Реакция микроорганизмов на действие экологических факторов высших растений в системе жизнеобеспечения
На правах рукописи
Бородина Елена Владимировна
Реакция микроорганизмов
на действие экологических факторов
высших растений В СистемЕ жизнеобеспечения
03.02.08 – экология (биология)
Автореферат
диссертации на соискание ученой степени
кандидата биологических наук
Красноярск – 2012
Работа выполнена в ФГБОУ ВПО “Красноярский государственный аграрный университет” и ФГБУН “Институт биофизики Сибирского отделения Российской Академии Наук”
| Научный руководитель | доктор биологических наук, с.н.с. Тирранен Ляля Степановна |
| Официальные оппоненты: | Елена Яковлевна Мучкина доктор биологических наук, профессор кафедры экологии и естествознания Красноярского государственного аграрного университета Галина Владимировна Макарская кандидат биологических наук, с.н.с. Института вычислительного моделирования СО РАН |
| Ведущая организация | Институт Леса и Древесины им. В.Н. Сукачева СО РАН |
Защита диссертации состоится 27 апреля 2012 г в 12 часов
на заседании диссертационного совета Д 220.037.04 при ФГБОУ ВПО “Красноярский государственный аграрный университет” по адресу: 660049, г. Красноярск, пр. Мира, 90. Факс: (391) 227-36-09
С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке ФГБОУ ВПО “Красноярский государственный аграрный университет”
Автореферат разослан « 27 » апреля 2012 г.
Ученый секретарь диссертационного совета
доктор биологических наук, профессор Г.А. Демиденко
Актуальность темы. Высшие растения - один из ключевых звеньев биологической системы жизнеобеспечения (БСЖО). Постоянным компонентом биоценоза фототрофного звена БСЖО является сопутствующая микрофлора, в постоянном взаимодействии с которой находятся высшие растения. Микроорганизмы - индикаторы состояния высших растений (Тирранен, Шиленко, 2008; Gitelsonetal., 2003; Tirranen, 2008), способны быстро и разнообразно отзываться на влияние окружающей их внешней среды (Кожевин, 2000; Заварзин, 2003 и др.).
Установлено, что ингибирует рост растений, снижает их продуктивность и влияет на микробный пейзаж звена высших растений в замкнутой экосистеме комплекс факторов, важнейшими из которых являются: длительное использование питательного раствора, введение в него внутрисистемной сточно-бытовой воды и газовое замыкание системы(Tirranen, 2001;Gitelsonetal., 1997;Tirranen, 2008).
В ранее проведенных экспериментах в замкнутой экологической системе «БИОС-3» растительные отходы и экзометаболиты человека (нативные выделения испытателей) выносились из БСЖО(Gitelsonetal., 2003).
Создание биологической системы жизнеобеспечения (БСЖО) нового поколения с более высокой степенью замкнутости круговорота веществ возможно за счет повышения эффективности утилизации растительных и физиологических отходов человека.
Какие изменения произойдут в микробиоте питательного раствора при введении в него жидких выделений человека при бессубстратном (воздушно-субирригационном) методе выращивания разновозрастной монокультуры пшеницы в замкнутой экологической системе и справится ли микрофлора раствора с ролью деструктора жидких выделений человека?
Кроме того, предстояло выяснить, не приведет ли выращивание одновозрастной монокультуры пшеницы в течение нескольких ротаций на почвоподобном субстрате (ППС), созданной на биологически переработанной соломе, к явлению, сходному с почвоутомлением? Известное ингибирование роста высших растений в замкнутых системах жизнеобеспечения человека (Лисовский, Шиленко, 1975; Gitelsonetal, 2003) определяет необходимость поиска токсикантов, вызывающих это явление. В ряде работ (Беркович, Следь, 1989; Gitelsonetal, 2003 и др.) показано, что угнетение роста растений взамкнутойБСЖО связано с особенностями газового состава ее атмосферы.Одним из направлений поиска ингибиторов может быть исследование влияния газообразных веществ атмосферы замкнутой системы на рост микроорганизмов. Известно, что микроорганизмы быстрее реагируют на изменения в замкнутой системе, чем растения, и могут рассматриваться в качестве биоиндикаторов состояния атмосферы (Tirranen,Gitelson, 2006).
Цель работы состоит в анализе и оценке реакции микроорганизмов на воздействие экологических факторов в фототрофном звене замкнутой системы жизнеобеспечения человека.
Основные задачи:
- Выявить изменения в микробиоте раствора с жидкими выделениями человека при бессубстратном методе выращивания разновозрастной монокультуры пшеницы в замкнутой экосистеме;
- Охарактеризовать микрофлору раствора, используемого для культивирования одновозрастных растений пшеницы на почвоподобном субстрате (ППС) без экзометаболитов человека, на ППС с нативными и минерализованными физико-химическим способом физиологическими отходами человека;
- Оценить влияние отдельных газообразных веществ – возможных источников загрязнения атмосферы замкнутой экосистемы на рост тест-микроорганизмов.
Научная новизна. Впервые показано, что микрофлорапитательного раствора при дробном введении в него жидких выделений человека и 70 % замене нитратного азота на азот мочи при воздушно-субирригационном способе выращивания разновозрастной монокультуры пшеницы успешно справляется с ролью деструктора жидких выделений человека. Обнаружено, чтовыращивание растений на ППС с использованием физико-химического метода переработки физиологических отходов человека целесообразнее, чем введение в ППС нативных продуктов жизнедеятельности человека.Изучено действие разных концентраций этилена на рост Bacilluscereus 60 в ростовой микрокамере О.К. Кузнецова для ускорения отклика микроорганизмов.
Практическая значимость. Полученные результаты могут быть востребованы при разработке биологических систем жизнеобеспечения, основанных на использовании высших растений и предусматривающих длительное пребывание в таких системах человека в условиях полной изоляции от земной биосферы (в космосе, под водой), в труднодоступных районах планеты - в полярных широтах, пустынях, в высокогорье.
По микробиологическим показателям выращивание растений на почвоподобном субстрате (ППС) с использованием физико-химического метода переработки экзометаболитов человека целесообразнее, чем введение в ППС нативных продуктов жизнедеятельности человека.
Выявленная индивидуальная чувствительность тест-микроорганизмовк разным концентрациям газообразных веществ подтверждает перспективность использования микроорганизмов в качестве биотестов загрязнения атмосферы.
Положения, выносимые на защиту:
1.Микробное сообщество питательного раствора при 70 % замене нитратного азота на азот мочи успешно справляется с ролью деструктора нативной мочи человека.
2.Наблюдаемые изменения в микрофлоре и состоянии одновозрастной пшеницы, культивируемой на почвопообном субстрате, используемом в течение 3 ротаций, аналогичны изменениям при почвоутомлении.
Наибольшие изменения выявляются в микробиоте раствора и массе зерна одновозрастной монокультуры пшеницы при выращивании ее на почвоподобном субстрате (ППС) с нативными экзометаболитами человека.
3.Индивидуален спектр действия отдельных газообразных веществатмосферына рост использованных тест-культур. Спектр чувствительности тест-микроорганизмов к влиянию разных концентраций исследуемых токсикантов также индивидуален.
Апробация работы. Основные положения диссертации доложены и обсуждены на Международных совещаниях по искусственным замкнутым экосистемам, Красноярск, 1990, 1991; Всесоюзной конференции “Биотехнология и биофизика микробных популяций”, Алма-Ата, 1991; Всесоюзном симпозиуме «Микробиология охраны биосферы Урала и Северного Прикаспия», Оренбург, 1991; XXV и XXXIV Научных чтениях, посвященных разработке творческого наследия К.Э. Циолковского, Калуга, 1990, 1999;Международной конференции «Физиология растений – наука III тысячелетия», Москва, 1999; Международных ассамблеях по космическим исследованиям:Вашингтон, США, 1992; Гамбург, Германия, 1994; Бирмингем, Англия, 1996; Нагоя, Япония, 1998; Варшава, Польша, 2000; Хьюстон, США, 2002; Париж, Франция, 2004; Пекин, Китай, 2006; на 17 Международном симпозиуме «Человек в космосе» IAA, Москва, Россия, 2009.
Публикации.По теме диссертации опубликовано20работ, в том числе 4 статьи в журналах, включенных в перечень изданий, рекомендованных ВАК РФ.
Структура и объем диссертации. Диссертационная работа изложена на 115 страницах, содержит 16 рисунков и 14 таблиц, состоит из введения, обзора литературы, материала и методики исследования, результатов и их обсуждения, практических рекомендаций, выводов, списка литературы, содержащего ссылки на 127 источников, из которых42 – на иностранных языках.
Личный вклад автора. Представленная работа является обобщением научных исследований. Отбор и анализ образцов, эксперименты,обработка, интерпретация результатов, написание работы выполнены лично автором.
Благодарности. Автор выражает искреннюю благодарность научному руководителю д.б.н. Л.С. Тирранен за всестороннюю помощь и поддержку в работе.
Глава 1. Обзор литературы
В первой главе дан обзор литературных источников по изучаемой проблеме. Анализируется не только роль микроорганизмов в жизни растений, но и влияние растений на микроорганизмы.
Глава 2. Материалы и методы исследований
2.1.Объектом исследования служила микробиота бессменного питательного раствора в различных вариантах опытов:
2.1.1.Раствор с добавками в виде жидких выделений человека, использованный при бессубстратном (воздушно-субирригационном) способе выращивания разновозрастных растений пшеницы (Lisovsky и др., 1997) в течение 190 суток (150 суток в замкнутой экологической системе и 40 суток после размыкания системы) и в опыте без замыкания экосистемы в течение 154 дней;
2.1.2.Раствор, используемый для выращивания одновозрастной монокультуры пшеницы на одном почвоподобном субстрате (ППС) в течение трех ротаций;
2.1.3.Растворс нативными и переработанными физико-химическим методом экзометаболитами человека, используемый при культивировании одновозрастных растений пшеницы на ППС. В контроле пшеница росла на ППС без добавок.
Исследуемыми объектами загрязнения атмосферного воздуха замкнутой экологической системы (ЗЭС) были аммиак, ацетальдегид, озон, сернистый ангидрид, этилен, углекислота.
В качестве экспериментальной модели апробировано до 96 тест-микроорганизмов из родов Pseudomonas, Erwinia, Enterobacter, Flavobacterium, Nocardia, Achromobacter, Mycobacterium, Bacillus, Micrococcus, Xanthomonas, Streptococcusи другие с разной чувствительностью к действию летучих веществ.
2.2. Методы исследования
2.2.1.Микробиоты раствора с жидкими выделениями человека при бессубстратном методе выращивания разновозрастной монокультуры пшеницы в замкнутой экосистеме
В эксперименте с ЗЭС в течение 102 суток, начиная с 49 суток после замыкания системы, и в опыте без замыкания экосистемы в течение 154 суток в питательный раствор вводили жидкие выделения человека, заменяя 70 % нитратного азота среды на азот мочи. Ежедневная подача жидких выделений человека в питательный раствор проводилась дробно: три раза в сутки.Конвейерную культуру пшеницы из семи возрастов выращивали в условиях интенсивного освещения воздушно-субирригационным способом с вегетационным периодом 63 дня (Lisovskyetal., 1997; Gitelsonetal., 2003).
Исследованы индикаторные группы микроорганизмов – общее количество бактерий, в т.ч. бактерий группы кишечной палочки, группы протея, споровых (в стадии спор), микроскопических грибов и дрожжей, актиномицетов, азотфикаторов (аэробных и анаэробных), аммонификаторов, денитрификаторов (косвенных и истинных), клетчаткоразрущающих микроорганизмов, наиболее показательные для контроля и прогнозирования состояния высших растений в замкнутой экосистеме (Тирранен, Шиленко,2008). Выделение и идентификацию микроорганизмов проводили общепринятыми методами (Билай и др., 1988; Практикум по микробиологии … под ред. Нетрусова, 2005; Поздеев, 2010).
2.2.2.Микрофлоры раствора для выращивания одновозрастной монокультурыпшеницы на одном (ППС) в течение 3 ротаций
В 3-х модельных экспериментах каждый продолжительностью 70 суток изучено поведение индикаторных групп микроорганизмов(п. 2.2.1) в растворе для выращивания одновозрастной монокультуры пшеницы на одном почвоподобном субстрате (ППС) в течение 3 ротаций. В п. 2.2.1 указаны использованные в работе методики.В экспериментах сорт пшеницы «232» селекции Г.М. Лисовского (Замкнутая система... под ред. Г.М. Лисовского, 1979) с вегетационным периодом 70 суток выращивали на ППС при температуре 22-24°С и относительной влажности воздуха 65% в сосудах площадью 0,057 м2 при уровне освещенности 150 Вт/м2 ФАР (Manukovsyetal., 1997).
2.2.3.Микробного населения растворов, используемых для выращивания растений пшеницы на почвоподобном субстрате с добавками
Микробиота растворов изучена в двух модельных экспериментах каждый продолжительностью 70 суток. Исследовано поведение 12 индикаторных групп (п. 2.2.2) микроорганизмов в бессменных растворах, использованных для выращивания монокультуры пшеницы на ППС с различными добавками: с нативными выделениями человека и с переработанными физико-химическим методом экзометаболитами человека. Контрольные растения монокультуры пшеницы культивировали на ППС без добавок.
Использованная методика мокрого сжигания экзометаболитов человека, изложена и запатентована Ю.А. Куденко и Р.П. Павленко (Куденко, Павленко, 1998). Физико-химический метод минерализации физиологических отходов человека позволяет использовать полученный окисленный продукт для питания растений как добавка в почвоподобный субстрат (ППС).
2.2.4.Влияния летучих загрязнителей атмосферного воздуха ЗЭС (аммиака, ацетальдегида, озона, сернистого ангидрида, диоксида этилена, углекислого газа) на рост тест-микроорганизмов проведено по схеме1 2 3 4,где:
1 -чашки Петри с агаризованной питательной средой предварительно экспонировались в атмосфере замкнутой экосистемы с известной концентрацией изучаемого загрязнителя;
2 -питательная среда в чашках Петри подвергалась воздействию атмосферного воздуха замкнутой экосистемы- в среду свободно проникали и накапливались в ней водорастворимые летучие вещества из атмосферы;
3 - затем тест-микроорганизмы наносили методом реплик на поверхность питательной среды с продиффундировавшими в нее летучими веществами из атмосферы. Для этого из 2-суточных исследуемых культур по оптическому стандарту мутности на 10 ед. готовили суспензию, которой пастеровскими пипетками заполняли лунки станины репликатора. С помощью ручки репликатора делали реплики (Tirranenetal., 2001) до 50 тест-культур одновременно на поверхность незасеянной среды, разлитой мерно на дно чашек Петри.
4 -реакцию бактерий на действие изучаемого токсиканта в атмосфере замкнутой системы оценивали по разнице диаметра колоний в опыте и контроле.
Тест-культуры выращивали в разработанном нами устройстве для культивирования микроорганизмов на твердых средах (Безруких и др., 1990). Чашки Петри с питательной средой и свеженанесенными методом реплик тест-культурами на ней размещали на гранях корпуса в отверстиях – питательной средой внутрь камеры и герметично фиксировали специальным прижимным устройством. В опытном варианте к отросткам камеры присоединяли цилиндры с исследуемым газом. Камеру с присоединенными к ней цилиндрами помещали в термостат. Концентрацию исследуемого газа определяли на хроматографе "Chrom-5". В контроле культуры выращивали в такой же камере, но без подачи исследуемого газа.
2.2.5.Методикаисследования действия этилена на рост бактерий (на клеточном уровне)в ростовых камерах О.Ю. Кузнецова.Эксперименты проводили с использованием светового микроскопа МБИ-15 с иммерсионным объективом и фотоаппаратом. Микроорганизмы выращивали в герметично замкнутой ростовой микрокамере О.Ю. Кузнецова (1988), который использовал ее для культивирования организмов в протоке питательной среды. В настоящем исследовании микрокамеру применяли для создания протока газообразных веществ и поддержания определенного состава атмосферы в ростовой полости. Эту полость камеры образуют параллельно установленные покровные стекла. Между ними помещают агаровый блок, на который наносят клетки исследуемой культуры.
Канал для подвода исследуемого газа соединен с мерным сосудом, содержащим газообразный этилен, а канал для отвода газа - с емкостью, в которой находится органический растворитель, улавливающий газ, выходящий из камеры. Объем камеры составляет 0,1 см3. Такая конструкция позволяет заполнить камеру газом и наблюдать за развитием одиночных клеток под микроскопом.Содержание этилена в исследуемых пробах воздуха определяли с помощью газового хроматографа "Chrom-5". После засева камеры микроорганизмами, ее наполняли смесью этилена заданной концентрации с воздухом. Наблюдения вели за одними и теми же клетками в течение 5 - 7 ч (1 раз в час): учитывали число клеток в поле зрения, фотографировали поле зрения. По фотографиям определяли длину бактериальной цепочки. В качестве критериев роста культуры использовали увеличение числа клеток в поле зрения и удлинение бактериальных цепочек. Все эксперименты десятикратно повторяли.
Статистическая обработка данных проведена по Г.Ф. Лакину (1990).Во всех экспериментах учитывали среднюю арифметическую величину диаметра колоний (Х), ошибку средней арифметической (m). Критерием оценки служила стандартная величина нормированного отклонения (tst), с которой сравнивалось фактическое значение этого критерия (tфактическое или t разности) для 95 – 99 %-го уровня значимости. Количественный учет микроорганизмов на жидких элективных средах проведен по таблице Мак-Креди [Теппер и др., 2004], разработанной на основе методов вариационной статистики.С помощью корреляционного анализа изучены взаимосвязи между различными группами микроорганизмов и массой зерна пшеницы; между длительностью поступления жидких выделений человека в питательный раствор и массойзерна пшеницы.
Воздействие газообразных веществ на тест-бактерии оценивали как положительное (стимулирующее) или отрицательное (ингибирующее), когда размер колоний тест-культур в опыте был соответственно достоверно увеличен или снижен по сравнению с контролем. Если размер колоний в опыте достоверно не отличался от контроля, действие газа оценивали как нулевое. Результаты сравнения размеров колоний выражали в процентах и баллах
Разницу в размерах опытных и контрольных колоний от 0 до 19 % оценивали в 0 баллов, а действие считали нейтральным (нулевым). Разницу от 20 до 39% оценивали в I балл, от 40 до 59 % - в 2, от 60 до 79 % - в 3, выше 80 % - в 4 балла.
Глава 3.Микробиологическая характеристика питательных растворов с добавками для культивирования высших растений
3.1.Микробиота питательного раствора с жидкими выделениями человека, используемого для выращивания растений
Длительное выращиваниеразновозрастной (7 возрастов) монокультуры пшеницы на питательном растворе с добавками в виде жидких выделений человека (при 70 % замене нитратного азота на азот мочи) не сопровождалось резким увеличением количества всех исследованных групп микроорганизмов в растворе. Органические вещества в среде почти не накапливались, в значительной степени минерализовались и усваивались биоценозом. Влияние замыкания проявилось в росте общего количества бактерий, группы кишечной палочки, группы протея, микроскопическихгрибов и дрожжей.
После размыкания экосистемы численность вышеназванных групп микроорганизмов снижалась. Изменения микробиоты питательного раствора с добавками в виде жидких выделений человека, используемого для выращивания растений, как в замкнутой экологической системе, так и без замыкания соответствовали изменениям химического состава питательной среды и состояния растений.
О влиянии жидких выделений человека на мобилизационные процессы, происходящие в питательном растворе, судили по динамике численности некоторых физиологических групп микроорганизмов, участвующих в превращении азотсодержащих веществ.С увеличением времени поступления мочи в питательный раствор, численность почти всех исследованных групп микроорганизмов увеличивалась.
К концу длительного эксперимента увеличивалась численность аэробных бактерий, аммонификаторов, олигонитрофилов, фитопатогенных (бактерий, растущих на среде Ферми) за счет накопления в среде легкоокисляемых органических веществ. Количество актиномицетов, микроскопических грибов, клетчаткоразрушающих и жирорасщепляющих микроорганизмов коррелировало с содержанием трудноокисляемых веществ в питательном растворе (рисунок 1).
Рисунок 1 - Динамика перманганатной окисляемости (——, мгО2/л), численностибактерий (——— —), в том числе бактерий группы кишечной палочки (- -- -)
в питательном растворе при введении в него жидких выделений человека в замкнутой экологической системе (КОЕ тыс./мл)
Критерий разности (tэксп*) между численностью микроорганизмов в исследуемых пробах определяли по следующим точкам: 40 сутки - проба перед началом введения метаболитов, 55 сутки - начало введения метаболитов, 144 сутки - перед окончанием введения мочи и 158 сутки - после окончания введения метаболитов, 1 и 186 сутки - первая и последняя пробы в эксперименте (таблица 1).
Таблица 1 - Критерий разности (tэксп*) между численностью микроорганизмов в исследуемых пробах
| А | Б | ||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
|
| ||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
| В | Г | ||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
|
|
А – общее число бактерий, Б – бактерии группы кишечной палочки,
В – микроскопические грибы, Г – актиномицеты
* -tэксп – критерий разности достоверен при tэксп tst (tst = 2,78 для р = 0,05; tst = 4,60 для р = 0,01; tst = 8,61 для р = 0,001).Достоверные значения выделены жирным шрифтом.
** - С 49суток в питательный раствор вводятся жидкие выделения человека, *** - После 150суток опыта прекращена подача жидких выделений в питательный раствор, система разомкнута
Корреляционный анализ выявил прямую зависимость между временем поступления нативной мочи в питательный раствор и развитием микроорганизмов, участвующих в трансформации азота. Величина коэффициента корреляции между длительностью использования питательного раствора с жидкими выделениями человека в течение 81 суток, 108 и 144 и урожаем зерна пшеницы, выращенной на этом питательном растворе в эксперименте вне ЗЭС, равная r: -0,22; -0,22 и -0,26 (соответственно), указывает на отсутствие достоверных связей между значениями признаков.
Проведен сравнительный анализ между массой зерна пшеницы, выращенной в течение 63-81 суток на питательном растворе без жидких выделений человека и урожаем зерна пшеницы, выращенной за тот же период на питательном растворе с 70 %-ой заменой нитратного азота среды на азот мочи человека в опытах без замыкания системы. Полученные результаты (r= 0,10) позволяют заключить, что дробное введение нативной мочи человека в питательный раствор, используемый для выращивания пшеницы в замкнутой экологической системе жизнеобеспечения человека, при 70 % замене нитратного азота среды на азот мочи возможно. Введение жидких выделений человека в нативной форме в питательную среду не вызвало необратимых изменений в микрофлоре питательного раствора.
3.2.Микробиологическая ситуация в растворах, используемых для выращивания растений пшеницы в течение трех ротаций на одном почвоподобном субстрате (ППС)
В данном эксперименте из 12 исследованных индикаторных групп микроорганизмов к концу 3 ротации (опыт) обнаружено достоверное увеличение численности бактерий группы кишечной палочки, фитопатогенных и флуоресцирующих бактерий, снижение количества клетчаткоразрушающих микроорганизмов и микроскопических грибов (рисунок 2).
Рисунок 2 Динамика численности фитопатогенных бактерий (а) и клетчаткоразрушающих микроорганизмов (б) в питательном растворе
Примечание: по оси Х – длительность использования раствора (сутки), по оси Y – количество микробных клеток, тыс./ 1 мл;
ряд 1 – контроль (1-ая ротация), ряд 2 – опыт (3-я ротация).
Одновременно наблюдалось ухудшение состояния одновозрастной монокультуры пшеницы и снижение массы зерна в 2,2 раза по сравнению с первоначальным использованием ППС в 1 ротации (контрольный вариант). Массазерна в контроле была равна 2653 г/м2.
По всей вероятности, наблюдаемые изменения в микрофлоре и состоянии выращиваемых растений на ППС аналогичны изменениям при почвоутомлении (Картвелишвили, 1984).Полагаем, что следует продолжить поиск путей длительного использования ППС для выращивания растений в СЖО.
3.3.Микробиота питательных растворов, используемых для выращивания растений пшеницы на почвоподобном субстрате с добавками
Известно, что к концу вегетации растений с изменением их корневых выделений, за счет которых размножаются микробы, уменьшается количество грамотрицательных бактерий и возрастает доля споровых форм бактерий, микроскопических грибов и клетчаткоразрушающих микроорганизмов (Иванов, 1973; Tirranen, 2001).
В контрольном варианте полученные данные подтвердили вышесказанное. Выявлено, что в длительно использованном питательном растворе численность всех исследованных групп микроорганизмов, кроме споровых форм бактерий, клетчаткоразрушающих и микроскопических грибов, снизилась к концу эксперимента. Количество аэробных бактерий снизилось с 15 по 70 сутки опыта с 2,4х107±0,28 КОЕ/мл до 0,32х107±0,02 КОЕ/мл.
При добавлении нативных экзометаболитов человека в ППС наиболее показательным было изменение количества бактерий группы кишечной палочки, группы протея, фитопатогенных бактерий, микроскопическихгрибов
(рисунок 3).
Рисунок 3 - Динамика численностибактерий группы кишечной палочки (БГКП) и микроскопических грибов в питательном растворе, использованном для выращивания растений на почвоподобном субстрате с нативными экзометаболитами человека в течение 70 суток (фон – питательный раствор без растений).
Следует заметить, что при выращивании растений пшеницы на ППС с добавками (и нативными экзометаболитами, и минерализованными) в микрофлоре питательного раствора появились дрожжи и дрожжеподобные грибы, которые в контрольном растворе отсутствовали. Добавление нативных выделений негативно сказалось и на продуктивности пшеницы – масса зерна была ниже, чем в контроле (таблица2).
Таблица 2- Продуктивность пшеницы в различных экспериментах (г/м2, % за вегетацию)
| Почвоподобный субстрат с различными добавками | Масса зерна | |
| г/м2 | % | |
| Контроль без добавок | 2486 | 100 |
| 1 опыт с нативными метаболитами | 1440 | 54,2 |
| 2 опыт с минерализованными отходами | 2051 | 77 |
Сделан вывод о целесообразности выращивания растений на ППС с использованием физико-химического метода переработки физиологических отходов человека. Данный вариант опыта по микробиологическим показателям в питательном растворе аналогичен контролю, а продуктивность пшеницы выше, чем в опыте с внесением в ППС непереработанных метаболитов человека.
Глава 4. Биотестирование атмосферы звена высших растений в эксперименте с замкнутой экосистемой с помощью тест-микроорганизмов
4.1. Реакция микроорганизмов на действие возможных источников загрязнения атмосферы замкнутой экосистемы (аммиака, озона, этилена, сернистого ангидрида, углекислоты, уксусного альдегида).
В ранее проведенных экспериментах с ЗЭС выявлено ингибирование роста растений и снижение их продуктивности (Лисовский, 1973).Установлено, что из комплекса факторов, отрицательно действовавших на биосинтез выращиваемых культур высших растений, наибольшее влияние оказывал газовый состав атмосферы системы (Гительзон, 1975; Gitelsonetal., 2003).Нами было показано, что газовый состав атмосферы отдельных звеньев (технологического оборудования, самих растений, человека и т.д.) не влиял отрицательно на состояние и продуктивностьрастений, но достоверно действовал на рост некоторых бактерий, что свидетельствует о большей чувствительности микроорганизмов к изменениям газового состава системы.
В эксперименте с ЗЭС, включавшей высшие растения, исследовали влияние различных концентрацийгазов- возможных источников загрязнения атмосферы на рост 96 тест-микробов (Фрагменттаблицы3).
Таблица 3 - Реакция тест-культур микроорганизмов на действие различных источников загрязнения атмосферы
| Источник загрязнения | Концентрация газа | Количество прореагировавших тест-культур | |||||||
| Всего действий | 0 | + | - | ||||||
| Всего | % | Всего | % | Всего | % | ||||
| Озон слабые дозы | на уровне ПДК 0,1мг/м3 | 716 | 681 | 95,11 | 17 | 2,38 | 18 | 2,51 | |
| Озон сред-ние дозы | 50-100 мкг/м3 | 706 | 587 | 83,14 | 28 | 3,97 | 91 | 12,89 | |
| Диоксид этилена | 2.67 мл/м3сут | 572 | 426 | 12,89 | 2 | 0,35 | 144 | 25,17 | |
Примечание. Действие: "+" - положительное, "-" - отрицательное, “0” – отсутствует (нулевое).
Диоксид этилена, озон и сернистый ангидрид в большей степени влияли на рост растений и бактерий, чем все остальные изученные источники загрязнения атмосферы системы. В дальнейших работах диоксид этилена заменили на этилен.
В эксперименте также было обнаружено, что биологическая активность исследуемых 96 штаммов бактерий и фотосинтез высших растений изменялись в зависимости от дозы токсиканта. Особенно наглядно это видно на примере действия сернистого ангидрида (рисунок 4).
Рисунок 4 - Влияние сернистого ангидрида SO2(мг/м3) на рост тест-микробов (%) и фотосинтез (%) опытных растений ЗЭС.
При концентрации сернистого ангидрида 0,13мг/м3 достоверное ингибирование роста тест-культур выявлено в 16 случаях из 333 сравниваемых с фоном действий, при концентрации 0,39 мг/м3- в 51 случае (из 352).При концентрации сернистого ангидрида 0,13 мг/м3 фотосинтез составлял 648,7 лС02/сут., а при дозе 0,39 мг/м3 выявлено наименьшее значение фотосинтеза - 417,3 лС02/сут. Следует заметить, что максимальное значение фотосинтеза (935,8 лСО2/сут.) было при подаче 0,21 мг/м3токсиканта в атмосферу замкнутой экосистемы.Полученные данные свидетельствуют об адаптации растений к токсиканту, не наблюдавшееся у микробов. Выявленная индивидуальная чувствительность тест-микробовк разным концентрациям сернистого ангидрида еще раз подтверждает перспективность использования микроорганизмов в качестве биотестов загрязнения атмосферы.
4.2. Влияние ацетальдегида и этилена на рост тест-культур микроорганизмов (на популяционном уровне)
Тест-микробы выращивали в герметичной камере для культивирования микроорганизмов на твердых средах (Безруких и др., 1990).
Результаты учитывали на третьи сутки. В результате действия различных концентраций ацетальдегида (АА) на рост 79 экспериментально подобранных чувствительных штаммов микроорганизмов выявлен широкий спектр реакций тест-микробов на исследуемый газ. Получена прямая зависимость реакций тест-культур от концентрации газа.
Отмечено три вида реакций микробов: нейтральная, положительная и отрицательная. Количество действий каждого вида находилось в прямой зависимости от концентрации АА. Так, с уменьшением концентрации газа с 1.3 х 10-1 до 6 х 10-8 количество отрицательных действий уменьшается, а при концентрации 6 х10-8 становится равным нулю. При низких дозах (10-7, 10-8) на большинство культур АА действия не оказывал. Отдельно нужно отметить два штамма - М355 (Mycobacteriumlacticolum) и 228 (неидентифицированный штамм), у которых наблюдалась наиболее яркая реакция на низкие концентрации АА. При концентрации 10-7 и 10-8АА вызывал достоверную стимуляцию роста штамма М 355 в 4 балла, а штамма 228 - в 3 балла, что позволяет сделать предположение о наличии штаммоспецифичности по отношению к ацетальдегиду.
Одновременно нами изучалось влияние восьми концентраций этилена на рост того же набора 79 тест-культур.
Анализ полученных данных показал отсутствие четкой зависимости реакций исследованных микроорганизмов от концентрации исследуемого этилена. Лишь 2%-ный этилен вызывал достоверную стимуляцию роста тест-микробов. При всех остальных концентрациях газа (1,16; 0,3; 2 х 10-2,2 x10-3,2 х 10-4 %) большинство реакций было нейтральным. Полученные результаты подтверждают предположение о том, что чистый этилен является нейтральным газом по отношению к микроорганизмам. Д.И. Никитин и Э.С. Никитина [1978] также показали отсутствие какого-либо воздействия ("+" либо "-") этилена на бактерии при его концентрации в инкубационной емкости, равной 90%.
Итак, в результате исследования влияния ацетальдегида (АА) и этилена получен различный спектр действия на рост 79 тест-культур, из которых отобрано 32 наиболее чувствительных к данным газам штамма микроорганизмов. Это дает возможность использовать предложенный метод и данный набор тест-культур для биоиндикации атмосферы ЗЭС.
4.3. Влияниеэтилена на рост Bacilluscereus(на клеточном уровне)
Ранее использованный нами метод позволял получить ответную реакцию тест-культуры на вторые-третьисутки после воздействия исследуемого газообразного вещества. Дальнейшая работа была направлена на ускорение отклика тест-культуры на тестируемое вещество в атмосфере ЗЭС. Эту задачу решили, применяя микроскопию ростовой микрокамерыКузнецова О.К., наполненной исследуемым газом.
В работе использовали 10-часовую культуру, суспензию которой наносили на блок, приготовленный из 1 % пептонного агара, диаметром 9 мм и толщиной 1 мм. Культуру засевали так, чтобы в поле зрения находилось не более 8-10 клеток.
Проведенные исследования показали, что под воздействием этилена не изменялись морфологические характеристики клеток Bacilluscereus 60.
В соответствии с полученными результатами достоверная стимуляция роста Bacilluscereus 60 наблюдалась при низких концентрациях этилена
(2•10-4 % и 2 %) через 3-5 ч роста культуры в микрокамереО.Ю. Кузнецова (рисунок 5).
Рисунок 5 - Влияние 2 % этилена на рост клеток Bacilluscereus60.
1 - через 1час культивирования в ростовой камере Кузнецова,
2 - через 3 часа; 3 - через 5 часов. Слева – контроль; справа – опыт.
Фото в световом микроскопе. Увеличение 100 х 7.
Выводы
- Исследования подтвердили зависимость развития микробного сообщества от длительности использования бессменного раствора, введения в него добавок в виде жидких нативных выделений человека и замыкания системы по газообмену.
- Поступления жидких выделений человека в питательный раствор, используемый для выращивания растений, не привело к необратимым изменениям в микробиоте раствора.
3. Выращивание растений на ППС с использованием физико-химического метода переработки физиологических отходов человека целесообразнее, чем введение в ППС нативных продуктов жизнедеятельности человека.
4. Выявлена индивидуальность спектра действия веществ на рост использованных тест-культур и индивидуальность спектра чувствительности бактерий к влиянию разных концентраций исследуемых токсикантов.
5.Озон, сернистый ангидрид и этилен в большей степени влияют на рост тест-микроорганизмов, чем остальные изученные источники загрязнения атмосферы системы.
Практические рекомендации
1. Рекомендуем научным учреждениям, занимающимся изучением субстратов длявыращивания растений, использовать ППС с использованием физико-химического метода переработки физиологических отходов человека, так как это по микробиологическим показателям безопаснее, чем введение в субстрат нативных продуктов жизнедеятельности человека.
2. Рекомендуем территориальному Центру по мониторингу загрязнения окружающей среды использовать для биотестирования атмосферного воздуха набор тест-микроорганизмов с разной чувствительностью к действию летучих веществ.
Список основных работ, опубликованных по теме диссертации
Статьи в изданиях, рекомендованных ВАК РФ
- Титова, Г.Т. К методике исследования влияния газообразных веществ на микроорганизмы/Г.Т. Титова, Л.С. Тирранен, Г.С. Калачева,Е.В.Бородина //Авиакосмическая и экологическая медицина. – 1994. - № 4. – С. 51-54.
- Бородина Е.В. Влияние уксусного альдегида и этилена на рост тест-культур микроорганизмов/ Л.С. Тирранен, Г.Т. Титова, Г.С. Калачева//Экология. – 1997. - № 3. - С. 197-199.
- Тирранен, Л.С. Изенения в микробиоте питательного раствора с жидкими выделениями человека, используемого для выращивания растений/ Л.С. Тирранен, Е.В. Бородина // Вестник КрасГАУ. № 10, 2011.- С. 69-74
- Бородина, Е.В. Влияние возможных источников загрязнения атмосферы замкнутой экосистемы на рост микроорганизмов / Е.В.Бородина, Л.С. Тирранен, Г.С. Калачева // Вестник КрасГАУ. № 11, 2011.- С. 154-157
Другие научные издания
- Тирранен, Л.С.Влияние этилена на рост споровых бактерий/Л.С. Тирранен, Г.Т. Титова, Е.В. Бородина и др. // Микробиология охраны биосферы в регионах Урала и Северного Прикаспия: Тезисы докладов Всесоюзного симпозиума. Оренбург, 1991.-С.121-122.
- Тирранен, Л.С. Реакция бактерий и растений на действие сернистого ангидрида в атмосфере замкнутой экологической системы/ Л.С. Тирранен, В.Е. Рыгалов, Г.Т. Титова, Е.В. Бородина//Тезисы Всесоюзной конференции «Биотехнология и биофизика микробных популяций». Алма-Ата, 1991.-С.128
- Tirranen, L.S. Response of plants and bacteria to SO2 in a cloed ecosystem atmosphere/ L.S.Tirranen, E.V.Borodina, V. Ye.Rygalov, G.T.Titova, I.A. Gladchenko // Abstracts/ 29-th COSPAR Scientific Assembly, Washington, USA, 28 aug.- 5 sept., 1992.- Р. 351.
- Tirranen, L.S.Microflora of nutrient solution used to grow wheat plants under the impact of sulphur dioxide/ L.S. Tirranen, G.T.Titova, E.V.Borodina,V.Ye.Rygalov, L.A.Stutko, A.P. Pusyr// Abstracts/30-th COSPAR Scientific Assembly Hamburg, Germany, П.Abstracts,11-21 Juli, 1994.-Р.327.
- Tirranen,L.S.Test-microorganisms affected by possible sourced of atmospheric pollution in a closed system/ L.S. Tirranen, G.T.Titova, E.V.Borodina,M.P Shilenko., V.Ye.Rygalov, L.A.Stutko//Abstracts/ 30-th COSPAR Scientific Assembly Hamburg, Germany, П.Abstracts,11-21 Juli, 1994. - Р.338.
- Gitelson, I.J.Impraited growth of plants cultivated in a closed system: Possible reasons/ I.J.Gitelson,L.S. Tirranen, E.V. Borodina, V. Ye. Rygalov// Abstracts/ 31th COSPAR Scientific Assembly, Birmingham, England, 14-21 July, 1996. - Р.382.
- Gitelson, I.J.Impraited growth of plants cultivated in a closed system: Possible reasonspress/ I.J.Gitelson, L.S. Tirranen, E.V. Borodina, V. Ye. Rygalov// Adv. Space Res. - 1997. – V. 20, N 10. - Р. 1927-1930.
12.Tirranen, L.S. Formation of microbial cenoses used to grow wheat plants on human physiological wastes processed by straw biotechnique/ L.S. Tirranen, E.V. Borodina, V. Ye. Rygalov, I.G.Zolotukhin, L.A Stutko// Abstracts/ 32nd Scientific Assembly of COSPAR, Nagoya, Japan, 12-19 July, 1998. - Р.440.
13.Тирранен, Л.С., Микробиологическая ситуация в питательных растворах, используемых для выращивания пшеницы на физиологических отходах человека и растений/Л.С. Тирранен, Е.В. Бородина, И.Г. Золотухин, И.В. Грибовская// Тезисы докладов/IV съезд общества физиологов растений России. Международная конференция «Физиология растений – наука III тысячелетия».- М., 4-9 октября 1999. – С.280.
14. Тирранен, Л.С., Микробиологическая ситуация в питательных растворах, используемых для выращивания растений пшеницы в течение 3 ротаций на одном почвоподобном субстрате/Л.С. Тирранен, Е.В. Бородина, Н.С. Мануковский, И.Г. Золотухин, Л.А. Стутко// Тезисы докладов/XXXIV научные чтения, посвященные разработке творческого наследия К.Э. Циолковского (Калуга, 14-16 сентября,1999 г.).- М.:ИИЕТРАН.-Калуга, 1999. – C. 92-93.
15. Borodina,E.V.Acetaldehyd effect on microorganism growth/ E.V.Borodina, L.S.Tirranen//Abstract 33thCOSPAR.- 2000. Poland (вэлектронномварианте).
16. Tirranen, L.S. Structurally functional changes in the microbiota of nutrient solution supplemented with human liquid wastes, used to grow plants in a closed ecological system/ L.S.Tirranen, E.V. Borodina,A.A. Markov // Abstract/ 35th COSPAR (вэлектронномварианте). 2004.
17.Gros, J.-B. Wheat growth on neutral and soil-like substrates: carbon dioxide exchange and microflora/ J.-B. Gros, C. Lasseur, A.A. Tikhomirov, N.S. Manukovsky, S.A. Ushakova, I.G. Zolotukhin, L.S. Tirranen, E.V. Borodina and V.S. Kovalev//Acta Hort. -2004 - (ISHS)644, P. 243-248.
18.Tirranen, L.S.The effect of possible sources of closed ecosystem atmosphere pollution on the growth of test microorganisms/ L.S.Tirranen,A.A.Tikhomirov, A.P.Puzyr, E.V. Borodina, G.S.Kalacheva, M.P.Shilenko// Abstract/ 36th COSPAR. China.- 2006 (в электронном варианте).
19.Тирранен, Л.С. Микробиота питательных растворов, используемых для выращивания растений пшеницы на почвоподобном субстрате с добавками/ Л.С.Тирранен, Е.В. Бородина, Ю.А.Куденко, Н.С.Мануковский// Сложные системы в экстремальных условиях/ Материалы XIV Всероссийского симпозиума с международным участием. 23-28 июня 2008 г., Красноярск, 2008. – С. 89-96.
20.Tirranen, L.S. Contribution of higher plant link microflora into the microbial landscape of a closed ecosystem / L.S. Tirranen, E.V. Borodina//Abstract, Moscow, June 7-11, 2009. – p. 134.
Санитарно-эпидемиологическое заключение № 24.49.04.953.П. 000381.09.03 от 25.09.2003 г.
Подписано в печать 26.03.2011. Формат 60х84/16. Бумага тип. № 1668
Печать – ризограф. Усл. печ. л. 1,0 Тираж 100 экз. Заказ №
Издательство Красноярского государственного аграрного университета
660017, Красноярск, ул. Ленина, 117
