Сравнительная характеристика природных и клинических изолятов сryptococcus neoformans
На правах рукописи
БОСАК
Илья Алексеевич
СРАВНИТЕЛЬНАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА ПРИРОДНЫХ И КЛИНИЧЕСКИХ ИЗОЛЯТОВ СRYPTOCOCCUS NEOFORMANS
03.00.24 – микология
Автореферат
диссертации на соискание ученой степени
кандидата медицинских наук
Санкт–Петербург
2009
Работа выполнена в Научно–исследовательском институте медицинской микологии им. П.Н. Кашкина Государственного образовательного учреждения дополнительного профессионального образования «Санкт-Петербургская медицинская академия последипломного образования Федерального агентства по здравоохранению и социальному развитию»
Научный руководитель:
доктор биологических наук Васильева Наталья Всеволодовна
Официальные оппоненты:
доктор медицинских наук, профессор Романюк Фёдор Петрович
доктор медицинских наук, профессор Афиногенов Геннадий Евгеньевич
Ведущая организация: ГОУ ВПО «Санкт-Петербургская государственная химико-фармацевтическая академия Федерального агентства по здравоохранению и социальному развитию»
Защита диссертации состоится «___»________ 200 г в ____ часов на заседании диссертационного совета Д.208.089.04 при Государственном образовательном учреждении дополнительного профессионального образования «Санкт-Петербургская медицинская академия последипломного образования Федерального агентства по здравоохранению и социальному развитию» (191015, Санкт-Петербург, ул. Кирочная, д. 41)
С диссертацией можно ознакомиться в фундаментальной библиотеке ГОУ ДПО «Санкт-Петербургская медицинская академия последипломного образования Федерального агентства по здравоохранению и социальному развитию» (195196, Санкт-Петербург, Заневский пр, д. 1/82)
Автореферат разослан «___»_____________200 г.
Ученый секретарь диссертационного совета
доктор медицинских наук М.А. Шевяков
Актуальность темы: Базидиомицетовые капсулированные дрожжи Cryptococcus neoformans и C. gattii вызывают поражение центральной нервной системы у иммунокомпрометированных и реже у иммунокомпетентных лиц. Частота заболевания криптококкозом составляет 0.2–0.9 на 100 000 населения (Murphy W.J., 2009г). По данным Центра по контролю за заболеваниями (CDC, США), в мире ежегодно регистрируют 1 млн. случаев криптококкоза у ВИЧ–инфицированных больных, из них 680 000 погибают (Perfect J., 2008). Данные о частоте криптококкоза в России отсутствуют. В последние годы отмечен рост числа зарегистрированных случаев криптококкоза в Санкт–Петербурге (Н.В. Васильева, 2005; Н.В. Васильева и др. 2009).
C. neoformans включает две разновидности и три серотипа: C. neoformans var. grubii (серотип А), C. neoformans var. neoformans (серотип D) и гибрид (серотип АD). C. gattii включает два серотипа – В и С. Не для всех серотипов C. gattii известны экологические ниши, так как природные местообитания C. gattii серотипа С не выявлены.
C. neoformans наиболее часто выявляют в разных странах мира в субстратах, обильно загрязненных пометом птиц, в основном – голубей, но природными биосубстратами, из которых может быть выделен C. neoformans, в различных условиях могут выступать: почва, гниющая древесина, фрукты, деревья, домашняя пыль, слизистые оболочки рта и полости носа домашних животных (кошек, собак, коров и др.) (Viviani М.А., 2009). Экология C. neoformans относительно хорошо изучена применительно к странам и территориям с умеренным, суб–, и тропическим климатом, чего нельзя сказать о регионах с прохладным (холодным) климатом – сведения о таких исследованиях весьма ограничены.
В отличие от C. neoformans, C. gattii не был найден в широком спектре субстратов из окружающей среды. Недавно полагали, что C. gattii распространен только в тропических и субтропических климатических зонах и его экологическая ниша связана с двумя видами эвкалиптов (Eucaliptus camaldulensis и E. tereticornis). Однако представления об экологии патогенных криптококков изменились после вспышки криптококкоза на о. Ванкувер (Канада), обусловленного C. gattii, обнаруженного в больших количествах на различных видах деревьев и в воздухе (Bartlet K., 2005). Позднее C. gattii выделяли от пациентов с криптококкозом и от животных в штатах Вашингтон и Орегон (США), а так же в Европе (Hagen F., 2009). Тем не менее вопрос об истинных природных источниках криптококковой инфекции остается открытым. Поэтому новые экологические ниши C. neoformans и C. gattii в настоящее время являются объектом исследования многих авторов за рубежом, а сведения о природных резервуарах криптококковой инфекции в России по–прежнему отсутствуют, равно как и сведения о популяционной структуре природных изолятов в России. Наряду с этим, несмотря на существенный прогресс в изучении патогенных криптококков молекулярно–генетическими методами в последние пять лет, следует признать, что существует значительный дисбаланс между количеством исследований клинических и природных изолятов C. neoformans со значительным их превалированием в сторону клинических (Kwon–Chung K.J., 2000; Meyer W., 2003; Litvintseva A.P., 2009).
В доступной нам литературе данные о морфогенезе клеток С. neoformans, выделенных из окружающей среды и выращенных in vitro, также отсутствуют.
В специальной литературе сведения о вирулентности природных изолятов C. neoformans противоречивые – от полного отрицания вирулентности до выявления высокого потенциала патогенности (Fraser J.A., 2005; Pal M., 2005; Litvintseva A.P., 2009).
Учитывая вышеизложенное актуальным является исследование возможных природных резервуаров возбудителя криптококкоза с оценкой морфо–биологических особенностей изолятов C. neoformans, выделенных из окружающей среды в г. Санкт–Петербурге.
Цель исследования. Выявить и изучить биологические особенности изолятов C. neoformans, выделенных из окружающей среды и от больных крип–тококкозом людей.
Задачи исследования.
- Выявить возможные природные резервуары C. neoformans в г.Санкт–Петербурге.
- Изучить морфологические особенности изолятов C. neoformans, выделенных из окружающей среды и от больных криптококкозом лиц.
- Исследовать особенности морфогенеза клеток культур – природных изолятов.
- Оценить вирулентность природных и клинических изолятов C. neoformans на экспериментальной модели криптококкоза у мышей.
- Исследовать факторы патогенности (лакказу, фосфолипазу, уреазу, способность к росту при 37С и капсулообразованию) у природных и клинических изолятов C. neoformans, а так же определить их чувствительность к флуконазолу и вориконазолу.
Научная новизна исследования.
Впервые:
- выявлен природный резервуар C. neoformans в г. Санкт–Петербурге;
- изучены морфологические свойства природных изолятов C. neoformans, в том числе, ультраструктурные аспекты их морфогенеза, в сравнении с клиническими изолятами, выделенными в Санкт–Петербурге в 2005–2008 г.г.;
- проведено сравнение активности внеклеточных ферментов (уреаза, фосфолипаза, фенолоксидаза) изолятов, выделенных из окружающей среды и от пациентов с криптококкозом в г. Санкт–Петербурге;
- исследованы ассоциативные взаимодействия криптококков, выделенных из помета голубей, с другими микроорганизмами, выделенными из этой экологической ниши в Санкт–Петербурге;
- определены профили вирулентности природных штаммов C. neoformans, выделенных из экониш г. Санкт–Петербурга;
- проведен сравнительный молекулярно–генетический анализ природных и клинических изолятов C. neoformans.
Практическая значимость.
- Наличие патогенного криптококка в отложениях помета голубей на чердаках жилых зданий диктует необходимость проведения санитарно–эпидемиологических мероприятий в местах гнездования птиц.
- Данные о резервуарах C. neoformans в г. Санкт–Петербурге следует учитывать в профилактических рекомендациях для лиц, относимых к группе риска развития криптококкоза, которым целесообразно избегать контакта с пометом птиц и местами гнездования голубей.
- Данные об избирательном росте C. neoformans на дифференциально–диагностических питательных средах необходимо учитывать при выборе сред для выделения криптококков из обьектов окружающей среды.
Положения, выносимые на защиту.
- Основным природным резервуаром C. neoformans в Санкт–Петербурге является помет голубей. Частота выделения культур криптококков из отложений помета голубей на чердаках жилых зданий составляет 3,2%.
- Характер ассоциативных взаимоотношений криптококков с другими микроорганизмами, выделенными из помета голубей – определяющий фактор при оценке природной экониши возбудителей криптококковой инфекции.
- Морфогенез клеток природных изолятов C. neoformans протекает однотипно. В тоже время изоляты различаются между собой по ультраструктурной организации полисахаридных капсул.
- Природные изоляты C. neoformans являются слабовирулентными сравнению с клиническими штаммами криптококков при воспроизведении на модели экспериментального криптококкоза у белых беспородных мышей, но обладают всеми известными факторами патогенности.
Апробация диссертационного материала. Материалы диссертации доложены на 4–ом Всероссийском конгрессе по медицинской микологии (Москва, 2006), на 9–ом съезде Всероссийского научно–практического общества эпидемиологов, микробиологов и паразитологов (Москва, 2007), на 3–ем конгрессе «Тенденции в медицинской микологии» (Италия, 2007), на 7–ой международной конференции по криптококку и криптококкозу (Япония, 2008), на 17–ом конгрессе международного общества по медицинской и ветеринарной микологии (Япония, 2009), на ежегодной научно–практической конференции по медицинской микологии «XII Кашкинские чтения» (г. Санкт–Петербург, Россия, 2009), на 4–ом конгрессе «Тенденции в медицинской микологии» (Греция, 2009).
Внедрение результатов исследования. Результаты настоящего исследования внедрены в учебный процесс кафедры лабораторной микологии и патоморфологии микозов и работу «Российской коллекции патогенных грибов» ГОУ ДПО СПб МАПО Росздрава.
Публикации по материалам исследования. По теме диссертации опубликовано 10 научных работ, в том числе 2 статьи в рецензируемых журналах, рекомендованных ВАК.
Личный вклад автора в проведенное исследование. Автор планировал и выполнял основные экспериментальные исследования по проблеме, участвовал в проведении электронно–микроскопических и молекулярно–генетических исследований природных и клинических изолятов C. neoformans. В постановке и решении конкретных задач, организации и выполнении экспериментальных исследований автору принадлежит ведущая роль. Доля участия автора в сборе проб из окружающей среды и выделении штаммов криптококков – 100%; в разработке и исполнении программ разделов исследований – 90%; доля участия в обработке данных – 100%; в анализе и обобщении экспериментального материала – 100%.
Объем и структура диссертации. Диссертация изложена на 151 странице машинописного текста и состоит из введения, обзора литературы, описания методов исследования, результатов работы и их обсуждения, выводов и списка литературы, содержащего 186 источников, и приложений. Текст диссертации иллюстрирован 19 таблицами, 3 схемами, 35 рисунками и микрофотографиями.
СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ
Материалы и методы исследования. Объекты исследования: 10 клинических штаммов, хранящихся в Российской коллекции патогенных грибов (РКПГ) НИИ медицинской микологии им. П.Н. Кашкина СПб МАПО (РКПГ Y № 1251, 1257, 1262, 1263, 1264, 1272, 1271, 1276, 1283, 1291) и 5 природных изолятов C. neoformans. Изоляты от пациентов были выделены сотрудниками НИЛ микологического мониторинга и биологии грибов НИИ медицинской микологии им. П.Н. Кашкина за период с 2005 по 2008 год. Клинические штаммы 1257, 1262, 1263, 1264, 1272, 1271, 1276, 1283, 1291 были выделены из ликвора больных СПИДом, тогда как шт. 1251 был выделен из крови пациента с онкогематологическим заболеванием. Среди природных изолятов C. neoformans – 4 выделены нами из проб помета голубей, собранных на чердаках жилых зданий г. Санкт–Петербурга в течение 2005-2008 г.г. (ГП 1, ГП 2, ГП 3, ГП 4) и 1 штамм C. neoformans (РКПГ № 861), поступивший из коллекции США в 1967 г и выделенный из помета голубей.
Для выделения патогенных видов криптококков из объектов окружающей среды были использованы элективные и селективные питательные среды: агар Сабуро с хлорамфениколом, агаризованная среда с Л–ДОФА, инозит агар, и агар Сабуро с хлорамфениколом и гентамицином.
Тип взаимодействия (симбиоз или антагонизм) природных изолятов C. neoformans с другими микроорганизмами in vitro определяли методом штриховых подсевов (Елинов Н.П., 1995). Для определения типов взаимодействия были выбраны микроорганизмы, выделенные из проб помета голубей: дрожжевые грибы С. albicans, Rhodotorula spp., и бактерии Staphylococcus aureus, Enterococcus faecalis, Escherichia coli, Pseudomonas aeruginosa, Klebsiella pneumoniae, Рroteus vulgaris.
Описание дрожжевых культур проводили через 72 часа после их выращивания на агаре Сабуро (рН 5,7) в термостате при +28°C и +37°С. Морфологию зрелых клеток (диаметр, толщина капсулы) изучали в нативных и тушевых препаратах в ходе 80–100 измерений в световом микроскопе Leica DM LB при увеличении х1000 (программное обеспечение Leica IM 1000).
В лаборатории патоморфологии и цитологии микозов НИИ медицинской микологии им. П.Н. Кашкина (при содействии д.б.н. Степановой А.А. и к.м.н. Синицкой И.А.), с помощью трансмиссионного электронного микроскопа (ТЕМ), изучали клетки культур 4–х природных изолятов (ГП 1, ГП 2, ГП 3, ГП 4) C. neoformans через 3, 7 и 10 суток выращивания на агаре Сабуро при 37С. Ультратонкие срезы изучали в электронном микроскопе Jem–100SX. Промеры клеточных компонентов проводили на 20–25 медианных срезах интактных зрелых клеток C. neoformans с помощью специальной измерительной шкалы. Кислые полисахариды выявляли по методу Тайса Л. и Барнетта Р. (1965), а также Гайер Г. (1974) с некоторыми модификациями.
Патоморфологические исследования кожи и подкожной клетчаки мышей, зараженных штаммом РКПГ Y 861, проводили на материале, фиксированном в 10% нейтральном формалине и залитом в парафин. Парафиновые срезы окрашивали гематоксилином–эозином и альциановым синим по Моури (Mowry R, 1958).
Изучение способности криптококка расти при повышенных температурах инкубации проводили в чашках Петри на агаре Сабуро при 28°, 37°, 39°, 40°, 41°, 42°, 43°С. Результаты учитывали на 3–и и 7–е сутки после посева.
Ассимиляцию углеводов природными и клиническими изолятами C. neo–formans изучали с помощью коммерческой тест–системы «Auxacolor®2» (Bio–Rad, Франция).
Уреазную активность природных изолятов и клинических штаммов C. neoformans исследовали полуколичественным методом на среде Христенсена с мочевиной при температуре инкубации 28С и 37С в течение 3–х суток.
Фенолоксидазную активность природных изолятов и клинических штаммов C. neoformans изучали на среде с L–ДОФА при температуре инку–бации 28С и 37С в течение 3–х суток.
Фосфолипазную активность криптококков определяли чашечным методом на плотной питательной среде с яичным желтком (Ottolenghi A., 1963). При учете результатов проводили измерение диаметра выросших колоний и диаметра зоны помутнения среды вокруг колонии гриба. Показатель фосфолипазной активности (Рz), рассчитывали по отношению диаметра колонии гриба к диаметру зоны помутнения среды. Минимальные значения Рz соответствуют наибольшей фосфолипазной активности исследуемых культур.
Определение патогенности криптококков проводили на модели экспериментального криптококкоза при внутривенном введении беспородным белым мышам, самцам весом 18–20 г. Животным вводили по 0,5 мл взвеси патогена с концентрацией 107, 106, 105, 104, 103 клеток C. neoformans на мышь для штамма, каждую дозу испытывали на 10 мышах. Всего в эксперименте было использовано 1400 мышей. Количество погибших и выживших животных регистрировали ежедневно. Ретрокультуру C. neoformans, для изучения влияния пассирования через организм беспородных мышей, получали после высева из органов животных (почка, печень, легкое, головной мозг) на 7–е сутки после внутривенного введения дозы патогена 107 КОЕ/мл. После выделения и накопления чистой культуры проводили внутривенное заражение групп животных дозами 107, 106, 105, 104, 103 кл/мышь. В качестве количественной характеристики вирулентности различных штаммов криптококков была принята величина LD50, которую определяли для каждого штамма на 28 сутки эксперимента методом «пробитов».
Исследование чувствительности криптококков к флуконазолу и вориконазолу проводили диско–диффузионным методом по протоколу CLSI M44A. Диаметр зон задержки роста грибов измеряли при помощи специализированной компьютерной программы посредством микробиологи-ческого анализатора «BIOMIC Vision». Интерпретацию категории чувствительности проводили согласно диаметру зоны задержки роста гриба по протоколу CLSI M44A.
Полученные в процессе исследования результаты обрабатывали на ЭВМ c помощью программной системы STATISTICA for Windows (версия 5.11 Лиц. №AXXR402C29502 3FA). При этом использовали преимущественно непараметрические методы и анализ выживаемости. Критерием статистической достоверности получаемых данных мы считали общепринятую в медицине величину Р<0,05.
Результаты собственных исследований. Среди экологических ниш, свойственных для C. neoformans, известных к настоящему времени, основными являются помет голубей, почва, деревья.
Нами было исследовано 253 образца биоматериалов из возможных природных резервуаров C. neoformans в г. Санкт–Петербурге. В результате исследования было выделено в чистой культуре 4 изолята этого вида гриба из 124 проб помета голубей, отобранных на чердаках жилых зданий в Санкт–Петербурге (табл. 1).
Таблица 1
Распределение количества проб из возможных природных резервуаров C. neoformans и результаты микологического исследования
| Объекты исследования | Материал | Количество проб | Результаты микологического исследования |
| Птицы | Содержимое кишечника мертвых птиц | 63 | Candida spp., Rhodotorula spp. |
| Помет голубей | 124 | Candida spp., Rhodotorula spp., C. neoformans 4 изолята | |
| Домашние животные (кошки, собаки) | Мазки из зева и носа | 47 | Candida spp., Rhodotorula spp., Malassezia spp. |
| Почва | Почва Листовой опад | 18 | Candida spp. |
| Итого: | 253 | ||
В результате нашего исследования культуры криптококков удалось получить в 3.2% (доверительные границы 0,8% – 7,0%) от количества исследованных проб помета голубей, а обсемененность составила 200 – 300 КОЕ/г. Пробы помета голубей, полученные с крыш зданий (Казанский собор) были отрицательными в отношении С. neoformans. Эти данные соответствуют современным представлениям о наиболее вероятных положительных находках С. neoformans в закрытых локализациях в сравнении с открытыми из–за высокой чувствительности этого микромицета к воздействию ультра–фиолетового излучения (Hubalek Z., 1975; Idnurm A., 2005; Casadevall A., 2007). При исследовании проб почвы, не загрязненной пометом голубей в Санкт–Петербурге, грибы С. neoformans выделены не были. По данным других исследователей, пробы почвы, положительные на криптококк, составляют около 1 % (Kwon-Chung К., 1992). Домашние животные (кошки, собаки) могут выступать носителями патогенных криптококков на слизистых носовой и ротовой полости, равно как и описаны случаи криптококкоза у этих животных (Castella G., 2008). В нашем исследовании 47 мазков из зева и носа домашних животных (кошки, собаки) патогенные виды криптококков выделены не были. Полученные при посевах виды дрожжевых грибов были идентифицированы как С. laurentii, Candida spp., Rhodotorula spp., Malassezia spp. В связи с этим, по–видимому, вероятность заражения криптококкозом людей от домашних животных в Санкт–Петербурге невелика.
Согласно последним исследованиям, места обитания C. neoformans, равно как C. gattii, могут быть связаны с деревьями. Оба вида имеют фермент лакказу, которая позволяет этим грибам расщеплять лигнин, таким образом давая им возможность использовать древесину деревьев как еще одну экологическую нишу (Williamson P.R., 1997). В нашем исследовании при анализе проб разлагающейся листвы деревьев (береза) криптококки обнаружены не были. Это соответствует данным исследований, проведенных в Турции. Так при мониторировании 61 эвкалиптового дерева (признанный источник криптококков в мире), в течение двух лет не было выделено ни одного изолята С. neoformans (Ates A., 2008). В то время как, например, в Индии при исследовании 311 деревьев 64 из них (20.5%) были положительны на С. neoformans или C. gattii (Randhawa H., 2008).
Выделение патогенных видов криптококков из сильно контаминированных сопутствующей биотой объектов окружающей среды значительно облегчается при использовании селективных и элективных питательных сред. Так Staib F., было предложено использование питательной среды, содержащей экстракт семян масличного нута (Guizotia abyssinica), а другие авторы показали возможность успешного использования для выделения криптококков из природных источников синтетической среды, содержащей Л–ДОФА, и ампициллин (Paliwal D.K., 1978). В нашем исследовании попытки выделить C. neoformans на аналогичных средах (среда с Л–ДОФА, инозит агар, Сабуро агар с хлорамфениколом) были неудачны.
Чистые культуры C. neoformans были выделены на среде Сабуро агар с хлорамфениколом и гентамицином. При этом удалось получить полное подавление роста бактерий – контаминантов, в обилии содержащихся в помете голубей. Выявленная нами низкая частота (3,2%) выявления криптококка в помете голубей в регионе Санкт–Петербурга (Северо–запад России) и низкий уровень обсемененности жизнеспособными клетками в сравнении с данными зарубежных исследователей, частота выделения С. neoformans в исследованиях которых достигает более 30% (Castanon-Olivares L., 1994), возможно, связаны с холодным климатом, с одной стороны, и ингибирующим действием микроорганизмов ассоциантов помета голубей, с другой. Мы изучили ассоциативные взаимодействия выделенных в результате исследования изолятов C. neoformans с основными микроорганизмами контаминантами помета голубей (С. albicans, Rhodotorula spp., Staphylococcus aureus, Enterococcus faecalis, Escherichia coli, Pseudomonas aeruginosa, Klebsiella pneumoniae, Рroteus vulgaris), в результате чего был выявлен выраженный односторонний антагонизм в отношении природных изолятов C. neoformans при совместном культивировании их с P. aeruginosa (табл. 2).
Таблица 2
Типы ассоциативных взаимодействий между природными изолятами C. neoformans и микроорганизмами контаминантами помета голубей
| Вид гриба | Рост криптококков | Рост ассоцианта | Тип ассоциативного взаимодействия | |||
| ГП 1 | ГП 2 | ГП 3 | ГП 4 | |||
| С. albicans | + | + | + | + | + | Нейтрализм |
| С. albicans | + | + | + | + | + | Нейтрализм |
| С. albicans | + | + | + | + | + | Нейтрализм |
| Rhodotorula spp. | + | + | + | + | + | Нейтрализм |
| Rhodotorula spp. | + | + | + | + | + | Нейтрализм |
| S. aureus | + | + | + | + | + | нейтрализм |
| E. faecalis | + | + | + | + | + | нейтрализм |
| E. coli | + | + | + | + | + | нейтрализм |
| P. aeruginosa | - | -- | --- | -- | + | односторонний антагонизм |
| K. pneumoniae | + | + | + | + | + | нейтрализм |
| Р. vulgaris | + | + | + | + | + | нейтрализм |
Другие исследованные образцы биоматериалов (содержимое кишечника погибших птиц, мазки из зева и носа кошек и собак, почва, растительные остатки), оказались отрицательными на наличие патогенных видов криптококков. Учитывая интенсивность заселения голубями крупных промышленных и культурных центров по всему миру, актуален вопрос о биологических особенностях природных изолятов данного патогена.
После 3–х суток выращивания, при 37С на агаре Сабуро, колонии клинических штаммов были от 1 до 3–х мм в диаметре, в большинстве своем, слизистые, блестящие, возвышающиеся над поверхностью питательной среды, край колонии ровный, цвет варьировал от кремового до светло–коричневого. Колонии природных изолятов были блестящие, слабо слизистые, с ровным краем, светло–кремового цвета, за исключением белых колоний у изолята ГП 2.
В ходе микроскопического изучения нативных препаратов визуализировали округлые, почкующиеся, одиночные и в группах клетки криптококков, с чётко очерченной клеточной стенкой и зернистым содержимым. Размеры клеток природных изолятов варьировали в пределах от 5,26±0,09 до 5,71±0,26 мкм, тогда как клинических штаммов – от 4,86±0,12 до 7,17±0,16 мкм. Получены достоверные различия (p=0.027), характеризующие клетки природных изолятов как более мелкие, по сравнению с таковыми клинических штаммов (рис. 1).
Рис. 1. Сравнение диаметров клеток природных
и клинических изолятов C. neoformans
При микроскопии в тушевом препарате у всех изучаемых культур была выявлена капсула. При сравнении толщины капсулы природных и клинических изолятов C. neoformans выявлены достоверные различия (p=0,035). Как видно из рисунка 2, толщина капсулы у клеток природных изолятов была меньше (от 0,62±0,02 до 0,80±0,03 мкм), чем аналогичная у клинических штаммов (от 0,79±0,03 до 3,06±0,11 мкм).
Таким образом, клетки природных изолятов значительно меньше в размерах, чем клинических штаммов, что, возможно, способствует их более эффективному распространению и проникновению в трахео–альвеолярное пространство у человека и животных.
Рис. 2. Сравнение природных
и клинических изолятов C. neoformans по ширине капсулы
При электронно–микроскопическом исследовании морфогенеза клеток 4–х природных изолятов (ГП 1, ГП 2, ГП 3, ГП 4) C. neoformans, выращенных in vitro, отмечено сходство его у всех изученных культур. В растущих клетках изученных природных изолятов C. neoformans мы не обнаружили варьирования в числе, топографии, форме и ультраструктуре митохондрий, по сравнению с ранее изученными клиническими штаммами (Васильева Н. В., 2005; 2007), для которых были выявлены существенные штаммные различия по этим признакам.
Структура митохондрий в пределах как отдельно взятой растущей клетки, так и между клетками культур разных природных изолятов, была всегда постоянной, что резко отличало их от ранее изученных клинических штаммов (Васильева Н. В., 2005; 2007). Интересно отметить, что у последних отмечено варьирование в топографии, числе и ультраструктуре митохондрий, как между клетками культуры одного штамма, так и разных.
Толщина капсулы у зрелых клеток природных изолятов криптококка, выращенных in vitro, всегда была больше таковой клеточной стенки (в 2 раза у изолятов ГП 1, ГП 3, ГП 4, в 3 раза – ГП 2). У зрелых клеток преобладающего числа (62%) клинических штаммов капсулы более чем в 10 раз превышали толщину их клеточных стенок (Васильева Н.В., 2005). Эти данные согласуются с гипотезой об общебиологической защитной роли капсулы (Елинов Н.П., 1989).
При изучении морфогенеза клеток природных изолятов C. neoformans с помощью традиционных методов трансмиссионной электронной микроскопии (фиксация глутаральдегидом–осмием) установлено три типа строения полисахаридных капсул (1 тип – ГП 1, 2 тип – ГП 2, 3 тип – ГП 3, ГП 4, рис. 3). Зрелые клетки культур у 3–х (ГП 1, ГП 3, ГП 4) из 4–х изученных изолятов гриба имели сходный план ультратонкого строения капсул (наличие трех слоев: нижнего с микрофибриллами (слой 1 на схеме), среднего плотного (слой 2 на схеме) и наружного аморфного (слой 3 на схеме), между которыми имели место различия по толщине описанных слоев.
Рис. 3. Схема морфогенеза капсулы зрелых клеток C. neoformans после применения традиционных методов фиксации (а–в) и после гистохимического выявления кислых полисахаридов (г). Арабскими цифрами показаны слои капсулы, римскими обозначены изоляты (I – ГП 1, II – ГП 2, III – ГП 3, IV – ГП 4). а – дочерняя почка, б – растущая, в, г – зрелые клетки гриба. Мф – микрофибриллы; ПК – полисахаридная капсула
При применении метода гистохимического окрашивания кислых полисахаридов, входящих в состав капсулы клеток природных изолятов криптококка, мы выявили четыре типа строения полисахаридной капсулы у зрелых клеток природных изолятов гриба (рис. 3г). Наши исследования показывают, что при ультраструктурной характеристике капсулы криптококков целесообразно одновременное использование этих двух методов просвечивающей электронной микроскопии.
При исследовании вирулентности все природные изоляты проявили свойства слабопатогенных: LD 50 на 28–е сутки после заражения составила 1х106–1х107 КОЕ/мл. Пассирование через организм беспородных мышей не изменило патогенности природного изолята ГП 3. Эти сведения согласуются с данными зарубежных исследователей, в работе которых даже трехкратное пассирование через организм мышей не увеличивало патогенности изначально слабо вирулентных природных изолятов C. neoformans (Litvintseva A. 2009).
Среди исследованных клинических изолятов четыре штамма были сильнопатогенными для белых беспородных мышей (LD 50 1x102–1x103 КОЕ/мл), четыре штамма со средней вирулентностью (LD 50 1x104–1x105 КОЕ/мл) и два штамма вошли в группу слабопатогенных (LD 50 1x106 КОЕ/мл). Распределение клинических штаммов C. neoformans по группам вирулентности представлено на рисунке 4.
Рис.4. Распределение выживаемости мышей в зависимости от групп патогенности клинических штаммов C. neoformans
При сравнении выживаемости мышей, зараженных природными и клиническими изолятами C. neoformans получены достоверные различия (р = 0.0002) между этими двумя группами криптококков. Выживаемость мышей, зараженных C. neoformans, изолятами от больных, была значительно ниже, чем выживаемость мышей, зараженных изолятами из помета голубей (рис. 5).
Рис.5. Выживаемость мышей, зараженных природными изолятами и клиническими штаммами C. neoformans
При исследовании вирулентности штамма С. neoformans РКПГ Y 861, на сроках позднее 60 суток после внутривенного введения, отмечена тропность к коже и подкожной клетчатки у беспородных мышей, с явлениями некроза тканей и накоплением возбудителя в подкожной клетчатке. К концу эксперимента (58 суток после заражения) гибель мышей отмечена в группах 106 (60%) и 107 (80%). В течение эксперимента с 40–х суток после заражения у животных на высоких дозах (106, 107) наблюдали поражения кожи в области носа в виде экзофитных разрастаний с явлениями некроза, прикрытых корками. На более поздних сроках подобные поражения проявлялись у животных, зараженных более низкими концентрациями клеток крипотококка (105). У животных были взяты ткани из очагов поражения для гистологического исследования. При патоморфологическом исследовании пораженных участков было выявлено массовое поражение кожи и подкожной клетчатки, проявляющееся в образовании крупных очагов лизиса в подкожной клетчатке, заполненных возбудителем. Характерным был полиморфизм гриба – от мелких бескапсульных форм (2–3 мкм) до крупных капсулообразующих клеток, интенсивно воспринимающих окраску альциановым синим. Неожиданным оказалось внедрение и размножение C. neoformans внутри пласта эпидермиса (рис.6).
Рис. 6. Гистологическая картина поражения кожи и подкожной клетчатки у мыши, зараженной штаммом С. neoformans РКПГ Y 861, окр. по Моури, х 1000. Стрелками показаны клетки гриба
Известно, что наряду со способностью к капсулообразованию важнейшими факторами патогенности криптококков является способность расти и размножаться при 37°С (в отличие от сапротрофов, выживающих при более низких температурных показателях) и энзиматическая активность фосфолипазы, фенолоксидазы и уреазы (Cox G., 2001; Eisenman H., 2007; Sanchez A., 2008).
Способность криптококков сохранять жизнеспособность при температурах выше 37°С является важной частью жизненного цикла С. neoformans. Это свойство позволяет им выживать в кишечнике птиц, температура которых, в частности голубей, составляет 39–43С. При исследовании устойчивости к повышенным температурам криптококков серотипов А и D выявили, что C. neoformans var. grubii (серотип А) более устойчив к воздействию высокой температуры, а природные изоляты криптококков менее, чем клинические, устойчивы к действию высоких температур (Martinez L.,2001; Perfect J., 2006). В нашем исследовании криптококки подвергали культивированию при температурах 37°, 40°, 41°, 42° и 43°С. Все изоляты из помета голубей проявили способность к росту на третьи сутки инкубации на агаре Сабуро при 40°С, а изолят ГП 2 на третьи сутки проявлял рост при 41°С. Исследованные культуры криптококков от пациентов отличались большей устойчивостью к действию высоких температур инкубации, штаммы РКПГ Y 1257 и РКПГ Y 1272 проявили способность к росту при температуре инкубации +42°С. При температуре +43°С к пятым суткам инкубации рост изучаемых культур получить не удалось (табл. 3).
Таблица 3
Влияние температуры на рост природных и клинических изолятов C. neoformans
| № п/п | № штамма РКПГ | 37°С | 40°С | 41°С | 42°С | 43°С |
| 1 | РКПГ Y 1251 | +++ | +++ | – | – | – |
| 2 | РКПГ Y 1257 | +++ | ++ | ++ | + | – |
| 3 | РКПГ Y 1262 | +++ | +++ | ++ | – | – |
| 4 | РКПГ Y 1263 | +++ | +++ | – | – | – |
| 5 | РКПГ Y 1264 | +++ | +++ | – | – | – |
| 6 | РКПГ Y 1271 | +++ | +++ | – | – | – |
| 7 | РКПГ Y 1272 | +++ | +++ | ++ | ++ | – |
| 8 | РКПГ Y 1276 | +++ | +++ | – | – | – |
| 9 | РКПГ Y 1283 | +++ | +++ | – | – | – |
| 10 | РКПГ Y 1291 | +++ | +++ | + | – | – |
| 11 | ГП1 | +++ | +++ | – | – | – |
| 12 | ГП2 | +++ | +++ | + | – | – |
| 13 | ГП3 | +++ | +++ | – | – | – |
| 14 | ГП4 | +++ | +++ | – | – | – |
| 15 | РКПГ Y 861 | ++ | – | – | – | – |
При изучении ферментативной активности природных изолятов C. neoformans выявлена способность этих культур к разложению мочевины на среде Христенсена при 28°С и 37°С, причем при температуре инкубации 37°С уреазная активность в обеих группах изолятов была выше, чем при 28°С (рис. 8). При сравнении уреазной активности природных и клинических изолятов выявлены достоверные различия (р<0.05) в первые и вторые сутки инкубации при 28°С. Клинические штаммы C. neoformans более активно разлагали мочевину при 28°С.
Рис. 8. Уреазная активность природных изолятов и клинических штаммов C. neoformans при 28°С
Фенолоксидазную активность природных и клинических изолятов C. neoformans изучали на синтетической среде с Л-ДОФА. Способность к меланинообразованию проявили все изученные культуры криптококков, а синтез меланина при 28°С протекал более активно, в сравнении с таковым при температуре инкубации 37°С (рис. 9). При сравнении фенолоксидазной активности природных и клинических изолятов C. neoformans достоверных различий в продукции фермента выявлено не было.
Рис. 9. Фенолоксидазная активность природных изолятов
C. neoformans при 28°С и 37°С, в течение 3–х суток
Изучение фосфолипазной активности природных изолятов C. neoformans на среде с яичным желтком выявило способность всех природных изолятов C. neoformans образовывать зону помутнения среды вокруг колонии гриба. Показатель Pz для этой группы был в пределах 0,51±0,03 – 0,60±0,03. При сравнении с активностью этого фермента у клинических изолятов (Pz от 0,48±0,09 до 0,66±0,10) достоверных различий не выявлено. Несмотря на то, что установлена взаимосвязь между патогенностью криптококков и активностью фосфолипазы (Cox G., 2001), мы не выявили корреляции между уровнем продукции фосфолипазы и уровнем вирулентности как у природных, так и у клинических изолятов C. neoformans. Ряд авторов подтверждает этот факт (Murphy J., 1998).
Эти факты и полученные нами данные об активности уреазы и фенолоксидазы усиливают предположение о том, что наличие этих факторов, а не их количественные показатели, определяют уровень вирулентности для C. neoformans, равно как и еще неизвестные факторы вирулентности.
Исследование нами молекулярно–генетического профиля культур природных и клинических изолятов С. neoformans методом RAPD анализа с праймером JWFF (5`-GGTCCGTGTTTCAAGACG-3`) позволило выявить наличие у природных изолятов C. neoformans нуклеотидных последова-тельностей (600–700 п.н.), отсутствующих у культур, выделенных от пациентов с криптококкозом в Санкт–Петербурге. Профили же клинических изолятов оказались генетически не идентичны, а выявленный полиморфизм их генов указывает на наличие как минимум трех внутривидовых генотипов.
При изучении чувствительности к флуконазолу и вориконазолу диско–диффузионным методом по протоколу CLSI M 44–A, все природные изоляты С. neoformans оказались чувствительны к флуконазолу и вориконазолу, тогда как 30% изученных клинические штаммы имели промежуточную чувствительность к флуконазолу, а один штамм (10%) был резистентен к флуконазолу и промежуточно чувствителен к вориконазолу. При сравнении диаметров зон задержки роста грибов получены достоверные различия между природными и клиническими изолятами С. neoformans (р = 0,001). Природные изоляты C. neoformans были более чувствительны к флуконазолу и вориконазолу (рис. 10).
Рис. 10. Чувствительность природных и клинических изолятов C. neoformans к флуконазолу и вориконазолу
ВЫВОДЫ
- Основным природным резервуаром C. neoformans в г. Санкт–Петербурге являются отложения помета голубей, частота выделения составила 3,2%.
- Низкая частота выделения C. neoformans на среде с хлорамфениколом обусловлена ассоциативным взаимодействием микроорганизмов по типу одностороннего антагонизма между C. neoformans и Pseudomonas aeruginosa.
- Морфогенез клеток природных изолятов C. neoformans происходит однотипно, но существуют различия в ультраструктурной организации капсулы.
- Природные изоляты C. neoformans, выделенные в Санкт–Петербурге, являются слабовирулентными, но обладают основными факторами патогенности: способностью к росту при 37°С и капсулообразованию, синтезу меланина, уреазной и фосфолипазной активностью.
- Природные изоляты C. neoformans отличаются от исследованных клинических штаммов молекулярно–генетическим профилем. Полиморфизм генов клинических штаммов указывает на наличие у них, как минимум, трех внутривидовых генотипов.
- Природные изоляты C. neoformans чувствительны к флуконазолу и вориконазолу; среди клинических штаммов 60% чувствительны к флуконазолу, а 10% имели промежуточную чувствительность к вориконазолу.
ПРАКТИЧЕСКИЕ РЕКОМЕНДАЦИИ
- Органам санитарно–эпидемиологического надзора рекомендуется проведение противоэпидемических мероприятий в местах отложения помета голубей.
- Персоналу, проводящему работы в местах накопления помета голубей, рекомендуется использование средств индивидуальной защиты: респираторы, защитная одежда и головные уборы.
- Лицам с нарушениями в системе иммунитета следует избегать контакта с птицами и продуктами их жизнедеятельности.
- В качестве питательной среды для выделения криптококков из объектов окружающей среды, следует использовать агар Сабуро с хлорамфениколом и гентамицином.
- При изучении ультраструктуры капсулы криптококков целесообразно сочетать два метода электронной микроскопии: традиционный (глютаральдегид-осмий), и гистохимический (докрашивание альциановым синим).
Список работ, опубликованных по теме диссертации:
- Босак И.А. Взаимосвязь чувствительности к флуконазолу и биологи–ческих особенностей клинических изолятов Cryptococcus neoformans / Н.В. Васильева, И.В. Выборнова, Т.С. Богомолова, Г.А. Чилина, М.А. Михайлова, И.А. Босак // В сб. «Успехи медицинской микологии». (Материалы четвертого Всероссийского конгресса по медицинской микологии).– Т.VII, гл. 2. – С.163–164. – М.: Национальная Академия микологии. – 2006.
- Босак И.А. Прошлое и настоящее Cryptococcus neoformans (Sanfelice) Vuillemin (1901) как объекта изучения и потенциально грозного патогена для человека / Н.П. Елинов, И.А. Босак // Проблемы медицинской микологии. 2006. – Т.8, №4. – С. 47–53.
- Bosak I.A. Cryptococcosis in HIV–infected patients in Saint–Petersburg / N.V. Vasilyeva, T.S. Bogomolova, I.V. Vybornova, I.A. Bosak // J. of Chemotherapy.–2007.– Vol. 19, Suppl. 3.– Р. 82.
- Босак И.А. Экспериментальный криптококкоз с вовлечением кожи и подкожной клетчатки / Н.В. Васильева, Р.А. Аравийский, И.А. Босак // Проблемы медицинской микологии.– 2007.– Т.9, №2.– С. 47.
- Босак И.А. Факторы патогенности Cryptococcus neoformans и их роль в патогенезе криптококкоза / Н.В. Васильева, Т.С. Богомолова, И.В. Выборнова, И.А. Босак // В сб. «Материалы IX съезда Всероссийского научно–практического общества эпидемиологов, микробиологов и паразитологов». –2007.– Т.2.– С. 221.
- Bosak I.A. Cryptococcosis in Saint Petersburg, Russia, 1990–2008 / N.V. Vasilyeva, N.N. Klimko, T.S. Bogomolova, I.A. Bosak, L.V. Filipova // Abstracts of the 17th Congress of the International Society for Human snd Animal Mycology, Tokyo, Japan, May 25–29, 2009, Р. 472.
- Bosak I.A. Virulence for mice and susceptibility to fluconasole of Cryptococcus neoformans clinical isolates / T.S. Bogomolova, N.V. Vasilyeva, I.A. Bosak, I.V. Vybornova // 7th International Conference on Cryptococcus and Cryptococcosis. Nagasaki, Japan, Sept. 11–14, 2009, Р.105.
- Босак И.А. Характеристика изолятов Cryptococcus neoformans из окружающей среды г. Санкт–Петербурга / И.А. Босак // Проблемы медицинской микологии. – 2009. – Т.11.– №2.– С. 59.
- Босак И.А. Особенности морфогенеза штаммов Cryptococcus neoformans, выделенных из окружающей среды / А.А. Степанова, И.А. Босак, И.А. Синицкая // Проблемы медицинской микологии. – 2009. – Т.11.– №2.– С. 113.
- Босак И.А. Выделение и характеристика изолятов Cryptococcus neoformans из окружающей среды г. Санкт–Петербурга / И.А. Босак // Проблемы медицинской микологии. – 2009. – Т.11. – №3. – С. 43–46.
