуры продуктов биодеструкции и термической деструкции ПУ применялся метод хроматомасс-спектрометрии (Хроматомасс-спектрометр “ Shimadzu GCMS QP-2010S “ Япония).
Для оценки экологической безопасности утилизации полиуретана путем захоронения в почве были проведены исследования доминирующих
и частых видов микроорганизмов, выделенных из образцов почвы, в которой проводилось инкубирование гранул полиуретана, а также микробиоты биоплёнок обрастания полимера на гемолитическую и плазмокоагулазную активность (Билай, 1982). При исследовании фитотоксических свойств изолятов были использованы общие рекомендации О.А. Берестецкого.
Статистическая обработка полученных экспериментальных резуль-татов проведена по численности микробиоты и выполнена с применением пакета программ «Statistica for Windows» и StatSoft\Statistica 6 Copyright©1984-2001.
Глава 3. Результаты проведённых исследований
Раздел 3.1.1 Общая характеристика почв исследуемых регионов
Район исследования (г. Советск Калининградской области) расположен в подтаежной (смешанных лесов) зоне. Почвенный покров исследуемой территории представлен лесной дерново-подзолистой почвой. Широколиственно-темнохвойный лес (дуб, ель, сосна, береза, липа);
в напочвенном покрове преобладает тимофеевка луговая, одуванчик обыкновенный, пастушья сумка.
Район исследования (Большое Сотниково Урицкого района Орловской области) расположен в центральной части Среднерусской возвышенности. По характеру растительного покрова территория района относится к лесостепной зоне. Суходольный луг с наиболее типичными травами: клевер, тимофеевка, лисохвост, чабрец, смолка, шалфей и др. Почвенный покров исследуемой территории представлен темно-серым пылеватым, средним суглинком.
Район исследования (п. Рощино Выборгского района Ленинградской области) в 63 км на северо-запад от Санкт-Петербурга. Почва располагается на склоне второй озерной террасы южной экспозиции. Тип почвы – торфянисто-дерново-подзолистая на озерно-ледниковых отложениях. Агрохимические показатели почв представлены в таблице 1.
Таблица 1
Агрохимическая характеристика почв (горизонт А пах., 0-10 см)
| N образца | pH водный | Гидро-литическая кислот-ность, мг. экв на 100 г | Сумма обмен. основан., мг . экв на 100 г | Степень насыщ. основа-ний, мг. экв на 100 г | Обменная кислот-ность, мг. экв на 100 г | AI + H | AI | C,% | N,% | C/N | N, мг/кг | P2O5, мг/кг | K2O, мг/кг |
| 1 | 6,7 | 1,06 | 32,5 | 96,8 | 1,17 | 0,78 | 0 | 1,48 | 0,12 | 12,8 | 53,5 | 26,7 | 200,2 |
| 2 | 5,7 | 5,37 | 20,41 | 79,2 | 1,17 | 1,56 | 0 | 2,60 | 0,16 | 16,1 | 49,7 | 24,9 | 108,0 |
| 3 | 4,4 | 19,3 | 2,86 | 12,9 | 22,62 | 42,12 | 0,77 | 8,77 | 0,38 | 23,1 | 94,7 | 47,4 | 88,0 |
Разделы 3.1.2 - 3.1.4 Микробиота контрольных образцов почв
Из суглинистых почв было выделено в чистую культуру около
500 изолятов грибов, принадлежащих к 45 видам из 18 родов, 5 семейств,
3 порядков и 3 классов. Наиболее богата по видовому составу группа несовершенных грибов (Hyphomycetes), представленная 38 видами из 14 родов, 3 семейств и 2 порядков. Бактериальная биота представлена бактериями
р. Bacillus: B. idosus, B. megaterium de Bary, B. mesentericus Flugge. Аэробные сапрофитные бактерии, в основном, представлены неспороносными формами рода Pseudomonas.
Из образцов лесной дерново-подзолистой почвы было выделено
в чистую культуру около 500 изолятов грибов, принадлежащих к 39 видам
из 21 родов, 5 семейств, 3 порядков и 3 классов. Бактериальная биота представлена бактериями р. Erwinia, Pseudomonas, Мicrococcus, Bacillus
и Streptomyces.
Из образцов торфянисто – дерново - подзолистой почвы было выделено в чистую культуру около 1000 изолятов грибов, принадлежащих
к 63 видам из 24 родов, 5 семейств, 4 порядков и 3 классов. Бактериальная биота представлена р. Pseudomonas, Achrobacter и Bacillus. Виды рода Bacillus представлены Bacillus cereus Frankland et Frank, B. megatherium
de Bary.
Раздел 3.1.5 Влияние экологических условий на численность
и динамику микробного сообщества почв в ходе инкубации образцов полиуретана
Численность микобиоты в почвах Орловской области значительно выше, чем в почвах Ленинградской и Калининградской областей.
Это связано с общеэкологическими условиями Орловской области.
Более длительный вегетационный период (190-200 дней), высокая продолжительность периода со средней температурой более 10 0С
(~200 дней) способствуют активному росту и развитию микроорганизмов.
Сравнивая численности микроорганизмов в естественных (нативных) образах почвы и в контрольных, следует отметить их значительное сокращение в 7-8 раз (Табл. 2). Это закономерно, поскольку в течение 20 мес. инкубации образцов почв в них не поступали какие-либо органические источники питания для микроорганизмов. Динамика численности микроорганизмов в контрольных почвах была идентична и для опытных образцов, в которых проходила экспозиция образцов полиуретана. Инертность к биодеструкции полиуретана привела к снижению численности микроорганизмов в почве, так как скорость поступления доступных для них источников углерода недостаточна для поддержания определённого пула микробного сообщества. Эта динамика характерна для всех образцов исследуемых почв различного зонального ряда.
Таблица 2
Численность микробиоты в нативных и опытных образцах почвы,
тыс. КОЕ/г
| Образцы почв | Нативная почва | 5 мес. | 10 мес. | 20 мес. |
| контрольная почва | контрольная почва | контрольная почва | ||
| опытная почва | опытная почва | опытная почва | ||
| Образец 1 | 79,8±2,1 | 48,2±3,3 46,9±2,1 | 27,4±2,8 32,6±4,2 | 10,2±1,6 15,9±2,4 |
| Образец 2 | 98,4±4,2 | 73,2 ±3,8 74,6±2,4 | 49,8±2,1 55,3±3,8 | 12,6±2,3 14,1±1,6 |
| Образец 3 | 34,3±2,2 | 23,8±3,3 19,1±2,1 | 15,4±1,5 13,8±1,8 | 4,8±1,2 6,1±1,4 |
Таким образом, исследования на ценотическом уровне недостаточны
для оценки экологических последствий воздействия техногенных загрязнителей на почвенную биоту. Исследования на популяционном уровне – определение закономерности изменений в сообществе почвенных микроорганизмов под воздействием техногенных факторов, позволило оценить влияние процесса компостировния полиуретана на микроорганизмы почвы.
Видовой состав микробиоты, выделенный из почвенных образцов,
в которых проводилось компостирование образцов полиуретана, полностью отличается от видового состава контрольных образцов почв. Микробиоценоз в контрольных образцах богат по видовому разнообразию
за счёт редких и случайных видов, естественных для почв исследуемых регионов.
Чувствительными к углероду, как единственному источнику питания в условиях эксперимента, были микромицеты независимо от типа почв.
Так, во всех исследуемых образцах почвы, в которых не проводилось компостирование полимеров после 20 месяцев эксперимента были выделены только бактерии рода Bacillus.
Анализ результатов исследования показал, что в данных условиях эксперимента в почвенных образцах (20 мес. инкубации) доминирует микробиота, обладающая функциональной активностью по отношению
к энергетическому субстрату - полиуретану, так как в образцах почвы,
в которых не проводилось компостирование полимеров, эти виды микроорганизмов не получили своё развитие. В образцах почвы Орловской области это – Gliocladium catenulatum, B. mesentericus, Verticillim terrestre;
в образцах почвы Калининградской области - Сunninghamella bertholletiae, Trichoderma harsianum, Streptomyces spp.; в образцах почвы Ленинградской области – Verticillium nigrescens, Chrysosporium pannorum, Sporotrichum roseolum, F. solani.
Раздел 3.2 Исследование процесса биодеструкции образцов полиуретана в почве
Результаты ИК-спектроскопии и электронной микроскопии. Исследования процесса разложения полиуретана в почвах в течение
20 месяцев с помощью ИК-спектроскопии показали, что полной биодеградации полимера не происходит независимо от химического состава почв. Об этом свидетельствует наличие в ИК - спектрах образцов (после выдерживания в почве) полос поглощения, отвечающих валентным колебаниям ассоциированной имино-группы в области 3346 - 3340 см-1 (с.,шир.) и карбонильной группы (амидной) в области 1734 - 1730 см-1
(с., резк.), (С- Н в арилах) в области 3010 см-1 (с., резк.), (С- Н) в области 2924 - 2920 см-1 (с., резк.), (С- Н) в области 2852-2850 см-1 (с., резк.),
(С=С в аренах) в области 1597 см-1 (с., резк.), деформационным колебаниям (NH) в области 1526-1524 см-1 (с., резк.) и др.
О частичной биодеградации второго полиуретанового образца свидетельствует исчезновение плеча – NH- своб. в области 3450 см-1, а также полос поглощения в ИК-спектрах в области 1665 см-1 ( С=О сопряж.), 1122 см-1 ( С-О-С в простых эфирах), 885 см-1 ( С-С) и одной из полос валентных колебаний С=С ароматич. в области 1600 см-1.
Деградация этого образца полиуретана обусловлена, на основании результатов ИК-спектроскопии, гидролизом простой эфирной связи:
~ R1-O- R2~ + HOH ~ R1 –OH + ~ R2-OH.
Электронная микроскопия исходных образцов полиуретана показала,
что их внешняя сторона ровная с небольшими наслоениями. Внутренняя сторона полимера имеет глобулярное строение.
В результате экспозиции полимера в почвенном образце 1
на поверхности полимера через 10 месяцев отмечено усиление пористости, эрозия стенок пор; поры покрыты биоплёнкой, что свидетельствует
о начальном этапе микробиологического повреждения – адгезии микроорганизмов. Плёнка представляет собой несколько слоёв микробных клеток, толщиной несколько сотен микрометров, покрытых общим гликокаликсом – полимером полисахаридной природы и межклеточным матриксом.
Экспозиция полиуретановых гранул в почвенном образце 2 способствовала образованию на поверхности полимера крупных и мелких глобулярных структур и бактериальных биопленок, как результат и роста актиномицетов. Кроме того, на поверхности образца 2 полимера адсорбировались бактериальные клетки (кокки) и отмечено развитие мицелия грибов. В результате экспозиции полиуретановых гранул
в почвенном образце 3, обычно округлые поры в полиуретане стали несимметричными, с рваными краями ("объеденными"), и покрылись мощной биоплёнкой.
В результате экспозиции полиуретана в течение 20 месяцев в почве образцы полимера подверглись обрастанию микроорганизмами-биодеструкторами. Так, на внутренней поверхности образца 1 в результате экспозиции в лесной дерново-подзолистой почве отмечен активный рост актиномицетов, а внутренняя поверхность образца 2 представляет собой сплошной слой биопленки, состоящей из нитей актиномицетов и бацилл.
Экспозиция полиуретановых гранул в почвенном образце 2 в течение
20 месяцев привела к обогащению бактериальной биопленки, сформировавшейся за 10 мес. инкубирования полимера (образец 1 полиуретана), спорами грибов. Такая же динамика наблюдалась в ходе инкубирования образца 2 полиуретана.
На образце 1 полиуретана образовалась биоплёнка как
на внутренней, так и на внешней стороне гранулы в результате
20–ти месячной инкубации в почвенном образце 3. На образце 2 отмечено активное развитие грибного мицелия.
Процессы образования биоплёнок, адсорбции микробиоты
на поверхности полимеров в стерильной почве и стерильном кварцевом песке не наблюдались. Таким образом, полиуретан в почве подвергается микробной деструкции. На деструкцию указывает возрастание численности различных таксономических групп почвенных микроорганизмов, формирование биопленок на поверхности полиуретана, активное развитие мицелия грибов. Мицелий развивается не только на внешней стороне гранул, но и проникает вовнутрь гранулы, где происходит активное вегетативное размножение грибов – формирование конидиеносцев, конидий и т.п.
Таким образом, результаты электронной микроскопии показали,
что образцы полиуретана линейного и трехмерного строения подвержены биодеструкции. Результаты ИК - спектроскопии показали, что образец полиуретана трехмерного строения, подвержен поверхностной биодеструкции, которая не приводит к изменению химической структуры полимера. Биодеструкция образца полиуретана линейного строения происходит как в поверхностном слое, так и в объеме и сопровождается распадом гидролитически нестойких связей в полимере.
- Раздел 3.2.2 Микроорганизмы, участвующие в процессе разрушения полиуретана
- В результате культурального исследования биоплёнок, образовавшихся в ходе инкубации полимерных гранул, в почве были выделены микроорганизмы, участвующие в процессе обрастания полиуретана (Табл. 3).
Таблица 3
Доминирующие виды микромицетов, участвующие в обрастании полиуретана
| № образца почвы | № образца полиуретана | |
| 1 | 2 | |
| 1 | Fusarium oxysporum Trichoderma harsianum Bacillus spp. | Сunninghamella bertholletiae Trichoderma harsianum Streptomyces spp. |
| 2 | Gliocladium catenulatum B. mesentericus | Cylindrocarpon sp., Verticillim terrestre |
| 3 | Sporotrichum roseolum, Chrysosporium pannorum Bacillus cereus | Trichoderma viridae Fusarium solani, Verticillium nigrescens |
Исследование способности микроорганизмов, участвующих
в формировании биоплёнок на полимере использовать полиуретан
в качестве единственного источника углерода показало, что только такие культуры грибов, как Trichoderma harsianum, Verticillim terrestre
и V. nigrescens способны расти на синтетической питательной среде
на основе полиуретана. На «голодной» среде Чапека (без сахарозы) рост этих микромицетов не был отмечен. Бактерии в ходе исследования выделялись с поверхности полиуретана, но они не были способны расти
на синтетической среде, в которой в качестве единственного источника углерода находились образцы полимера.
Таким образом, только некоторые члены микробного сообщества, участвующие в обрастании полиуретана могут его разрушать. Можно заключить, что продукты распада, образующиеся в результате деятельности грибов – деструкторов полиуретана, используются как источник углерода неразлага-ющими полимер микроорганизмами, что также может объяснить присутствие последних в почвенных образцах после 20 - месячной инкубации в них образцов полиуретана. Повреждение полимера обусловлено разрастанием колоний грибов на поверхности изделия, проникновением мицелия в толщу материала через микротрещины, а также вследствие агрессивного воздействия ферментов и органических кислот — метаболитов грибов на отдельные компоненты полиуретана. Ферменты разрушают полиуретан в результате двухступенчатой реакции: гидрофобная адсорбция на поверхности полимера с последующим его гидролизом.
Нами были идентифицированы следующие органические соединения
на поверхности полиуретана при контакте с почвенными микромицетами:
2 – гидрокси - фениловый эфир бензойной кислоты, 2 – ундецен – 4 - ол,
2,2,6,6 – тетраметил – пиперидин – 4 - ол, 2,4 - диаминотолуол
и м - фенилендиамин.
Эти вещества образуются в процессе биодеструкции полимера
под воздействием микроорганизмов. Судя по химической структуре образующихся веществ можно заключить, что биодеструкция полиуретана происходит за счёт разрыва основной цепи по функциональным группам
(C-N связей).
Термическая деструкция ПУ (в атмосфере азота при 260о С) привела
к образованию других органических веществ: о-хлоранилина,
м-хлорбензальдегида, метилового эфира гексадециловой кислоты
и 4,4- дихлорбензофенона.
Нами установлено, что структура продуктов биодеструкции
не изменяется в течение 24 месяцев наблюдения и не зависит от типа почв.
Концентрация выявленных нетоксичных органических веществ в почвах находится в пределах 1.10-4 – 7.10-4 %.
Глава 4. Экотоксикологические исследования безопасности утилизации полиуреана
В главе представлены результаты исследования экологической безопасности утилизации полиуретанов путем инкубирования в почве.
В результате длительного компостирования в почве образцов полиуретана
в ней сформировался определенный состав микробиоценоза. Следствием этого процесса станет видовой состав и концентрация микробиоты окружающей среды, которые определят этиологию инфекций в регионе.
Одним из проявлений патогенных свойств микроорганизмов является их способность расти при температуре тела человека. В табл. 4 представлены микромицеты, выделенные с поверхности полиуретановых образцов после
их длительного инкубирования в почве. Кроме того, эти виды микромицетов занимали доминирующее положение в почвенном микробном сообществе, сформировавшемся в результате компостирования полимеров. Способность образовывать токсины присуща определенным видам микромицетам.
К токсичным метаболитам относится гемотоксин, вазывающий лизис эритроцитов. Гемолитическая активность была выявлена у грибов, участвующих в процессе обрастания полимера. Особую опасность
для человека представляют грибы, которые наряду со способностью расти при температуре 37 0С, обладают плазмокоагулазной активность: Verticillium nigrescens, Fusarium oxysporum, так как выявленные у них факторы патогенности позволяют отнести их к потенциальным возбудителям госпитальных инфекций.
Таблица 4
Факторы патогенности микромицетов, выделенных с поверхности полимера и почвенных образцов
| Факторы патогенности | Микромицеты |
| Рост при 370 С | Verticillium nigrescens (3-2) Sporotrichum roseolum (3-1) Fusarium oxysporum (2-1,2) Рenicillium funiculosum (2-1,2) P. decumbens (1-2) P. nigricans (3-1) |
| Гемолитическая активность | Fusarium oxysporum (2-1,2) Verticillim terrestre (2-2) Trichoderma harsianum (1-2) Penicilium brevicompactum (1-1,2) P. fellutanum (3-2) P. funiculosum (2- 1,2) P. aurantiogriseum (3-2) |
| Плазмокоагулазная активность | Verticillium nigrescens (3-2) Fusarium oxysporum (2-1,2) |
Примечание: в скобках приводится номер образца почвы, из которой
выделен микромицет и через дефис - номер образца полимера).
Фитотоксические свойства микромицетов представлены в Таблице 5.
Среди болезней зерновых культур заметное место занимают фузариозы
и вертициллез – заболевания, вызываемые несовершенными грибами рода Fusarium и Verticillium, соответственно. Основную опасность, которую таит в себе присутствие эти видов в зерне, - загрязнение сельскохозяйственной продукции вторичными метаболитами грибов, токсичными для растений, животных и человека.
Таблица 5
Фитотоксические свойства микроорганизмов, выделенных с поверхности полимера и почвенных образцов
| Культура микроорганизма | Растение | Показатель всхожести семян | Показатель ингибирования роста корня |
| Fusarium oxysporum (2-1) | пшеница | нет всхожести | нет роста |
| горох | нет всхожести | нет роста | |
| овёс | 10% | 60% | |
| Verticillim terrestre (2-2) | пшеница | нет всхожести | нет роста |
| редис | нет всхожести | нет роста | |
| горох | нет всхожести | нет роста | |
| овёс | нет всхожести | нет роста | |
| Trichoderma harsianum (1-2) | пшеница | нет всхожести | нет роста |
| горох | нет всхожести | нет роста | |
| овёс | 60% | 40% | |
| P. nigricans (3-1) | пшеница | нет всхожести | нет роста |
| горох | нет всхожести | нет роста | |
| овёс | нет всхожести | нет роста | |
| P. decumbens (1-2) | пшеница | нет всхожести | нет роста |
| горох | 80% | 50% | |
| овёс | нет всхожести | нет роста | |
| P. funiculosum (2- 2) | пшеница | 60% | 30% |
| горох | 30% | 75% | |
| овёс | 40% | 25% | |
| Verticillium nigrescens (3-2) | пшеница | 80% | 10% |
| горох | нет всхожести | нет роста | |
| овёс | нет всхожести | нет роста | |
| Chrysosporium pannorum (3-1) | пшеница | нет всхожести | нет роста |
| горох | нет всхожести | нет роста | |
| овёс | 100% | нет ингибирования | |
| Trichoderma viridae (3-2) | пшеница | нет всхожести | нет роста |
| редис | 50% | 60% | |
| овёс | нет всхожести | нет роста |
Таким образом, полиуретаны различного строения экологически опасны при их утилизации инкубированием в почве.
ВЫВОДЫ
- Исследование процесса биодеструкции полиуретана в почвах различного зонального ряда показало, что полной биодеструкции полимера не происходит, независимо от химического состава почв. На это указывают результаты бактериологических исследований
и ИК-спектроскопии. - Инертность процесса биодеструкции полиуретана ведёт
к значительному (в 7-8 раз) снижению численности микроорганизмов в почве. Изменение структурно-фунциональной организации микробных сообществ в почвах в результате компостирования полимеров привело к доминированию микробиоты, обладающей функциональной активностью по отношению полиуретану.
В образцах почвы Орловской области это - Gliocladium catenulatum, B. mesentericus, Verticillim terrestre; в образцах почвы Калининградской области - Сunninghamella bertholletiae, Trichoderma harsianum, Streptomyces spp.; в образцах почвы Ленинградской области – Verticillium nigrescens, Chrysosporium pannorum, Sporotrichum roseolum, F. solani. - Полиуретан трехмерного строения, подвержен поверхностной биодеструкции, которая также не приводит к изменению химической структуры полимера. Биодеструкция образца полиуретана линейного строения происходит как в поверхностном слое, так и в объеме
и сопровождается распадом гидролитически нестойких связей
в полимере. Продуктами взаимодействия микроорганизмов
и образцов полиуретана в процессе инкубирования последних
в почвах, являются нетоксичные органические вещества, концентрация которых находится в пределах 1.10-4 – 7.10-4 %. Химический состав этих продуктов метаболизма не изменялся
в течение 20 месяцев наблюдения и не зависел от типа исследуемых почв. - Одним из негативных последствий изменения видового состава микроорганизмов в процессе инкубации полимера в различных почвах является формирование «трансформированного» биогеоценоза, в котором присутствуют микромицеты, обладающие гемолитической, плазмокоагулазной активностью, растущие
при температуре тела человека и проявляющие фитопатогенные свойства. Способность этих микроорганизмов образовывать биоплёнки на поверхности полиуретановых гранул увеличивает риск их распространения в окружающей природной среде. - Исследования, проведённые на популяционном уровне и на функци-ональных характеристиках микробных ценозов показали,
что физико-географические и экологические условия анализируемых почв различного зонального ряда не оказывают существенного влияния на процесс деструкции полиуретана, однако способствуют формированию определённого функционально - активного
по отношению к компостируемому субстрату сообщества микроорганизмов.
По материалам диссертации опубликованы следующие работы:
1. Зачиняева, А.В. Негативные последствия антропогенных изменений
комплексов почвенных микроскопических грибов / А.В.Зачиняева, И.И. Мирошниченко, И.И.Соломенникова, Я.В.Зачиняев // Успехи медицинской микологии.- 2007.- Т.9. - С. 60 - 63.
2. Зачиняев, Я.В. Лабораторные исследования биодеградации полиуре-тана в почвах Ленинградской области / Я.В. Зачиняев, И.И. Мирошниченко, А.В. Зачиняева // Успехи медицинской микологии.- 2008.- Т.2. – С. 372.
3. Мирошниченко, И.И. Микробные сообщества, участвующие в био-деградации полиуретана / И.И. Мирошниченко, А.В. Зачиняева, Я.В. Зачиняев // Экология и промышленность России.- 2009.- № 3. -
С. 20 - 21.
4. Зачиняев, Я.В. Микробная деградация полиуретана / Я.В. Зачиняев, И.И. Мирошниченко, А.В. Зачиняева // Журнал прикладной химии.- 2009.- Т. 82, Вып. 7. – С. 1224 - 1226.
5. Мирошниченко, И.И. Ассоциация микроорганизмов, участвующих
в формировании биоплёнки обрастания на полимерных материалах / И.И. Мирошниченко, Я.В. Зачиняев, А.В. Зачиняев // Иммунопатология, аллергология, инфектология.- 2009.- № 1. - С. 27.
6. Zachinyaev, Ya.V. The Chemical Structure and Some Chemical Features of the Coating Material (Polyurethane) / Ya.V. Zachinyaev, A.V. Zachinyaeva, I.I. Miroshnichenko // Матер. межрегион. научно-практич. конф. VI Кирилло-Мефодиевские чтения "Роль вузов в решении государственной проблемы создания общенациональной системы резерва управленческих кадров", 26 мая 2009 г.- Луга, 2009.- Т.1- С. 180 - 182.
7. Зачиняев, Я.В. Микробная деградация полиуретана / Я.В. Зачиняев, А.А. Анищенко, И.И. Мирошниченко, А.В. Зачиняева // Вісн. Національн.-технолог. ун-ту “ХПІ”. Хімія, хімічна технологія
та екологія.- 2009.- Вип. 46. – С. 166 – 173.
8. Зачиняев, Я.В. Исследование процесса биодеградации при захоро-нении полиуретана в различных почвах при утилизации промышленных отходов / Я.В. Зачиняев, И.И. Мирошниченко,
А.В. Зачиняева // Технико-технологические проблемы сервиса.- 2009.- № 2.- С. 46 – 49.
9. Зачиняев Я.В. Экотоксилогические исследования безопасности утилизации полиуретана / Я.В. Зачиняев, И.И. Мирошниченко, А.В. Зачиняева // Иммунопатология, аллергология, инфектология. - 2010. - № 1. - С. 191 -192.
