Окисление лигнинных веществ в присутствии катализатора – пероксидазы из корней хрена
На правах рукописи
Айзенштадт Мария Аркадьевна
ОКИСЛЕНИЕ ЛИГНИННЫХ ВЕЩЕСТВ В ПРИСУТСТВИИ КАТАЛИЗАТОРА – ПЕРОКСИДАЗЫ ИЗ КОРНЕЙ ХРЕНА
05.21.03 – технология и оборудование химической переработки
биомассы дерева; химия древесины
Автореферат
диссертации на соискание ученой степени
кандидата химических наук
Архангельск
2010
Работа выполнена на кафедре теоретической и прикладной химии
Архангельского государственного технического университета
| Научные руководитель: | заслуженный деятель науки РФ, доктор химических наук, профессор Боголицын К.Г. |
| Консультант: | доктор химических наук, профессор Шеховцова Т.Н. |
| Официальные оппоненты: | доктор химических наук, профессор Хабаров Ю.Г. кандидат химических наук, Синицына О.А. |
Ведущая организация: ОАО « Всероссийский научно - исследовательский институт целлюлозно - бумажной промышленности (ВНИИБ)»
Защита диссертации состоится «20» апреля 2010 г. в 10 часов на заседании диссертационного совета Д.212.008.02 в Архангельском государственном техническом университете (163002, г. Архангельск, Набережная Северной Двины, 17)
С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Архангельского государственного технического университета.
Автореферат разослан «____» ____________ 2010 г.
Ученый секретарь диссертационного
совета, кандидат химических наук, доцент Т.Э. Скребец
Общая характеристика работы
Актуальность темы
Одними из основных компонентов технологических сред целлюлозно-бумажных предприятий (ЦБП) являются лигнинные вещества, представляющие собой группу родственных высокомолекулярных соединений ароматической природы. Они не относятся к опасным токсичным соединениям, однако, при попадании в природный водоем группа конденсированных и малотрансформируемых лигнинных веществ склонна к накоплению и образованию опасных для здоровья и жизни компонентов. Таким образом, актуальными задачами химической технологии древесины являются поиск и создание новых экологически чистых способов химической переработки лигносодержащих материалов и совершенствование системы производственного экологического контроля путем разработки и внедрения новых высокочувствительных, информативных и экспрессных методов анализа.
В соответствии с «Перечнем приоритетных направлений развития науки, технологий и техники в РФ» и «Перечнем критических технологий РФ» по направлению «Биокаталитические, биосинтетические и биосенсорные технологии», перспективным для решения указанных задач является использование ферментативных систем; создание новых высокоэффективных, стабильных и специфичных биокатализаторов и разработка на их основе ферментативных методов делигнификации и анализа технологических растворов.
Большой интерес в связи с этим вызывают ферменты класса оксидоредуктаз, а именно пероксидазы. Этот класс широко применяется для контроля примесей в объектах пищевой, микробиологической и фармацевтической промышленности, в мониторинге окружающей среды, для решения некоторых медицинских и биохимических задач. Кроме того, в литературе представлены сведения о возможности применения пероксидаз в ЦБП, а именно в процессе делигнификации древесины, так как одной из основных биологических функций этих ферментов является окисление фенольных соединений и участие в процессе биосинтеза веществ лигнинной природы.
Цель диссертационной работы – установление основных закономерностей окисления лигнинных веществ в водной среде в присутствии катализатора - пероксидазы из корней хрена.
Для достижения этой цели необходимо решить следующие задачи:
1) исследовать основные закономерности протекания процесса пероксидазного окисления модельных соединений структурного звена лигнина в водной среде;
2) определить оптимальные условия проведения процесса пероксидазного окисления модельных соединений лигнина гваяцильного ряда в водной среде;
3) изучить влияние природы, функционального состава и полимолекулярных свойств препаратов лигнина на эффективность их пероксидазного окисления;
4) разработать схему механизма и кинетическую модель процесса ферментативного окисления лигнинных веществ.
Работа выполнена в рамках гранта Министерства науки и образования Российской Федерации, Федерального агентства по науке и инновациям (Государственный контракт № 02.444.11.7036) и гранта Администрации Архангельской области по поддержке научно-исследовательской работы молодых ученых (Проект № 04-04).
Научная новизна
Установлены основные закономерности пероксидазного окисления родственных лигнину фенольных соединений гваяцильного ряда в водной среде (влияние рН раствора, концентрации катализатора, концентрации субстрата-окислителя, концентрации субстрата-восстановителя); показано, что основным реакционным центром, участвующим в редокс – превращениях структурных единиц лигнина, является фенольный гидроксил.
Экспериментально определены кинетические параметры (Kmэф, Vmэф, kэфф, kcat, kcat/ Kmэф) позволяющие расположить модельные соединения лигнина по способности к пероксидазному окислению в следующий ряд: гваякол > ванилиновый спирт > ацетованилон > феруловая кислота.
Показано, что полимолекулярные свойства и форма макромолекул лигнина являются важными факторами процесса биохимического окисления.
Теоретически обоснована и экспериментально доказана применимость модели неупорядоченного присоединения субстратов по типу Random Bi Uni для интерпретации процесса пероксидазного окисления лигнинных веществ в широком диапазоне концентраций.
Практическая ценность
Получены новые данные (кинетическое описание процесса, модель и схема механизма пероксидазного окисления соединений структурного звена лигнина), создающие необходимую теоретическую основу для разработки эффективных биокаталитических систем, применимых в сфере эколого-аналитического контроля.
Определены и обоснованы оптимальные условия пероксидазного окисления соединений фенольного ряда (гваякола, феруловой кислоты, ацетованилона, ванилинового спирта) в водной среде.
На защиту выносятся
- Основные закономерности пероксидазного окисления лигнинных веществ в водной среде на основе результатов исследования влияния рН раствора, концентрации окисляемого вещества, окислителя и катализатора на кинетику процесса.
- Схема механизма и кинетическая модель процесса пероксидазного окисления соединений фенольного ряда пероксидом водорода в водной среде.
- Обоснование влияния электроноакцепторных свойств пара - заместителей на активность фенольного реакционного центра структурных единиц лигнина в процессах пероксидазного окисления.
- Обоснование влияния полимолекулярных свойств и формы макромолекул лигнина на процесс их биохимического окисления.
Апробация работы
Основные положения диссертационной работы докладывались и получили положительную оценку на международных конференциях «Аналитика России 2007» (Краснодар, 2007 г.); «Ломоносов - 2008» (Москва, 2008 г.); «Северные территории России: проблемы и перспективы развития» (Архангельск, 2008 г.); «10th European Workshop on Lignocellulosics and Pulp «EWLP 2008» (Stockholm, Sweden, 2008); «Физикохимия лигнина» (Архангельск, 2009 г.); на международном форуме «Аналитика и аналитики» (Воронеж, 2008 г.); на всероссийской конференции «ЭКОАНАЛИТИКА-2009» (Йошкар-Ола, 2009 г.); а также на ежегодных научно-технических конференциях Архангельского государственного технического университета.
Публикации По теме диссертации опубликовано 10 работ, в том числе 2 статьи.
Структура и объем диссертации
Диссертация состоит из введения; обзора литературы; методической части; экспериментальной части, включающей 4 раздела; выводов; списка литературы. Содержание работы изложено на 139 страницах, из них 122 страниц основного текста, включая 73 рисунка и 22 таблицы, библиография содержит 156 наименований.
Краткое содержание работы
В обзоре литературы рассмотрены основные пути образования, трансформации и способы определения лигнинных веществ в технологических средах ЦБП (на примере ОАО «Архангельский ЦБК»). Отмечено, что в настоящее время не существует универсального метода их определения, отличающегося высокой чувствительностью и экспрессностью.
Проанализированы результаты работ направленные на изучение катализируемого ферментами окисления лигнина и его модельных соединений. Наиболее широко в процессе окисления лигнина применяются ферменты класса оксидоредуктаз, а именно пероксидазы: МnР (марганецпероксидаза), LiP (лигнинпероксидаза), лакказа. Использование пероксидазы хрена (HRP) ограничено недостатком сведений о механизме ее действия на компоненты древесины, в особенности на лигнин. Вместе с тем, рассмотренные в обзоре особенности строения этого фермента позволяют предположить перспективность его использования для создания эффективного, информативного и высокочувствительного метода определения лигнинных веществ в различных жидких средах.
На основе анализа литературных данных сформулированы цели и задачи исследования.
В методической части диссертационной работы приведена характеристика используемых модельных соединений структурного звена лигнина, а также функциональный состав и значения молекулярных масс препаратов диоксанлигнина ели, сульфатного хвойного лигнина исходного и восстановленного NaBH4 (Табл. 1, 2); приведены характеристики, используемые для спектрофотометрического исследования кинетики пероксидазного окисления лигнина и его модельных соединений (Табл. 3, 4).
Таблица 1 - Функциональный состав препаратов лигнина
| Препарат лигнина | S, % | Зола, % | Функциональный состав, % | ||||
| OCH3 | OH общ | COOH | OH фен | С=О | |||
| Диоксанлигнин ели | * | * | 15,62 | 3,12 | 0,87 | 1,88 | 5,66 |
| Сульфатный хвойный лигнин исходный | 2,02 | 2,16 | 10,20 | 3,40 | 2,10 | 1,30 | 5,80 |
| Cульфатный хвойный лигнин восстановленный NaBH4 | * | * | 10,40 | 3,51 | 2,16 | 1,45 | 1,22 |
* - не определялось.
Таблица 2 – Характеристика полимолекулярного состава препаратов лигнина
| Препарат лигнина | Mw, а.е.м. | Mn, а.е.м. | Mz, а.е.м. | Степень полидисперсности (СП= Mw / Mn) |
| Диоксанлигнин ели | 16700 | 11600 | 19400 | 1,44 |
| Сульфатный хвойный лигнин исходный | 14600 | 7800 | 19200 | 1,87 |
Таблица 3 – Положение полос поглощения и значения молярных коэффициентов поглощения в спектрах продуктов окисления модельных соединений структурного звена лигнина
| Соединение | , нм | , л/(мольсм) |
| Гваякол | 470 | 4980 |
| Феруловая кислота | 286 | 6707 |
| Ацетованилон | 274 | 8427 |
| Ванилиновый спирт | 230 | 6085 |
Таблица 4 – Положение полос поглощения в спектрах и значения молярных коэффициентов поглощения продуктов окисления различных препаратов лигнина
| Вид лигнина | , нм | , л/(гсм) |
| Диоксанлигнин ели (ДЛ) | 280 | 40,54 |
| Сульфатный хвойный лигнин исходный (СХЛ) | 420 | 5,89 |
| Сульфатный хвойный лигнин восстановленный NaBH4 (ВСХЛ) | 300 | 26,82 |
Начальную скорость реакции окисления определяли по тангенсу угла наклона касательной к начальному линейному участку кривой (метод тангенсов) по формуле (1) для гваякола и (2) для феруловой кислоты, ацетованилона, ванилинового спирта и препаратов лигнина:
если p > 0, то  (1) | если p = 0, то  (2) |
| где tg - тангенс угла наклона кинетических кривых в координатах оптическая плотность (А) – время (t, сек); - молярный коэффициент поглощения субстрата (s) или продукта его окисления (p) (л·моль-1см-1); l- толщина кюветы (см). | где tg - тангенс угла наклона кинетических кривых в координатах оптическая плотность (А) – время (t, сек); s - молярный коэффициент поглощения субстрата (л·моль-1см-1); l- толщина кюветы (см). |
В качестве кинетических параметров определяли: начальную скорость реакции (v0), эффективную константу Михаэлиса (Km эф), эффективную максимальную скорость реакции (Vm эф), эффективную (kэфф) и каталитическую (kcat) константы реакции.
При статистической обработке экспериментальных данных рассчитывали относительную погрешность результатов исследований, которая составила 5 %.
Экспериментальная часть
- Каталитическая активность пероксидазы хрена в реакциях окисления лигнинных веществ
Пероксидаза хрена обладает рядом уникальных свойств, таких как: высокая каталитическая активность в довольно мягких условиях температур, давлений и кислотности среды; и специфичность (избирательность) действия в отношении структуры субстрата, типа реакции и условий ее проведения.
Перечисленные свойства обусловлены структурной сложностью пероксидазы и многостадийностью механизма ее действия; в пероксидазном катализе большую роль играет образование фермент-субстратного комплекса, обеспечивающее сближение и правильное ориентирование реагирующих частиц относительно активных центров фермента.
С целью подтверждения каталитической активности пероксидазы хрена проведено окисление лигнинных веществ как в присутствии, так и в отсутствие катализатора. Выявлено, что окисление субстратов собственно пероксидом водорода не происходит. Это связано с тем, что пероксид водорода в нейтральной среде находится в неионизированной форме, а, следовательно, не способен координироваться с активными реакционными центрами рассматриваемых субстратов, которые также находятся в молекулярной форме (рКаГВ = 10,04; рКаФК = 9,40; рКаФК (для СООН) = 4,43; рКаВС = 9,80; рКаАЦ = 7,90).
Таким образом, окисление лигнинных веществ достигается за счет образования промежуточного фермент-субстратного комплекса (Е-Н2О2), который взаимодействует с окисляемыми субстратами.
2. Кинетика пероксидазного окисления родственных лигнину фенольных соединений гваяцильного ряда
В качестве объектов исследований использованы гваякол, феруловая кислота, ацетованилон и ванилиновый спирт, моделирующие структурные фрагменты хвойных лигнинов, содержащие различные заместители в пара-положении к фенольному гидроксилу:
 | где - Н – гваякол; - СН=СН–СООН – феруловая кислота; - СО-СН3 – ацетованилон; - СН2-ОН– ванилиновый спирт. |
Для оптимизации условий проведения ферментативного окисления, установления основных закономерностей превращений лигнинных веществ в этом процессе и его кинетического описания изучена кинетика окисления модельных соединений структурного звена лигнина пероксидом водорода в водной среде с использованием в качестве катализатора пероксидазы хрена.
С этой целью исследовано влияние на кинетику окисления: рН раствора, концентраций фермента, субстрата-восстановителя и субстрата-окислителя пероксидазы. Эти факторы оказывают влияние как на механизм и кинетику взаимодействия фермента с модельными соединениями лигнина, так и на его стабильность и активность по отношению к выбранным субстратам вследствие изменения его нативной конформации.
Результаты исследования влияния рН среды (рисунок 1) показали, что рН раствора оказывает значительное влияние на начальную скорость процесса окисления. Оптимальное значение рН, при котором наблюдается максимальная начальная скорость реакции пероксидазного окисления гваякола, феруловой кислоты и ацетованилона равно 6,0.
 |  |
| А | Б |
| Рисунок 1 - Зависимость начальной скорости пероксидазного окисления модельных соединений от рН раствора; Ацетатный буферный раствор (рН 4,5-5,5), Фосфатный буферный раствор (рН 5,5-8,0); А - окисление гваякола; окисление феруловой кислоты; Б - окисление ацетованилона; окисление ванилинового спирта. | |
Этот факт объясняется наличием в активном центре фермента ионизованных групп с рКа 3,9, 4,0, 5,5 (карбоксильные группы), обусловливающих существование каталитически активной формы фермента в слабо-кислой и нейтральной областях. Для ванилинового спирта максимальная начальная скорость реакции максимальна при рН = 7,5, что связано с влиянием природы пара - заместителя на скорость взаимодействия модельного соединения лигнина с активным фермент-субстратным комплексом (E-H2O2).
При изучении влияния концентрации пероксидазы хрена, пероксида водорода и модельных соединений лигнина на скорость реакции окисления последних выявлено, что она сначала линейно возрастает с повышением концентрации всех перечисленных компонентов, а затем выходит на плато (т.е. достигается кажущаяся предельная скорость и дальнейшее увеличение концентрации фермента не влияет на скорость реакции). Для дальнейших исследований в качестве оптимальных выбраны следующие условия пероксидазного окисления, приведенные в таблице 5.
Таблица 5 - Оптимальные условия пероксидазного окисления модельных соединений лигнина
| Субстраты (PhOH) | , нм | , л /(моль·см) | Оптимальные концентрации | рН | |||
| HRP, нмоль/л | H2O2, ммоль/л | PhOH, ммоль/л | |||||
| Гваякол | 470 | 5000 | 12 | 5 | 0,15 | 6,0 | |
| Феруловая кислота | 286 | 6707 | 50 | 10 | 0,05 | 6,0 | |
| Ацетованилон | 274 | 8427 | 9 | 6 | 0,30 | 6,0 | |
| Ванилиновый спирт | 230 | 6085 | 10 | 0,0006 | 0,20 | 7,5 | |
Кинетические параметры реакции (эффективная максимальная скорость реакции Vm эф, эффективная константа Михаэлиса Km эф) определяли графическим методом линеаризации уравнения Михаэлиса – Ментен в координатах c/v0 – c (Табл. 6, 7).
Таблица 6 - Линейные зависимости и кинетические параметры в реакции пероксидазного окисления модельных соединений лигнина
| Субстрат | Уравнение линейной зависимости | R2 | Km эф105, мольл-1 | Vm эф106, мольл-1мин-1 | |
| Гваякол (0,00)* | H2O2 | y = 0,95x + 1,93 | 0,99 | 20 | 105 |
| PhOH | y = 0,19x + 1,64 | 0,98 | 8 | 538 | |
| Феруловая кислота (0,41)* | H2O2 | y = 0,10x + 1,19 | 0,99 | 119 | 10 |
| PhOH | y = 3,11x + 0,26 | 0,99 | 9 | 3 | |
| Ацетованилон (0,81)* | H2O2 | y = 1,11x + 18,25 | 0,99 | 17 | 90 |
| PhOH | y = 1,14x + 6,67 | 0,99 | 1 | 88 | |
| Ванилиновый спирт (0,08)* | H2O2 | y = 0,10x + 0,14 | 0,99 | 14 | 96 |
| PhOH | y = 0,02x + 0,91 | 0,99 | 5 | 500 | |
*- -константы Гаммета заместителей в п-положении к ОНфен.
PhOH – соответствующее модельное соединение лигнина.
Таблица 7 - Кинетические параметры реакции пероксидазного окисления модельных соединений лигнина, характеризующие эффективность ее протекания
| Субстрат | kэфф10-7, лмоль-1мин-1 | kcat10-3, мин-1 | kcat/ Km эф10-5, лмоль-1мин-1 | |
| Гваякол | H2O2 | 43,8 | 52,5 | 2,60 |
| PhOH | 224 | 269 | 34,10 | |
| Феруловая кислота | H2O2 | 0,9 | 0,9 | 0,01 |
| PhOH | 0,3 | 0,3 | 0,04 | |
| Ацетованилон | H2O2 | 0,9 | 1,5 | 0,09 |
| PhOH | 3,7 | 7,3 | 8,70 | |
| Ванилиновый спирт | H2O2 | 3,8 | 7,9 | 0,58 |
| PhOH | 5,0 | 10,0 | 1,86 | |
Анализ полученных экспериментальных данных показывает, что все соединения окисляются с достаточно высокими скоростями, а наибольшую специфичность пероксидаза проявляет по отношению к гваяколу.
Этот факт можно объяснить с позиций структурных особенностей молекул модельных соединений лигнина, выбранных для исследования. При введении в молекулу пара- заместителей, обладающих сильно выраженными электроноакцепторными свойствами (например -CH=CH–COOH у феруловой кислоты и CO-CH3 у ацетованилона), электронная плотность в ароматическом кольце понижается, что способствует эффективной делокализации избыточного отрицательного заряда кислородного атома в сопряженной системе. Это приводит к упрочнению связи О-Н в фенольном гидроксиле, а значит, к снижению способности модельных соединений окисляться под действием пероксидазы. Однако, если в молекулу ввести пара- заместитель со слабовыраженными электроноакцепторными свойствами (например -СH2OH в ванилиновом спирте), то реакционная способность модельных соединений не понижается.
Таким образом, проведенные исследования по изучению кинетики пероксидазного окисления модельных соединений лигнина свидетельствуют о том, что введение пара- заместителей с различными электроноакцепторными свойствами в молекулу модельного соединения в значительной степени влияет на активность реакционного центра - фенольной гидроксильной группы, а, следовательно, и на способность органического соединения к пероксидазному окислению:
гваякол > ванилиновый спирт > ацетованилон > феруловая кислота.
3. Кинетическая модель и механизм пероксидазного окисления модельных соединений лигнина
С целью установления кинетической модели и схемы механизма пероксидазного окисления модельных соединений структурного звена лигнина (гваякола, феруловой кислота, ацетованилона и ванилинового спирта) были выполнены исследования в условиях одновременного варьирования концентрации субстратов; концентрация катализатора (пероксидазы хрена) во всех экспериментах была постоянна и соответствовала ранее установленному оптимальному значению.
Согласно литературным данным, механизм пероксидазного окисления субстратов является трехстадийным, включающим образование двух промежуточных продуктов окисления фермента Сpd I и Cpd II:
где Е – несвязанная форма фермента; H2O2 – субстрат-окислитель; Cpd I – активный фермент-субстратный комплекс; PhOH – субстрат-восстановитель (модельное соединение лигнина); PhO• - феноксирадикалы; Сpd II – активный фермент-субстратный (продуктный) комплекс; Ps – продукты реакции.
Однако, механизм действия пероксидаз может быть различным в реакциях с субстратами разной природы. Поэтому, с целью разработки кинетической модели процесса, адекватно отражающей полученные опытные данные, проведена их обработка с помощью методов математического анализа.
Применяя метод стационарных концентраций, для представленной ранее кинетической схемы, можно записать выражение для зависимости начальной скорости реакции (v0) от начальных концентраций субстрата- окислителя (СH2O2) и субстрата-восстановителя (CPhOH):
(3).
где b, a1, a2 и a3 – функции от констант k1, k-1, k2, k-2 и k3 соответственно и они равны:
| b | = k1k-2k3 + k-1k2k3 |
| a1 | = k1k-2 |
| a2 | = k-1k2 +k-2k3 |
| a3 | = k1k-2k3+k-1k2+k1k3+k2k3 |
Применение уравнения (3) ограничено теорией Михаэлиса-Ментен о упорядоченном механизме присоединения субстратов. Поэтому необходимо проверить справедливость применения этого допущения в конкретном случае пероксидазного окисления выбранных модельных соединений лигнина.
С помощью программы SigmaPlot v. 11.0 (Systat Software Inc. SigmaPlot for Windows) нами рассчитаны коэффициенты этого уравнения и построены зависимости v0=f(СPhOH) для каждого фенольного соединения по экспериментальным и расчетным данным, представленные на рис. 2.
 |  |
| А | Б |
 |  |
| В | Г |
| Рисунок 2 – Зависимость v0 от концентрации модельных соединений в реакции окисления их пероксидом водорода в присутствии перокидазы хрена: А- гваякол, Б- феруловая кислота, В- ацетованилон, Г- ванилиновый спирт (1 – кривая, полученная по экспериментальным данным; 2- кривая, полученная расчетным методом (уравнение 3)). | |
Такая зависимость корректно описывает поведение системы в области низких «ненасыщающих» концентраций субстратов. Однако, если рассматривать их поведение в более широком диапазоне концентраций, то необходимо использовать допущение о неупорядоченном стационарном механизме пероксидазного окисления субстратов.
Основной особенностью этого механизма является одновременное связывание субстрата Н2О2 с ферментом Е и с промежуточным фермент-субстратным комплексом Cpd I.
Учитывая это взаимодействие, необходимо привести уравнение (3) в более сложный вид (4):
b1, b2, b3, a1, a2, a3, a4, a5, a6, a7 – функции от констант k1, k-1, k2, k-2, k3, k-3, k4, k-4, k5 соответственно и они равны:
| b1 | = k1k-2k3k5 + k-1k2k4k5 |
| b2 | = k1k3k4k5 |
| b3 | = k2k3 k4k5 |
| a1 | = k1k-2k-3 + k1k-2k-4 + k1k-2k5 + k-1k-3k4 + k-1k4k5 |
| a2 | = k1k-3k4 + k1k4k5 |
| a3 | = k-1k2k-3 + k1k+2k-4 + k-1k2k5 + k-2k3k-4 + k-2k3k5 |
| a4 | = k2k3k-4 + k2k3k5 |
| a5 | = k1k-2k3 + k-1k2k4 + k1k3k-4 + k2k-3k4 + k3k4k5 |
| a6 | = k1k3k4 |
| a7 | = k2k3k4 |
Уравнение (4) является системой второй степени относительно СPhOH и CH2O2, так как субстраты взаимодействуют с ферментом Е и с промежуточными фермент-субстратными комплексами Cpd I, Cpd I*. Соотношение констант в уравнении получено методом Кинга и Альтмана (метод графов для получения уравнения скорости).
С помощью программы SigmaPlot v.11 были рассчитаны коэффициенты в уравнении (4) и построены зависимости v0=f(СPhOH) для каждого фенольного соединения по экспериментальным и расчетным данным (рис.3).
Как видно из представленных данных (рис. 3), кривые зависимостей, полученных опытным путем адекватны кривым, полученным при расчете.
 |  |
| А | Б |
 |  |
| В | Г |
| Рисунок 3 – Зависимость v0 от концентрации модельных соединений в реакции окисления их пероксидом водорода в присутствии перокидазы хрена: А- гваякол, Б- феруловая кислота, В- ацетованилон, Г- ванилиновый спирт (1 – кривая, полученная по экспериментальным данным; 2- кривая, полученная расчетным методом (уравнение 4)). | |
Таким образом, показано, что для модельных соединений лигнина гваяцильного ряда (гваякола, феруловой кислоты, ванилинового спирта и ацетованилона), окисляемых в широком диапазоне концентраций пероксидом водорода, полученные экспериментальные результаты невозможно интерпретировать согласно классической теории Михаэлиса - Ментен. Объяснением наблюдаемого отклонения от классического упорядоченного механизма является допущение о неупорядоченности каталитического процесса.
На основании этого предложена и экспериментально доказана кинетическая модель процесса каталитического окисления гваяцильных структур по типу Random Bi Uni с неупорядоченным присоединением субстратов.
где Е – несвязанная форма фермента; H2O2 – субстрат-окислитель; Cpd I – активный фермент-субстратный комплекс с пероксидом водорода; PhOH – субстрат-восстановитель (модельное соединение лигнина); PhO• - феноксирадикалы; Сpd II – активный фермент-субстратный (продуктный) комплекс c модельным соединением лигнина; Cpd I* - активный фермент-субстратный комплекс с модельным соединением лигнина; Сpd II* - активный фермент-субстратный (продуктный) комплекс с пероксидом водорода; Ps – продукты реакции.
4. Изучение закономерностей пероксидазного окисления препаратов лигнина
С целью исследования процесса пероксидазного окисления лигнина, использовались те же подходы, что и при изучении процесса окисления модельных соединений его структурного звена. Препараты лигнина, выделенные различными методами существенно различаются по целому ряду физико-химических характеристик, что связано с различным соотношением функциональных групп в выделенном образце.
Рассчитав скорость реакции пероксидазного окисления препаратов лигнина и сопоставив полученные значения с данными по функциональному составу, можно сделать вывод о том, что на скорость реакции окисления оказывает существенное влияние содержание в образцах карбоксильных групп и фенольных гидроксилов.
Таблица 8 - Скорость реакции пероксидазного окисления препаратов лигнина
| Вид лигнина | v0102, мг/(млмин) |
| Диоксанлигнин ели (ДЛ) | 3,0 |
| Сульфатный хвойный лигнин (СХЛ) | 2,0 |
| Сульфатный хвойный лигнин восстановленный NaBH4 (ВСХЛ) | 2,8 |
Основными реакционными центрами рассматриваемых препаратов лигнина являются фенольные гидроксильные группы. Доступность этих групп определяется не только функциональной природой, но и макромолекулярными свойствами (характеристиками полимолекулярного состава, полидисперсностью, формой макромолекул). Поэтому для исследования пероксидазного окисления лигнинных макромолекул исходный препарат ДЛЕ расфракционировали методом дробного осаждения в системе диоксан «растворитель» - бензол «осадитель» с выделением 7 фракции различной функциональной природы и полимолекулярных характеристик (таблица 9).
Согласно представленным данным, зависимость содержания фенольных гидроксилов от значений молекулярной массы фракций ДЛ имеет линейный характер. Полученную зависимость можно объяснить снижением «доступности» окислительных центров с увеличением молекулярной массы образца.
Таблица 9 - Изменение содержание метоксильных и фенольных групп в зависимости от молекулярной массы фракций ДЛ
| Диоксанлигнин | Mw, а.е.м. | OCH3, % | OH фен, % |
| Исходный ДЛ | 16700 | 15,62 ± 0,10 | 1,88 ± 0,01 |
| 1 фракция | 28600 | 14,83 ± 0,40 | 1,32 ± 0,01 |
| 2 фракция | 17000 | 14,40 ± 0,50 | 1,56 ± 0,01 |
| 3 фракция | 10700 | 10,68 ± 0,32 | 2,12 ± 0,05 |
| 4 фракция | 7500 | 14,59 ± 0,30 | 2,39 ± 0,01 |
| 5 фракция | 4900 | 12,71 ± 0,07 | 2,42 ± 0,03 |
| 6 фракция* | 3600 | - | - |
| 7 фракция* | 2900 | 13,38 ± 0,21 | 1,29 ± 0,01 |
* фракция лигнина, не используемая для исследований.
Обнаруженный факт связан с конформационными особенностями лигнинного полимера: лигнин в реакционной среде присутствует в форме разбухшего непротекаемого клубка. Рост молекулярной массы приводит к увеличению взаимного влияния активных реакционных центров (функциональных групп) в макромолекуле, образованию внутримолекулярных и межмолекулярных водородных связей, росту внутреннего сопряжения, вызывающего повышение электронной плотности на фенольных гидроксильных группах.
Следовательно, при увеличении молекулярной массы лигнинных образцов отмеченные факты приводят к обратному эффекту - снижению количества активных фенольных группировок, участвующих в ферментативных окислительных взаимодействиях, при сохранении конформации макромолекулярного клубка.
На рисунке 4 представлена зависимость скорости реакции пероксидазного окисления от молекулярной массы фракций ДЛ.
Рисунок 4 - Зависимость начальной скорости реакции пероксидазного окисления от молекулярной массы фракций ДЛ.
Таким образом, в результате суммарного влияния рассмотренных факторов, происходит снижение способности лигнина к окислительно-восстановительным взаимодействиям в реакциях его пероксидазного окисления.
Выводы
1. Показано, что пероксидаза хрена является эффективным биокатализатором редокс - превращений лигнинных веществ.
2. Установлены основные закономерности пероксидазного окисления родственных лигнину фенольных соединений гваяцильного ряда в водной среде (влияние рН раствора, концентраций катализатора, субстрата-окислителя, субстрата-восстановителя); определены оптимальные условия проведения процесса; показано, что основным реакционным центром, участвующим в редокс – превращениях структурных единиц лигнина, является фенольный гидроксил.
3. Изучено влияние электроноакцепторных свойств пара-заместителей на активность фенольного реакционного центра структурных единиц лигнина в процессах ферментативного окисления. Экспериментально определенные кинетические параметры позволяют расположить модельные соединения по способности к пероксидазному окислению в следующий ряд:
гваякол > ванилиновый спирт > ацетованилон > феруловая кислота.
4. Полимолекулярные свойства и форма макромолекул лигнина являются важными факторами, влияющими на процесс биохимического окисления. Зависимость начальной скорости реакции пероксидазного окисления диоксанлигнина от его молекулярной массы носит линейный характер и выражается уравнением v0 = k·Mw + b (где k = - 4,6·10-4; b = 10,91; R2 =0,97).
5. Теоретически обоснована и экспериментально доказана применимость модели неупорядоченного присоединения субстратов по типу Random Bi Uni для интерпретации процесса пероксидазного окисления лигнинных веществ в широком диапазоне их концентраций.
Список публикаций по теме диссертации
- Боголицын, К.Г. Применение ферментативного метода для оценки содержания фенольных компонентов в технологических, сточных и природных водах [Текст] / К.Г. Боголицын, М.А. Айзенштадт, А.С. Почтовалова, Т.Н. Шеховцова // II Всероссийская конференция по аналитической химии с международным участием «Аналитика России»: Материалы конференции. – Краснодар. – 2007. – С. 318.
- Айзенштадт, М.А. Методика оценки ингибирующего действия лигнина и его модельных соединений на каталитическую активность пероксидазы хрена [Текст] / М.А. Айзенштадт, С.А. Покрышкин, К.Г. Боголицын // Всероссийской конференции с международным участием «Северные территории России: проблемы и перспективы развития»: Материалы конференции. - Архангельск. – 2008. – С.18 – 20.
- Айзенштадт, М.А. Ферментативное определение модельных соединений лигнина гваяцильного ряда [Текст] / М.А. Айзенштадт, С.А. Покрышкин // XV Международная конференция студентов, аспирантов и молодых ученых «Ломоносов»: Материалы конференции. – Москва. – 2008. – С. 266.
- Bogolitsyn, K.G. Kinetics of enzyme catalyzed oxidation of lignin model compounds by horseradish peroxidase – hydrogen peroxide complex [Text] / K.G. Bogolitsyn, M.A. Aizenshtadt // 10th European Workshop on Lignocellulosics and Pulp EWLP 2008: Proceedings. - Stockholm, Sweden. – 2008. – P.384 - 387.
- Айзенштадт, М.А. Применение методов ферментативного анализа при изучении кинетики окисления ароматических полимеров растительного происхождения [Текст] / М.А. Айзенштадт, К.Г. Боголицын, С.А. Покрышкин // Международный форум «Аналитика и Аналитики»: Рефераты докладов. – Воронеж. – 2008. - Т.2. - С. 391.
- Айзенштадт, М.А. Пероксидазное окисление лигнина и его модельных соединений [Текст] / М.А. Айзенштадт, К.Г. Боголицын // Химия растительного сырья. – 2009. - № 2. – С. 5 – 18.
- Айзенштадт, М.А. Каталитическое окисление модельных соединений лигнина пероксидом водорода в присутствии пероксидазы хрена в качестве катализатора [Текст] / М.А. Айзенштадт, К.Г. Боголицын, С.А. Покрышкин // Химия растительного сырья. – 2009. - № 4. – С. 31 – 37.
- Боголицын, К.Г. Оценка возможности применения методов ферментативного анализа для определения лигнина в технологических средах ЦБП [Текст] / К.Г. Боголицын, М.А. Айзенштадт // VII Всероссийская конференция по анализу объектов окружающей среды «Экоаналитика 2009»: Тезисы докладов. - Йошкар-Ола.- 2009. - С. 43-44.
- Айзенштадт, М.А. Ферментативное определение лигнина по реакции его пероксидазного окисления [Текст] / М.А. Айзенштадт, К.Г. Боголицын // III международная конференция Физикохимия лигнина: Материалы конференции. – Архангельск. – 2009. – С. 117 - 121.
- Айзенштадт, М.А. Использование ферментов как катализаторов процессов биодеградации лигнина [Текст] / М.А. Айзенштадт, К.Г. Боголицын // Международная научно-техническая конференция посвященная 80-летию АЛТИ-АГТУ: Материалы конференции. – Архангельск. - 2009. - С. 112-114.
Отзывы на автореферат в 2-х экземплярах с заверенными гербовой
печатью подписями просим направлять по адресу:
163002, г. Архангельск, Набережная Северной Двины, 17, АГТУ, диссертационный совет Д.212.008.02.
