Алексеевич гемоглобины человека: иммунобиохимическая характеристика и медико-биологическое значение
На правах рукописи
кривенцев Юрий Алексеевич
ГЕМОГЛОБИНЫ ЧЕЛОВЕКА: ИММУНОБИОХИМИЧЕСКАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА И МЕДИКО-БИОЛОГИЧЕСКОЕ ЗНАЧЕНИЕ
03.00.04. Биохимия
Автореферат
диссертации на соискание ученой степени
доктора медицинских наук
Москва 2009
Работа выполнена в государственном образовательном учреждении высшего профессионального образования «Астраханская государственная медицинская академия Федерального агентства по здравоохранению и социальному развитию»
Научный консультант:
доктор медицинских наук, Никулина
профессор АГМА Дина Максимовна
Официальные оппоненты:
| член-корреспондент РАМН, доктор медицинских наук, профессор | Терентьев Александр Александрович |
| доктор медицинских наук, профессор | Хватов Валерий Борисович |
| доктор медицинских наук, профессор | Сучков Сергей Викторович |
Ведущая организация: – ГОУ ВПО «Московский государственный медико-стоматологический университет Федерального агентства по здравоохранению и социальному развитию», Адрес: 127473, Москва, ул. Делегатская, д. 20/1.
Защита диссертации состоится 28 декабря 2009 г. в 15.00. часов на заседании Диссертационного Совета Д.208.072.01 при ГОУ ВПО «Российский государственный медицинский университет Федерального агентства по здравоохранению и социальному развитию» по адресу:
117997, Москва, ул. Островитянова, 1.
С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке ГОУ ВПО РГМУ по адресу:
117997, Москва, ул. Островитянова, 1.
Автореферат разослан 15 сентября 2009 г.
Ученый секретарь диссертационного совета,
доктор медицинских наук,
профессор П.Х. Джанашия
Общая характеристика работы
Актуальность проблемы. В последние годы повышается интерес к отдельным типам гемоглобина как диагностически значимым маркерам. Существует разнообразие патологических состояний красной крови (талассемии, онкопатология, гипоксии и др.), при которых важное диагностически-прогностическое значение имеет не только изменение количества общего гемоглобина крови, но и отдельных его типов. К наиболее физиологически и диагностически значимым типам гемоглобина человека относятся гемоглобины взрослого HbА1, HbА2, фетальный гемоглобин (HbF) и эмбриональный гемоглобин (HbP).
В современной клинической практике большинства стран для количественного анализа гемоглобинов в качестве стандартных применяются колориметрические циангемоглобиновые методы, рекомендованные комитетом по стандартизации Европейского и Международного Общества по Гематологии (Deutscher Normenausschuss, Normentwurf DIN 58931, 1964), основным из которых является унифицированный гемоглобинцианидный метод [Зорина Н.В., 1980; Делекторская Л.Н., 1992; Гаранина Е.Н., 1997]. Большинство колориметрических методов количественного определения гемоглобина не отличаются избирательностью: с их помощью определяется лишь общее количество гемоглобина крови, а не отдельных его типов. Даже в случае определения щелочеустойчивой фракции гемоглобина по Зингеру и Бетке регистрируются несколько типов гемоглобина, а не только фетальный [Betke K., 1958; Betke K., 1979]. Кроме того, методы Бетке и Зингера несовершенны при определении малых концентраций гемоглобина. Методика определения гемоглобинов путем электрофореза в геле крахмала, агарозы или ацетата целлюлозы при рН 8,4-8,6 [Huisman, T.H.J. 1996, Тиц Н.У. 1997, Fairbanks, V.P. 1999] является полуколичественной.
В современной медицинской лабораторной практике четко прослеживается тенденция перехода от определений фракций веществ к индикации каждого вещества фракции в отдельности, что, очевидно, повышает качество диагностики и оценки состояния пациента. Безусловно, современная медицина нуждается в появлении новой схемы тестирования гемоглобинового спектра человека, которая позволяла бы определять уровень каждого из основных типов гемоглобина. В последние годы появились единичные работы по изучению отдельных типов гемоглобина с помощью иммунохимических тест-систем [Никулина Д.М. 2002; Токарев Ю.Н. 2003].
Огромным преимуществом иммунохимических методов является их высокая специфичность, которую обеспечивают интимные избирательные взаимодействия: антиген–антитело. Кроме того, к преимуществам иммунохимических методов можно отнести высокую чувствительность, позволяющую количественно определять белки в малых пробах, а также то, что эти методы позволяют исследовать сложные биологические смеси без какой-либо предварительной очистки и выделения исследуемого белка.
Таким образом, моделирование моноспецифических иммунохимических тест-систем на основные типы гемоглобина (HbА1, HbF, HbP и др.), разработка комплексной схемы оценки гемоглобинового спектра крови и их внедрение в клиническую практику актуально и целесообразно.
Цель исследования: оптимизация клинической оценки состояния красной крови путем пополнения фундаментальных сведений по основным типам гемоглобина и формирования комплексной иммунохимической схемы оценки гемоглобинового спектра.
Задачи исследования
- Провести сравнительное иммунобиохимическое изучение физико-химических свойств HbА1, HbА2, HbF и HbP.
- Разработать рациональные способы выделения и очистки основных типов гемоглобина.
- Смоделировать моновалентные иммунохимические тест-системы на гемоглобины А1, А2, F и P.
- Разработать способы количественного иммунохимического анализа основных типов гемоглобина.
- Определить сроки начала и динамику продукции HbР и HbF на ранних этапах онтогенеза человека.
- Создать комплексную схему оценки гемоглобинового спектра крови на основе иммунохимических тест-систем и установить ее клинико-диагностическое значение при патологии эритрона и заболеваниях, сопровождающихся гипоксией.
Научная новизна исследования
Пополнены фундаментальные данные по физико-химическим свойствам HbA1, HbA2, HbF, получены новые сведения по некоторым физико-химическим свойствам эмбрионального гемоглобина: относительной электрофоретической подвижности в полиакриламидном и агарозном гелях, изоэлектрической точке, степени щелочной резистентности и отношению к осаждающим агентам, на основании чего разработаны и апробированы оригинальные алгоритмы их выделения и очистки.
Сконструирована моновалентная иммунохимическая тест-система на эмбриональный гемоглобин. Смоделированы и успешно апробированы новые точные и надежные оптимальные алгоритмы количественного анализа по гемоглобинам A1, A2, F и P. Впервые разработана комплексная схема количественной оценки гемоглобинового спектра, отличающаяся точностью, специфичностью, надежностью и экономичностью.
Уточнены сроки начала продукции антенатальных гемоглобинов и проведен параллельный иммунохимический анализ динамики концентрации HbР и HbF в раннем эмбриогенезе.
Впервые выявлен HbР и отмечено повышение концентарции HbF в крови больных эритремией, сублейкемическим миелозом, острым и хроническим миелолейкозом, что доказывает значение этих белков как канцероэмбриональных антигенов в диагностике миелопролиферативных заболеваний.
Впервые показано появление HbР и достоверное изменение уровня HbF в крови новорожденных с тяжелой внутриутробной гипоксией, задержкой внутриутробного развития и глубокой недоношенностью, доказывающее диагностическую роль тестов на HbP и HbF при патологии новорожденных.
Впервые отмечено значительное превышение концентрации фетального гемоглобина в крови больных опийной наркоманией и алкоголизмом.
Практическая значимость работы
Предложенные оригинальные алгоритмы выделения и очистки гемоглобинов А1, А2, F и P, позволят экономить исходный биоматериал, реактивы, временные и финансовые ресурсы. Полученные белковые препараты могут быть использованы для научных исследований и для практического применения.
Разработаны и используются в клинической практике следующие тесты: способ количественного анализа HbF ракетным электрофорезом с додецилсульфатом натрия, способ полуколичественного анализа HbP путем трехэтапной иммунодиффузии по Оухтерлони, способ количественного анализа HbA1 и HbA2 радиальной иммунодиффузией по Манчини. Составлена инструкция по применению сформированного набора реагентов для иммунохимической индикации HbF, HbP, HbA1 и HbA2. Разработана и используется в клинической практике комплексная схема оценки гемоглобинового спектра, основанная на сочетании оптических и иммунохимических методов индикации гемоглобинов.
Результаты диссертационного исследования и предложенные рекомендации могут быть использованы в работе клинико-диагностических лабораторий, поликлинических, гематологических, педиатрических, неонатологических, наркологических, пульмонологических, кардиологических, онкологических и терапевтических лечебно-профилактических учреждений.
Внедрение результатов исследования позволит оптимизировать способы аналитической и препаративной работы с основными типами гемоглобина человека, осуществлять более точный и полный анализ гемоглобинового статуса и состояния красной крови, что будет способствовать улучшению диагностики, лечения и прогноза заболеваний, сопровождающихся изменением концентрации общего гемоглобина или отдельных его типов.
Внедрение результатов исследования в практику
Разработанные в диссертации методики и полученные результаты исследований внедрены в практическую деятельность КДЛ учебно-научно-диагностического центра ГОУ ВПО АГМА; МУЗ «Клинический родильный дом» г. Астрахань; ГУЗ Александро-Мариинской ОЦКБ, г. Астрахань; НУЗ Медико-санитарная часть, г. Астрахань; МУЗ клиническая больница №5, г. Астрахань. Теоретические положения используются в учебном процессе на биохимии с курсом клинической лабораторной диагностики, патологической физиологии ГОУ ВПО АГМА Росздрава.
Материалы научных исследований используются в научных разработках и в педагогическом процессе на всех факультетах на кафедрах биохимии с курсом клинической лабораторной диагностики и патологической физиологии Астраханской государственной медицинской академии.
Положения, выносимые на защиту:
1. При очистке основных типов гемоглобина наиболее эффективны методы фракционирования, основанные на разделении по изоэлектрической точке: ионообменная хроматография и препаративный электрофорез. При электрофоретическом разделении гемоглобинов оптимальным является диапазон рН рабочего буфера от 6,0 до 6,6. Значительное влияние на электрофоретическую подвижность HbA1, HbA2, HbF и HbP в агарозе и ПААГ оказывают додецилсульфат натрия, тритон, мочевина и бихромат калия. На ранних этапах выделения HbP следует использовать модифицированную методику щелочной денатурации с 40-секундной экспозицией в 1,2 н NaOH.
2. Оптимальными для количественного определения основных типов гемоглобина являются методы иммунохимического анализа. Разработаны точные алгоритмы селективного количественного анализа HbA1, HbA2, HbF и HbP, основанные на методах двойной иммунодиффузии, ракетного иммуноэлектрофореза и РИД по Манчини. Создана и внедрена в клиническую практику комплексная схема количественной оценки гемоглобинового спектра по основным типам гемоглобина, основанной на модифицированных иммунохимических методах.
3. Иммунохимическим путем проведен количественный анализ динамики концентраций HbР и HbF в раннем эмбриогенезе (с 4 по 12 нед гестации), и уточнены сроки начала продукции антенатальных гемоглобинов.
4. Доказано значение HbP и HbF как канцероэмбриональных антигенов в диагностике миелопролиферативных заболеваний, оценке степени тяжести и прогноза гипоксии новорожденных, ЗВУР и глубокой недоношенности. Впервые отмечено значение иммунохимического теста на HbF в оценке тяжести и эффективности лечения больных опийной наркоманией и алкогольной зависимостью.
Апробация работы
Основные положения диссертации доложены на V научной конференции с международным участием «Дни иммунологии в Санкт-Петербурге» 2001; на III съезде биохимического общества РАН (Санкт-Петербург, 2002); на 2-й и 3-й научно-практической конференции и школе-семинаре для молодых ученых с международным участием «Белки-маркеры патологических состояний» (Астрахань-Москва, 2001, 2003); на научно-практической конференции с международным участием «Современные достижения фундаментальных наук в решении актуальных проблем медицины» (Астрахань-Москва, 2004), (Астрахань-Волгоград-Москва, 2006), (Астрахань-Москва 2008); на VIII Международной научной конференции «Эколого-биологические проблемы бассейна Каспийского моря» (Астрахань, 2005); на международной научной конференции, посвященной 450-летию г. Астрахани (Астрахань. 2007), на VI Всероссийской конференции молодых ученых «Актуальные вопросы клинической и экспериментальной онкологии» (Москва. 2007), IV съезде Российского общества биохимиков и молекулярных биологов (Новосибирск. 2008), межрегиональной научно-практической конференции «Актуальные проблемы кардиологии детей и взрослых-2009» (Астрахань. 2009), Всероссийской научной конференции «Актуальные вопросы клиники, диагностики и лечения больных в многопрофильном лечебном учреждении» (С-Пб., 2009).
Материалы диссертации были представлены на выставке: «Инновационные достижения России» XI Петербургского международного экономического форума (С-Петербург. 2007).
Публикации
По материалам диссертации опубликована 41 научная работа, в том числе 12 в рецензируемых научных изданиях, рекомендуемых ВАК, 1 патент.
Структура и объем работы: Диссертация изложена на 264 страницах текста, иллюстрирована 34 таблицами, 39 рисунками, состоит из введения, обзора литературы, главы методов исследования, 6 глав собственных экспериментальных и клинических исследований, обсуждения, заключения, выводов, практических рекомендаций. Указатель литературы содержит 251 отечественных и 139 иностранных авторов.
Личное участие автора в получении результатов исследования
Основной материал, представленный в диссертации, получен, обработан и проанализирован лично автором. Исследования проведены на кафедре биохимии с курсом клинической лабораторной диагностики АГМА, КДЛ учебно-научно-диагностического центра ГОУ ВПО АГМА; МУЗ «Клинический родильный дом»; ГУЗ Александро-Мариинской ОЦКБ, НУЗ Медико-санитарная часть, МУЗ клиническая больница №5, г. Астрахань.
СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ
Материалы и методы исследования
Исследование было проведено в период с 2003 по 2009 гг. на биологическом и клиническом материале общей численностью 1288 образцов. Объектом исследования являлись изучаемые гемоглобины типов А1, А2, F и P, источники получения которых приведены в табл. № 1.
Таблица 1
Перечень использованного в работе материала
| Материал | Число образцов | Место получения биоматериала |
| Биоматериал: | г. Астрахань | |
| Эмбриональный материал | 170 | Отделение гинекологии МУЗ КБ №5 |
| Плоды | 12 | Отделение патанатомии ГУЗ АМ ОЦКБ |
| Пуповинная кровь здоровых новорожденных | 62 | МУЗ «Клинический родильный дом» |
| Кровь беременных | 57 | |
| Кровь здоровых доноров | 84 | Станция переливания крови |
| Клинический материал: | ||
| Пуповинная кровь новорожденных | 196 | МУЗ «Клинический родильный дом» |
| Кровь кардиологических больных | 49 | НУЗ Медико-санитарная часть |
| Кровь наркологических больных | 138 | наркологический УНЛЦ АГМА |
| Кровь гематологических больных: | ||
| Гемобластозы | 244 | Отделение гематологии ГУЗ АМ ОЦКБ |
| Анемии | 64 | НУЗ Медико-санитарная часть |
| Здоровые доноры (группы контроля) | 212 | Станция переливания крови |
| ВСЕГО | 1288 |
Биоматериал использовали как при изучении физико-химических свойств HbA1, HbA2, HbF и HbP, так и в разработке новых способов выделения и очистки названных белков. Исходным материалом для очистки HbA1 и HbA2 являлась кровь доноров и здоровых беременных женщин; для очистки фетального гемоглобина - пуповинная кровь здоровых новорожденных и ткани плодов; для очистки HbP – эмбриональный материал сроком гестации 5-9 нед.
Постановку и верификацию диагнозов в обследуемых группах проводили при участии квалифицированных специалистов. Исследованный клинический материал был разделен по нозологии на три группы:
1) Гепаринизированная кровь больных миелоприлиферативными заболеваниями. Всего было обследовано 244 образца крови (табл. 2). Т.к. в обследуемый спектр нозологии входили заболевания с редкой встречаемостью (эритремия, сублейкемический миелоз, эритроцитоз), если число вариант в выборке не превышало 20, применяли алгоритмы статистической обработки для малых групп.
Таблица 2
Перечень использованного в работе материала
| Исследуемый материал (кровь больных) | Количество проб |
| Эритремия | 36 |
| Сублейкемический миелоз | 34 |
| Хронический миелолейкоз | 76 |
| Острый миелолейкоз | 36 |
| Острый и хронический лимфолейкоз | 56 |
| Эритроцитоз | 6 |
| ВСЕГО | 244 |
2) Гепаринизированная пуповинная кровь новорожденных, в количестве 196 образцов (табл. 3).
3) Гепаринизированная периферическая кровь наркологических больных (табл. 1). Были обследованы образцы крови от 138 человек, из них: 52 образца от пациентов с алкогольной зависимостью; 44 – от больных опийной наркоманией и 42 пробы от здоровых взрослых (контрольная группа). Возраст больных составил от 18 до 43-х лет. Клинический статус обследуемых соответствовал острому абстинентному синдрому.
Таблица 3.
Перечень использованного в работе материала
| Исследуемый материал (пуповинная кровь новорожденных) | Количество проб | ||
| Всего | Мальчики | Девочки | |
| Здоровые дети (контрольная группа) | 62 | 33 | 29 |
| Дети с тяжелой внутриутробной гипоксией | 52 | 27 | 25 |
| Дети с тяжелой внутриутробной гипоксией и задержкой внутриутробного развития | 43 | 21 | 22 |
| Дети с тяжелой внутриутробной гипоксией и глубокой недоношенностю (масса тела не более 1000 г.) | 39 | 18 | 21 |
| ВСЕГО | 196 | 99 | 97 |
Кровь брали пункцией кубитальной вены или пальца у взрослых людей, у новорожденных - из пуповины сразу после ее рассечения, у плодов - из сердца. Забор крови производили в пробирки с добавленным в них раствором гепарина. Эмбриональные ткани получали в ходе экстренных и запланированных медицинских абортов при участии квалифицированного врача-гинеколога, с письменного согласия пациенток. После получения материал упаковывали в стерильные, герметично закрытые емкости, которые тут же транспортировали в научную лабораторию кафедры биохимии с курсом КЛД в охлажденном состоянии. Хранили материал в морозильной камере при температуре -180С.
При изучении физико-химических свойств HbA1, HbA2, HbF и HbP, и при разработке новых способов выделения и очистки названных белков применяли методы механически-термического гемолиза, комбинированной щелочной денатурации (поэтапная обработка гемолизата раствором сульфата аммония 50% насыщенности и 1,2 М раствором едкого натра с последующей седиментацией при 8000 g), препаративного электрофореза в агаровом геле на 0,1 М цитратном буфере рН 6,0 (в авторской модификации), электрофореза в полиакриламидном геле, ионообменной и гель-проникающей хроматографии (Л.А.Зильбер, ред., 1968; Davis 1964; Ornstein 1964; Г.Детерман, 1970; Г.Маурер, 1971; Э.Руослахти, 1979; Л.А.Остерман, 1985; Э.Гааль и соавт., 1982; X. Фримель, ред., 1987; О.Микеш, ред., 1982; Р.Скоупс, 1985; А.М.Егоров и соавт., 1991). Идентификацию полученных препаратов проводили методами ИХА. Всего протестировано свыше 4500 образцов биоматериала.
Моновалентные антисыворотки на изучаемые типы гемоглобина получали самостоятельно методом иммунизации кроликов породы «шиншилл» дробными дозами чистого антигена с адъювантом Фрейнда по общепринятой схеме. При моделировании иммунохимических тест-систем применяли: выделение -цепей пара-хлормеркурибензоатом, истощение антисывороток путем иммуноаффинной хроматографии на Bio Gel P-200, электрофорез в агаре, иммуноэлектрофорез по Грабару и Уильямсу (Grabar P. et al. 1958).
Для индикации белков в био- и клиническом материале использовали:
- оптические методы определения: унифицированный гемоглобинцианидный метод (по инструкции Департамента государственного контроля качества, эффективности, безопасности лекарственных средств и медицинской техники МЗ РФ 17.06.2000), определение фетального гемоглобина по Зингеру в модификации Бетке (Betke, K. 1979); определение общего белка биуретовым методом (набор реагентов фирмы «Vital», экстинкцию измеряли на фотоэлектроколориметре «Spicol-11») или спектрофотометрически при 280 и 260 нм по Варбургу.
- иммунохимические методы: иммунодиффузионное титрование по Ouchterlony в модификации Н.И.Храмковой и Г.И.Абелева, РИД по Манчини в модификации Фехей и Мак-Келви (Fahey, J.L. 1965), ракетный электрофорез в агаровом геле в варианте Laurell C.B. и Merrill D в авторской модификации.
Для статистической обработки и анализа полученных результатов исследования, а также построения графиков был использован лицензионный пакет прикладных программ статистического анализа Excel-2003 (Microsoft), Statistica 6.0 (StatSoft. Inc.). Для каждой выборки вычисляли средние величины (М), среднее квадратичное отклонение (), среднюю ошибки средней арифметической (m). Проводили дисперсионный анализ с подсчетом степеней свободы (меж и вну) и критерия дисперсии (F). С целью определения значимости Р различий сопоставляемых величин применялся критерий t Стьюдента и однофакторный дисперсионный анализ с вычислением критерия F Фишера. Различие считали достоверным при Р<0,05. Для оценки межгрупповой зависимости проводился линейный корреляционный анализ Пирсона (коэффициент корреляции - r). Корреляция считалась высокой при приближении модульной величины r к единице. Статистические взаимосвязи между показателями оценивались применением корреляционного, регрессионного анализа и методов многомерной статистики (Гланц С., 1999).
Результаты исследования и их обсуждение
Сравнительное изучение физико-химических свойств основных типов гемоглобина (HbA1, HbA2, HbF и HbP) показало, что все изучаемые типы являются водорастворимыми хромопротеидами с электрофоретической подвижностью -глобулинов. Установлено, что все методы обратимого и необратимого осаждения, за исключением осаждения слабыми растворами кислот и щелочей, не позволяют разделять типы гемоглобина, однако могут быть использованы для очистки Hb от других белков и концентрирования препаратов гемоглобина. Показаны значительные отличия разных типов гемоглобина в способности осаждаться сульфатом аммония, что может быть использовано при их разделении. Установлено, что HbP резистентен к действию щелочей, но его устойчивость ниже, чем у HbF (табл. 4).
Экспериментально показано, что из четырех основных типов гемоглобина, как в ПААГ, так и в агарозном гелях максимальную электрофоретическую подвижность (как по альбумину, так и по гемоглобину А1) имеет эмбриональный гемоглобин, второй по скорости миграции - HbA1. В агарозном геле минимальную подвижность среди названных протеинов имеет HbA2, а в ПААГ – HbF (рис. 1). Степень корреляции относительной электрофоретической подвижности изучаемых протеинов, как по альбумину, так и по гемоглобину А1, оказалась положительной и высокой (в агарозе: r = 0,88; в ПААГ: r = 0,91).
Таблица 4
Сравнительный анализ физико-химических свойств гемоглобинов
| Ф/х свойства | HbA1 | HbA2 | HbF | HbP |
| Растворимость в воде | + | + | + | + |
| Отношение к осаждающим реагентам 0,5% риванол этанол | осаждается обратимо*** осаждается обратимо*** | осаждается обратимо*** осаждается обратимо*** | осаждается обратимо*** осаждается обратимо*** | осаждается обратимо*** осаждается обратимо*** |
| Отнощение к сульфату аммония (в % насыщенности): оптимум осаждения диапазон осаждения | 55* 30-65* | 50* 30-65* | 70* 40-80* | 65* 35-80* |
| Относительная электрофоретическая подвижность по альбумину: в агарозе в ПААГ | 0,258±0,009* 0,29-0,30** 0,610±0,022* 0,63-0,68** | 0,206±0,007* -**** 0,537±0,020* 0,51-0,525** | 0,217±0,008* 0,30-0,35** 0,512±0,019* 0,50-0,52** | 0,309±0,010* -**** 0,679±0,024* -**** |
| Изоэлектрическая точка | 7,0±0,1* 6,95-7,18** | 7,3±0,15* 7,4-7,6** | 7,1±0,13* 6,9-7,15** | 6,85±0,1* -**** |
| Резистентность к действию щелочей | Неустой-чив*** | Неустой-чив*** | Устой-чив*** | Относительно устойчив* Устойчив** |
| Пероксидазная и каталазная активность | Активен*** | Активен*** | Активен*** | Активен*** |
| Характеристические окраски: белки (амидочерный) общее железо (красная кровяная соль) на гемоглобины (бензидин, гваякол) гликопротеиды (Шифф) липопротеиды (судан) | +*** +*** +*** -*** -*** | +*** +*** +*** -*** -*** | +*** +*** +*** -*** -*** | +*** +*** +*** -*** -*** |
| Гомогенность | Гомогенен при э/ф в агарозе и ПААГ*** | Гомогенен при э/ф в агарозе и ПААГ*** | Гомогенен при э/ф в агарозе и ПААГ*** | Гомогенен при э/ф в агарозе, гетерогенен при э/ф в ПААГ*** |
* - собственные данные
** - данные других авторов (Стародуб Н.Ф. (1987), Иржак Л.И. (1985))
*** - собственные и литературные данные совпадают
-**** - данные в литературе отсутствуют
Можно констатировать несовпадение литературных и полученных нами средних значений относительной электрофоретической подвижности по HbA1 в ПААГ и агарозном геле и по HbF в агарозе. При этом полученные результаты заслуживают доверия в силу большой выборки количества проведенных идентичных экспериментов. Впервые получены статистически достоверные данные по относительной электрофоретической подвижности HbP в полиакриламидном и агарозном гелях и HbA2 в агарозном геле и значению его изоэлектрической точки (t=3,29; Р<0,01).
Получены новые данные по действию некоторых детергентов на HbP. Отмечено, что действие тритонов различных видов снижает электрофоретическую подвижность HbP, мочевина и бихромат калия не изменяют электрофоретической подвижности HbP, но делают его фракцию гетерогенной. Впервые показано, что ДСН меняет вектор электрофоретической подвижности HbP на противоположный и увеличивает скорость движения этого белка.
Разработка новых способов выделения и очистки по каждому из изучаемых типов гемоглобина проводилась с учетом полученных на предыдущем этапе данных. Разработаны и апробированы оригинальные способы очистки по каждому из изучаемых типов гемоглобина. Новизна разработок состоит, прежде всего, в подборе оптимального методического сочетания и алгоритма выполнения способа получения чистого препарата по каждому белку.
Наиболее эффективным по большинству показателей является разработанный способ выделения и очистки фетального гемоглобина (рис. 2). Применение данного алгоритма приводит к получению белка наибольшей степени очистки с высоким его процентом в полученном препарате. Кроме того, данный способ оказывается наиболее экономным по биопродукту, выход которого довольно высок (табл. 5).
Таблица 5
Анализ качества выделения HbF
| Основные этапы выделения | Общий белок, мг/л | Кол-во продукта, мг|л | Целевой продукт, % | Степень очистки HbF | Выход HbF (%) |
| Исходный материал | 240189±316,2 | 3751±68,0 | 1,56 | 1 | 100 |
| Получение гемолизата | 128163±293,9 | 3118±73,2 | 2,42 | 1,55 | 82,66 |
| Щелочное осаждение | 4651±188,5 | 2816±54,9 | 60,21 | 38,59 | 76,66 |
| Ионообменная хроматография | 2912±192,3 | 2542±46,5 | 85,58 | 54,86 | 67,73 |
= 30,81. F = 5,3.
Способ выделения HbA1 по эффективности и чистоте получаемого продукта практически не уступает способу очистки HbF, а по простоте и дешевизне превосходит его (табл. 6).
Таблица 6
Анализ качества выделения HbA1
| Основные этапы выделения | Общий белок, мг/л | Кол-во продукта, мг|л | Целевой продукт, % | Степень очистки HbA1 | Выход HbA1 (%) |
| Исходный материал | 215112±218,1 | 145039±172,9 | 67,44 | 1 | 100 |
| Получение гемолизата | 165128±221,5 | 138128±155,0 | 83,64 | 1,24 | 95,17 |
| Препаративный электрофорез | 53506±183,3 | 51640±129,3 | 95,52 | 1,42 | 35,62 |
| Разведение | 535±32,4 | 516,4±64,8 | 95,52 | 1,42 | 0,36 |
= 68,17. F = 4,8.
Менее эффективными по характеристикам оказались предлагаемые способы получения HbA2 и HbP (табл. 7 и 8; рис. 2). Это логично, учитывая, что HbA2 является минорным, а HbP получают из «грязного» абортивного материала сложным и трудоемким способом. Тем не менее, чистота каждого из полученных препаратов оказалось достаточной для получения качественных моновалентных иммунохимических антисывороток.
Очищенные препараты использовали, в частности, для получения специфических антисывороток методом иммунизации кроликов.
Таблица 7
Анализ качества выделения HbP
| Основные этапы выделения | Общий белок, мг/л | Кол-во продукта, мг|л | Целевой продукт, (%) | Степень очистки HbР | Выход HbР (%) |
| Исходный материал | 165019±492,8 | 1851±64,9 | 1,12 | 1 | 100 |
| Гомогенизация и экстрагирование | 36113±378,5 | 961±85,3 | 2,66 | 2,38 | 51,89 |
| Щелочное осаждение | 5451±91,6 | 630±77,1 | 11,56 | 10,32 | 34,05 |
| Ионообменная хроматография | 1770±79,2 | 565±58,0 | 31,92 | 28,50 | 30,54 |
=36,00. F = 6,1.
Таблица 8
Анализ качества выделения HbA2
| Основные этапы выделения | Общий белок, мг/л | Кол-во продукта, мг/л | Целевой продукт, (%) | Степень очистки HbA2 | Выход HbA2 (%) |
| Исходный материал | 221814±369,0 | 2951±155,8 | 1,33 | 1 | 100 |
| Получение гемолизата | 125603±294,5 | 2612±94,6 | 2,07 | 1,56 | 88,47 |
| Препаративный электрофорез | 26934±119,7 | 1931±89,7 | 7,17 | 5,39 | 65,42 |
| Ионообменная хроматография | 2361±128,6 | 834±39,6 | 35,32 | 26,564 | 28,26 |
= 51,88. F =6,4.
Иммунохимическое сопоставление полученной антисыворотки на HbP с антигенными композитами (рис. 3) показало ее специфичность по отношению к экстракту тканей эмбриона и очищенному препарату HbP. Идентификация методом иммуноэлектрофореза с экстрактом тканей эмбриона (рис. 4) также регистрировала одну дугу в зоне подвижности гемоглобинов. Линии преципитации давали положительное окрашивание бензидиновым и гваяколовым методами. Параллельное титрование нативного экстракта эмбриональной ткани и того же препарата, подвергнутого щелочной денатурации, показало, что в обоих случаях тестируемая антисыворотка работала идентично до одинаковых разведений, что служило свидетельством специфичности полученной антисыворотки к HbР.
Полученные антисыворотки на фетальный гемоглобин подвергались контролю качества по тому же алгоритму, что и антисыворотки на эмбриональный гемоглобин: ИДА, иммуноэлектрофорез, специфическое окрашивание и параллельное титрование нативного и подвергнутого щелочной денатурации препаратов HbF. По всем названным тестам показана полная моноспецифичность полученных антисывороток к HbF.
Иммунохимический анализ антисывороток на гемоглобин A2, как правило, выявлял дополнительную линию преципитации на HbA1, которая исчезала после истощения антисыворотки, методом аффинной сорбциии с -цепями гемоглобина (в авторской модификации). Контроль качества антисывороток на гемоглобины A1 и A2, проводимый методами иммунодиффузионного анализа, иммуноэлектрофореза и специфического окрашивания показал их полную специфичность.
В результате проведенной работы впервые разработана специфическая иммунохимическая тест-система на эмбриональный гемоглобин, в которой тест-антигеном является очищенный препарат HbР в рабочем разведении: 1/2 или экстракт тканей эмбриона (срок – 6-9 недель) в рабочем разведении 1/8-1/16. Порог чувствительности тест-системы 4,25±0,22 мг/л, (Р<0,01).
Смоделированы специфические иммунохимические тест-системы на: фетальный гемоглобин, в которой тест-антигеном является гемолизат пуповинной крови в рабочем разведении: 1/64-1/256, порог чувствительности 2,21±0,26 мг/л, (Р<0,005); гемоглобин А1, тест-антигеном является гемолизат крови взрослых доноров в рабочем разведении: 1/128-1/512, порог чувствительности 3,24±0,18 мг/л, (Р<0,01); гемоглобин А2, в которых тест-антигеном является очищенный препарат HbА2 в рабочем разведении: 1/32-1/64, порог чувствительности 4,42±0,19 мг/л, (Р<0,01).
Иммунохимические моновалентные антисыворотки были использованы для моделирования оптимальных способов индикации изучаемых типов гемоглобина.
Для количественного анализа фетального гемоглобина разработан способ ракетного электрофореза в агаровом геле в собственной модификации (патент №2310204. от 10.11.2007), основанный на полученных данных о повышении скорости электрофоретической миграции гемоглобинов, обработанных ДСН (рис. 5). Эмпирически подобраны оптимальные параметры проведения методики, построена стандартная калибровочная кривая. Корреляционный анализ Пирсона показал высокую прямую линейную зависимость концентрации HbF в исследуемых образцах от квадрата диаметра кольца преципитации (r=0,96; P<0,001). Преимущества способа: селективность; упрощение способа; высокая чувствительность (порог чувствительности 1,7±0,29 мг/л); точность (максимальная погрешность ±2%); достоверность определения, в том числе и при определении малых величин гемоглобина (Р<0,01; F=8,4); экономия временных трудозатрат (10-12 часов).
Предложен и успешно апробирован способ восходящей трехэтапной индикации HbP, включающий: РИД-тестирование в тест-системе с двойным наполнением лунки антисывороткой (порог чувствительности 2,13±0,19 мг/л); классическое РИД-тестирование (порог чувствительности 4,25±0,22 мг/л) и титрование в тест-системе в кратных разведениях антигена. В каждом последующем этапе тестировали только пробы, положительно прореагировавшие на предыдущем этапе.
Для определения HbP в материале с заведомо высокой концентрацией HbP разработан метод радиальной иммунодиффузии по Манчини в модификации Фехей и Мак-Келви. Сравнительный анализ качества предлагаемых методов определения эмбрионального гемоглобина (табл. 9) показал, что и полуколичесвенный анализ по Оухтерлони и количественный по Манчини, в равной степени, характеризуются высокой точностью, специфичностью, достоверностью и надежностью.
Таблица 9
Сравнительный анализ предлагаемых способов количественного определения HbP
| Характеристика | Полуколичесвенный анализ по Оухтерлони | Количественный анализ по Манчини |
| Избирательность регистрации HbР | Специфичен | Специфичен |
| Чувствительность | Порог чувствительности 2,17±0,33 мг/л | Порог чувствительности 2,8±0,4 мг/л |
| Точность получаемых результатов | Максимальная погрешность ±2,7% | Максимальная погрешность ±3,1% |
| Достоверность определения | Достоверен, Р<0,01 | Достоверен, Р<0,01 |
| Время проведения | Около 12 часов | Около 36 часов |
Разработаны и успешно апробированы способы количественного анализа HbА1 и HbA2, основанные на методе радиальной иммунодиффузии по Манчини в модификации Фехей и Мак-Келви. Способы отличаются: специфичностью, чувствительностью (порог чувствительности от 2,1±0,32 до 2,9±0,41 мг/л; =0,08); точностью (максимальная погрешность ±2,8%); достоверностью определения, в том числе и при определении малых величин гемоглобина (Р<0,01; F=6,9); экономией трудозатрат за счет сокращения времени методики (не более 12 часов).
Создана новая комплексная схема количественной оценки гемоглобинового спектра по основным типам гемоглобина. Алгоритм предлагаемой схемы включает: определение общего Hb унифицированным гемоглобинцианидным методом; определение HbA2, HbF и HbP (при необходимости) описанными методами иммунохимической индикации и определение уровня HbА1, как разности между количеством общего Hb и HbA2, HbF, HbP.
В рамках этой работы проведен сравнительный анализ HbА1 HbА2 и HbF описанными иммунохимическими способами, параллельно с определением общего Hb гемоглобинцианидным методом, в большой выборке доноров (табл. 10). Анализ показал, что средние значения концентрации HbА1 HbА2 и HbF, в пересчете на относительные единицы от общего Hb составляют 94,3%, 2,1% и 2,9% соответственно.
Таблица 10
Показатели общего гемоглобина и его изоформ в исследуемой группе
| Тип Hb | Методика определения | Концентрация (г/л) | % Hb | |
| Общий Hb | Унифицированный гемоглобинцианидны метод | 145,8±24,4 | 15,62 | 100 |
| HbА1 | Радиальная иммунодиффузия по Манчини в модификации Фехей и Мак-Келви | 137,5±19,7 | 13,09 | 94,3 |
| HbA2 | Радиальная иммунодиффузия по Манчини в модификации Фехей и Мак-Келви | 3,07±0,12 | 0,10 | 2,1 |
| HbF | Ракетный электрофорез в предлагаемой модификации | 4,24±0,19 | 0,16 | 2,9 |
Статистический анализ показал высокую положительную корреляцию между суммой концентраций HbА1, HbA2 и HbF (в мг/л), определенных иммунохимически и концентрацией общего гемоглобина, определенной гемоглобинцианидным методом (r=0,98). Ошибка метода составляет 0,68%.
Преимущества разработанной схемы: комплексность анализа по общему Hb и важнейшим его изоформам; специфичность; высокая чувствительность (порог чувствительности от 1,7±0,29 до 2,13±0,3 мг/л); точность (максимальная погрешность ±1,2%); достоверность определения (р<0,001); экономия трудозатрат за счет исключения из общей схемы этапа иммунохимического определения HbА1.
Разработанные на предыдущем этапе алгоритмы выявления HbF и HbP были успешно использованы для анализа продукции антенатальных типов гемоглобина (HbF и HbP) в раннем эмбриогенезе человека.
Настоящее исследование позволило иммунохимическим путем количественно определить динамику продукции HbР и HbF в раннем эмбриогенезе (рис. 6). Проведен полный анализ динамики концентраций HbР и HbF в доступном временном диапазоне гестационного возраста. Полученные данные являются достоверными и характеризуются малым разбросом и удовлетворительной дисперсией средних величин (F - от 5,6 до 6,3).
Иммунохимически определены сроки начала продукции антенатальных гемоглобинов: HbР - с 4-й недели ГВ, HbF – с 5-й недели. Показана высокая достоверная зависимость продукции антенатальных гемоглобинов от сроков гестации (в диапазоне с 4 по 12 неделю). Для эмбрионального гемоглобина эта корреляция является нелинейной отрицательной (r=-0,898); для фетального гемоглобина – положительной (r=0,936), т.е. динамика изменений количественных показателей HbР и HbF в эмбриогенезе носила разнонаправленный характер (r = -0,94).
В изучении клинико-диагностического значения иммунохимических тест-систем на гемоглобины типов А1, А2, F и P наибольшего внимания заслуживают результаты по трем нозологическим группам: миелоприлиферативные заболевания крови, патология новорожденных, сопровождающаяся хронической гипоксией и наркологическая патология. Данные по количественному анализу HbA1 и HbA2 во всех перечисленных группах заболеваний, не имели достоверных отличий от аналогичных репрезентативных показателей в группах здоровых лиц, следовательно, имели информативную ценность нулевой гипотезы. Сведения по антенатальным типам гемоглобина (HbF и HbP), напротив, отличались новизной и фундаментально-прикладной значимостью.
При анализе гемоглобинового спектра в крови больных миелопролиферативными заболеваниями мы исходили из предположения, что названные формы патологии, связанные с понижением степени дифференцировки клеток миелоидного ростка (в т.ч. и эритроидных клеток) должны сопровождаться индукцией генов эмбриоспецифических белков, в частности, -гена HbP и -гена HbF.
Как и ожидалось, исходя из цитологической специфики данных опухолей эмбриональный гемоглобин не выявлен в контрольной группе и у больных острым и хроническим лимфолейкозом. Уровень фетального гемоглобина в крови больных острым и хроническим лимфолейкозами также не имел достоверных отклонений от такового в группе контроля (P>0,3).
Эмбриональный гемоглобин впервые выявлен в крови больных эритремией (частота выявления 67,78%), сублейкемическим миелозом (49,41%), острым (24,44%) и хроническим миелолейкозом (и 20,53%). Причем средние концентрации эмбрионального гемоглобина в выборках с положительным результатом были близки к порогу чувствительности разработанной тест-системы на HbP в классическом РИД-тестировании (4,25±0,22 мг/л). Средняя концентрация HbP у больных эритремией составила 4,07±0,23 мг/л; сублейкемическим миелозом - 3,89±0,25 мг/л; острым миелолейкозом - 3,71±0,20 мг/л; хроническим миелолейкозом - 3,27±0,19 мг/л. Математический анализ полученных результатов показал их статистическую значимость (Р<0,005; t>4,95; F>5,2) (рис. 7).
Отмечено значительное достоверное (t>4,66; Р<0,005) повышение концентарции фетального гемоглобина в крови больных эритремией (на 78,8% выше референтных значений), сублейкемическим миелозом (на 42,7%), острым (на 58,06%) и хроническим (на 70,20%) миелолейкозом.
Для максимальной верификации полученных результатов по HbF, в тех же выборках было проведено их конвертирование в относительные величины: процент от общего гемоглобина в каждой нозологической группе. Полученные данные (в %), в целом адекватно соотносились с результатами иммунохимического тестирования HbF (в мг/л) (рис. 8).
Полученные результаты свидетельствуют, что эмбриональный и фетальный гемоглобины могут рассматриваться как канцероэмбриональные антигены, иммунохомическая регистрация которых может повысить качество диагностики миелопролиферативных заболеваний. Следует отметить, что в силу дешевизны, простоты и доступности (для проведения тестов на HbP и HbF по предложенной схеме достаточно 0,1 мл крови из пальца), разработанные иммунохимические тесты на HbP и HbF могут применяться в скрининг-обследовании групп риска по данной нозологии.
Проведен широкий иммунохимический анализ гемоглобинового спектра у новорожденных с внутриутробной гипоксией и сопутствующей патологией (табл. 11). Показано значительное достоверное (t=5,52; Р<0,002; F>4,8) повышение уровня HbF в крови новорожденных с тяжелой внутриутробной гипоксией (на 30,08% выше, чем в группе контроля), и, особенно, с задержкой внутриутробного развития в сочетании с тяжелой внутриутробной гипоксией (на 68,46%). Концентрация HbF в крови новорожденных с массой тела менее 1000 г, наоборот, оказалась на 58,25% ниже, чем в контрольной группе (t=7,3; Р<0,001; F=9,2).
Таблица 11
Результаты количественного определения HbF у новорожденных
по клиническому диагнозу
| Исследуемые группы | n | Концентрация HbF (мг/л) | Стандартное отклонение () |
| Здоровые дети (контрольная группа) | 62 | 1096,7±64,1 | 45,3 |
| Дети с тяжелой внутриутробной гипоксией | 52 | 1426,6±73,5 | 52,1 |
| Дети с тяжелой ВГ и задержкой внутриутробного развития | 43 | 1847,7±98,2 | 69,7 |
| Дети с тяжелой ВГ и глубокой недоношенностью (масса тела не более 1000 г.) | 39 | 458,1±32,0 | 23,8 |
| Всего | 196 |
по генеральной совокупности 4,95. F = 6,8.
Сравнительный иммунохимический анализ HbF у новорожденных по половому признаку впервые показал, что уровень фетального гемоглобина в крови новорожденных девочек достоверно (t=4,8; Р=0,001; F=7,1) превышает таковой у новорожденных мальчиков (рис. 9). И если в группе здоровых детей эта разница невелика, то в группе новорожденных с внутриутробной гипоксией уровень HbF в крови новорожденных девочек значительно выше, чем у мальчиков (t=7,2; Р<0,0005; F=6,7).
HbP не выявлялся иммунохимически в крови здоровых новорожденных и в крови новорожденных с различными формами внутриутробной гипоксии легкой и средней степени тяжести.
Эмбриональный гемоглобин впервые выявлен в крови новорожденных с тяжелой внутриутробной гипоксией (33,82% от общей выборки). Показано, что в крови новорожденных девочек с тяжелой степенью ВГ HbP выявлялся в два раза чаще (табл. 12), чем у новорожденных мальчиков с той же патологией (42,76% и 23,85% соответственно). Анализ статистической значимости полученных результатов показал высокую степень достоверности как по нозологическому (Р=0,001; F=8,6), так и по половому признаку (Р=0,003; F=6,4).
Определение концентрации HbP (полуколичественный анализ) проводилось только у пациентов с положительным тестом на этот белок. Средняя концентрация эмбрионального гемоглобина в крови новорожденных с тяжелой внутриутробной гипоксией с позитивной индикацией составила 3,81±0,21 мг/л; среди них, у девочек - 3,96±0,24 мг/л; у мальчиков - 3,65±0,18 мг/л.
Таблица 12
Частота выявления HbP у новорожденных с внутриутробной гипоксией
тяжелой степени
| Пол | Число обследованных | Среднее число положительных тестов на HbP | Частота выявления (в %) |
| Мальчики | 26 | 6,2 | 23,85 |
| Девочки | 29 | 12,4 | 42,76 |
| Всего | 55 | 18,6 | 33,82 |
Повышение уровня HbF и появление HbP при гипоксии, очевидно, объясняется тем, что эти протеины имеет бльшее сродство к кислороду, чем гемоглобин взрослого, следовательно увеличение уровня антенатальных гемоглобинов в крови способствует более оптимальному тканевому газообмену в условиях тканевой гипоксии. Значительный разброс средних концентраций HbF и частоты выявления HbP в крови новорожденных мальчиков и девочек с внутриутробной гипоксией можно объяснить более высокими компенсаторными возможностями женского организма в этом онтогенетическом периоде.
Иммунохимический анализ гемоглобинового спектра у наркологических больных с алкогольной зависимостью и опийной наркоманией дал ценные сведения по HbF. Впервые показно значительное превышение концентрации фетального гемоглобина в крови больных алкогольной зависимостью и опийной наркоманией почти в три раза, по сравнению с уровнем концентрации HbF в крови доноров контрольной группы (табл. 13). Анализ статистической значимости полученных результатов показал высокую степень достоверности как в группе больных опийной наркоманией (t=7,21; Р<0,001), так и в группе больных алкоголизмом (t=6,38; Р<0,001).
Таблица 13
Результаты количественного определения HbF в крови
наркологических больных и здоровых доноров
| Исследуемая группа | n | Концентрация HbF (мг/л) | Стандартное отклонение () | Процент HbF от общего Hb |
| Кровь больных алкоголизмом | 44 | 1631±83 | 68,69 | 3,76 |
| Кровь больных опийной наркоманией | 52 | 1848±99 | 74,01 | 4,26 |
| Кровь здоровых (контрольная группа) | 42 | 650±47 | 36,23 | 1,51 |
по генеральной совокупности 60,81, F = 5,7. меж = 2.
Активация -гена фетального гемоглобина у наркологических больных, по нашему мнению, объясняется тем, что метаболические нарушения, возникающие в результате хронической интоксикации психоактивными веществами, затрагивают процессы аэробного окисления, что неизбежно приводит к развитию гипоксических состояний. А HbF, как было сказано выше является хромопротеидом, эволюционно адаптированным к стабилизации тканевого газообмена в условиях хронической гипоксии. С другой стороны, возможно в результате хронической интоксикации ПАВ, в некоторых гемопоэтических стволовых клетках возникает трансформация генетических структур, ведущая к изменению интенсивности синтеза фетального гемоглобина.
ВЫВОДЫ
1. Получены новые достоверные сведения (Р<0,01) по некоторым физико-химическим свойствам эмбрионального гемоглобина: относительной электрофоретической подвижности в полиакриламидном и агарозном гелях, изоэлектрической точке, степени щелочной резистентности и отношению к осаждающим агентам. Аналогичные сведения по HbA1, HbA и HbF уточнены и дополнены.
2. Отмечено изменение электрофоретической подвижности HbP под действием тритонов, мочевины и бихромата калия. Показано, что ДСН меняет вектор электрофоретической подвижности гемоглобинов на противоположный и увеличивает их скорость движения, что было положено в основу разработки способа количественного определения HbF.
3. Разработаны и апробированы эффективные алгоритмы выделения и очистки четырех типов гемоглобина со степенью чистоты HbF - 85,58%; HbР -30,54%; HbA1 - 95,52%; HbA2 - 35,32%, позволившие получить моновалентные антисыворотки на HbA1, HbA2, HbF и HbP.
4. Впервые сконструирована селективная иммунодиффузионная тест-система на эмбриональный гемоглобин с порогом чувствительности 4,25±0,22 мг/л и смоделированы иммунохимические тест-системы на фетальный гемоглобин с чувствительностью 2,21±0,26 мг/л; на гемоглобин А1 и А2- с порогом чувствительности 3,24±0,18 мг/л и 4,42±0,19 мг/л соответственно.
5. Разработаны и успешно апробированы оптимальные алгоритмы количественного анализа изучаемых типов гемоглобина, отличающиеся простотой, специфичностью (Р<0,01), точностью (погрешность <3%), экономичностью: индикация HbP модифицированным методом двойной иммунодиффузии (чувствительность 2,17±0,33 мг/л); количественное определение HbF методом ракетного иммуноэлектрофореза (чувствительность 1,7±0,29 мг/л); количественный анализ HbA1 и HbA2 по Манчини (чувствительность 2,1±0,32 мг/л и 2,9±0,41 мг/л соответственно).
6. Создана и успешно апробирована на больших выборках клинического материала комплексная схема количественной оценки гемоглобинового спектра по основным типам гемоглобина, отличающаяся специфичностью, надежностью (коэффициент Пирсона 0,98), чувствительностью (порог от 1,7±0,29 до 2,13±0,3 мг/л), точностью (±1,2%), достоверностью (р<0,001), экономичностью.
7. Показана высокая достоверная зависимость продукции антенатальных гемоглобинов от сроков гестации в раннем эмбриогенезе человека (4-12 недель гестации): для эмбрионального гемоглобина корреляция является нелинейной отрицательной, r=-0,89; для фетального – положительной, r=0,94. Установлены сроки начала продукции HbР с 4-й недели гестационного возраста, HbF – с 5-й недели.
8. Доказано значение HbP и HbF как канцероэмбриональных антигенов в диагностике миелопролиферативных заболеваний: Эмбриональный гемоглобин впервые выявлен в крови больных эритремией (частота выявления 67,78%), сублейкемическим миелозом (49,41%), острым (24,44%) и хроническим миелолейкозом (20,53%). Отмечено достоверное повышение концентрации фетального гемоглобина в крови больных эритремией (превышение референтных значений на 78,8%), сублейкемическим миелозом (на 42,7%), острым (на 58,06%,) и хроническим (на 70,20%) миелолейкозом.
9. Определена диагностическая роль тестов на HbP и HbF при патологии новорожденных: впервые выявлен HbP в крови новорожденных с тяжелой внутриутробной гипоксией (33,82%); отмечено повышение уровня HbF в крови новорожденных с тяжелой внутриутробной гипоксией на 30,08%, - с ЗВУР в сочетании с тяжелой внутриутробной гипоксией на 68,46% и снижение концентрации HbF в крови новорожденных с массой тела менее 1000 г на 58,25%. Отмечена корреляция уровней HbP и HbF с полом новорожденных (r=0,96 и r=0,93).
10. Установлено диагностическое значение иммунохимического теста на фетальный гемоглобин при наркологической патологии. Впервые отмечено достоверное превышение концентрации фетального гемоглобина в крови больных опийной наркоманией (на 184,3% превышает полученные референтные величины) и алкогольной зависимостью (выше на 150,9%) (Р<0,001).
Практические рекомендации
1. При очистке основных типов гемоглобина рекомендуется использовать методы фракционирования, основанные на разделении по изоэлектрической точке (с учетом полученных данных по величинам рI): ионообменную хроматографию и препаративный электрофорез. При применении электрофоретических методов разделения гемоглобинов в качестве рабочего буфера эффективнее использовать буферы с рН от 6,0 до 6,6 (цитратный, ацетатный и др.). На ранних этапах выделения HbP использовать модифицированную методику щелочной денатурации с 40-секундной экспозицией в 1,2 н NaOH.
2. При получении антисывороток на HbA2, HbF и HbP использовать только очищенные препараты этих протеинов. Иммунизацию проводить по описанной комбинированной схеме (адъювант Фрейнда и алюмовокалиевые квасцы). Проводить истощение -цепями гемоглобина на Bio-Gel 300. При иммунизации препаратом HbA1, эффективно его предварительное разведение в 500-2000 раз.
3. Внедрить в клинико-лабораторную практику метод ракетного иммуноэлектрофореза с ДСН для количественного определении HbF; трехэтапную методику РИД-тестирования при индикации HbP; РИД по Манчини в количественном анализе HbA1 и HbA2. При применении названных методов определения гемоглобинов пользоваться смоделированными калибровочными графиками.
4. Внедрить разработанную схему количественного анализа гемоглобинового спектра для комплексной оценки уровней HbA1, HbA2, HbF и HbP.
5. Рекомендуется использовать разработанные тесты на HbF и HbP при скрининг-анализе и диагностике миелопролиферативных заболеваний: эритремии, сублейкемического миелоза, острых и хронических миелолейкозов.
6. Дополнять классические схемы оценки степени тяжести и прогноза гипоксии новорожденных, ЗВУР и глубокой недоношенности, иммунохимическими тестами на эмбриональный и фетальный гемоглобины.
7. В оценке тяжести и эффективности лечения больных опийной наркоманией и алкогольной зависимостью целесообразно дополнение общепринятых схем тестом на HbF.
Список работ, опубликованных по теме диссертации
- Nikulina D.M., Kriventsev Y.A., Djachina M.N. Immunochemical test-systems for diagnostics and estimations to efficiency of the treatment of the inflammatory process // International journal of immunorehabilitation. - Israel. - Maj 2000. - V.2. - №2. P.12.
- Агапова А.Б., Дьякова О.Н., Кривенцев Ю.А. Разработка диагностической иммунодиффузионной тест-системы на фетальный гемоглобин // Материалы конференции молодых ученых с международным участием “Белки-маркеры патологических состояний”. – Астрахань-Москва. – 2001. – С.101-102.
- Агапова А.Б., Кривенцев Ю.А. Получение чистого антигена и моделирование тест-системы на фетальный гемоглобин // Материалы 82-й итоговой студенческой научной конференции АГМА. Астрахань. - 2001. – С.13.
- Никулина Д.М., Дьякова О.Н., Кривенцев Ю.А., Корноухова И.Ю., Агапова А.Б. Фетальный гемоглобин как тест для диагностики гипоксических состояний // Материалы III съезда биохимического общества РАН. – С-Пб. 2002. – С.131.
- Никулина Д.М., Сентюрова Л.Г., Кривенцев Ю.А., Агапова А.Б., Дьякова О.Н. Отчет о научно-исследовательской работе разработка иммунохимических тест-систем для выявления и оценки гипоксических состояний и деструкции тканей в организме человека // Отчет включен в национальный фонд РФ. Инвентарный № 02.2.00403489.
- Метелкина Е.В., Коханов А.В., Агапова А.Б., Кривенцев Ю.А., Суринков Д.Б. Железосодержащие белки в остром периоде черепно-мозговой и скелетной травмы // Материалы научно-практической конференции и школы-семинара для молодых учёных с международным участием «Современные достижения фундаментальных наук в решении актуальных проблем медицины». - Астрахань-Москва. – 2004. – с.114-118.
- Бисалиева Р.А., Кривенцев Ю.А., Никулина Д.М., Краморенко П.В. Разработка способа выделения эмбрионального гемоглобина и моделирование иммунохимической тест-системы на него / Материалы научно-практической конференции с международным участием «Достижения фундаментальных наук в решении актуальных проблем медицины». – Астрахань-Волгоград-Москва. – 2006. – С.34-37.
- Кривенцев Ю.А., Бисалиева Р.А., Ковалева Н.А., Лада Л.В. Получение специфической антисыворотки на фетальный гемоглобин / Материалы научно-практической конференции с международным участием «Достижения фундаментальных наук в решении актуальных проблем медицины». – Астрахань-Волгоград-Москва. – 2006. – С.62-65.
- Коханов А.В., Метелкина Е.В., Кривенцев Ю.А., Белопасов В.В. Суточные ритмы показателей системы эритрона у больных с тяжелой черепно-мозговой травмой / Труды Астраханской государственной медицинской академии. – Астрахань. – 2006. - Т.33. – С.264-267.
- Кривенцев Ю.А., Бисалиева Р.А., Никулина Д.М., Краморенко П.В., Семенова Т.Б. Иммунохимический анализ продукции эмбрионального гемоглобина в раннем эмбриогенезе человека / Материалы научно-практической конференции с международным участием «Достижения фундаментальных наук в решении актуальных проблем медицины». – Астрахань-Волгоград-Москва. – 2006. – С.58-62.
- Кривенцев Ю.А., Никулина Д.М., Бисалиева Р.А., Пичугина Н.А. Разработка способа количественного определения фетального гемоглобина человека / Материалы научно-практической конференции с международным участием «Достижения фундаментальных наук в решении актуальных проблем медицины». – Астрахань-Волгоград-Москва. – 2006. – С.65-68.
- Никулина Д.М., Кривенцев Ю.А., Бахмутова Л.А., Бисалиева Р.А., Штепо М.В., Лапеко С.В. Определение эмбрионального гемоглобина в крови новорожденных с внутриутробной гипоксией / Материалы научно-практической конференции с международным участием «Достижения фундаментальных наук в решении актуальных проблем медицины». – Астрахань-Волгоград-Москва. – 2006. – С.72-73.
- Коханов А.В., Метелкина Е.В., Кривенцев Ю.А., Белопасов В.В. Суточные ритмы показателей системы эритрона у больных с тяжелой черепно-мозговой травмой // Труды Астраханской государственной медицинской академии. – Астрахань. – 2006. - Т.33. – С.264-267.
- Кривенцев Ю.А., Бисалиева Р.А., Носков И.А. Изучение воздействия детергентов на эмбриональный гемоглобин // Вестник Астраханского государственного технического университета. - Астрахань. – 2006. - №6. - Т.35. – С.69-72.
- Бахмутова Л.А., Кривенцев Ю.А., Огуль Л.А. Выявление эмбрионального гемоглобина в крови новорожденных с внутриутробной гипоксией // Вопросы практической педиатрии. – М. – 2006. – Т.1. - №4. – С.12.
- Кривенцев Ю.А., Никулина Д.М., Бисалиева Р.А., Борисова Н.Б., Бисалиев Р.В. Экспрессия -гена эмбрионального гемоглобина при гематологической патологии // Успехи современного естествознания. – М. – 2007. - №3. – С.72-75.
- Кривенцев Ю.А., Никулина Д.М., Бисалиева Р.А. Иммунохимический анализ концентрации фетального гемоглобина в крови новорожденных мальчиков и девочек с внутриутробной гипоксией // Омский научный вестник. – Омск. – 2006. - №9. – Т.46. – С.272-274.
- Кривенцев Ю.А., Никулина Д.М., Бисалиева Р.А., Борисока Н.В. Иммунохимический анализ содержания эмбрионального гемоглобина в крови больных с онкогематологической патологией // Омский научный вестник. – Омск. – 2006. - №8. – Т.44. – С.279-281.
- Кривенцев Ю.А., Бисалиева Р.А., Никулина Д.М., Носков А.И. Моделирование нового способа количественного анализа плодового гемоглобина человека // Фундаментальные исследования. М. 2007. №4. С.76-78.
- Кривенцев Ю.А., Бисалиева Р.А., Семенова Т.Б., Никулина Д.М., Краморенко П.В. Изучение относительной электрофоретической подвижности анте- и постнатальных типов гемоглобина человека / Астраханский медицинский журнал. – Астрахань. – 2007. - №2. – С.102.
- Никулина Д.М., Кривенцев Ю.А., Бахмутова Л.А., Бисалиева Р.А., Лапеко С.В., Штепо М.В., Огуль Л.А. Фетальный и эмбриональный типы гемоглобина в крови новорожденных с внутриутробной гипоксией / Астраханский медицинский журнал. – Астрахань. – 2007. - №2. – С.132-133.
- Бисалиева Р.А., Кривенцев Ю.А., Яблокова И.Ю., Ким И.В., Вафина Р.А. Изучение подходов к выделению и очистке эмбрионального гемоглобина / Материалы конференции молодых ученых АГМА. – 2007. – С.30-31.
- Кико Е.Е., Бисалиева Р.А., Кривенцев Ю.А., Ким И.В., Яблокова И.Ю., Вафина Р.А. Иммунохимическое определение эмбрионального гемоглобина у больных гемобластозами / Материалы VI Всероссийской конференции молодых ученых «Актуальные вопросы клинической и экспериментальной онкологии». – М. – 2007. – С.107-109.
- Кривенцев Ю.А., Никулина Д.М., Бисалиева Р.А. Гемоглобины человека // Вестник Астраханского государственного технического университета. - Астрахань. – 2007. - №6. - Т.41. – С.34-41.
- Кривенцев Ю.А., Никулина Д.М. Строение и биологическая роль белков гемоглобинового профиля / Гриф УМО 897 от 10.12.2007. Изд-во АГМА, Астрахань, 2007. 101 с.
- Кривенцев Ю.А., Никулина Д.М., Бисалиева Р.А. Способ количественного определения фетального гемоглобина человека // Бюллетень «Изобретения. Полезные модели». - М. - 10.11.2007. - №31 (III ч.), С.666.
- Никулина Д.М., Воробьева Т.Б., Кривенцев Ю.А. Стадиоспецифические белки как маркеры развития плода и состояния новорожденного // Материалы IV съезда Российского общества биохимиков и молекулярных биологов. – Новосибирск. – 2008. – С.474.
- Бисалиева Р.А., Кривенцев Ю.А., Краморенко П.В. Иммунохимический анализ продукции фетального гемоглобина в раннем эмбриогенезе человека // Материалы конференции молодых ученых ГОУ ВПО «АГМА Росздрава». – Астрахань. – 2008. – С.4-6.
- Бисалиева Р.А., Кривенцев Ю.А., Никулина Д.М., Краморенко П.В., Дьячкова Т.Б. Иммунохимический анализ продукции антенатальных гемоглобинов в раннем эмбриогенезе человека // Российский иммунологический журнал (РАН). – М. «Наука». 2008. – Т.2(11), № 2-3. С. 327.
- Кривенцев Ю.А., Никулина Д.М., Бисалиева Р.А. Моделирование нового способа определения плодового гемоглобина человека // Астраханский медицинский журнал. – Астрахань. – 2008. – Т.3. - №2. – С.53-55.
- Кривенцев Ю.А., Бисалиева Р.А., Батуев Д.Г., Яблокова И.Ю., Вафина Р.А.., Мустафаев И.М.-А. Пополнение сведений по физико-химическим свойствам гемоглобина типов: A1, A2, F и P // Материалы 6-й международной научно-практической конференции «Достижения фундаментальных наук в решении актуальных проблем медицины». –Астраханский медицинский журнал. Астрахань-Москва. 2008. Т.3. №3. С.20-22.
- Кривенцев Ю.А., Никулина Д.М., Заклякова Л.В., Бисалиева Р.А., Борисова Н.В., Кико Е.Е., Ким И.В. Иммунохимический тест на антенатальные гемоглобины в гематологии // Материалы 6-й международной научно-практической конференции «Достижения фундаментальных наук в решении актуальных проблем медицины». – Астраханский медицинский журнал. – Астрахань-Москва. – 2008. – Т.3. - №3. – С.106-110.
- Коханов А.В., Никулина Д.М., Кривенцев Ю.А., Белопасов В.В., Метелкина Е.В. Фетальный гемоглобин как маркер гипоксии при черепно-мозговой травме // Материалы 6-й международной научно-практической конференции «Достижения фундаментальных наук в решении актуальных проблем медицины». – Астраханский медицинский журнал. – Астрахань-Москва. – 2008. – Т.3. - №3. – С.171-173.
- Никулина Д.М., Кривенцев Ю.А., Бисалиева Р.А. Иммунохимический тест на примитивный гемоглобин: перспективы внедрения.// Материалы 6-й международной научно-практической конференции «Достижения фундаментальных наук в решении актуальных проблем медицины». – Астраханский медицинский журнал. – Астрахань-Москва. – 2008. – Т.3. - №3. – С.185-188.
- Бисалиева Р.А., Кривенцев Ю.А., Бисалиев Р.В., Кальной В.С. Иммунохимический анализ фетального гемоглобина в крови наркологических больных // Наркология. – М. – 2009. - №1(85). – С.95-97.
- Кривенцев Ю.А., Бисалиева Р.А., Никулина Д.М. Модификация способа количественного анализа эмбрионального гемоглобина человека // Материалы межрегиональной научно-практической конференции «Актуальные проблемы кардиологии детей и взрослых-2009». – Астрахань. 2009. С.138-140.
- Бисалиева Р.А., Штепо М.В., Кривенцев Ю.А., Никулина Д.М. Железосодержащие белки в крови новорожденных с внутриутробной гипоксией // Материалы международна наукова конференцiя студентiв та молодих вчених «Молодь медицинi майбутнього». – Одесса. – 2009. – С.71.
- Кривенцев Ю.А., Бисалиева Р.А., Никулина Д.М., Носков А.И. Разработка оптимального алгоритма для создания иммунохимической тест-системы на примитивный гемоглобин человека // Вестник российской военно-медицинской академии. - С.-Пб. – 2009. - №1(25). – С.450.
- Никулина Д.М., Кривенцев Ю.А., Бахмутова Л.А., Бисалиева Р.А., Лапеко С.В. Эмбриональный гемоглобин как критерий оценки гипоксии новорожденных // Вестник российской военно-медицинской академии. - С.-Пб. – 2009. - №1(25). – С.450-451.
- Бахмутова Л.А., Кривенцев Ю.А., Никулина Д.М., Лапеко С.В., Бисалиева Р.А. Антенатальные гемоглобины в оценке течения раннего неонатального периода у новорожденных с задержкой внутриутробного развития // Вестник российской военно-медицинской академии. - С.-Пб. – 2009. - №1(25). – С.451.
- Бахмутова Л.А., Никулина Д.М., Кривенцев Ю.А. Клиническое значение изучения антенатальных типов гемоглобина для прогноза ранней адаптации у недоношенных новорожденных детей // Вопросы современной педиатрии. – 2009. – Т.8. - №2. – С.120-122.
Патент на изобретение
Кривенцев Ю.А., Никулина Д.М., Бисалиева Р.А. Способ количественного определения фетального гемоглобина человека // Патент на изобретение №2310204. Зарегистрировано в Государственном реестре изобретений РФ 10.11.2007. г. Москва. – 7 с.
Список использованных сокращений
| Hb | гемоглобин |
| HbA1 и HbA2 | гемоглобины взрослого |
| HbP | эмбриональный или примитивный гемоглобин |
| HbF | фетальный гемоглобин |
| pI | изоэлектрическая точка |
| вну | внутригрупповая степень свободы |
| АФП | альфа-фетопротеин |
| ВГ | внутриутробная гипоксия |
| ГВ | гестационный возраст |
| ГПХ (ГФ) | гель-проникающая хроматография (гель-фильтрация) |
| ДСН | додецилсульфат натрия |
| ЗВУР | задержка внутриутробного развития |
| ИДА | иммунодиффузионный анализ |
| ИФА | иммуноферментный анализ |
| ИХ | ионообменная хроматография |
| ИХА | иммунохимический анализ |
| ОЭП | относительная электрофоретическая подвижность |
| ПААГ | полиакриламидный гель |
| ПАВ | психоактивные вещества |
| ПК | пуповинная кровь |
| РИД | радиальная иммунодиффузия |
КРИВЕНЦЕВ
Юрий Алексеевич
ГЕМОГЛОБИНЫ ЧЕЛОВЕКА: ИММУНОБИОХИМИЧЕСКАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА И МЕДИКО-БИОЛОГИЧЕСКОЕ ЗНАЧЕНИЕ
03.00.04. Биохимия
Автореферат
диссертации на соискание ученой степени
доктора медицинских наук
Тираж 100 экз. Подписано в печать 14.09.09 г. Заказ № 2679
Издательство ГОУ ВПО «Астраханская государственная медицинская академия Росздрава», 414000, г. Астрахань, ул. Бакинская, 121
