Совершенствование отбелки сульфатной целлюлозы с использованием ферментов ксиланаз
На правах рукописи
АКСЁНОВ Андрей Сергеевич
СОВЕРШЕНСТВОВАНИЕ ОТБЕЛКИ СУЛЬФАТНОЙ ЦЕЛЛЮЛОЗЫ С ИСПОЛЬЗОВАНИЕМ
ФЕРМЕНТОВ КСИЛАНАЗ
05.21.03 – Технология и оборудование химической
переработки биомассы дерева; химия древесины
АВТОРЕФЕРАТ
диссертации на соискание ученой степени
кандидата технических наук
Архангельск - 2007
Работа выполнена на кафедре биотехнологии Архангельского государственного технического университета
Научный руководитель: доктор технических наук,
профессор Новожилов Е.В.
Официальные оппоненты: доктор технических наук,
профессор Канарский А.В.
кандидат технических наук,
доцент Суханова Г.П.
Ведущая организация: ОАО «ЦНИИБ»
Защита диссертации состоится 14 декабря 2007 г. в 10 00 часов на заседании диссертационного совета Д.212.008.02 в Архангельском государственном техническом университете по адресу: 163002, г. Архангельск, наб. Северной Двины, 17.
С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Архангельского государственного технического университета.
Автореферат разослан ноября 2007 г.
Ученый секретарь диссертационного совета,
канд. хим. наук, профессор Т.Э. Скребец
ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ
Актуальность темы.
Основным направлением развития производства беленой сульфатной целлюлозы является снижение или полное исключение применения хлорсодержащих реагентов и переход к широкому использованию кислородсодержащих отбеливающих химикатов. Большое внимание уделяется повышению белимости сульфатной целлюлозы, для чего предлагаются усовершенствованные методы варки, а также эффективные стадии предварительной обработки целлюлозы перед отбелкой, которые позволяют существенно уменьшить затраты на производство товарной целлюлозы по ECF- и TCF- схемам отбелки.
Наряду с кислородсодержащими отбеливателями все чаще находят применение ферменты. В производстве сульфатной целлюлозы используются ксиланазы. Действие ферментов данного класса направлено на гидролиз лигноуглеводных связей и на расщепление ксилана, сорбированного на поверхности целлюлозных волокон при варке. Предварительная обработка целлюлозы ксиланазами снижает расход отбеливающих реагентов и приводит к более высокому отбеливающему эффекту.
В настоящее время ксиланазы выпускаются в США (Genencor International), Дании (Novozymes), Финляндии (Oy Banmark AB), Канаде (IOGEN Bio-Products), Индии (Biocon). Ферментные препараты зарубежных производителей используются в настоящее время на целлюлозно-бумажных предприятиях России. Производство ксиланаз для нужд ЦБП в нашей стране находится на стадии лабораторных исследований и получения опытных партий. В институте ГосНИИГенетики получена высокоочищенная ксиланаза из штамма Penicillium canescens F-912. Представляет интерес проверить возможность использования этого препарата для предварительной обработки сульфатной целлюлозы перед отбелкой.
Данная работа выполнена в рамках Российской научно-технической программы “Живые системы” ЖС-КП 4/002 (2006 – 2007 годы).
Цель и задачи исследования. Целью настоящей работы являлась разработка методов улучшения белимости сульфатной целлюлозы за счет химических и биохимических воздействий на стадии её подготовки к процессу отбелки и в процессе отбелки.
Для достижения этой цели были поставлены следующие задачи:
- установить влияние условий хранения небеленой сульфатной целлюлозы на удаление черного щелока из волокна и предложить варианты интенсификации этого процесса;
- провести сравнительную оценку действия различных препаратов ксиланаз и их отдельных фракций на небеленую сульфатную целлюлозу и целлюлозу в процессе отбелки;
- исследовать поведение лигноуглеводных комплексов сульфатной целлюлозы при ферментативном гидролизе ксиланазами;
- разработать режим и провести промышленные испытания стадии биохимической обработки сульфатной хвойной целлюлозы отечественной ксиланазой.
Научная новизна
Показано, что повышение рН при хранении небеленой сульфатной целлюлозы интенсифицирует удаление лигнина и в сочетании с ферментативной обработкой ксиланазой повышает белимость целлюлозы. Выявлено, что обработка лиственной сульфатной целлюлозы ксиланазой в процессе отбелки приводит к удалению фрагментов ксилана, снижающих белимость целлюлозы.
Установлено, что в результате ферментативного гидролиза ксиланазой небеленой сульфатной целлюлозы растворяются лигноуглеводные комплексы. В их состав входят фрагменты ксилана с числом остатков ксилозы до 10.
Установлена субстратная специфичность ксиланаз по отношению к лиственной и хвойной сульфатной целлюлозе. Подтверждено отрицательное влияние целлюлазной активности на прочностные характеристики волокон. Определено соотношение ксиланазной и целлюлазной активности в промышленных препаратах ксиланаз, при котором ферменты не снижают прочность целлюлозы.
Практическая ценность
Предложен способ подготовки сульфатной целлюлозы к отбелке, обеспечивающий интенсификацию диффузии черного щелока из волокна, снижение числа Каппа и уменьшение расхода отбеливающих химикатов.
Показана эффективность ферментативной обработки сульфатной хвойной целлюлозы отечественной ксиланазой F-912 для повышения белимости целлюлозы при сохранении прочностных характеристик волокна.
Предложен способ оценки компонентного состава препаратов ксиланаз с помощью эксклюзионной ВЭЖХ и методика оценки активности ксиланаз и их отдельных фракций.
Автором выносятся на защиту следующие основные положения диссертационной работы:
- результаты хроматографического анализа препаратов ксиланаз;
- результаты обработки различными ксиланазами и отдельными фракциями препаратов ксиланаз лиственной и хвойной сульфатных целлюлоз;
- результаты хроматографического анализа лигноуглеводных комплексов, растворяющихся при ферментативной обработке целлюлозы;
- режим обработки небеленой хвойной сульфатной целлюлозы отечественным препаратом ксиланазы F-912.
Апробация работы
Основные положения диссертационной работы докладывались и получили положительную оценку на международных конференциях «Физикохимия лигнина» I и II (Архангельск, 2005, 2007 г.); Всероссийской научной конференции «Химия и технология растительных веществ» (Сыктывкар, 2006 г.); международной научно-технической конференции, посвященной 75–летию АЛТИ-АГТУ «Современная наука и образование в решении проблем экономики Европейского Севера» (Архангельск, 2004 г.); II Всероссийской научно-технической конференции студентов и аспирантов (Екатеринбург, 2006 г.); а также на ежегодных научно-технических конференциях Архангельского ГТУ (2005-2007 гг.).
Публикации. По теме диссертации опубликовано 9 работ.
Структура и объем диссертации. Диссертация включает в себя: введение; аналитический обзор; методическую часть; экспериментальную часть, включающую 4 раздела; общие выводы и список использованных источников. Содержание работы изложено на 127 страницах, включая 31 рисунок и 32 таблицы, библиография содержит 161 наименование.
КРАТКОЕ СОДЕРЖАНИЕ РАБОТЫ
В аналитическом обзоре рассмотрены современные методы отбелки сульфатной целлюлозы. Отмечены преимущества и недостатки использования различных отбеливающих химикатов. Рассмотрено влияние сорбированного ксилана, лигноуглеводных комплексов, гексенуроновых кислот на белимость сульфатной целлюлозы. Представлен обзор применения ферментов в целлюлозно-бумажной промышленности, особое внимание уделено гемицеллюлозолитическим ферментам. Показана эффективность использования ксиланаз перед отбелкой сульфатной целлюлозы. Отмечено, что механизм их действия на целлюлозу изучен недостаточно, сделан вывод о необходимости проведения исследований в данном направлении. На основе анализа литературных данных сформулированы цель и задачи работы.
В методической части представлены характеристики объектов, материалов и методики исследования. В работе использовались образцы небеленой лиственной сульфатной и небеленой хвойной сульфатной целлюлоз, полученных по режимам Архангельского и Котласского ЦБК; препараты ксиланаз: Pulpzyme НС (”Novozymes”, Дания), Ecopulp TX-200 А (”Oy Banmark AB”, Финляндия), Biobrite UHB (”Iogen”, Канада), Neoxylanase ALK HC (”Biocon” Индия), F-912 (”Сиббиофарм”, Россия). Обработку целлюлозы ферментами и отбелку проводили в условиях, близких к технологическим режимам указанных предприятий. Анализ целлюлозы выполняли в соответствии со стандартными методиками ГОСТ, SCAN, ISO.
Анализ состава препаратов ксиланаз, выделение отдельных фракций, а также определение состава олигосахаридов в фильтратах проведены методом эксклюзионной ВЭЖХ (хроматографическая система «Стайер», программа «Мультихром»). Молекулярно-массовое распределение лигноуглеводных комплексов было определено с помощью эксклюзионной ВЭЖХ (хроматограф «Милихром - 4»).
Экспериментальная часть состоит из 4 разделов.
1. Влияние условий подготовки лиственной сульфатной целлюлозы к отбелке на эффективность ферментативной обработки ксиланазой
При подготовке к отбелке в процессе выдерживания целлюлозы в башнях высокой концентрации (БВК) и массных бассейнах происходит диффузия черного щелока из волокна, что приводит к снижению числа Каппа небеленой целлюлозы. Переход в раствор лигнина при хранении целлюлозной массы подтверждается увеличением оптической плотности фильтрата (рис. 1, рН 9).
 Рисунок 1 – Оптическая плотность фильтратов при хранении небеленой сульфатной целлюлозы | Число Каппа – это важный показатель качества подготовки небеленой целлюлозы, оно во многом определяет расход химикатов на последующую отбелку. Дополнительное и существенное уменьшение числа Каппа (2…3 ед.) можно достичь за счет тщательной промывки массы с большим расходом |
воды, но это неприемлемо для условий производства.
На ряде целлюлозно-бумажных предприятий России обработка небеленой хвойной и лиственной целлюлозы ксиланазой является завершающей стадией ее подготовки к отбелке. Необходимо максимально полно удалить черный щелок из волокон до стадии ферментативной обработки, которая проводится в среде, близкой к нейтральной, в которой процесс диффузии лигнина замедляется (рис.1, рН 6).
В данной работе изучено и предложено для уменьшения числа Каппа небеленой целлюлозы проводить ее выдерживание при более высоком значении рН чем обычно. Этот способ можно реализовать при хранении массы в БВК при температуре 70…80 0С, продолжительности 120 минут и концентрации массы 8…10 %, добавляя NaOH с расходом 2…5 кг/т целлюлозы.
Выдерживание целлюлозы при сильно щелочном значении рН приводит к набуханию целлюлозы, раскрытию микрокапиллярной структуры волокон, растворению остаточного лигнина целлюлозы. Снижение числа Каппа на 0,5 ед. в данном случае имеет место и у тщательно промытой пробы целлюлозы (рис. 2), что указывает на то, что в процессе «выщелачивания» идет дополнительное, по сравнению с обычной диффузионной промывкой массы, извлечение лигнина из волокна.
 | |||
| Целлюлоза после промывки в производстве | Целлюлоза после промывки в лаборатории | ||
| Рисунок 2 - Влияние подщелачивания при хранении небеленой целлюлозы на число Каппа | |||
Дальнейшее снижение числа Каппа может быть получено при обработке небеленой целлюлозы ксиланазой. Механизм действия ксиланаз предполагает
деструкцию сорбированного ксилана и разрыв связей между лигнином и углеводами, что приводит к дополнительному удалению остаточного лигнина целлюлозы.
 | Как видно из рис. 3, выдерживание небеленой целлюлозы в щелочной среде перед стадией ферментативной обработки (Ф) усиливает растворение лигнина и дополняет действие фермента. Уменьшение числа Каппа после начальных стадий отбелки Д0-Щ1 на 0,2…0,3 ед. весьма существенно сказывается на белимости целлюлозы. Отбелка по полной схеме проходит при более низком числе Каппа на отдельных стадиях процесса, что |
| Рисунок 3 – Влияние хранения целлюлозы при высоком значении рН на число Каппа целлюлозы после обработки ксиланазой и отбелки по схеме До-Щ1 |
обеспечивает повышенную конечную белизну целлюлозы (таблица 1).
Таблица 1 - Влияние значения рН при хранении небеленой сульфатной лиственной целлюлозы на ее белимость
| Схема подготовки и отбелки целлюлозы | рН при хранении массы перед стадией Ф | Число Каппа целлюлозы | Белизна целлюлозы, % | |
| Перед стадией Д0 | После стадии Щ1 | |||
| Ф-До-Щ1-Д1-Щ2-Д2-К | 8,8 | 9,6 | 3,2 | 88,3 |
| Щ-Ф-До-Щ1-Д1-Щ2-Д2-К | 12,0 | 9,3 | 2,9 | 89,0 |
Повышение рН после обработки ксиланазой также приводит к интенсификации удаления лигнина и снижению числа Каппа перед отбелкой (таблица 2). К пробам целлюлозы, взятым после обработки ксиланазой в условиях производства, не проводя промывки, добавляли NaOH до рН 11,0…11,5 и продолжали обработку в щелочной среде при концентрации массы 3,5% в течение 40 минут при температуре 55 0С. Завершение подготовки целлюлозы к отбелке в щелочной среде способствует переходу лигнина в раствор, что выражается в снижении числа Каппа после щелочной обработки на 0,6…0,9 ед. Каппа.
Таблица 2 - Влияние ферментативной и щелочной обработки на растворение лигнина и
на число Каппа небеленой сульфатной лиственной целлюлозы
| Реагент | Показатели фильтратов | Число Каппа целлюлозы | ||
| Оптическая плотность фильтрата, Е.о.п. | Содержание лигнина в фильтрате по Пирлу-Бенсону, мг/л | |||
| 237 нм | 280 нм | |||
| Фермент | 4,7 | 2,8 | 83 | 12,7 |
| NaOH | 4,9 | 3,4 | 95 | 13,1 |
| Фермент / NaOH | 6,0 | 3,1 | 113 | 12,2 |
Это объясняется тем, что деструкция ксилана на поверхности волокон целлюлозы и разрыв связей между ксиланом и фрагментами лигнина при ферментативной обработке в сочетании с последующим набуханием сульфатной целлюлозы в щелочной среде при рН 11 увеличивают доступность лигнина, что вызывает его усиленное удаление из волокон в результате щелочной экстракции (выщелачивания). В данном случае, при высокой концентрации лигнина в окружающей волокна жидкости исключительно важную роль играет эффективная промывка целлюлозы перед ее отбелкой.
На Архангельском ЦБК стадия ферментативной обработки постоянно применяется при подготовке сульфатной лиственной целлюлозы к последующей отбелке по ECF – схеме До-Щ1-Д1-Щ2-Д2-К. Использование предлагаемого
| способа выдерживания массы в щелочной среде обеспечивает при такой схеме отбелки повышение белизны при равном расходе отбеливающих химикатов или при равной белизне уменьшение расхода диоксида хлора на 5…10 % (рис. 4). В целом, совместное применение щелочной и ферментной обработок небеленой сульфатной лиственной целлюлозы повышает эф- | |
| Рисунок 4 - Влияние подщелачивания на белизну лиственной cульфатной целлюлозы |
фективность подготовки ее к отбелке, снижает число Каппа на 2...3 ед., улучшает белимость целлюлозы и уменьшает расход химикатов на отбелку на 10…15 %.
2. Сравнение эффективности действия ксиланаз на сульфатную
целлюлозу
Для оценки влияния ксиланаз на процесс удаления лигнина был предложен следующий метод. Образец небеленой сульфатной целлюлозы дополнительно промывали в лаборатории и обрабатывали ксиланазами при оптимальных значениях рН и температуры. Затем проводили начальные стадии отбелки. Для лиственной сульфатной целлюлозы это стадии До – Щ; для хвойной – До-Щ1-Д1-Щ2. После этого в пробах определяли число микро-Каппа, по снижению которого по сравнению с контролем можно судить о делигнифицирующем действии препаратов ксиланаз.
Методом эксклюзионной ВЭЖХ на колонке BioSep-SEC S 3000, откалиброванной по глобулярным белкам (рис. 5) были получены хроматограммы то-
 Рисунок 5 - Калибровочная зависимость колонки BioSep-SEC S 3000 | варных препаратов ксиланаз (рис. 6). Препараты неоднородны по своему составу. Основная фракция, имеющая максимальную величину пика (для ксиланазы Biobrite UHB это пик 2, для Ecopulp TX-200 A – пик 3) обладает ксиланазной активностью. Минорные фракции, соответствующие пикам 1 и 3 у Biobrite UHB, 1 и 2 у Ecopulp TX-200 A, могут обладать как ксиланаз- |
ной, так и целлюлазной активностью. 4-й пик соответствует низкомолекулярным стабилизирующим добавкам, вносимым в препарат для сохранения его активности.
Хроматографический метод позволяет оценивать чистоту препарата, степень концентрирования, наличие примесей, обладающих побочными активностями. Чем больше в препарате фракций, обладающих целлюлазной активностью, тем более вероятен гидролиз целлюлозы при ферментной обработке. Препарат BioBrite UHB, обладая в 2,5 раза более высокой ксиланазной активностью
 |
| Рисунок 6 – Хроматограммы ферментных препаратов ксиланаз Biobrite UHB (А) и Ecopulp TX-200 A (Б) |
по сравнению препаратом Ecopulp TX-200 A, является при этом и более чистым.
С помощью хроматографического метода были выделены отдельные фракции препаратов ксиланаз. Представляло интерес оценить эффективность обработки целлюлозы фракциями отечественного фермента, полученного с помощью штамма Penicilium canescens F-912 (рис. 7).
У этого препарата нет ярко выраженного основного пика, содержание фракций, соответствующих пикам 1 и 2, на хроматограмме примерно одинаково. Более высокая молекулярная масса фракции № 1 может быть обусловлена наличием наряду с каталитическим доменом еще и субстратсвязывающего домена, как это часто бывает у целлюлаз.
В пробах целлюлозы, обработанных этими фракциями, число Каппа после начальных стадий отбелки ниже, чем у контрольных образцов (таблица 3). Установлено, что фракции препарата по-разному действуют на лиственную и хвойную сульфатную целлюлозу. Обработка лиственной целлюлозы фракцией № 2, имевшей меньшую молекулярную массу по сравнению с фракцией
№ 1, привела к более значительному снижению числа Каппа целлюлозы. Для хвойной целлюлозы, наоборот, фракция № 1 при отбелке по схеме Д0 – Щ1 – Д1 – Щ2 оказалась эффективнее.
 |
| Рисунок 7 - Хроматограмма ферментного препарата ксиланазы F-912 |
Таблица 3 Влияние обработки фракциями ксиланазы F-912 на белимость хвойной и лиственной сульфатной целлюлозы
| Фермент и его фракции | Число Каппа лиственной целлюлозы после стадий До – Щ1 | Число микро-Каппа хвойной целлюлозы после стадий До – Щ1 - Д1 – Щ2 |
| Контроль | 8,7 | 6,0 |
| Фермент | 7,8 | 5,3 |
| Фракция № 1 | 8,5 | 5,3 |
| Фракция № 2 | 8,0 | 5,6 |
При действии ксиланаз на лиственную целлюлозу важную роль играет разрыв связей между лигнином и углеводами, в результате чего наряду с лигнином с продуктами деструкции ксилана частично удаляются и гексенуроновые кислоты. Это приводит к снижению числа Каппа целлюлозы на 1…2 ед непосредственно после ферментативной обработки. Чем меньше молекулярная масса, тем легче ксиланаза проникает внутрь волокон, тем в большей степени катализирует гидролиз связей между лигнином и ксиланом.
У хвойной сульфатной целлюлозы общее содержание ксилана и его концентрация на внешней поверхности волокон значительно ниже, чем у лиственной целлюлозы. При ксиланазной обработке небеленой хвойной целлюлозы имеется некоторое снижение числа Каппа, но эффект повышения белимости в основном проявляется в процессе отбелки. Частичный гидролиз ксилана ускоряет проникновение отбеливающих химикатов в волокно, а затем из ферментативно обработанной целлюлозы на делигнифицирующих стадиях отбелки извлекается больше остаточного лигнина с большей молекулярной массой, чем из необработанной целлюлозы. Высокая эффективность фракции № 1 при действии на хвойную целлюлозу, вероятно, обусловлена большей активностью каталитического центра фермента за счет наличия субстратсвязывающего модуля.
В процессе многоступенчатой отбелки при удалении основной массы лигнина раскрывается структура волокна и доступность ксилана, находящегося внутри клеточной стенки, увеличивается. Поэтому нами была проверена возможность использования ксиланаз на завершающих стадиях отбелки. Для этого лиственную целлюлозу, отобранную в ходе производственной отбелки после стадии Д1, обрабатывали ксиланазой, а в контрольных пробах проводили щелочение с расходом NaOH 5 и 10 кг/т целлюлозы. Затем проводили стадию Д2 в условиях, аналогичных производственным.
Обработка целлюлозы ферментами Ecopulp TX-20 A и Pulpzyme HC вместо стадии Щ2 приводит к удалению фракций, отрицательно влияющих на белимость целлюлозы. В результате белизна (рис. 8) и стабильность белизны целлюлозы увеличиваются.
 |
| Рисунок 8 – Влияние ферментативной обработки после стадии Д1 на белимость сульфатной лиственной целлюлозы |
На этом этапе отбелки щелочение даже при расходе NaOH 10 кг/т целлюлозы оказывается менее эффективным по сравнению с ксиланазной обработкой, тем более, что расход ксиланаз при этом возможно уменьшить до 0,1…0,2 кг/т целлюлозы.
Проведенные исследования показали, что при получении ферментных препаратов для целлюлозно-бумажной промышленности перспективным является создание монокомпонентных высокоочищенных ксиланаз, предназначенных для обработки конкретных видов целлюлоз.
3. Влияние ксиланаз на гидролиз связей между лигнином и углеводами в сульфатной целлюлозе
Ксиланазы катализируют гидролиз -1,4 гликозидных связей в макромолекуле ксилана, в тех местах цепи, где отсутствуют боковые заместители. При этом образуются ксилоолигосахариды, которые легко переходят в раствор. Методом ВЭЖХ на колонке Rezex RSO - Oligosacharides Ag 4 % с рефрактометрическим детектором были обнаружены ксилотриоза, ксилотетраоза и олигосахариды с большей длиной цепи, перешедшие в фильтрат после ксиланазной обработки небеленой сульфатной целлюлозы (рис. 9).
 |
| Рисунок 9 - Хроматографический анализ продуктов деструкции ксилана технической целлюлозы |
Согласно одной из теорий, объясняющих механизм действия ксиланаз на целлюлозное волокно, ферменты катализируют гидролиз лигноуглеводных связей, благодаря чему часть остаточного лигнина диффундирует из волокна в раствор. В развитие этого подхода, нами были выделены лигноулеводные комплексы (ЛУ комплексы) сульфатной целлюлозы и определены их молекулярно-массовые характеристики методом ВЭЖХ на хроматографе «Милихром - 4».
Было установлено, что в процессе ферментативной обработки лиственной сульфатной целлюлозы извлекаются ЛУ комплексы с молекулярной массой, на 25 % большей, чем молекулярная масса фрагментов лигнина, удаленных из целлюлозы промывкой водой (рис. 10, а).
В процессе обработки ксиланазой происходит раскрытие микрокапиллярной структуры волокна за счет частичного гидролиза поверхностно локализованного ксилана. Это приводит к растворению ЛУ комплексов с высокой молекулярной массой не только из небеленой целлюлозы, но и из целлюлозы на начальных стадиях отбелки. Так, после стадии Д0 в фильтрате ферментативно обработанной целлюлозы обнаружены ЛУ комплексы с большей молекуляр ной массой, чем ЛУ комплексы в пробах без предварительной обработки (рис. 10, б).
 а б |
| Рисунок 10 - Нормированные хроматограммы ЛУ комплексов, выделенных после обработки лиственной сульфатной целлюлозы* а) после ферментативной обработки; б) после стадии До 1 – фильтрат ферментативно обработанной целлюлозы; 2 – фильтрат целлюлозы без ферментативной обработки (контроль) |
* - молекулярные массы рассчитаны по калибровочной кривой для сульфатного лигнина
 | ЛУ комплекс, выделенный из фильтрата после ферментной обработки, был разделен по схеме (рис. 11). Лигнин в мягких условиях удаляли диоксидом хлора. Методом ВЭЖХ определено, что оставшаяся углеводная часть ЛУ комплекса представлена олигосахаридами с несколькими мономерными остатками (рис. 12). В продуктах деструкции ЛУ комплекса наряду с остатками углеводов присутствуют и остатки уроновых кислот. В лиственной целлюлозе после ферментативной обработки сохраняются ЛУ комплексы, которые недоступны для ксиланазы, но могут быть выделены экстракцией 5%-ным раствором NaOH. В выделенных таким образом ЛУ комплексах ксиланаза способна деструктировать связи между лигнином и углеводами. После декатионирования смолой КУ-2 в Н+ форме полученный |
| Рисунок 11 - Схема разделения ЛУ комплекса, выделенного из фильтрата после ферментативной обработки целлюлозы |
 |
| Рисунок 12 - Хроматографический анализ продуктов деструкции ЛУ комплекса |
раствор обрабатывали ксиланазой. При этом молекулярная масса ЛУ комплекса уменьшилась с 22 кДа до 16 кДа.
Таким образом, экспериментально показано, что наряду с деструкцией ксилана, при ксиланазной обработке целлюлозы может происходить гидролиз связей между лигнином и ксиланом в ЛУ комплексах. Повышение белимости сульфатной целлюлозы при ферментативной обработке происходит как за счет раскрытия микрокапиллярной структуры волокна, так и вследствие перехода в растворимое состояние фрагментов лигнина при разрушении ЛУ комплексов.
4. Разработка режима биохимической обработки сульфатной хвойной целлюлозы ферментным препаратом F-912
В работе исследована возможность использования в производстве беленой сульфатной целлюлозы из древесины хвойных пород ксиланазы F-912, полученной в России. С помощью генетической модификации штамма мицелиального гриба Penicillium canescens F-912 в препарате практически полностью удалена целлюлазная активность. В сравнении с ксиланазами, уже используемыми в целлюлозно-бумажной промышленности (Ecopulp TX-200 A и Biobrite UHB), в отечественной ксиланазе доля целлюлазной активности в несколько раз ниже (таблица 4).
Таблица 4 – Характеристика ксиланаз
| Препарат ксиланазы | Ксиланазная активность, ед/мл | Целлюлазная активность, ед/мл | Общий белок, г/л | Ксиланазная активность/ целлюлазная активность |
| Ксиланаза F-912 | 700 | 0,7 | 5,5 | 1000 : 1 |
| Biobrite UHB | 6000 | 14,9 | 8,0 | 402 : 1 |
| Ecopulp TX-200 A | 4100 | 31,0 | 4,5 | 132 : 1 |
Определены условия проведения стадии ферментативной обработки целлюлозы с использованием ксиланазы F-912: продолжительность – 40…60 минут, температура – 40…50 0С, рН – 6,0…7,0, концентрация массы – 3,5 %, расход – 1 кг/т целлюлозы.
Были проведены серии отбелки сульфатной хвойной целлюлозы со стадией ферментативной обработки препаратом Ecopulp TX-200 A и отечественным препаратом F-912. Оба фермента действуют на целлюлозу аналогичным образом, что проявляется в снижении числа Каппа после начальных стадий отбелки, а также в повышении степени белизны на конечных стадиях отбелки по сравнению с контрольной пробой (таблица 5). При практически равной белизне следует отметить сохранение высокого значения разрывной длины беленой целлюлозы, полученной с использованием ксиланазы F-912.
Таблица 5 Влияние ксиланазной обработки хвойной сульфатной целлюлозы на
ее белимость и разрывную длину
| Фермент | Расход, кг/т целлюлозы | Белизна, % | Разрывная длина, м |
| Контроль (без фермента) | - | 84,2 | 9600 |
| Ecopulp TX-200 A | 0,3 | 85,9 | 8700 |
| Ксиланаза F-912 | 1,5 | 85,8 | 9500 |
Проведены опытно-промышленные испытания стадии обработки небеленой сульфатной хвойной целлюлозы ксиланазой F-912 перед отбелкой на ОАО «Котласский ЦБК». В период испытаний выработано 1200 т беленой целлюлозы. Использование отечественной ксиланазы обеспечило повышение белимости целлюлозы, что позволило сократить расход отбеливающих химикатов на 14 % по активному хлору при сохранении высоких прочностных показателей беленой целлюлозы.
ВЫВОДЫ
- Для повышения белимости сульфатной целлюлозы предложено выдерживание небеленой массы при значении рН 11…12 перед обработкой ксиланазой и щелочная обработка целлюлозы после указанной обработки. Применение предложенных методов приводит к снижению числа Каппа целлюлозы перед отбелкой на 2…3 ед. и позволяет уменьшить расход отбеливающих химикатов на 10…15 %.
- Использование обработки ксиланазой в процессе многоступенчатой отбелки вместо стадии Щ2 повышает белизну сульфатной целлюлозы на 0,6…0,8 %.
- Из сульфатной лиственной целлюлозы различными методами выделены лигноуглеводные комплексы. Показано, что ксиланазы разрушают ЛУ комплексы с образованием олигосахаридов различной длины цепи, что свидетельствует о наличии в составе этих комплексов фрагментов ксилана. Экспериментально установлено, что расщепление связей между лигнином и углеводами способствует растворению остаточного лигнина сульфатной лиственной целлюлозы.
- Проведен скрининг ксиланаз по технологическим параметрам для обработки лиственной и хвойной сульфатной целлюлозы перед отбелкой. Установлено, что для сохранения высоких прочностных показателей беленой целлюлозы отношение ксиланазной активности к целлюлазной активности в препаратах ксиланаз должно быть не менее 1000 : 1.
- Методом эксклюзионной ВЭЖХ выделены отдельные фракции препаратов ксиланаз. Оценено их влияние на белимость сульфатной целлюлозы. Экспериментально показано, что для небеленой лиственной сульфатной целлюлозы эффективнее применение ксиланаз с меньшей молекулярной массой.
- Проведены опытно-промышленные испытания отечественной ксиланазы F-912, которые показали высокую эффективность этого фермента для улучшения белимости сульфатной целлюлозы и снижения расхода химикатов в процессе отбелки.
Основное содержание диссертации изложено в следующих публикациях:
1. Аксенов, А.С. Интенсификация удаления остаточного лигнина сульфатной целлюлозы с применением ксиланаз [Текст] / А.С. Аксенов, Д.Г. Чухчин, Е.В. Новожилов // Современная наука и образование в решении проблем экономики европейского севера. Материалы международной научно-технической конференции, посвященной 75-летию АЛТИ-АГТУ. – Архангельск: Изд-во АГТУ, 2004. – С. 186–188.– ISBN 5-261-00166-8.
2. Аксенов, А.С. Влияние предварительной подготовки сульфатной целлюлозы на эффективность стадии ферментной обработки ксиланазами [Текст] / А.С. Аксенов, Е.В. Новожилов // Наука – Северному региону. Сб. научных трудов. Архангельск: Изд-во АГТУ, 2005. – Вып.62. – С. 6–8.
3. Аксенов, А.С. Молекулярно-массовые и спектральные характеристики лигнина, растворенного из сульфатной лиственной целлюлозы при ферментной обработке ксиланазой [Текст] / А.С. Аксенов, Е.В. Новожилов, Л.В. Майер, Д.Г. Чухчин, И.В. Лобова // Физикохимия лигнина. Материалы международной конференции. – Архангельск: Изд-во АГТУ, 2005. – С. 129 – 133. – ISBN 5-261-00212-6.
4. Аксенов, А.С. Поведение лигнина сульфатной целлюлозы в процессе ферментной обработки ксиланазами [Текст] / А.С. Аксенов, Е.В. Новожилов, И.В. Лобова, Д.Г. Чухчин // Физикохимия лигнина. Материалы международной конференции. – Архангельск: Изд-во АГТУ, 2005. – С. 89 – 93. – ISBN 5-261-00212-6.
5. Аксенов, А.С. Делигнифицирующее действие различных препаратов ксиланаз на начальных стадиях отбелки сульфатной целлюлозы [Текст] / А.С. Аксенов, А.В. Кондаков, Н.А. Свиязов, Н.В. Ягушкин // Материалы II Всероссийской научно-техн. конференции студентов и аспирантов. - Екатеринбург: УГЛТУ. – 2006. – С. 250 - 252. – ISBN 5-94984-118-2.
6. Аксенов, А.С. Характеристика ксиланаз различными методами [Текст] / А.С. Аксенов, Е.В. Новожилов, Д.Г. Чухчин // Химия и технология растительных веществ: Тезисы докладов IV Всероссийской научной конференции «Химия и технология растительных веществ» - Сыктывкар. – 2006. – С. 309. – ISBN 5-89606-270-2.
7. Аксенов, А.С. Промышленное использование ксилназ при отбелке сульфатной целлюлозы [Текст] / А.С. Аксенов, Е.В. Новожилов, О.А. Демашев, А.А. Опарина // «Целлюлоза. Бумага. Картон», пилотный научный выпуск – 2006. - С. 15-17.
8. Аксенов, А.С. Влияние фракций ферментных препаратов ксиланаз на белимость сульфатных целлюлоз [Текст] / А.С. Аксенов, Д.Г. Чухчин, Е.В.Новожилов, С.В. Беневоленский, А.М. Чулкин // Лесной журнал. – 2007. – №2. – С. 90–96. (Изв.высш.учеб.заведений). – ISSN 0536-1036.
9. Аксенов, А.С. Деструкция лигноуглеводного комплекса сульфатной целлюлозы при ферментативной обработке ксиланазой / А.С. Аксенов, Е.В. Новожилов, Д.Г. Чухчин // Физикохимия лигнина. Материалы международной конференции. – Архангельск: Изд-во АГТУ, 2007. – С. 89 – 93. – ISBN 5-261-00335-X.
Отзывы на автореферат в 2-х экземплярах с заверенными гербовой печатью подписями просим направлять по адресу:
163002, г. Архангельск, наб. Северной Двины, 17, АГТУ, диссертационный совет Д.212.008.02
